CN117887648A - 表达h9n2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其应用 - Google Patents

表达h9n2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN117887648A
CN117887648A CN202410081533.0A CN202410081533A CN117887648A CN 117887648 A CN117887648 A CN 117887648A CN 202410081533 A CN202410081533 A CN 202410081533A CN 117887648 A CN117887648 A CN 117887648A
Authority
CN
China
Prior art keywords
recombinant
recombinant lactobacillus
avian influenza
lactobacillus
influenza virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202410081533.0A
Other languages
English (en)
Inventor
单宝龙
郭杨丽
亓秀晔
王春凤
刘乃芝
单嘉劲
邵庆武
张臻
孙永林
谷巍
翟延庆
王红
高绪娜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Original Assignee
Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd filed Critical Shandong Boly Lely Bioengineering Co ltd
Priority to CN202410081533.0A priority Critical patent/CN117887648A/zh
Publication of CN117887648A publication Critical patent/CN117887648A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A61P31/16—Antivirals for RNA viruses for influenza or rhinoviruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
    • C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
    • C12N2760/16134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明公开了一种表达H9N2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其应用，属于生物药品制造技术领域。本发明的重组乳酸菌组合物包括：表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组乳酸菌H9‑HA和表达H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白、M1蛋白的重组乳酸菌H9‑NP‑M1；所述重组乳酸菌组合物中，重组乳酸菌H9‑HA和重组乳酸菌H9‑NP‑M1的活菌数均大于或等于1010CFU/g。本发明的重组乳酸菌组合物，能够有效缓解机体免疫抑制，提高了传统灭活疫苗的作用效果，降低了感染H9N2亚型禽流感病毒后机体内的病毒载量，在禽流感防治方面具有较好的应用前景。

Description

表达H9N2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其 应用
技术领域
本发明涉及生物药品制造技术领域，具体涉及一种表达H9N2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其应用。
背景技术
禽流感(Avian Influenza，AI)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种家禽高度接触性的呼吸道疾病，该病发病急、传播快、流行范围广，给我国养殖业造成了巨大的损失。根据血凝素(Hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase，NA)的抗原特性的不同，禽流感病毒(Avian Influenza virus，AIV)分为许多亚型，包括18种HA亚型(H1～H18)以及11种NA亚型(N1～N11)。其中H9N2 AIV在全世界各类型的家禽中流行，并且能够感染哺乳动物甚至人类。H9N2 AIV HA蛋白的裂解位点仅有1个或者2个不连续的碱性氨基酸，是一种低致病性的禽流感病毒，H9N2 AIV感染只能引起鸡的轻微呼吸道症状。但是，H9N2 AIV感染能够导致大肠杆菌、鸡毒支原体和鸡传染性支气管炎病毒等病原的继发感染，从而引起明显的鸡呼吸道症状或者死亡。
病禽和带毒禽是禽流感疾病主要传染源，其次是康复禽。病毒可通过病禽和带毒禽的呼吸道、消化道的分泌物及排泄物进行传播。病禽和带毒禽的笼具、料槽、水槽等也可以做为传染源，昆虫及各种携带病毒的野生鸟类等均可成为AIV携带者。AIV最普遍的传播方式是水平传播，最主要的传播途径是易感动物群内通过呼吸道进行传播，且病禽的粪便也带有病毒，也可以污染到正常禽类。禽类主要病症在呼吸道、生殖系统及消化道的变化。
