CN116024244A - 一种融合蛋白基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种融合蛋白基因及其应用，由分泌信号肽基因、猪的CTLA4基因、猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白基因、猪A群轮状病毒抗原性蛋白基因和猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白基因连接而成的融合蛋白基因CTLA4‑PEDVS‑PoRVP6‑SADSVS；再将融合蛋白基因克隆到pDC316载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，与腺病毒骨架载体pBHGlox_1,3cre进行体外重组，转染Hek293细胞，等细胞病变收集细胞，细胞裂解后的上清纯化产物得到重组载体rAd‑CTLA4‑PEDVS‑PoRVP6‑SADSVS；该重组载体仅需要一次注射即能刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答。

Description

一种融合蛋白基因及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种融合蛋白基因及其应用。

背景技术

(1)猪流行性腹泻(Porcine epidemic diarrhea,PED)是由冠状病毒科猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)引起的各年龄段的猪腹泻、呕吐、脱水以及特别对一周龄内的哺乳仔猪高度致死为特征的一种高度接触性肠道传染病。流行性腹泻病毒S基因核苷酸长短不一，其核苷酸长度在4143bp-4161bp之间。多年来，关于PEDV的S基因的分子流行病学数据研究较多，通过研究发现，S基因可用来作为PEDV基因分型的一个依据，可将其分为2个大的基因群，G1基因群和G2基因群，各个亚群均可细分为2个小的遗传分支，即G1-1、G1-2和G2-1、G2-2。研究还发现，G1基因群均存在有碱基缺失或插入现象(以基因插入为主)。G1基因群PEDV毒株既存在大量的氨基酸点突变外，又存在氨基酸插入和缺失现象；但G2基因群PEDV毒株却不存在氨基酸插入现象，以氨基酸点突变为主。G1基因群PEDV毒株氨基酸序列与CV777(G2基因群代表株)的同源性为93.0％-93.8％。由于PEDV只有一个血清型，氨基酸的变异并不会对血清型产生影响，但推测其和疫苗的推荐使用密切相关。对PEDV新流行株的S基因序列分析发现，PEDV流行株S基因已出现缺失(197aa)和插入(4aa)，表明随着疫苗的使用，PEDV基因组进化趋势增强。以S基因绘制PEDV遗传进化树发现PEDV可分为2个明显的分支G1和G2，G1分支主要是CV777、DR13等活疫苗株和PEDV早期分离株，而G2分支均为新PEDV流行株。目前流行性腹泻疫苗主要有活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗等类型；从目前流行性腹泻疫苗所表现出来的免疫效果来看，其中亚单位疫苗和灭活疫苗免疫效果一般，经典的活疫苗已经保护不了变异病毒造成的危害。

(2)猪急性腹泻综合征(swine acute diarrhea syndrome，SADS)是由猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV)引起的一类急性传染病。临床表现主要有感染仔猪急性腹泻、呕吐，5日龄内新生仔猪由于体重骤减和严重脱水而迅速死亡，且死亡率高达90％。通过检测发现猪急性腹泻综合征并不是已知的猪腹泻冠状病毒所引起的，通过将病毒分离培养鉴定后发现这是一种新型的猪肠道冠状病毒，与蝙蝠来源的HKU2核苷酸序列同源性达到90％以上；且至今仍无有效的SADS疫苗和抗病毒药物问世，目前防控该病主要措施就是控制传染源和切断潜在的传播途径。

(3)轮状病毒(Rotavirus，简称RV)属呼肠弧病毒科(Reoviridae)，轮状病毒属，仔猪、耗牛、绵羊、山羊、幼驹、鸡、火鸡及其他禽类均可感染轮状病毒。轮状病毒体的核心为双股RNA，由11个不连续的RNA节段组成；与RV抗原有关的主要结构蛋白有VP4、VP6、VP7，根据内壳结构蛋白VP6抗原性的不同，目前将RV分为A-G七个群，其中最常见的是A群(A群也是主要引起婴幼儿和多种幼龄动物病毒性腹泻的主要病原体)。轮状病毒在世界范围内广泛流行，导致仔猪生长缓慢或死亡率升高，给养猪业造成了巨大的经济损失。而目前对于猪轮状病毒病没有有效的药物，常规治疗方法不佳，疫苗是预防和控制该病的主要措施。然而，猪轮状病毒的分离比较困难，且分离的病毒株病毒滴度较低，不利于后期的培养增殖，造成制备的疫苗组合物免疫效力不高，无法有效对猪轮状病毒病进行有效防控。

