CN102839226A - Qc-pcr检测禽坦布苏病毒竞争模板的扩增引物、制备方法和禽坦布苏病毒检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的引物，核苷酸序列见序列表中序列1和序列2。竞争模板的制备方法：提取病毒RNA，反转录得到禽坦布苏病毒的cDNA一链；进行PCR扩增，扩增体系中含有步骤（1）得到的cDNA一链、引物1和引物2，得到QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板。禽坦布苏病毒检测试剂盒由PCR扩增体系组成。本发明的禽坦布苏病毒检测试剂盒，可在5小时内完成病毒的快速定量检测，最低检测限为4×10²个目标基因；比传统的测定病毒含量的方法节省了4-5天时间，还克服了荧光定量方法仪器要求高、易污染、成本高的缺点，可满足禽坦布苏病毒及时准确定量的需要。

Description

QC-PCR检测禽坦布苏病毒竞争模板的扩增引物、制备方法和禽坦布苏病毒检测试剂盒

技术领域    

本发明涉及病毒检测技术领域，特别涉及QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的引物，还涉及此竞争模板的制备方法，还涉及禽坦布苏病毒检测试剂盒。

背景技术   

2010年4月以来，在我国山东、江苏、 浙江、广西等养禽集中区域爆发了一种疾病，以种禽产蛋严重下降、肉禽出现神经症状为特点，后证实是由坦布苏病毒（Tembusu virus）所引起, 目前研究人员已先后在鸭、鹅、鸡、麻雀等体内分离到该病毒，同时也已证实该病毒在养禽区域定植。禽坦布苏病毒属于黄病毒科黄病毒属蚊媒病毒类恩塔亚病毒群，是一种新发黄病毒，给中国的养禽业带来了极大的经济损失。

禽坦布苏病毒病毒活力较低，滴度下降快，造成病毒滴度不稳定，所以给病毒的定量带来了一定的困难。目前对禽类病毒定量的方法主要是荧光定量PCR和半数鸡胚感染量（EID₅₀）的测定，但前者存在仪器昂贵、使用成本高和易污染等方面的缺点；而后者则需要将病毒接种SPF鸡胚或者鸭胚，统计不同病毒稀释度对胚体的感染量，一般需要5-6天时间，耗时长、工作量大，加之禽坦布苏病毒活力低，所以更不适合使用EID₅₀进行含量的测定。此外，一般的PCR检测方法只能进行定性的检测，而不能定量，不能满足部分实验的要求。

发明内容   

为了解决以上禽坦布苏病毒检测中存在的仪器昂贵、使用成本高、易污染、耗时长、工作量大、禽坦布苏病毒活力低的问题，本发明提供了QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的扩增引物。

本发明还提供了上述QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的制备方法。

本发明的另一个目的是提供禽坦布苏病毒检测试剂盒。

本发明是通过以下步骤实现的：

一种QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的扩增引物，核苷酸序列如下：

引物1：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，

引物2：5’-CCNARCCACATRWACCATTYTCHCTYTTBCCCATCATGTT-3’。

一种QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的制备方法，包括以下步骤：

（1）提取禽坦布苏病毒RNA，进行反转录得到禽坦布苏病毒的cDNA一链；

（2）进行PCR扩增，扩增体系中含有步骤（1）得到的cDNA一链、引物1和引物2，胶回收得到QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板；

引物1核苷酸序列：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，

引物2核苷酸序列：5’-CCNARCCACATRWACCATTYTCHCTYTTBCCCATCATGTT-3’。

所述PCR扩增体系组成：10×Ex Taqbuffer 2.5μL，2.5mM的dNTP2μL，引物1和引物2各0.5μL，Ex Taq 酶0.5μL，cDNA一链0.5μL, ddH₂O补足25μL；

引物1和引物2的浓度各为100pmol/μL；

cDNA一链浓度为2.5ng/μL；

Taq 酶浓度为5U/μL。

所述PCR扩增反应条件：98℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s, 30个循环；再72℃延伸10min，4℃终止反应。

一种禽坦布苏病毒检测试剂盒，含有8个子PCR扩增体系，每个PCR扩增体系组成为：10×Ex Taqbuffer 2.5μL，2.5mM 的dNTP 2μL，引物1和引物3各0.5μL，Ex Taq 酶0.5μL，竞争模板0.5μL，ddH₂O补足24.5μL；