目前在实践中，疫苗免疫接种是防止禽流感暴发所应用最主要的方法。但是禽流感病毒变异性强，所以导致目前血清型众多，在这种情况下就会给疫苗的研制增加困难，现存的灭活疫苗免疫空白期长而且只能刺激体液免疫，不能刺激细胞免疫和黏膜免疫反应，因此不能有效地抑制禽流感病毒在鸡群中的复制和传播，有研究报道，通过给鸡群免疫灭活疫苗后，即使体内HI抗体滴度高达210-12，动物仍然存在传毒带毒问题。另外，用于控制家禽中AIV流行病所进行的广泛的疫苗接种有利于季节性疫苗毒株漂移为抗原多样性的病毒，这可能降低疫苗效力并导致疫苗接种失败。相比而言，黏膜疫苗会引起更好的局部免疫反应。鉴于AIV的感染和扩散发生在黏膜表面，通过黏膜途径施用疫苗可以诱导黏膜免疫来提供抵御病毒感染的第一道防线。黏膜免疫诱导产生的抗体的作用更广泛，与血清IgG抗体相比，sIgA抗体具有更强的防护流感病毒变异株感染的作用。
近年来，随着动物医学和分子生物学技术的发展，乳酸菌作为黏膜表面抗原递呈载体在防控细菌、病毒、寄生虫等领域得到了广泛应用。乳酸菌安全、无内毒素且表达的外源蛋白无需纯化可直接连同菌体一起口服使用，操作方便，对动物应激更小，避免了肌肉注射导致的血源传播，降低了疾病传播风险。相较于注射性疫苗，经口服免疫后局部黏膜免疫水平的提升为机体筑起应对病原体的第一道“防火墙”，同时，具有阻断病原体进一步传播和扩散的潜力。
吉林农业大学杨文涛构建了基于禽流感病毒NP、M1和树突状细胞诱导肽基因的重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep，它能诱导小鼠产生特异性T细胞免疫反应和黏膜免疫反应，能对同型鼠适应性禽流感病毒和异源流感病毒产生部分保护作用。吉林农业大学石少华以植物乳杆菌作为递呈抗原的活菌载体，以禽流感病毒主要免疫保护性抗原HA蛋白的基因片段为靶基因，并融合36bp大小的树突状细胞诱导肽(Dcpep)，构建了表达HA-DC的重组植物乳杆菌表达系统，其具有较好的免疫原性，能诱导良好的黏膜免疫反应和全身免疫反应。
上述研究为禽流感病毒口服重组乳酸菌活载体疫苗的开发奠定了基础，但是，H9N2AIV感染还可以诱发鸡的免疫抑制，导致鸡群的疫苗免疫失败。目前还很少见有关于缓解机体免疫抑制的报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种表达H9N2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其应用。本发明将表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组乳酸菌H9-HA和表达H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白、M1蛋白的重组乳酸菌H9-NP-M1组合使用，能够有效缓解机体免疫抑制，提高了传统灭活疫苗的作用效果，降低了感染H9N2亚型禽流感病毒后机体内的病毒载量，在禽流感防治方面具有较好的应用前景。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
本发明的第一方面，提供一种表达H9N2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物，包括：重组乳酸菌H9-HA和重组乳酸菌H9-NP-M1；
所述重组乳酸菌H9-HA表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白；所述重组乳酸菌H9-NP-M1表达H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白和M1蛋白。
所述重组乳酸菌组合物中，重组乳酸菌H9-HA和重组乳酸菌H9-NP-M1的活菌数均大于或等于1010CFU/g。
优选的，所述重组乳酸菌组合物中，重组乳酸菌H9-HA和重组乳酸菌H9-NP-M1的活菌数比例为1:1。
本发明的第二方面，提供上述重组乳酸菌组合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)重组乳酸菌H9-HA发酵液的制备：
将重组乳酸菌H9-HA接种到MRS液体培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为25-35℃，接种4h后加入诱导剂，继续培养6-10h，制备得到重组乳酸菌H9-HA发酵液；
(2)重组乳酸菌H9-NP-M1发酵液的制备：
将重组乳酸菌H9-NP-M1接种到MRS液体培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为25-35℃，接种4h后加入诱导剂，继续培养6-10h，制备得到重组乳酸菌H9-NP-M1发酵液；
(3)重组乳酸菌组合物的制备：
将重组乳酸菌H9-HA发酵液和重组乳酸菌H9-NP-M1发酵液分别离心，收集菌体沉淀，将菌体沉淀与冻干保护剂混合，真空冷冻干燥，分别得到重组乳酸菌H9-HA菌粉和重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉；将重组乳酸菌H9-HA菌粉和重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉复配，制备得到重组乳酸菌组合物。
优选的，步骤(1)和步骤(2)中，所加入的诱导剂为清酒乳杆菌素，诱导剂加入后的终浓度为100ng/mL。
优选的，步骤(3)中，所述冻干保护剂由以下质量份的原料组成：
脱脂奶粉22.5份、蔗糖9份、甘油1份、水67.5份。
优选的，步骤(3)中，所述菌体沉淀与冻干保护剂按质量比1:1混合，真空冷冻干燥48h。
优选的，步骤(3)中，重组乳酸菌H9-HA菌粉和重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉中的活菌数均大于或等于1011CFU/g。
优选的，步骤(3)中，根据重组乳酸菌H9-HA菌粉和重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉的活菌数，分别称取重组乳酸菌H9-HA菌粉和重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉进行复配，使得复配后的重组乳酸菌组合物中，重组乳酸菌H9-HA和重组乳酸菌H9-NP-M1的活菌数均为1×1010CFU/g。