发明内容

本发明提供了一种融合蛋白基因，所述融合蛋白基因的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；用于编码该融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

可选的，所述融合蛋白基因由分泌信号肽基因、猪的CTLA4基因、猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白、猪A群轮状病毒抗原性蛋白和猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白连接而成，所述的融合蛋白基因的表达为CTLA4-PEDVS-PoRVP6-SADSVS。

可选的，所述分泌信号肽的基因序列如SEQ ID NO.3所示。

可选的，所述猪的CTLA4的基因序列如SEQ ID NO.4所示。

可选的，所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白为猪流行性腹泻病毒S蛋白片段，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因序列为SEQ ID NO.5，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白片段是所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因序列的第455-890位氨基酸序列。

可选的，所述猪A群轮状病毒抗原性蛋白为猪A群轮状病毒VP6蛋白片段，所述猪A群轮状病毒VP6蛋白的基因序列为SEQ ID NO.6，所述猪A群轮状病毒VP6蛋白片段是所述猪A群轮状病毒VP6蛋白的基因序列的第8-404位氨基酸序列。

可选的，所述猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白为猪急性腹泻综合症病毒S蛋白片段，所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白的基因序列为SEQ ID NO.7，所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白片段是所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白的基因序列的第17-538位氨基酸序列。

一种重组载体，所述重组载体含上述所述的融合蛋白基因，所述重组载体为包含猪的CTLA4基因、猪流行性腹泻病毒基因、猪A群轮状病毒基因以及猪急性腹泻综合症病毒基因的重组5型腺病毒载体。

可选的，所述重组载体为含有上述所述核苷酸序列的腺病毒表达载体pDC316或者pAdv-CAG，该重组载体的表达为rAd-CTLA4-PEDVS-PoRVP6-SADSVS。

一种重组载体的制备方法，包括以下步骤：

1)、将含上述所述核苷酸序列的重组载体克隆到pDC316载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，获得重组穿梭质粒；

2)、重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体pBHGlox_1,3cre进行体外重组，得到重组腺病毒；

3)、包装重组腺病毒后，转染Hek293细胞；

4)、等细胞病变收集细胞，细胞裂解后的上清纯化产物即得。

所述的融合蛋白基因在制备用于预防和治疗猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒和猪急性腹泻综合症病毒的疫苗或者药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一种包含猪流行性腹泻病毒蛋白、猪A群轮状病毒蛋白和猪急性腹泻综合症病毒蛋白的重组腺病毒载体rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS，经试验表明，该重组腺病毒载体rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS仅需要一次注射就能起到一免防三病的效果(该重组腺病毒载体可应用于制备作为预防和治疗猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒和猪急性腹泻综合症病毒的疫苗或者药物，以实现预防和治疗猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒和猪急性腹泻综合症病毒三种病毒的效果)，刺激机体产生特异性的体液免疫和细胞免疫应答，使其实现了一免防三病的效果，且其具有安全性好、免疫效价高、适合于大规模生产的特点。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明实施例中重组载体pDC316-PEDVS-PoRVP6-SADSVS的图谱；

图2是本发明实施例中重组质粒pDC316-PEDVS-PoRVP6-SADSVS和包装质粒pBHGlox(delta)E13Cre的电泳图，其中：1为pDC316-PEDVS-PoRVP6-SADSVS质粒；M为DNAMarker,100,250,500,750,1000,1500,2000,3000,5000；2为pBHGlox(delta)E13Cre的质粒；

图3(a)是本发明实施例中收毒前的正常hek293细胞的形态示意图；

图3(b)是本发明实施例中收毒前的转染质粒细胞的形态示意图；

图4是本发明实施例中收集的正常hek293细胞和转染质粒细胞的WB鉴定结果；其中：3为对照组；4为实验组；

图5是本发明实施例中接种重组腺病毒rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS疫苗后猪体内中和抗体的检测结果曲线示意图，其中：纵坐标为OD值结果；

