CN113373265A

CN113373265A - 特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒

Info

Publication number: CN113373265A
Application number: CN202110671712.6A
Authority: CN
Inventors: 陈珍; 陈翠腾; 朱春华; 施少华; 傅光华; 黄瑜; 万春和; 程龙飞; 陈红梅; 傅秋玲; 刘荣昌
Original assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Animal Husbandry and Veterinary of Fujian Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2021-06-17
Filing date: 2021-06-17
Publication date: 2021-09-10

Abstract

本发明提供一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒。所述检测试剂盒包含特异性检测禽坦布苏病毒的引物ATMUV‑F、ATMUV‑R和探针ATMU‑probe。该检测试剂盒灵敏度高、稳定性好、特异性强、重复性好，可用于禽坦布苏病毒特异性检测，为后续科学研究禽坦布苏病毒致病机理和开展分子流行病学奠定基础。

Description

特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒

技术领域

本发明属于动物病毒学领域，具体涉及一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒。

背景技术

实时荧光定量PCR方法（Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质检测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。实时荧光定量PCR在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系。目前根据所使用荧光化学物质的不同，主要包括荧光染料和荧光探针两类。荧光探针是基于荧光共振能量转移(fluorescence resonanceenergy transfer, FRET)原理。TaqMan 探针是水解探针的代表，对目标序列有很高的特异性，同时结合引物的特异性，使得qRT-PCR技术的特异性和准确性极大提高，而且反应结束后不需进行寡核苷酸熔解曲线分析，缩短了实验时间，可避免SYBR GreenⅠ实时荧光定量方法可能导致的结果误读误判。MGB TaqMan 探针是经过改进的探针，其3'端采用的是非荧光性的淬灭基团，大大降低了本底信号的干扰；尤其是该探针的3'端还连接了1 个MGB，使探针与模板的杂交更加稳定，提高探针熔解温度(melting temperature, Tm)，使较短的探针也能达到较高的Tm 值；又由于短探针的荧光基团和淬灭基团的距离较近，所以淬灭效果更好，荧光背景更低；另外短探针也节约了探针设计成本，可同时对单一样本（尤其针对样品难以获取或病原载量较低样本）开展多种病原学检测，具有高通量、成本低廉、结果迅速等优点，在新发传染病等领域被广泛使用。

禽坦布苏病毒（avian tembusu virus，ATMUV）感染是一种以高热、采食量骤降、产蛋率急剧下降、卵泡出血为特征的传染病。该病于2010年4月最初出现在我国东部地区（浙江、福建、山东等）种（蛋）鸭群，引起患病种（蛋）鸭群从高产蛋率（80%-95%）下降至20%-30%，甚至有的停产，剖检可见病鸭卵泡充血、出血。随后，蛋鸡群也出现坦布苏病毒感染，引起蛋鸡发热、采食减少或食欲废绝、产蛋急降或停止，剖检可见卵泡出血，部分卵黄破裂；鹅感染坦布苏病毒后表现产蛋急剧下降、神经症状（如摇头），剖检主要见卵巢出血或卵黄液化。此外，肉鸭、肉鸡、鸽、麻雀感染该病的报道。目前，鸭坦布苏病毒感染波及我国大部分家禽养殖区，给我国养禽业造成了巨大的经济损失。。

本发明建立的禽坦布苏病毒MGB TaqMan 探针实时荧光定量PCR方法不仅可用于流行病学检测且可对禽坦布苏病毒感染程度进行精确定量（比SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法敏感性更高），可有效用于禽坦布苏病毒致病机制差异研究，本发明可填补国内外相关研究领域空白。

发明内容

本发明的目的在于，针对现有技术的不足，提供一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒。本发明的检测试剂盒特异性强，灵敏度高，重复性好，能用于快速、准确的检测禽坦布苏病。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种检测禽坦布苏病毒的引物和探针，所述引物和探针的核苷酸序列如下：

引物ATMUV-F：5’- GGTCCTCCCCATGATTCTGA -3’；

引物ATMUV-R：5’-AGATACCGTATTGGAAGTCCTTTCA -3’；

探针ATMUV-probe：5’- FAM-CTCCGACTCGGGTGGT-MGB-3’。

上述一种检测禽坦布苏病毒的引物和探针在检测禽坦布苏病毒中的应用。

一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒，所述所述试剂盒包括以下组分：引物ATMUV-F、引物ATMUV-R、探针ATMUV-probe和Probe qPCR Mix（2×）。

上述一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其最佳反应体系为：ProbeqPCR Mix（2×）混合液10μL、上/下游引物（ATMUV-F和ATMUV-R）（20 μmol/L）各 0.2 μL、探针（ATMUV-probe）（20 μmol/L）0.4 μL、cDNA模板 1 μL、水（Nuclease-free Water）补足至20 μL。