本发明的第三方面，提供上述重组乳酸菌组合物在如下(1)-(3)至少一项中的应用：
(1)制备缓解机体免疫抑制的微生态制剂；
(2)制备增强禽流感病毒疫苗作用效果的促进剂；
(3)制备降低感染禽流感病毒后机体内病毒载量的药物。
上述应用中，所述机体免疫抑制是由H9N2 AIV感染引起，或因环磷酰胺免疫抑制剂引起。
上述应用中，所述禽流感病毒为H9N2亚型禽流感病毒。
本发明的第四方面，提供一种禽流感免疫微生态制剂，所述禽流感免疫微生态制剂是以上述的重组乳酸菌组合物为活性成分。
进一步的，所述禽流感免疫微生态制剂还包括辅料，所述辅料选自葡萄糖、乳糖、果糖、海藻酸钠、麦芽糊精中的一种或多种。
进一步的，所述禽流感免疫微生态制剂可以根据使用及贮存的要求，制备成不同的剂型，例如：液体制剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂等。
本发明的有益效果：
(1)针对H9N2 AIV感染诱发鸡的免疫抑制而导致鸡群疫苗免疫失败的问题，本发明将表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组乳酸菌H9-HA和表达H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白、M1蛋白的重组乳酸菌H9-NP-M1组合使用，其组合后能显著缓解机体的免疫抑制，与单一重组乳酸菌相比，在降低因免疫抑制引起的死亡率提高方面具有协同增效作用；而且，将重组乳酸菌H9-HA和重组乳酸菌H9-NP-M1组合后，还能协同提高H9亚型禽流感抗体水平和黏膜抗体sIgA水平。
(2)与传统灭活疫苗共同使用，本发明的重组乳酸菌组合物还能够提高传统禽流感灭活疫苗的免疫效果。
(3)本发明的重组乳酸菌组合物还能够降低感染H9N2亚型禽流感病毒后机体内病毒载量，在H9N2亚型禽流感病毒预防和治疗方面具有较好的应用前景。
附图说明
图1：试验例1中肠黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量；*代表P值＜0.05；**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001；
图2：试验例3中肠道黏膜中sIgA含量；*代表P值＜0.05；**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001；
图3：荧光定量RT-PCR标准曲线；
图4：荧光定量PCR检测各组泄殖腔棉拭子中病毒拷贝数；*代表P值＜0.05；**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001；
具体实施方式：
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或者按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可通过商业途径获得。其中：
表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白的重组乳酸菌H9-HA是参照“树突状细胞介导重组HA-DC乳酸菌对H9N2型禽流感保护作用研究”(吉林农业大学硕士学位论文，石少华，2013年)第二篇中第一章表达HA-DC重组乳酸菌的构建记载的方法进行构建的，本发明中的重组乳酸菌H9-HA即对应于该硕士论文中构建的表达HA-DC的重组乳酸菌。
表达H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白和M1蛋白的重组乳酸菌H9-NP-M1是参照“靶向树突状细胞通用型禽流感病毒重组乳酸菌的研究”(吉林农业大学博士学位论文，杨文涛，2015年)第二篇中第一章表达NP-M1-Dcpep重组乳酸菌的构建及验证记载的方法进行构建的，本发明中的重组乳酸菌H9-NP-M1即对应于该博士论文中构建的重组乳酸菌NC8-pSIP409-NP-M1-DCpep。
实施例1：表达H9N2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌发酵工艺研究
1、试验材料
菌株：重组乳酸菌H9-HA、重组乳酸菌H9-NP-M1。
培养基：
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨10g/L、牛肉膏10g/L、酵母膏5g/L、硫酸镁0.5g/L、硫酸锰0.2g/L、柠檬酸铵2g/L、乙酸钠5g/L、吐温-80 1mL/L，pH值6.0±0.05，121℃灭菌20min。
清酒乳杆菌素，购自吉尔生化(上海)有限公司。
2、试验方法
(1)一级种子液制备：分别将重组乳酸菌H9-HA、重组乳酸菌H9-NP-M1甘油管保存液0.5mL接种于100mL MRS液体培养基中，30℃恒温培养过夜后，按3％(体积比)接种量转接至新鲜灭菌的100mL MRS液体培养基，30℃静置培养过夜，分别制得一级种子液。
(2)二级种子液制备：分别将一级种子液按3％(体积比)的接种量接种到3LMRS液体培养基中进行扩大培养，温度为30℃，过夜培养，得二级种子液。
(3)种子罐活化：将3L二级种子液接种到100L种子罐(装液量MRS液体培养基60L)，厌氧条件下，30℃活化10-12h，得到种子罐发酵液；
(4)大罐发酵工艺：将活化后的种子罐发酵液60L转接到500L发酵大罐(装液量MRS液体培养基400L)，厌氧条件下，30℃培养4h，然后加入清酒乳杆菌素，进行诱导培养，清酒乳杆菌素加入后的终浓度为100ng/mL，待发酵液pH降至4.0以下(或者pH值不持续降低)则发酵结束，总发酵时间一般控制在10-12h左右。在发酵过程中每隔2h进行取样检测，检测并记录发酵液的OD600、pH值和活菌数。