图6是本发明实施例中接种重组腺病毒rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS疫苗后腹泻病毒接种后肛门拭子病毒载量的检测结果曲线示意图，其中：横坐标为攻毒后天数，纵坐标为的单位为CT值(CT值为40表明没有病毒检出，CT值越高，病毒含量越低；反之CT值越低，病毒含量越高)。

具体实施方式

术语“融合蛋白(fusion protein)”有两种不同的含义，一种是通过DNA重组技术得到的两个基因重组后的表达产物，将两个不同的蛋白质连成一个大分子；另一种可以通过化学方法连接，也可通过基因的融合来实现。

术语“猪”是指任何属于猪科(Suidae)成员的动物，如猪。

本发明涉及一种融合蛋白基因，所述融合蛋白基因的表达为

CTLA4-PEDVS-PoRVP6-SADSVS，由分泌信号肽基因、猪的CTLA4基因、猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白、猪A群轮状病毒抗原性蛋白和猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白连接而成。

作为本发明的进一步实施例，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MGVLLT1RTLLSLVLALLFPSMASMHMKGMHVAQPAVVLANSRGVASFVCE YGSAGKAAEVRVTVLRRAGSQMTEVCAATYTVEDELTFLDDSTCTGTSTENKVNLTILGLRAVDTGLYICKVELLYPPPYYVGMGNGTQIYVIDPEPCPDSDGGGGSGGGGSGGGGSGTSIQRILYCDDPVSQLKCSQVAFDLDDGFYPISSRNLLSHEQPISFVTLPSFNDHSFVNITVSASFGGHSGANLIASDTTINGLSSFCVDTRQFTISLFYNVTNSYGYVSKSQDSNCPFTLQSVNDYLSFSKFCVSTSLLASACTIDLFGYPEFGSGVKFTSLYFQFTKGELITGTPKPLEGVTDVSFMTLDVCTKYTIYGFKGEGIITLTNSSILAGVYYTSDSGQLLAFKNVTSGAVYSVTPCSFSEQAAYVDDDIVGVISSLSSSTFNSTRELPGFFYHSNDGSNCTEPVLVYSNIGVCKSGSIGYVPSQSGQVKIAPMVTGNISIPTNFSMSIRTEYLQLYNTPVSVDCATYVCNGNSRCKQLLTQYTAACKTIESVLQLSARLESVEVNSMLTISEEALQLATISSFNGDGYNFTNVLGVSVYDPASGRVGSGGGSGGGSGSVLYSLSKTLKDARDKIVEGTLYSNVSDLIQQFNQMIVTMNGNDFQTGGIGNLPIRNWTFDFGLLGTTLLNLDANYVENARTTIEYFIDFIDNVCMDEIARESQRNGIAPQSEALRKLSGIKFKRINFDNSSDYIENWNLQNRRQRTGFVFHKPNILPYSASFTLNRSQPAHDNLMGTMWINAGSEIQVAGFDYSCAFNAPANIQQFEHVVPLRRALTTATITLLPDAERFSFPRVINSADGTTTWYFNPVILRPSNVEVEFLLNGQIINTYQARFGTIVARNFDTIRLSFQLVRPPNMTPAVANLFPQAPPFIFHATVGLTLRIESAVCESVLADASETLLANVTSVRQEYAIPVGPVFPPGMNWTELITNYSPSREDNLQRVFTVASIRSMLIKGSGGGSGGGSGSCESVDFNLFNTIFSTHRGLSNTTSVITGAYPSTNKSDWSCNTRTGHLSGSGFGIGLYVQTPREQYQYDGSGAGGYTIAVSPIHVTNLTWELWIHRKWGVNSVVTVRLCRWWQFMSFNSTSHAADAGPTNAFECLINGSYPTHRNTGYMFGVTWYNDLVRIVFPPTVLEMQLDGLQWERVQFNSPVNAGHATRFNVVKDISTVLVETNSGGSVFRYSYCADGFVNGLQCKLRLFDIPPGVYSNSEVEYPTALYTVVHNMSACPERPDSYCGSNSCPFKRAVFSNCIVNYTTWVNPDQRDFQHLILPNGKFNPFTECNGLNRIVDGCVPGFVLRVGRGKAVNRTIVTPYLKPYECFGWSWNDNQDSIYDWWIADFVSTGAFVCESNPEAPKTGVCVTYTVEKVTFQGVLYESNFTFAQYYNLLYVGSQLRYVRILGKVYEVSSCFEASYDVLYRNNQSFGLLYRSFDCNQLHIKSARFVDRLLPSHNGTAHHHHHH