引物1核苷酸序列：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，

引物3核苷酸序列：5’-CCNARCCACATRWACCA-3’； 

引物1和引物3的浓度各为100pmol/μL；

8个子PCR扩增体系竞争模板的浓度，自4×10⁹-4×10²竞争模板/扩增体系以10倍的浓度梯度设置；

Taq 酶浓度为5U/μL。

所述的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征是使用时向PCR扩增体系中加入待检样品病毒cDNA 0.5μL。

所述的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征是PCR反应条件为：98℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s, 30个循环；再72℃延伸10min，4℃终止反应。

本发明提供的检测禽坦布苏病毒的特异性引物，由以下三条引物组成：一条引物是能与禽坦布苏病毒NS5基因结合的用于病毒目标基因和竞争模板扩增的共用上游引物1（见序列表中序列1），一条引物是能与禽坦布苏病毒NS5基因结合的用于竞争模板扩增的下游引物2（见序列表中序列2），一条引物是能与禽坦布苏病毒NS5基因结合的用于病毒目标基因扩增的下游引物3（见序列表中序列3）。引物识别的三个区域是黄病毒科病毒NS5基因的保守区，所以能够识别所有的禽坦布苏病毒NS5基因，包括鸭、鹅、鸡等体内分离的病毒基因。其中竞争模板用作定量内标物，扩增的产物大小为353bp，目标基因为定量检测基因，扩增的产物大小为413bp，目标基因与竞争模板在禽坦布苏病毒基因中起始位置相同，只是在其3’端比竞争模板多出60bp。

本发明的有益效果：本发明的禽坦布苏病毒检测试剂盒，可在5小时内完成病毒的快速定量检测，最低检测限为4×10²个目标基因；此方法不仅比传统的测定病毒含量的方法节省了4-5天时间，还克服了荧光定量方法仪器要求高、易污染、成本高的缺点，可满足禽坦布苏病毒及时准确定量的需要。

附图说明

附图1为准确性检测中阳性对照检测组 QC-PCR结果，

其中：M: 100 bp DNA ladder, 1: 4×10⁹竞争模板/反应体系；2：4×10⁸竞争模板/反应体系；3：4×10⁷竞争模板/反应体系；4：4×10⁶竞争模板/反应体系；5：4×10⁵竞争模板/反应体系；6：4×10⁴竞争模板/反应体系；7：4×10³竞争模板/反应体系；8：4×10²竞争模板/反应体系；

图2为准确性检测中检测组1 QC-PCR结果，

其中：M: 100 bp DNA ladder, 1: 4×10⁹竞争模板/反应体系；2：4×10⁸竞争模板/反应体系；3：4×10⁷竞争模板/反应体系；4：4×10⁶竞争模板/反应体系；5：4×10⁵竞争模板/反应体系；6：4×10⁴竞争模板/反应体系；7：4×10³竞争模板/反应体系；8：4×10²竞争模板/反应体系；

图3为准确性检测中检测组2 QC-PCR结果，

其中：M: 100 bp DNA ladder, 1: 4×10⁹竞争模板/反应体系；2：4×10⁸竞争模板/反应体系；3：4×10⁷竞争模板/反应体系；4：4×10⁶竞争模板/反应体系；5：4×10⁵竞争模板/反应体系；6：4×10⁴竞争模板/反应体系；7：4×10³竞争模板/反应体系；8：4×10²竞争模板/反应体系；

图4为准确性检测中检测组3 QC-PCR结果，

其中：M: 100 bp DNA ladder, 1: 4×10⁹竞争模板/反应体系；2：4×10⁸竞争模板/反应体系；3：4×10⁷竞争模板/反应体系；4：4×10⁶竞争模板/反应体系；5：4×10⁵竞争模板/反应体系；6：4×10⁴竞争模板/反应体系；7：4×10³竞争模板/反应体系；8：4×10²竞争模板/反应体系；

图5为灵敏度检测QC-PCR检测极限（竞争模板与目标模板浓度相同）

其中：M:100 bp DNA ladder；1:4×10⁷模板/反应体系；2：4×10⁶模板/反应体系；3：

4×10⁵模板/反应体系；4：4×10⁴模板/反应体系；5：4×10³模板/反应体系；6：4×10²模板/反应体系；7：4×10¹模板/反应体系；8：4×10⁰模板/反应体系。