3、试验结果
(1)重组乳酸菌H9-HA的发酵效果
重组乳酸菌H9-HA的发酵数据见表1。
表1重组乳酸菌H9-HA发酵数据
由表1可以看出，重组乳酸菌H9-HA稳定期活菌数最高5.2×109CFU/mL。
(2)重组乳酸菌H9-NP-M1的发酵效果
重组乳酸菌H9-NP-M1的发酵数据见表2。
表2重组乳酸菌H9-NP-M1发酵数据
由表2可以看出，重组乳酸菌H9-NP-M1发酵过程中稳定期活菌数最高达7.1×109CFU/mL。
实施例2：表达H9N2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物的制备
(1)重组乳酸菌H9-HA发酵液的制备：
将重组乳酸菌H9-HA依次进行一级种子液制备、二级种子液制备和种子罐活化，操作同实施例1；将活化后的重组乳酸菌H9-HA种子液接种到MRS液体培养基中进行发酵培养，接种量为MRS液体培养基体积的15％，发酵培养的温度为30℃，接种4h后加入诱导剂清酒乳杆菌素，诱导剂加入后的终浓度为100ng/mL，继续培养6h，制备得到重组乳酸菌H9-HA发酵液。
(2)重组乳酸菌H9-NP-M1发酵液的制备：
将重组乳酸菌H9-NP-M1依次进行一级种子液制备、二级种子液制备和种子罐活化，操作同实施例1；将活化后的重组乳酸菌H9-NP-M1种子液接种到MRS液体培养基中进行发酵培养，接种量为MRS液体培养基体积的15％，发酵培养的温度为30℃，接种4h后加入诱导剂清酒乳杆菌素，诱导剂加入后的终浓度为100ng/mL，继续培养6h，制备得到重组乳酸菌H9-NP-M1发酵液。
(3)重组乳酸菌H9-HA菌粉的制备：
将重组乳酸菌H9-HA发酵液离心，收集菌体沉淀，将菌体沉淀与冻干保护剂按质量比1:1混合，其中，冻干保护剂是由以下质量份的原料组成：
脱脂奶粉22.5份、蔗糖9份、甘油1份、水67.5份。
然后再利用常规真空冷冻干燥技术冷冻干燥48h，得到重组乳酸菌H9-HA菌粉；重组乳酸菌H9-HA菌粉的活菌数不小于1×1011CFU/g。
(4)重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉的制备：
将重组乳酸菌H9-NP-M1发酵液离心，收集菌体沉淀，将菌体沉淀与冻干保护剂按质量比1:1混合，其中，冻干保护剂是由以下质量份的原料组成：
脱脂奶粉22.5份、蔗糖9份、甘油1份、水67.5份。
然后再利用常规真空冷冻干燥技术冷冻干燥48h，得到重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉；重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉的活菌数不小于1×1011CFU/g。
(5)重组乳酸菌组合物的制备：
根据重组乳酸菌H9-HA菌粉和重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉的活菌数，分别称取适量的菌粉进行复配，使得复配后菌粉中，重组乳酸菌H9-HA和重组乳酸菌H9-NP-M1的活菌数均为1×1010CFU/g。
试验例1：环磷酰胺免疫抑制模型建立及机体免疫抑制效果考察
1、试验材料
环磷酰胺免疫抑制剂：购自上海源叶生物科技有限公司，型号S30563-5G。
重组新城疫病毒、禽流感病毒(H9亚型)二联灭活疫苗(简称“新流二联灭活疫苗”)，购自青岛易邦生物工程有限公司。
试验动物：1日龄AA白羽肉鸡，20日龄以下饲喂肉鸡饲料510，21日龄之后饲喂肉鸡饲料511，肉鸡饲料510和肉鸡饲料511均购自山农农牧(泰安)有限公司，不含抗生素。
2、试验方法
1日龄雏鸡320只，随机分成4组，分别为：正常对照组、灭活疫苗组、低剂量免疫抑制组、高剂量免疫抑制组；每组设2个平行，每个平行40只，平行1进行临床症状(死亡率)监测、HI抗体和细胞因子测定；平行2用于测定免疫器官指数和sIgA。具体按照表3对各组进行处理。
表3试验分组与设计
监测指标：
(1)临床症状：每日观察记录临床症状及动物死亡情况；
(2)HI抗体:于7、14、21、28、35和42日龄，每组平行1随机选取10只鸡，翅下静脉采血1mL，4500rpm 10min分离血清，进行血凝抑制(HI)抗体的测定。
(3)细胞因子测定：于7、14、21、28、35和42日龄，每组平行1随机选取10只鸡，翅下静脉采血1mL，4500rpm 10min分离血清，利用鸡白介素10(IL-10)ELISA检测试剂盒测定血清中IL-10水平；
(4)免疫器官指数测定：于14、28和42日龄，每组平行2随机选取4只鸡安乐死，取脾脏和法氏囊称重，计算免疫器官指数；
(5)分泌型免疫球蛋白A(sIgA)测定:于14、28和42日龄，每组平行2随机选取4只鸡安乐死(选取的样本同免疫器官指数测定)，选取空肠肠段，获取肠黏膜，利用鸡分泌型免疫球蛋白sIgA ELISA检测试剂盒检测肠黏膜sIgA水平。(方法：移出约20cm左右长的空肠肠段，用60mL的0.9％生理盐水冲洗4次，无菌条件下剪开肠段，用吸水纸轻轻地吸取残留的食糜和粪液，用刀片轻轻地刮取肠黏液于10mL离心管中，加入2倍体积的0.9％生理盐水，低温下充分震荡混匀30min，12000rpm、4℃离心20min后所获全部上清液，-20℃冻存备用。
3、试验结果
(1)临床症状
通过观察临床症状发现，低剂量免疫抑制组和高剂量免疫抑制组在注射环磷酰胺后，均出现鸡生长缓慢，雏鸡的兴奋性降低、食欲下降、体重下降、羽毛零乱、精神萎靡、个别弱小、出现死亡等症状。
(2)死亡率
死亡率的统计结果见表4，高剂量免疫抑制组的死亡率高于低剂量免疫抑制组，且两者均显著高于灭活疫苗组和正常对照组。
表4死亡率统计结果
(3)HI抗体
HI抗体监测结果见表5。
表5不同日龄各组H9亚型禽流感HI抗体水平(Log2)
注：**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001；