作为本发明的进一步实施例，用于编码该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

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作为本发明的进一步实施例，所述分泌信号肽的基因序列如SEQ ID NO.3所示：

atgggtgtactgctcacacagaggacgctgctcagtctggtccttgcactcctgtttccaagcatggcgagcatgcatatg

作为本发明的进一步实施例，所述猪的CTLA4基因的基因序列如SEQ ID NO.4所示：

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作为本发明的进一步实施例，所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白为猪流行性腹泻病毒S蛋白片段，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白片段是所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因序列的第455-890位氨基酸对应的核苷酸序列。优选的，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因序列为SEQ ID NO.5所示：

ggaacttccattcagcgtattctttattgtgatgatcctgttagccaactcaagtgttctcaggttgcttttgaccttgacgatggtttttaccctatttcttctagaaaccttctgagtcatgaacagccaatttcttttgttactctgccatcatttaatgatcattcttttgttaacattactgtctctgcttcctttggtggtcatagtggtgccaaccttattgcatctgatactaccatcaatgggcttagttctttctgtgttgacactagacaatttaccatttcactgttttataacgttacaaacagttatggttatgtgtctaaatcacaggacagtaattgccctttcaccttgcaatctgttaatgattacctgtcttttagcaaattttgtgtttccaccagccttttggctagtgcctgtaccatagatctttttggttatcctgagtttggtagtggtgttaagtttacgtccctttactttcaattcacaaagggtgagttgattactggcacgcctaaaccacttgaaggtgtcactgacgtttcttttatgactctggatgtgtgcaccaagtatactatctatggctttaaaggtgagggtatcattacccttacaaattctagcattttggcaggtgtttattacacatctgattctggacagttgttagcttttaagaatgtcactagtggtgctgtttattctgtcacgccatgttctttttcagagcaggctgcatatgttgatgatgatatagtgggtgttatttctagtttgtctagctccacttttaacagtactagggagttgcctggtttcttctaccattctaatgatggctctaattgtacagagcctgtgttggtgtatagtaacataggtgtttgtaaatctggcagtattggctacgtcccatctcagtctggccaagtcaaaattgcacccatggttactgggaatatcagtattcccaccaactttagtatgagtattaggacagaatatttacagctttacaacacgcctgttagtgttgattgtgccacatatgtttgtaatggtaactctcgttgtaaacaattactcacccagtacactgcagcatgtaagaccatagaatcagtattacaactcagcgctaggcttgagtctgttgaagttaactctatgctcactatttctgaagaggctctacagttagctaccattagttcgtttaatggtgatggatataattttactaatgtgctgggtgtttctgtgtatgatcctgcaagtggcagggtg

作为本发明的进一步实施例，所述猪A群轮状病毒抗原性蛋白为猪A群轮状病毒VP6蛋白片段，所述猪A群轮状病毒VP6蛋白片段是所述猪A群轮状病毒VP6蛋白的基因序列的第8-404位氨基酸对应的核苷酸序列。优选的，所述猪A群轮状病毒VP6蛋白的基因序列为SEQ ID NO.6所示：