具体实施方式

实施例1：竞争模板的制备

（1）提取禽坦布苏病毒RNA，进行反转录得到禽坦布苏病毒的cDNA一链；

（2）进行PCR扩增，扩增体系中含有步骤（1）得到的cDNA一链、引物1和引物2，对目标片段凝胶回收得到QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板；

引物1核苷酸序列：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’， （见序列表中序列1）

引物2核苷酸序列：5’-CCNARCCACATRWACCATTYTCHCTYTTBCCCATCATGTT-3’（见序列表中序列2）。

步骤（1）中提取禽坦布苏病毒RNA，进行反转录得到禽坦布苏病毒的cDNA一链，这是本领域的普通技术人员不花费创造性劳动就可以实现的，在此，就不一一举例了，只列举其中一种，但并不仅仅限于这一种，也不能因为只列举这一种就对上述技术方案产生任何限制作用。

步骤（1）中提取禽坦布苏病毒RNA、反转录，操作步骤如下：

①在离心管中加入250μL病毒培养液和750μL TRIzol Reagent，剧烈振荡，冰浴5min；

②加氯仿200μL，冰浴5min；

③12000rpm，4℃条件下离心10min，取水相,置于另一离心管中；

④加入异丙醇500μL（-20℃预冷），-20℃下孵育10min；

⑤12000rpm，4℃条件下离心10min，弃上清；

⑥向沉淀中加入1mL 75%乙醇（0.1％DEPC水配制）进行洗涤；12000rpm，4℃条件下离心5min，弃上清；

⑦再重复⑥；

⑧将沉淀室温晾干10min，用0.1%DEPC水将沉淀溶解，并在55-60℃下孵育10min；所制备RNA应立即反转录或贮存于-80℃备用；

⑨反转录体系组成：

RNA 2μL，5×Reverse transcriptase buffer 4μL，dNTP (2.5mM)8μL，RNA抑制剂0.5μL，random primer(9 mer) 50pmol，AMV 2μL，DEPC水补足20μL；

⑩反转录反应条件：

30℃10min，42℃ 1h，99℃5min，4℃10min，即合成cDNA一链；

对于步骤（2）中的PCR扩增体系，组成为10×Ex Taqbuffer 2.5μL，2.5mM的dNTP 2μL，引物1和引物2各0.5μL，Ex Taq 酶0.5μL（5U/μL），cDNA一链0.5μL（2.5ng/μL）, ddH₂O补足25μL；

引物1和引物2的浓度各为100pmol/μL。

步骤（2）中的PCR扩增反应条件：98℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s, 30个循环；再72℃延伸10min，4℃终止反应。

（3）竞争模板的制备；

使用2%琼脂糖凝胶电泳和紫外观察步骤（2）中扩增的产物，对大小为353bp的产物进行凝胶回收纯化，并使用分光光度计测定DNA产物的浓度。根据分子量计算出回收产物的分子数，并稀释成4×10⁹个分子/反应体系，10倍系列稀释，得到4×10⁹-4×10²个分子/反应体系的竞争模板。(可参考《分子克隆试验指南》第三版，所需要的试剂和仪器均为市面可购买的。)

实施例2：禽坦布苏病毒检测试剂盒

禽坦布苏病毒检测试剂盒中含有8个子PCR扩增体系，每个子PCR扩增体系组成：10×Ex Taqbuffer 2.5μL，dNTP(2.5mM) 2μL，引物1和引物3各0.5μL，Ex Taq 酶0.5μL（5U/μL），8个子PCR扩增体系分别含竞争模板各0.5μL，浓度自4×10⁹-4×10²个竞争模板/反应体系10倍的浓度梯度递减，ddH₂O补足24.5μL；

引物1核苷酸序列：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’， （见序列表中序列1）

引物3核苷酸序列：5’-CCNARCCACATRWACCA-3’； （见序列表中序列3）

引物1和引物3的浓度各为100pmol/μL。

使用时向各子PCR扩增体系中加入待检样品病毒cDNA 0.5μL。

PCR反应条件：98℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s, 30个循环；再72℃延伸10min，4℃终止反应。