由表5可知：随着体内母源抗体不断降低，正常对照组抗体呈不断下降的趋势，在28-42日龄时均显著低于灭活疫苗组；灭活疫苗组在7日龄注射灭活疫苗后，21日龄后，抗体开始呈现逐渐上升的趋势；与灭活疫苗组相比，免疫抑制组因环磷酰胺抑制剂的注射，导致疫苗抗体水平在21日龄之后均显著低于灭活疫苗组，且高剂量免疫抑制组比低剂量免疫抑制组抗体水平偏低。
(4)免疫器官指数
免疫器官指数＝各免疫器官重(g)/活体重(g)×100。免疫器官监测结果见表6-7。
表6脾脏指数
注：*代表P值＜0.05；**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001
由表6可以看出：与灭活疫苗组相比，14和28日龄时，环磷酰胺显著降低鸡脾脏指数，抑制作用与环磷酰胺剂量呈正相关。42日龄时，抑制作用减弱，只有高剂量免疫抑制组与灭活疫苗组的脾脏指数存在统计学差异。
表7法氏囊指数
注：**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001
由表7可以看出：与灭活疫苗组相比，14和28日龄时，环磷酰胺可显著降低法氏囊指数，42日龄免疫抑制作用减弱。与文献报道一致，环磷酰胺能使鸡的法氏囊皮质变薄，皮质内淋巴细胞减少，上皮分界不清，小结内和黏膜层可见坏死空泡。环磷酰胺对有丝分裂期母细胞的抑制作用严重，而法氏囊是鸡的中枢免疫器官，是B细胞分化成熟的场所，故环磷酰胺对法氏囊有较强的损伤作用。
(5)血清IL-10水平
血清IL-10监测结果见表8。
表8环磷酰胺对血清中IL-10的影响(ng/L)
注：*代表P值＜0.05，***代表P值＜0.001
由表8可知，14日龄时，高剂量免疫抑制组血清中IL-10的含量显著低于灭活疫苗组；21日龄和28日龄时，灭活疫苗组与正常对照组相比，IL-10的含量显著升高，但低剂量免疫抑制组和高剂量免疫抑制组与灭活疫苗组相比，IL-10含量显著降低，说明环磷酰胺免疫抑制剂的使用抑制了免疫灭活疫苗后引起的机体的免疫反应，且高剂量免疫抑制组效果更明显。
(6)分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平
空肠肠黏膜中sIgA的监测结果见表9和图1。
表9分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平(ng/mL)
注：*代表P值＜0.05；***代表P值＜0.001
由表9和图1结果可知：14日龄时，高剂量免疫抑制组的sIgA水平与灭活疫苗组之间存在统计学差异，28和42日龄时，低剂量组和高剂量组的sIgA水平均显著低于灭活疫苗组，说明环磷酰胺抑制机体免疫功能后，空肠肠黏膜中sIgA水平也显著降低。
综上得出结果：注射环磷酰胺会抑制试验动物的生长并引起死亡，影响免疫器官的生长发育，抑制机体免疫反应，在免疫灭活疫苗后抑制了IL-10及黏膜中分泌型免疫球蛋白A(sIgA)的产生，表明环磷酰胺免疫抑制模型造模成功，且低剂量(80mg/kg鸡重)即可引起明显免疫抑制，因此后续选择80mg/kg进行试验。
试验例2：重组乳酸菌组合物缓解机体免疫抑制试验
1、试验材料
药物：
重组乳酸菌H9-HA菌粉：将本发明实施例2制备的重组乳酸菌H9-HA菌粉，用载体葡萄糖进行稀释活菌数至1×1010CFU/g，得到重组乳酸菌H9-HA菌粉，用无菌水配成溶液，按表10的剂量进行灌胃。
重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉：将本发明实施例2制备的重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉，用载体葡萄糖进行稀释活菌数至1×1010CFU/g，得到重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉，用无菌水配成溶液，按表10的剂量进行灌胃。
重组乳酸菌组合物：将本发明实施例2制备的重组乳酸菌组合物，用无菌水配成溶液，按表10的剂量进行灌胃。
对实施例2制备的重组乳酸菌组合物、重组乳酸菌H9-HA菌粉和重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉中的活菌数进行测定的方法为：称取1g菌粉加入99mL无菌生理盐水震荡30min后，取1毫升稀释梯度计细菌活菌数。
环磷酰胺免疫抑制剂：购自上海源叶生物科技有限公司，型号S30563-5G。
灭活苗：重组新城疫病毒、禽流感病毒(H9亚型)二联灭活疫苗(简称“新流二联灭活疫苗”)，购自青岛易邦生物工程有限公司。
试验动物：1日龄AA白羽肉鸡，20日龄以下饲喂肉鸡饲料510，21日龄之后饲喂肉鸡饲料511，以上均购自山农农牧(泰安)有限公司，不含抗生素。
2、试验方法
1日龄雏鸡540只，随机分成9组，每组2个平行，每个平行30只，平行1进行死亡率统计、HI抗体和细胞因子监测；平行2用于测定肠黏膜中sIgA含量。试验设计如下：
表10试验分组及处理
注：灭活疫苗的免疫剂量：按说明书皮下注射0.2mL/只。
参照试验例1的方法统计并监测各处理组的死亡率、HI抗体水平、分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平和血清IL-10水平。
3、试验结果
(1)死亡率
各处理组的死亡率统计结果见表11。
表11各组死亡率统计结果
由表11可知，注射环磷酰胺免疫抑制剂的各组出现了鸡只死亡现象，各组比较分析可见，(H9-HA)+(H9-NP-M1)重组乳酸菌组合物在缓解免疫抑制引起的死亡率效果好于单用其中任意一种重组乳酸菌，具有协同增效作用。
(2)HI抗体水平
各处理组的HI抗体水平见表12。
表12各组不同日龄的H9亚型禽流感HI抗体水平(Log 2)
注：***代表P值＜0.001