gttctgtactcattgtcaaaaactttgaaggatgctagggacaaaattgttgaaggtacgctatattcaaatgtaagtgatttgattcaacaatttaatcaaatgatagttactatgaatggaaatgattttcaaacaggaggaataggaaatttgccaattaggaattggacctttgattttggattacttggtactactttacttaatctagatgcaaattacgttgagaatgctagaactactattgaatatttcattgattttatagataatgtatgtatggatgaaatagcaagagaatcacaacgaaatggaatagcaccacaatctgaagcactaagaaagctgtcgggtattaaatttaaaagaattaattttgataattcatctgattatattgagaattggaatctacagaataggcggcagcgcactggatttgtatttcataaaccaaacatacttccatactcagcatcattcactctaaatcgatcacagccagctcatgataatttgatgggaactatgtggattaacgccggatcagaaattcaagtagctggatttgattattcatgtgcctttaatgcaccagcaaacattcagcagtttgaacatgttgtaccactaagacgtgctctcacaacagctacaattactctgctaccagatgctgaaagattcagtttcccgagagtaattaactcagccgatggtactaccacatggtacttcaatccagttattctaagaccaagtaacgtagaggttgaatttctattgaatggacaaataattaatacatatcaagcgcgatttggaactatcgtagctagaaattttgatactattcgtttatcattccaattagtacgtccaccaaatatgacaccagcagttgcaaacctatttccgcaagcgccaccatttatatttcatgctacagtcggacttacgttgcgtattgaatctgcagtttgtgaatctgtgcttgcggacgcttcagaaactttgttggcaaatgtgacatcagtacgtcaggagtatgcaataccagtaggaccagtatttccaccaggtatgaattggacggagttaattactaactattcaccttcaagagaagataacttgcaacgtgtatttacagtagcttccattagaagcatgttgattaag

作为本发明的进一步实施例，所述猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白为猪急性腹泻综合症病毒S蛋白片段，所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白片段是所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白的基因序列的第17-538位氨基酸对应的核苷酸序列。优选的，所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白的基因序列为SEQ ID NO.7所示：

tgtgaatccgttgattttaatttgtttaatacaatattttcaacacacagaggtttaagtaataccacctctgttatcactggtgcttacccttccaccaataagtcagactggtcttgtaatacaagaactggtcatttgagtggtagtggtttcggcataggtttgtatgtacagacaccacgtgaacaataccagtatgatggttctggtgcaggcggctatactatagctgtttcgcccattcacgttacgaatttgacttgggagctatggatccaccgtaaatggggtgttaactcagttgttactgttagattatgtaggtggtggcagtttatgagttttaactctactagccatgcagcagatgctggtcctactaatgcatttgagtgtcttataaatggttcctatcctactcatcgtaacactggttatatgtttggtgttacttggtacaatgatttagttagaatagtttttccacctactgttcttgaaatgcagcttgatggtttacagtgggaacgtgtccagtttaatagtcctgttaatgctggacatgctactaggtttaacgtcgttaaggacatttctactgttttggttgaaactaacagtggtggctctgtttttagatattcgtattgtgctgatgggtttgttaacggtctgcaatgtaagcttagactatttgatataccccctggtgtttattctaatagtgaggttgaatatcctacagcactatatactgttgtacacaatatgtcagcctgtccagagaggccagatagctattgtggttctaattcgtgcccttttaagcgtgcagtgttttctaattgtattgttaattatactacctgggttaatccagaccagcgtgattttcaacatttaattttgcctaatggcaagtttaatccatttactgagtgtaatgggttgaacagaattgttgatggttgcgttcctggtttcgttcttagagttggtcgtggtaaggctgttaacagaactattgttacaccttatctcaagccttatgaatgttttgggtggtcatggaatgacaaccaggatagtatttatgactggtggattgctgattttgtctccactggtgctttcgtttgtgagagtaatcccgaagctcctaagactggggtttgtgtgacatacactgtagagaaagttacttttcagggtgtgctgtatgagagtaattttactttcgcacagtattataacctattgtatgtaggttctcaacttaggtatgtgcgtatactcggtaaagtttatgaagtttcatcttgttttgaggcttcatatgacgttttataccgtaacaatcagtcttttgggttgctttatagaagtttcgattgtaatcagcttcatattaaatctgcacgttttgtggaccgtttattaccgtctcataatggtactgct

作为本发明的进一步实施例，所述融合蛋白应用于制备用于预防和治疗猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒和猪急性腹泻综合症病毒的疫苗或者药物。