使用本检测试剂盒用于检测时需同时设置阳性对照和阴性对照，在阳性对照能够扩增413bp片段，同时阴性对照无扩增产物出现的前提下，进行结果判定。

禽坦布苏病毒检测试剂盒中还可以选择性含有其他在PCR扩增中使用到的起辅助作用的器械或者试剂，但都不是必须的，只有PCR扩增体系是必须的，其他组成部分不做具体要求。

PCR扩增产物进行凝胶电泳检测，

定性判定：体系扩增出413bp的片段，说明样品中含有禽坦布苏病毒，结果判定为“禽坦布苏病毒”阳性，否则应判定“禽坦布苏病毒”阴性，样品中不含有禽坦布苏病毒。

定量判定：以10倍系列稀释浓度的竞争模板为参照，当体系中413bp和353bp的片段等量共扩增时，说明样品中禽坦布苏病毒的量与该体系中竞争模板的量相同。

禽坦布苏病毒检测试剂盒准确性检测

提取禽坦布苏病毒（包括鸭、鹅、鸡）RNA样本，并以新城疫病毒La Sota株（Newcastle Disease Virus, NDV)、H9N2亚型禽流感病毒(Avian Influenza Virus, AIV)、禽呼肠孤病毒（Avian reovirus, ARV）、减蛋综合症病毒（Egg Drop Syndrome Virus，EDS）为对照病原，采用实施例2制备的检测试剂盒对禽坦布苏病毒RNA样本和对照病原核酸进行准确性检测。

1核酸提取

（1）提取RNA

提取鸭坦布苏病毒、鹅坦布苏病毒、鸡坦布苏病毒、新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽呼肠孤病毒的RNA，进行反转录得到禽坦布苏病毒的cDNA一链，步骤同实施例1的步骤（1）。

（2）提取DNA

提取减蛋综合症病毒的DNA, 取病原液体培养物进行核酸DNA的提取，步骤如下：

取500μL培养液加入25μL10％的SDS和10μL 20mg/mL的蛋白酶K，震荡均匀；56℃条件下水浴2小时；加入200μL Tris饱和酚，混匀后12000rpm离心10min；取上层水相，加入100μL Tris饱和酚和100μL 氯仿，混匀，12000rpm离心10min；将上层水相转移到新的离心管中，加入200μL 氯仿，振荡， 12000rpm离心10min；转移上层水相到一新的离心管，加入等体积的异丙醇，-20℃冰冻10分钟后12000rpm离心10min；弃上清，加入500μL 70%乙醇， 12000rpm离心2min；弃上清，室温放置30min后加入50μL水溶解DNA。

2分别对上述病原样本核酸进行检测，检测步骤如下：

（1）    竞争定量PCR反应

取步骤1得到的鸭坦布苏病毒、鹅坦布苏病毒、鸡坦布苏病毒、新城疫病毒、H9N2亚型禽流感病毒、禽呼肠孤病毒和减蛋综合症病毒cDNA(DNA)各0.5μL，分别加至实施例2试剂盒中的子PCR反应体系中，分别作为检测组1、2、3、4、5、6、7。用相同体积的灭菌水代替DNA同法制备阴性对照，另取已公布序列的DT534坦布苏病毒毒株（GeneBank Accession Number JQ901941）的cDNA为阳性对照。

上述各检测管均用实施例2试剂盒的PCR反应条件扩增，扩增产物进行凝胶电泳检测，并紫外观察。

（2）    结果判定

定性判定：阳性对照扩增出413bp片段，阴性对照没有扩增出413bp片段，只扩增353bp片段。检测组1扩增出413bp片段，检测组2扩增出413bp片段，检测组3扩增出413bp片段，检测组4没有扩增出413bp片段，检测组5没有扩增出413bp片段，检测组6没有扩增出413bp片段，检测组7没有扩增出413bp片段。

定量判定：阳性对照组在4×10⁵竞争模板/反应体系时出现竞争模板与目标基因等量扩增，检测结果见图1，表明DT534坦布苏病毒含量为4×10⁵目标基因/反应体系；检测组1在4×10⁷竞争模板/反应体系时出现竞争模板与目标基因等量扩增，检测结果见图2，表明检测组1病毒含量为4×10⁷目标基因/反应体系；检测组2在4×10⁵竞争模板/反应体系时出现竞争模板与目标基因等量扩增，检测结果见图3，表明检测组2病毒含量为4×10⁵目标基因/反应体系；检测组3在4×10⁷竞争模板/反应体系时出现竞争模板与目标基因等量扩增，检测结果见图4，表明检测组3病毒含量为4×10⁷目标基因/反应体系。