由表12可知，7日龄接种灭活疫苗后，2组、3组、4组、5组的H9亚型禽流感抗体水平均在21日龄后呈现上升的趋势且3组的抗体水平最高，而6组、7组、8组、9组均因注射环磷酰胺，导致抗体水平均低于灭活疫苗组，说明环磷酰胺抑制了机体的免疫机能，与6组相比，7组、8组、9组的抗体水平有所提升，其中7组的提升效果优于8组和9组，且显著高于6组(28日龄)，说明(H9-HA)+(H9-NP-M1)重组乳酸菌组合物在缓解免疫抑制、提升疫苗抗体水平方面效果好于单用其中任意一种重组乳酸菌。
(3)分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平
各处理组的黏膜抗体sIgA水平见表13。
表13分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量(ng/mL)
注：*代表P值＜0.05；**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001
由表13可知，21和28日龄时，与2组相比，3组中sIgA的含量均显著提高，而4组和5组只在28日龄时sIgA水平显著提升，说明(H9-HA)+(H9-NP-M1)重组乳酸菌组合物能显著提升黏膜免疫水平，效果好于单用其中任意一种重组乳酸菌。与6组相比，21、28、35日龄时，7组中sIgA的水平均显著提高，说明在免疫抑制情况下，(H9-HA)+(H9-NP-M1)重组乳酸菌组合物能显著提升黏膜免疫水平。
(4)血清IL-10水平
各处理组的血清IL-10水平见表14。
表14各组血清IL-10水平(ng/L)
注：*代表P值＜0.05；**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001
由表14可知，14、21和28日龄时，3组中IL-10的含量显著高于2组，且对IL-10含量的提升效果优于4组和5组，说明(H9-HA)+(H9-NP-M1)重组乳酸菌组合物能显著提升细胞因子IL-10水平。21和28日龄时，7组与6组相比，IL-10水平显著升高，而8组和9组与6组相比，数值上有提升但没有显著性差异，说明在免疫抑制的情况下，(H9-HA)+(H9-NP-M1)重组乳酸菌组合物能促进IL-10的分泌。
试验例3：重组乳酸菌组合物对传统灭活疫苗免疫效果的影响
1、试验材料
药物：将本发明实施例2制备的重组乳酸菌组合物用无菌水配成溶液，按表15的剂量进行灌胃。
灭活苗：重组新城疫病毒、禽流感病毒(H9亚型)二联灭活疫苗(简称“新流二联灭活疫苗”)，购自青岛易邦生物工程有限公司。
试验动物：1日龄AA白羽肉鸡，20日龄以下饲喂肉鸡饲料510，21日龄之后饲喂肉鸡饲料511，以上均购自山农农牧(泰安)有限公司，不含抗生素。
2、试验方法
180只试验动物随机分成6组，每组30只。包括正常对照组、灭活疫苗组、试验1组、试验2组、试验3组、试验4组，按照表15对各组进行处理，重组乳酸菌组合物的使用剂量为5亿CFU/只/天，灭活疫苗为皮下注射0.2mL/只。
表15试验分组及处理
参照试验例1的方法统计并监测各试验组在不同时间的HI抗体水平和黏膜抗体sIgA水平。
3、试验结果
(1)H9亚型禽流感抗体
通过血凝抑制试验检测各处理组在不同时间点H9亚型禽流感抗体水平，结果如表16所示。
表16各组不同日龄的H9亚型禽流感HI抗体水平(Log2)
由表16可知，21日龄后，试验1组和试验3组均高于灭活疫苗组，试验1组稍高于试验3组，试验1组比灭活疫苗组最高可提高1.5个滴度(42日龄时)；21日龄后，试验2组和试验4组的抗体水平均略优于正常对照组。说明重组乳酸菌组合物与灭活疫苗联合使用，或单独使用重组乳酸菌组合物，均能提高H9亚型禽流感抗体水平。
(2)分泌型免疫球蛋白A(sIgA)水平
黏膜抗体sIgA水平的测定结果见表17和图2。
表17各组不同日龄肠道黏膜分泌型免疫球蛋白A(sIgA)含量(ng/mL)
注：**代表P值＜0.01；***代表P值＜0.001
由表17和图2可知，18日龄和25日龄时，试验1组和试验3组与灭活疫苗组相比，肠道黏膜中sIgA的含量均显著升高(p＜0.001)。18日龄时，与灭活疫苗组相比，试验1组sIgA含量提高24.4％，试验3组sIgA含量提高24.0％；25日龄时，试验1和试验3组sIgA含量分别比灭活疫苗组提高28.6％、25.8％；同样，18日龄和25日龄时，试验2组和试验4组与正常对照组相比，肠道黏膜中sIgA的含量均显著升高。以上结果表明，重组乳酸菌组合物的使用促进了黏膜免疫反应，增加sIgA的分泌量。
试验例4：重组乳酸菌组合物对感染H9N2亚型禽流感病毒后机体内病毒载量的影响
1、试验材料
药物:本发明实施例2制备的重组乳酸菌组合物；将实施例2制备的重组乳酸菌组合物用无菌水配成溶液，按H9-HA、H9-NP-M1，各2.5亿CFU/只/天的剂量进行灌胃。
灭活苗：重组新城疫病毒、禽流感病毒(H9亚型)二联灭活疫苗(简称“新流二联灭活疫苗”)，购自青岛易邦生物工程有限公司。
试验动物：1日龄AA白羽肉鸡，20日龄以下饲喂肉鸡饲料510，21日龄之后饲喂肉鸡饲料511，以上均购自山农农牧(泰安)有限公司，不含抗生素。
2、试验方法
175只肉鸡随机分为7组，每组25只。18日龄时，除正常对照组，其余各组滴鼻H9N2亚型禽流感病毒(EID50＝10-7/0.2mL)，并肌肉注射大肠杆菌处理，大肠杆菌活菌数为106CFU/mL，所有组的攻毒剂量分别为每种病原微生物各1mL，试验分组及处理情况见表18。攻毒后继续观察2周，期间记录鸡只死亡数并统计死亡率。攻毒后2、4、6天各组随机取5只鸡，采用泄殖腔棉拭子取病毒进行病毒载量定量检测。
表18试验分组及处理
3、试验结果
(1)死亡率
各组的死亡率统计结果见表19。
表19各组死亡率统计结果(攻毒两周内)
由表19可知，攻毒组死亡率为40％，灭活疫苗组死亡率为28％，较攻毒对照组死亡率降低12％，试验1组和试验3组的死亡率分别为20％、24％，死亡率较攻毒对照组降低20％、16％；而试验2组和试验4组的死亡率较攻毒对照组分别降低8％、4％。说明重组乳酸菌组合物无论是单独使用还是与灭活疫苗联合使用，均可以降低因禽流感病毒感染造成的死亡率。