实施例1：包装重组5型腺病毒载体rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS

一、构建穿梭载体pDC316-PEDVS-PoRVP6-SADSVS

人工合成PEDVS-PoRVP6-SADSVS基因；再将PEDVS-PoRVP6-SADSVS基因克隆到pDC316载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，得到腺病毒穿梭载体pDC316-PEDVS-PoRVP6-SADSVS(腺病毒穿梭载体pDC316-PEDVS-PoRVP6-SADSVS图谱如图1所示)。

二、转染质粒提取

采用中提试剂盒提取重组质粒pDC316-PEDVS-PoRVP6-SADSVS和包装质粒pBHGlox(delta)E13Cre，对提取的质粒进行SDS-PAGE电泳分析，结果如图2所示。

三、包装重组5型腺病毒载体rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS

①在直径10cm的培养皿里种1×10⁶个HEK293细胞，培养到细胞铺满皿底80-90％；

②使用lipo2000脂质体进行转染：分别取pDC316-PEDVS-PoRVP6-SADSVS质粒4μg和pBHGlox(delta)E13Cre的质粒6μg加入到0.5mL无血清的DMEM培养基中，同时取20μLlipo2000加入到0.5mL无血清的DMEM培养基中室温静置10min；

③将步骤②中质粒的溶液逐滴加入到含lipo2000的溶液中，混匀，室温静置15min；

④将上步溶液加入到HEK293细胞中，6小时后，换含10％FBS的DMEM完全培养基继续培养；

⑤当细胞有明显的CPE现象，且有>50％脱壁时，收集细胞进行裂解和分离病毒，步骤如下：

A、收集细胞于15mL的干净离心管中；

B、1500g离心5min；

C、留1mL上清，多余部分弃去；

D、在干冰浴及37℃间快速反复冻融三次；

E、2000g离心15min。

四、放大培养重组腺病毒rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS(200个平皿为例)

a、在直径10cm培养皿里接种3×10⁶个HEK293细胞；

b、细胞长满后按照1:5进行传代，直到一共有200个皿细胞；

c、将适量上步实验中得到的含腺病毒的细胞裂解上清加入到95％融会度的HEK293细胞中；

d、当细胞有明显的CPE现象(如图3所示)时，分别对细胞上清和细胞沉淀进行收集。

e、细胞沉淀用PBS洗三遍后，按照细胞培养上清的1/10体积加入PBS进行细胞重悬，-80℃和37℃反复冻融三次后，离心，收集上清备用。

五、PCR测定重组腺病毒的滴度

Ⅰ、将收集的细胞培养上清和细胞沉淀裂解上清，用荧光定量PCR进行病毒滴度测定。

引物序列如下：

PEDVS-153F：5'-CTAGGGAGTTGCCTGGTTTCTTC-3'，

PEDVS-153R：5'-TAACCATGGGTGCAATTTTGAC-3'，

PEDVS-153PROBE：5'-FAM-ACCATTCTAATGATGGCTC-BHQ1-3'；

Ⅱ、反应体系：2x PCR mix，10μL；PEDVS-153F，1μL；DNA，2μL；H2O，5μL；PEDVS-153R，1μL；PEDVS-153PROBE，1μL；

反应条件：95℃，3min；95℃，15s 40cycle；60℃，30s。

Ⅲ、反应结束后，根据结果计算得出标准曲线方程为：y＝-0.2803Logx+13.211；R²＝0.9997，再根据标准曲线方程计算出copy数。

六、Western blotting检测目的蛋白CTLA4-PEDVS-PoRVP6-SADSVS的表达

提取重组腺病毒rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS感染的HEK-293细胞总蛋白，以His单抗作为一抗，进行Western blotting检测，结果如附图4。

实施例2：重组腺病毒rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS疫苗安全性和免疫原性评价

(一)、重组腺病毒rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS载体疫苗在猪体内评价

腺病毒rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS载体疫苗在猪体内进行安全性评价：购买实验猪(14-21日龄的PEDV、PoRV和SADSV阴性猪)共6头，分为A、B两组，每组5只。A组每头颈部肌肉注射10¹⁰cfu重组腺病毒(1mL)；B组每头颈部肌肉注射1mL灭菌PBS，连续观察14天，发现两组猪的采食和精神状态均无异常反应，此结果表明该疫苗对猪是安全的。