禽坦布苏病毒检测试剂盒灵敏度检测

1、模板稀释

将实施例1中得到的竞争模板浓度10倍系列稀释至4×10⁰竞争模板/反应体系，浓度为4×10⁹-4×10⁰竞争模板/反应体系，取4×10⁷-4×10⁰竞争模板/反应体系进行灵敏度检测，每个反应取不同浓度竞争模板0.5μL，分别为4×10⁰-4×10⁷竞争模板/反应体系。

2、竞争定量PCR反应

将病毒目标基因测定浓度后也进行同样浓度的稀释，PCR反应体系中加入相同浓度的竞争模板和目标基因，分别进行QC-PCR，PCR反应条件：98℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s, 30个循环；再72℃延伸10min，4℃终止反应。扩增产物凝胶电泳检测，检测结果见图5，从图中看出，本发明的检测试剂盒的最低检测限为4×10²个目标基因，灵敏度非常高，只比应用探针的realtime PCR方法少一个数量级，完全可以满足检测需要，并且两模板在浓度相同的情况下均可实现等量扩增。

<110>山东省农业科学院畜牧兽医研究所

<120> QC-PCR检测禽坦布苏病毒竞争模板的扩增引物、制备方法和禽坦布苏病毒检测试剂盒

<160>3

<210>1

<211>22

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

 <400>1

ATGACTGACACNACTCCNTTTG 22

<210>2

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

 <400>2

CCNARCCACATRWACCATTYTCHCTYTTBCCCATCATGTT 40

<210>3

<211>17

<212>DNA

<213>人工合成

 

<220>

<223>

 

 <400>3

CCNARCCACATRWACCA 17

Claims (7)

1.一种QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的扩增引物，其特征是核苷酸序列如下：

引物1：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，

引物2：5’-CCNARCCACATRWACCATTYTCHCTYTTBCCCATCATGTT-3’。

2.一种QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板的制备方法，其特征是包括以下步骤：

（1）提取禽坦布苏病毒RNA，进行反转录得到禽坦布苏病毒的cDNA一链；

（2）进行PCR扩增，扩增体系中含有步骤（1）得到的cDNA一链、引物1和引物2，胶回收得到QC-PCR检测禽坦布苏病毒的竞争模板；

引物1核苷酸序列：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，

引物2核苷酸序列：5’-CCNARCCACATRWACCATTYTCHCTYTTBCCCATCATGTT-3’。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述PCR扩增体系组成：10×Ex Taq buffer 2.5μL，2.5mM的dNTP2μL，引物1和引物2各0.5μL，Ex Taq 酶0.5μL，cDNA一链0.5μL, ddH₂O补足25μL；

引物1和引物2的浓度各为100pmol/μL；

cDNA一链浓度为2.5ng/μL；

Taq 酶浓度为5U/μL。

4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其特征在于所述PCR扩增反应条件：98℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s, 30个循环；再72℃延伸10min，4℃终止反应。

5.一种禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征是含有8个子PCR扩增体系，每个PCR扩增体系组成为：10×Ex Taq buffer 2.5μL，2.5mM 的dNTP 2μL，引物1和引物3各0.5μL，Ex Taq 酶0.5μL，竞争模板0.5μL，ddH₂O补足24.5μL；

引物1核苷酸序列：5’-ATGACTGACACNACTCCNTTTG-3’，

引物3核苷酸序列：5’-CCNARCCACATRWACCA-3’； 

引物1和引物3的浓度各为100pmol/μL；

8个子PCR扩增体系竞争模板的浓度，自4×10⁹-4×10²竞争模板/扩增体系以10倍的浓度梯度设置；

Taq 酶浓度为5U/μL。

6.根据权利要求5所述的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征是使用时向PCR扩增体系中加入待检样品病毒cDNA 0.5μL。

7.根据权利要求6所述的禽坦布苏病毒检测试剂盒，其特征是PCR反应条件为：98℃预变性5min；94℃变性30s，47℃退火30s，72℃延伸40s, 30个循环；再72℃延伸10min，4℃终止反应。

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