(2)泄殖腔棉拭子中H9N2亚型禽流感病毒载量
采用荧光定量PCR对泄殖腔棉拭子中H9N2亚型禽流感病毒载量进行定量测定，首先建立荧光定量RT-PCR标准曲线。标准曲线方程为Y＝-3.682X+46.396，线性关系良好，相关系数(R2)为0.999(图3)。标准曲线的相关系数r2、斜率K值均符合理论要求，重组质粒的拷贝数与CT值线性关系良好，可以作为荧光绝对定量的依据。熔解曲线峰值单一，没有引物二聚体和非特异性扩增产物，证明引物可以特异性扩增出目的基因。其扩增曲线符合标准“S”形，拐点清楚，曲线平行性整体良好，基线平而且没有明显上扬趋势。
荧光定量PCR检测各组泄殖腔棉拭子中病毒拷贝数结果见表20和图4。
表20各组泄殖腔棉拭子中H9N2亚型禽流感病毒载量(拷贝数)
注：*代表P值＜0.05；**代表P值＜0.01
由表20可知，灭活疫苗组与攻毒对照组相比，在攻毒后2天和4天时，禽流感基因拷贝数均显著降低，而试验1组和试验3组与灭活疫苗组相比，在攻毒后2、4、6天，棉拭子中病毒拷贝数均显著降低；试验2组和试验4组与攻毒组相比，棉拭子中病毒拷贝数有下降趋势，表明本发明的重组乳酸菌组合物可降低肠道禽流感病毒载量，与疫苗联合使用效果更佳。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种表达H9N2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物，其特征在于，包括：重组乳酸菌H9-HA和重组乳酸菌H9-NP-M1；
所述重组乳酸菌H9-HA表达H9N2亚型禽流感病毒HA蛋白；所述重组乳酸菌H9-NP-M1表达H9N2亚型禽流感病毒NP蛋白和M1蛋白；
所述重组乳酸菌组合物中，重组乳酸菌H9-HA和重组乳酸菌H9-NP-M1的活菌数均大于或等于1010CFU/g。
2.根据权利要求1所述的重组乳酸菌组合物，其特征在于，所述重组乳酸菌组合物中，重组乳酸菌H9-HA和重组乳酸菌H9-NP-M1的活菌数比例为1:1。
3.权利要求1或2所述的重组乳酸菌组合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)重组乳酸菌H9-HA发酵液的制备：
将重组乳酸菌H9-HA接种到MRS液体培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为25-35℃，接种4h后加入诱导剂，继续培养6-10h，制备得到重组乳酸菌H9-HA发酵液；
(2)重组乳酸菌H9-NP-M1发酵液的制备：
将重组乳酸菌H9-NP-M1接种到MRS液体培养基中进行发酵培养，发酵培养的温度为25-35℃，接种4h后加入诱导剂，继续培养6-10h，制备得到重组乳酸菌H9-NP-M1发酵液；
(3)重组乳酸菌组合物的制备：
将重组乳酸菌H9-HA发酵液和重组乳酸菌H9-NP-M1发酵液分别离心，收集菌体沉淀，将菌体沉淀与冻干保护剂混合，真空冷冻干燥，分别得到重组乳酸菌H9-HA菌粉和重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉；将重组乳酸菌H9-HA菌粉和重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉复配，制备得到重组乳酸菌组合物。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)和步骤(2)中，所加入的诱导剂为清酒乳杆菌素，诱导剂加入后的终浓度为100ng/mL。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，所述冻干保护剂由以下质量份的原料组成：
脱脂奶粉22.5份、蔗糖9份、甘油1份、水67.5份。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，重组乳酸菌H9-HA菌粉和重组乳酸菌H9-NP-M1菌粉中的活菌数均大于或等于1011CFU/g。
7.权利要求1或2所述的重组乳酸菌组合物在如下(1)-(3)至少一项中的应用：
(1)制备缓解机体免疫抑制的微生态制剂；
(2)制备增强禽流感病毒疫苗作用效果的促进剂；
(3)制备降低感染禽流感病毒后机体内病毒载量的药物。
8.一种禽流感免疫微生态制剂，其特征在于，所述禽流感免疫微生态制剂是以权利要求1或2所述的重组乳酸菌组合物为活性成分。
9.根据权利要求8所述的禽流感免疫微生态制剂，其特征在于，所述禽流感免疫微生态制剂还包括辅料，所述辅料选自葡萄糖、乳糖、果糖、海藻酸钠和麦芽糊精中的一种或多种。
10.根据权利要求8所述的禽流感免疫微生态制剂，其特征在于，所述禽流感免疫微生态制剂的剂型为液体制剂、粉剂、颗粒剂或胶囊剂。
CN202410081533.0A 2024-01-19 2024-01-19 表达h9n2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其应用 Pending CN117887648A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410081533.0A CN117887648A (zh) 2024-01-19 2024-01-19 表达h9n2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202410081533.0A CN117887648A (zh) 2024-01-19 2024-01-19 表达h9n2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117887648A true CN117887648A (zh) 2024-04-16

Family

ID=90640733