(二)、腺病毒rAd-PEDVS-PoRVP6-SADSVS载体疫苗在猪体内进行免疫原性评价

ⅰ、免疫后抗体检测

购买实验猪12只，随机分成A、B、C三组，每组4只。A组每头猪颈部肌肉注射109cfu重组腺病毒(1mL)，B组每头猪颈部肌肉注射10¹⁰cfu重组腺病毒(1mL)，C组免疫PBS，3周后以相同剂量加强免疫一次。首免后第0天、7天、14天、28天、42天和56天前腔静脉采血进行中和抗体检测(检测结果见附图5)。结果表明，A和B组的抗体水平随时间延长而升高，而C组(对照组)没有检测到抗体的产生，说明腺病毒载体注射能够产生特异性的抗体。

ⅱ、免疫后抗体检测攻毒试验

在免疫后42天采完血后用带PEDV的肠道研磨物过滤除菌(检测只有PEDV病毒)，对猪只进行灌服，每只猪5毫升，灌服后每隔1天监测肛门拭子PEDV病毒的病毒载量，连续8次，病毒载量的监测结果如图6所示。由图可以看出，C组(对照组)排毒量分别和A、B组(腺病毒注射组)相比，排毒量大和排毒时间长，增加其他猪只的感染风险；A和B组(腺病毒注射组)能显著降低病毒载量，并能在很短的时内降低排毒直到清除病毒，表明能够起到保护作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种融合蛋白基因，其特征在于，所述融合蛋白基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白基因，其特征在于，用于编码该融合蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白基因，其特征在于，所述融合蛋白基因由分泌信号肽基因、猪的CTLA4基因、猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白、猪A群轮状病毒抗原性蛋白和猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白连接而成，所述的融合蛋白基因的表达为CTLA4-PEDVS-PoRVP6-SADSVS；

所述分泌信号肽的基因序列如SEQ ID NO.3所示；

所述猪的CTLA4的基因序列如SEQ ID NO.4所示；

所述猪流行性腹泻病毒抗原性蛋白为猪流行性腹泻病毒S蛋白片段，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因序列为SEQ ID NO.5，所述猪流行性腹泻病毒S蛋白片段是所述猪流行性腹泻病毒S蛋白的基因序列的第455-890位氨基酸序列；

所述猪A群轮状病毒抗原性蛋白为猪A群轮状病毒VP6蛋白片段，所述猪A群轮状病毒VP6蛋白的基因序列为SEQ ID NO.6，所述猪A群轮状病毒VP6蛋白片段是所述猪A群轮状病毒VP6蛋白的基因序列的第8-404位氨基酸序列；

所述猪急性腹泻综合症病毒抗原性蛋白为猪急性腹泻综合症病毒S蛋白片段，所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白的基因序列为SEQ ID NO.7，所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白片段是所述猪急性腹泻综合症病毒S蛋白的基因序列的第17-538位氨基酸序列。

4.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体含有权利要求1或2所述的融合蛋白基因，所述重组载体为包含猪的CTLA4基因、猪流行性腹泻病毒基因、猪A群轮状病毒基因以及猪急性腹泻综合症病毒基因的重组5型腺病毒载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为含有权利要求3所述核苷酸序列的腺病毒表达载体pDC316或者pAdv-CAG，该重组载体的表达为rAd-CTLA4-PEDVS-PoRVP6-SADSVS。

6.一种重组载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、将含权利要求5所述核苷酸序列的重组载体克隆到pDC316载体的EcoRI和XhoI酶切位点之间，获得重组穿梭质粒；

2)、重组穿梭质粒与腺病毒骨架载体pBHGlox_1,3cre进行体外重组，得到重组腺病毒；

3)、包装重组腺病毒后，转染Hek293细胞；

4)、等细胞病变收集细胞，细胞裂解后的上清纯化产物即得。

7.权利要求1所述的融合蛋白基因在制备用于预防和治疗猪流行性腹泻病毒、猪A群轮状病毒和猪急性腹泻综合症病毒的疫苗或者药物中的应用。

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