上述一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其反应条件为：95℃ 120s 预变性；95℃ 10s、60℃30s，共45个循环。

上述一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒在禽坦布苏病毒检测中的应用。

有益效果

1、检测快速、高效：该检测方法无需进行常规琼脂糖凝胶电泳检测，反应结束后即可通过实时荧光定量PCR机器自带的程序进行结果判定。

2、定量准确：通过制备标准品、绘制标准曲线，根据检测待检样品中的Ct值，直接对禽坦布苏病毒感染给出判定，并可对其感染程度进行准确定量。

3、灵敏度高：最低可检测25.52拷贝/μL。

4、特异性强：和鸭中的常见传染病[如鸭肝炎病毒（DHV）、禽呼肠孤病毒（ReoV）、鹅细小病毒（GPV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鸭圆环病毒（DuCV）、鸭腺病毒A型（DAdV-A）、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌（E. coli）、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)]均均无反应信号，仅对禽坦布苏病毒感染检测出现荧光信号。

5、重复性好：建立的实时荧光定量PCR检测方法进行ATMUV检测的组内变异系数为0.35%-2.19%，组间变异系数0.64%-2.51%。

附图说明：

图1 实时荧光定量PCR检测ATMUV扩增曲线。1： ATMUV扩增曲线，N：阴性对照。

图2 实时荧光定量PCR检测ATMUV标准曲线。

图3实时荧光定量PCR检测ATMUV敏感性试验。1-5为模板浓度2.32×10⁴拷贝/μL至2.32×10⁰拷贝/μL的扩增曲线。

图4 实时荧光定量PCR检测ATMUV特异性试验。1为ATMUV；Controls为 DHV、ReoV、GPV、MDPV、DuCV、DAdV-A、DEV、E. coli、R.A.和P.M.对照样品。

具体实施方式

下面实施例对本发明做进一步的描述。

试验用毒株：

禽坦布苏病毒（WR株）由福建省农业科学院畜牧兽医研究所分离、鉴定和保存。

试验对照毒株和菌株：

鸭群中常见的病原，如鸭肝炎病毒（DHV）、禽呼肠孤病毒（ReoV）、鹅细小病毒（GPV）、番鸭细小病毒（MDPV）、鸭圆环病毒（DuCV）、鸭腺病毒A型（DAdV-A）、鸭瘟病毒(DEV)、鸭大肠杆菌（E. coli）、鸭疫里氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所鉴定和保存。

实施例1 MGB TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的引物和探针的设计

根据禽坦布苏病毒核苷酸序列E基因分析比对结果，利用引物设计软件PrimerExpress设计特异性的引物和探针，序列为：

引物ATMUV-F：5’- GGTCCTCCCCATGATTCTGA -3’；

引物ATMUV-R：5’-AGATACCGTATTGGAAGTCCTTTCA -3’；

探针ATMUV-probe：5’- FAM-CTCCGACTCGGGTGGT-MGB3’。

引物和探针均在生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

实施例2 阳性标准品的构建

利用Oligo 6.0 引物设计软件设计引物，上游引物F1：5＇-TGGTGGGTTCAGGCGATTTT -3＇、下游引物R1：5＇- TCCTCTGGCAGCAATACTGG -3＇，预期扩增片段大小为 434 bp。使用 PCR 扩增试剂（2×PCR Master试剂）推荐的100 μL体系进行扩增，其中2×PCR Mix反应液 50 μL、上/下游引物（F1/R1）（引物浓度为10 μmol·L^-1）各 2.5 μL、WR株的核酸cDNA 2.5 μL，补充灭菌去离子水至终反应体系100 μL。混匀后进行PCR扩增，扩增条件为94 ℃预变性 5 min后进入循环，94 ℃变性 15 s 、58 ℃退火15 s、72 ℃延伸15s，35个循环结束后，72℃终延伸10 min。

PCR反应结束后，产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒对特异性目的片段进行切胶回收。按照pEASY-T1 Simple Cloning Kit克隆连接试剂盒说明书将目的基因片段克隆到pEASY-T1载体上，随机挑取5个单菌落于氨苄青霉素（含量为100 μg/mL）抗性的LB液体培养基培养16 h后，利用快速质粒小提试剂盒提取相应的质粒。采用PCR扩增时的引物（F1/R1）和条件对提取的质粒进行PCR鉴定，将筛选出的阳性重组质粒送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。经Blast分析后，符合实验预期的阳性重组质粒作为本研究的标准品（P-ATMUV）。利用分光光度计测定其浓度后，计算相应的拷贝数为2.32×10⁹ 拷贝/μL。经线性化酶切后，进行连续10倍倍比稀释，将获得的浓度分别为2.32×10⁷ 拷贝/μL至2.32×10⁰ 拷贝/μL，均冻存于-20℃备用。

实施例3 MGB TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测方法的建立

按照Probe qPCR Mix试剂盒说明书配制 20 μL的实时荧光定量PCR反应体系，筛选出的最佳反应体系为：Probe qPCR Mix（2×）混合液10μL、上/下游引物（ATMUV-F和ATMUV-R）（20 μmol/L）各 0.2 μL、探针（ATMUV-probe）（20 μmol/L）0.4 μL、cDNA模板 1 μL、水（Nuclease-free Water）补足至20 μL。优化后的最佳反应条件为：95℃ 120s 预变性；95℃ 10s、60℃30s，共45个循环（扩增曲线见图1）。

分别以标准品（P-ATMUV）含量为2.32×10⁷拷贝/μL-2.32×10³ 拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得扩增动力学曲线。以标准品起始拷贝数的常用对数为横坐标，以循环数阈值（cycle threshold，Ct值）为纵坐标，推导出标准线性回归方程（标准曲线，见图2），获得实时荧光定量PCR标准曲线的线性方程的斜率为-3.319，Y轴截距为36.80，相关系数为1.000，扩增效率为100%，表明建立的实时荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系。

分别以标准品（P-ATMUV）含量为2.32×10⁴拷贝/μL至2.32×10⁰ 拷贝/μL的标准品作为模板，用优化后的反应条件进行扩增，获得本发明的最低检测限为25.52拷贝/μL（图3）。

实施例4 MGB TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测ATMUV的特异性试验

用优化后的实时荧光定量PCR条件，分别对ATMUV、DHV、ReoV、GPV、MDPV、DuCV、DAdV-A、DEV、E. coli、R.A.和P.M进行检测。结果发现仅对ATMUV出现阳性扩增，对DHV、ReoV、GPV、MDPV、DuCV、DAdV-A、DEV、E. coli、R.A.和P.M（图中的Controls）均未见阳性扩增信号（图4）。

实施例5 TaqMan实时荧光定量PCR特异性检测ATMUV重复性试验

用建立的实时荧光定量PCR方法分别对质粒含量为2.32×10³、2.32×10⁴、2.32×10⁵的标准品进行检测，量重复3次，计算组内（intra-group）变异系数。分别将上述不同质粒含量的标准品分装后置于-20 ℃保存，每隔10d取出，用建立的实时荧光定量PCR方法进行检测，共检测3次，计算组间（inter-group）变异系数。建立的实时荧光定量PCR检测方法进行的组内变异系数为0.35%-1.99%，组间变异系数0.64%-2.51%。表明建立的实时荧光定量PCR检测方法重复性好。

实施例 6 临床应用

使用建立的禽坦布苏病毒特异性检测方法，对临床收集的112份产蛋下降的鸭泄殖腔棉拭子进行禽坦布苏病毒进行检测。结果显示，35份检测出现荧光信号（判为阳性样品），阳性率为31.25%。利用文献【陈国强，李永旺，王凯民，陈雷，钱伟，朱婷，陆春华，时长军*. 鸭坦布苏病毒SYBR Green qPCR 检测方法的建立［J］．畜牧与兽医，2018，50 ( 09) :78-81．】介绍的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法进行禽坦布苏病毒检测，其中ATMUV阳性34份，阳性率为30.36 %；且该34份阳性样品经本发明建立的方法检测均为阳性，符合符合率为100%。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> 特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒

<130> 5

<160> 5

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggtcctcccc atgattctga 20

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

agataccgta ttggaagtcc tttca 25

<210> 3

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ctccgactcg ggtggt 16

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

tggtgggttc aggcgatttt 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcctctggca gcaatactgg 20

Claims

1.一种检测禽坦布苏病毒的引物和探针，其特征在于：所述引物和探针的核苷酸序列如下：

引物ATMUV-F：5’- GGTCCTCCCCATGATTCTGA -3’；

引物ATMUV-R：5’-AGATACCGTATTGGAAGTCCTTTCA -3’；

探针ATMUV-probe：5’- FAM-CTCCGACTCGGGTGGT-MGB3’。

2.如权利要求1所述的一种检测禽坦布苏病毒的引物和探针在检测禽坦布苏病毒中的应用。

3.一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征在于：所述检测试剂盒包含权利要求1所述的检测禽坦布苏病毒的引物和探针。

4.根据权利按要求3所述的一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒的反应体系为： 2×Probe qPCR Mix混合液10μL、浓度为20 μmol/L的引物ATMUV-F和引物ATMUV-R各0.2 μL、浓度为20 μmol/L的探针ATMUV-probe 0.4 μL、cDNA模板1 μL、Nuclease-free水补足至20 μL。

5.根据权利按要求3所述的一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征在于：检测试剂盒的反应条件为：95℃ 120s 预变性；95℃ 10s、60℃30s，共45个循环。

6.如权利要求3所述的一种特异性更强的禽坦布苏病毒检测试剂盒在禽坦布苏病毒检测中的应用。