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202410081533.0A Pending CN117887648A (zh) 2024-01-19 2024-01-19 表达h9n2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN117887648A (zh)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101056976A (zh) * 2004-11-11 2007-10-17 索尔瓦药物有限公司 有缺陷的流感病毒颗粒
WO2007128169A1 (fr) * 2006-05-09 2007-11-15 Zhigao Bu SOUCHE DE FAIBLE VIRULENCE DU VACCIN RECOMBINANT LaSota DE LA MALADIE DE NEWCASTLE EXPRIMANT LA PROTÉINE HA DU VIRUS H5 DE LA GRIPPE AVIAIRE
CN105483149A (zh) * 2015-12-25 2016-04-13 吉林农业大学 广谱型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法
CN105483141A (zh) * 2015-12-25 2016-04-13 吉林农业大学 通用型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101056976A (zh) * 2004-11-11 2007-10-17 索尔瓦药物有限公司 有缺陷的流感病毒颗粒
WO2007128169A1 (fr) * 2006-05-09 2007-11-15 Zhigao Bu SOUCHE DE FAIBLE VIRULENCE DU VACCIN RECOMBINANT LaSota DE LA MALADIE DE NEWCASTLE EXPRIMANT LA PROTÉINE HA DU VIRUS H5 DE LA GRIPPE AVIAIRE
CN105483149A (zh) * 2015-12-25 2016-04-13 吉林农业大学 广谱型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法
CN105483141A (zh) * 2015-12-25 2016-04-13 吉林农业大学 通用型抗禽流感重组乳酸菌及其制备方法

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
杨文涛: "靶向树突状细胞通用型禽流感病毒重组乳酸菌的研究", 《中国博士学位论文全文数据库》, 15 April 2016 (2016-04-15), pages 050 - 27 *
石少华: "树突状细胞介导重组HA-DC乳酸菌对H9N2型禽流感保护作用研究", 《中国优秀硕士学位论文数据库》, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 050 - 107 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101554080B1 (ko) 1b형 소 바이러스성 설사 바이러스 백신 조성물 및 방법
CN105985966B (zh) 基因vii型新城疫病毒株、其疫苗组合物、制备方法及应用
US10143713B2 (en) In ovo delivery of probiotic cultures
CN108066758B (zh) 貉犬瘟热-细小病毒性肠炎二联活疫苗及其制备方法和用途
CN109207436B (zh) 一株i群4型禽腺病毒毒株及其应用
CN111073863B (zh) 猪流行性腹泻、猪德尔塔冠状病毒二联弱毒疫苗及其制备方法
CN105733987A (zh) 一种鸡滑液囊支原体
CN114561366B (zh) 一种山羊库布病毒分离株及其应用
CN111808826B (zh) 猪A型塞内卡病毒SVA/CH-Fuj株及其应用
CN110846284B (zh) 一种犬细小病毒CPV-HuN1703株及其应用
CN110859956B (zh) 一种犬细小病毒灭活疫苗及其制备方法
CN115322972B (zh) 一株h9亚型禽流感病毒分离株及其应用
CN110302374B (zh) 犬用疫苗及其制备方法和应用
CN107537033B (zh) 疫苗组合物、试剂盒及其应用
CN117887648A (zh) 表达h9n2亚型禽流感病毒抗原蛋白的重组乳酸菌组合物及其应用
CN114377127B (zh) 一种三联卵黄抗体制剂及其制备方法和应用
CN100443502C (zh) 一种防治对虾病毒病的卵黄免疫球蛋白及其制备方法和应用
CN107158370B (zh) 貉犬瘟热冻干活疫苗及其制备方法和应用
CN108624522B (zh) 一种副鸡禽杆菌菌株及其应用
CN1384119A (zh) 抗禽类病毒性疫病的复合卵黄抗体及其制备和应用
KR102615970B1 (ko) 소에서 설사병을 유발하는 바이러스에 대한 고도면역혈청, 이를 포함하는 조성물, 이의 제조 방법, 및 이를 이용한 소 바이러스성 설사병의 예방 및 치료 방법
CN114015658B (zh) 一种h9n2亚型禽流感和鸡滑液囊支原体的二联灭活疫苗
CN113832068B (zh) 链球菌菌株及防治猪链球菌病的疫苗
CN115261335B (zh) 一种口服免疫的禽流感灭活疫苗
KR101360112B1 (ko) 공기전파가 가능한 신규한 ｈ９ｎ２형 저병원성 조류인플루엔자 바이러스 균주 및 그로부터 유래된 백신

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination