CN110305895B - 利用水稻RAmy1A基因防止转基因花粉漂移的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用水稻RAmy1A基因防止转基因花粉漂移的方法，包括以下步骤：将花粉特异性启动子和水稻RAmy1A基因连接至表达载体的目标T‑DNA区得到重组载体；水稻RAmy1A基因如SEQ ID NO.1所示；花粉特异性启动子为P_NOP启动子，P_NOP启动子的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；将所述重组载体导入水稻愈伤组织中获得花粉败育的水稻植株。本发明利用水稻内源α淀粉酶基因构建花粉失活技术来防止转基因花粉漂移，将RAmy1A基因和花粉特异性启动子导入到水稻愈伤组织中，通过在花粉发育过程中高水平表达α淀粉酶，使花粉成熟过程中形成的淀粉粒不断降解。达到构建水稻普通核不育系种子的目的。

Description

利用水稻RAmy1A基因防止转基因花粉漂移的方法

技术领域

本发明涉及水稻基因工程技术领域，尤其涉及利用水稻RAmy1A基因防止转基因花粉漂移的方法。

背景技术

第三代杂交水稻是指以普通核不育系为遗传工具的杂交水稻技术体系，而普通核不育系的批量繁殖技术是其中关键技术环节。当前，水稻普通核不育系的繁殖方法主要借鉴了杜邦先锋公司在玉米中已实现的SPT技术的基本思路，该技术巧妙的利用种子胚乳荧光标记技术标记区分不含转基因元件的普通核不育系种子以及利用花粉失活技术防止转基因花粉漂移所产生的生物安全问题。在防止转基因花粉漂移的应用中，SPT技术利用花粉特异性启动子驱动玉米的α淀粉酶基因ZMAA(Zea Maizeα-amylase)在含有转基因元件的花粉中高水平表达，通过该淀粉酶降解转基因花粉中的淀粉，使转基因花粉发育因缺乏所需的能量而败育，从而避免因转基因花粉逃逸所产生的转基因生物安全问题。

淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，主要分布在动植物、细菌和真菌。在成熟水稻花粉中，适量的淀粉酶可水解淀粉，为花粉的正常发育提供能量。相反，若在花粉的发育过程中过表达淀粉酶，会阻碍淀粉粒的合成，导致淀粉积累不足而产生败育花粉。目前，已经在水稻中有多种α淀粉酶基因的克隆报道，但侧重点都集中在α淀粉酶基因对种子萌发、根和叶等器官发育的作用，而在利用该类基因失活水稻花粉从而控制转基因花粉逃逸方面的研究鲜少报道。因此，水稻α淀粉酶基因为构建花粉失活技术体系提供了众多新基因资源，也为第三代杂交水稻普通核不育系的繁殖技术体系构建规避国外专利的限制。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种利用水稻内源α淀粉酶基因构建花粉失活技术来防止转基因花粉漂移的方法，将RAmy1A基因和花粉特异性启动子导入到水稻愈伤组织中，通过在花粉发育过程中高水平表达α淀粉酶，使花粉成熟过程中形成的淀粉粒不断降解。达到构建水稻普通核不育系种子的目的。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种利用水稻RAmy1A基因防止转基因花粉漂移的方法，包括以下步骤：

S1、将花粉特异性启动子和水稻RAmy1A基因连接至表达载体的目标T-DNA区得到pSB130-P_NOP-RAmy1A载体；

所述水稻RAmy1A基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

所述花粉特异性启动子为P_NOP启动子，所述P_NOP启动子的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；

S2、将所述pSB130-P_NOP-RAmy1A载体导入水稻愈伤组织中获得花粉败育的水稻植株。

上述的方法，进一步的，所述S1具体为：

S1-1、根据水稻RAmy1A基因设计引物RAmy1A-F和RAmy1A-R，以水稻DNA为模版，进行PCR扩增得到扩增产物1，将所述扩增产物1连接至表达载体中得到pSB130-RAmy1A载体；

S1-2、根据P_NOP启动子序列设计引物PNOP-F和PNOP-R，以水稻DNA为模版，进行PCR扩增得到扩增产物2；将所述扩增产物2连接至所述pSB130-RAmy1A载体中得到pSB130-P_NOP-RAmy1A载体。

上述的方法，进一步的，所述RAmy1A-F的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；所述RAmy1A-R的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

上述的方法，进一步的，所述P_NOP-F的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；所述PNOP-R的DNA序列如SEQ ID NO.6所示。

上述的方法，进一步的，所述S1-1中所述表达载体为pSB130。

上述的方法，进一步的，所述方法还包括：

S3、将PTC1基因和红色荧光蛋白DsRed基因连接至所述pSB130-P_NOP-RAmy1A载体中得到pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1-DsRed载体；

S4、将所述pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1-DsRed载体导入PTC1基因发生突变的水稻普通核不育系的幼穗愈伤组织中，筛选花粉一半可育一半不育的植株作为ptc1普通核不育系的繁殖系；

S5、将所述ptc1普通核不育系的繁殖系自交，其中发荧光的种子含有转基因元件，为繁殖系种子，可继续用于繁殖ptc1普通核不育系；而不发荧光的种子则不含转基因元件，为ptc1普通核不育系种子。

上述的方法，进一步的，所述S3具体为：

S3-1、根据PTC1基因设计引物对，进行PCR扩增获得PTC1基因，将所述PTC1基因片段连接至pSB130-PNOP-RAmy1A载体中获得pSB130-PNOP-RAmy1A-PTC1载体；

S3-2、根据DsRed基因设计引物对；进行PCR扩增获得DsRed基因，将所述DsRed基因连接至pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1载体中获得pSB130-PNOP-RAmy1A-PTC1-DsRed载体。

上述的方法，进一步的，所述S3-1中所述根据PTC1基因设计引物对包括PTC1-F和PTC1-R，所述PTC1-F的DNA序列如SEQ ID NO.11所示；所述PTC1-R的DNA序列如SEQ IDNO.12所示。

上述的方法，进一步的，所述S3-1中所述根据DsRed基因设计引物对包括DsRed-F和DsRed-R，所述DsRed-F的DNA序列如SEQ ID NO.13所示；所述DsRed-R的DNA序列如SEQ IDNO.14示。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

本发明提供一种利用水稻RAmy1A基因防止转基因花粉漂移的方法，将RAmy1A基因的重组载体导入水稻愈伤组织中，并将愈伤培养成含有RAmy1A基因的水稻植株。这种含有RAmy1A基因的水稻植株在花粉发育过程中高水平表达α淀粉酶，使花粉成熟过程中形成的淀粉粒不断降解。如果RAmy1A基因为纯合子则为不育植株；如果RAmy1A基因为杂合子则为可育植株，但可育植株中的花粉只有一半功能正常，可使雌配子受精发育成正常的种子。而另一半花粉功能异常，不能与雌配子受精发育成种子。本发明利用水稻自身的花粉特异性启动子与α淀粉酶基因构建花粉失活技术，相比其他作物的花粉启动子的特异性更好，另外，利用水稻内源的α淀粉酶基因其安全性和稳定性也更高。

附图说明

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。

图1为本发明实施例1中pSB130-P_NOP-RAmy1A表达载体图。

图2为本发明实施例1中转RAmy1A基因杂合植株的育性结果。

图3为本发明实施例2中pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1-DsRed载体图谱。

图4为本发明实施例2中繁殖系通过自交可获得的结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。

以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。

实施例1：

利用水稻内源α淀粉酶基因失活花粉，防止转基因花粉漂移的方法。具体步骤如下：

(1)利用Biozol Reagent方法提取日本晴水稻的RNA，以提取到的日本晴水稻RNA为模板进行逆转录获得日本晴水稻总cDNA。

(2)构建pSB130-P_NOP-RAmy1A载体：

2.1、根据水稻RAmy1A基因序列(Seq1)设计引物RAmy1A-F(Seq3)和RAmy1A-R(Seq4)。

水稻RAmy1A基因序列Seq1，如SEQ ID NO.1所示，具体为：

atgcaggtgctgaacaccatggtgaacaaacacttcttgtccctttcggtcctcatcgtcctccttggcctctcctccaacttgacagccgggcaagtcctgtttcagggattcaactgggagtcgtggaaggagaatggcgggtggtacaacttcctgatgggcaaggtggacgacatcgccgcagccggcatcacccacgtctggctccctccgccgtctcactctgtcggcgagcaaggctacatgcctgggcggctgtacgatctggacgcgtctaagtacggcaacgaggcgcagctcaagtcgctgatcgaggcgttccatggcaagggcgtccaggtgatcgccgacatcgtcatcaaccaccgcacggcggagcacaaggacggccgcggcatctactgcctcttcgagggcgggacgcccgactcccgcctcgactggggcccgcacatgatctgccgcgacgacccctacggcgatggcaccggcaacccggacaccggcgccgacttcgccgccgcgccggacatcgaccacctcaacaagcgcgtccagcgggagctcattggctggctcgactggctcaagatggacatcggcttcgacgcgtggcgcctcgacttcgccaagggctactccgccgacatggcaaagatctacatcgacgccaccgagccgagcttcgccgtggccgagatatggacgtccatggcgaacggcggggacggcaagccgaactacgaccagaacgcgcaccggcaggagctggtcaactgggtcgatcgtgtcggcggcgccaacagcaacgccacggcgttcgacttcaccaccaagggcatcctcaacgtcgccgtggagggcgagctgtggcgcctccgcggcgaggacggcaaggcgcccggcatgatcgggtggtggccggccaaggcgacgaccttcgtcgacaaccacgacaccggctcgacgcagcacctgtggccgttcccctccgacaaggtcatgcagggctacgcatacatcctcacccaccccggcaacccatgcatcttctacgaccatttcttcgattggggtctcaaggaggagatcgagcgcctggtgtcaatcagaaaccggcaggggatccacccggcgagcgagctgcgcatcatggaagctgacagcgatctctacctcgcggagatcgatggcaaggtgatcacaaagattggaccaagatacgacgtcgaacacctcatccccgaaggcttccaggtcgtcgcgcacggtgatggctacgcaatctgggagaaaatctga。

RAmy1A-F(Seq3)，如SEQ ID NO.3所示，具体为：atgcaggtgctgaacaccatggtgaacaaac。

RAmy1A-R(Seq4)，如SEQ ID NO.4所示，具体为：tcagattttctcccagattgcgtagccatca。

2.2、以日本晴水稻总cDNA为模板，以RAmy1A-F和RAmy1A-R为引物进行PCR扩增得到扩增产物1，

扩增体系包括：10μl PCR Mix，正向和反向引物各0.2μl，DNA模板1μl，补充8.6μlddH₂O至总体积20μl。

扩增程序：

①98℃预变性3min；

②30循环(98℃10s，65℃30s，72℃1min 20s)；

③最后延伸72℃1min；

④4℃保存。

2.3、以SmaI酶切表达载体pSB130，并将酶切后的pSB130与扩增产物1重组连接，构建成pSB130-RAmy1A载体。

2.4、根据P_NOP启动子序列(Seq2)设计引物P_NOP-F(Seq5)和P_NOP-R(Seq6)。

P_NOP启动子Seq2，如SEQ ID NO.2所示，具体为：

ccatcggtggccgaaggttcagtgaaggaaccagtgctgaccgggaaattcagagaacactaatggagctcttaaaccagttagatggatttgatgagcttggaaaggtacacatcttttactgaatagcattagttatgcataggcatgtagtaaattactgctaatgcaaatgattttgtgttgatgtgcatcataataaggttgtatgagcatgtgcatatacaagctgatacagtcacacacggtttctattgcttgtgattggcaattgtacaatacttgaataatagcatgttttgttctgccgtctttggtaacgtgacgcattattttgtccattgatcagagtactgatttagatttggaaacatatgtttgtttaagtttggttccaccaatcagctgcacaatcaactttatccgagttgcttcttgtaaacctcttttatttcctttgtgttaagattgattgactagctgatagcacatttgatctacatcagtatggaaatgtaattttggtatacagattccagataagagtgctagtttcaaaccatttggaagtccttgatggttgtcactgattcctttaatatgatgtggaaaactgtatgtgactcctggtattgcatggattgtgtgtaacagaattttcctacttttatacaggtaaaaatgatcatggcgactaatcgtcctgatgttttggaccctgcactccttcgtcctgggcggttggacaggaagattgaaattccactgccaaatgagcagtcgaggatggaagtcctcaaaattcacgcagctggtattgctaaacatggtgaaatcgattatgaagctgtcgtgaagctagctgaagtgagttaacctacttaacctgagcatggtaaaatcttgttttgcattttgttctaactgaggctgttccagggcttcaatggtgccgatctgcgcaatgtctgcactgaggctggcatggctgctattcgagcagagcgcgactatgtcattcatgaagatttcatgaaggtgggttatcacaaacacttctcttctgtctgtctctgcatcaaaacacaaggttagttcatagttctcaccatttctatctttgtgacgaaaaatggtttcaggcggtgcgcaagctgaacgacgccaagaagctcgagtctagtgcgcactacagcgcggactttggcaaggaatgaggctgatttggtgatgtgctgacttctttttttttctccatgggggaggaactgtcatgctgatcctactcctcacttgcaaaaatcctgcgatgatgatgatatacacgccaaattgaattagaaactgatccctctgaggtcaacctgacaaggagttgtgatcctgtcttctatttattgtacttcttgtaactttgggcatactcctatatgggatgattaattcgatttcatttattcccacaagcggctctgttcttcacgaatgattggacagattatggacgattgcttatcataaacctacaaataggttaaaacaaagttctaagcaatattgatgttgaatttattttcaagaaagttaagtcgtatctgaattgttgacgaggtaaaacaatcttctacaactgccaatatcccggtgaaatagcttctggtttccgaatatatcttcttttcaaacagttttatgacgaaacgaacaaaaaaaaaagaaaaacgagaaaaaccaatttttttcaaacggtttatgacgagattaaaaaaaagagaaaaaccattttttaatgttttaattaaaagaaaccttctcttttttttacctgaagccacccaagcagctcggagccccggtgccacgtgttcggccgagacgccctctcctctcccaacgctccatcccctcccgcaaatccaacggccaccgaacccctccatcccatcccgcacgaatctccacgccaagcaacgtcccaaaaacagccagttcaaaccggcgcgcggaaaaaaccaacccaacccaccccacccctcctccaaatccccaaattccaagaagacgacgacgacgagctcgacccaatccatcctcgccgcgatttccccgcgagatcgccgatcctgctggtgcggcggaggagggggaggaggagggaggttccggcgtcgaatggtggttgtcggatgacaaggctccggagtttgtcgtcgagcgcgcggctggcggcggcggagtgggcggcgccg。

P_NOP-F(Seq5)，如SEQ ID NO.5所示，具体为：ccatcggtggccgaaggttcagtgaaggaac。

P_NOP-R(Seq6)，如SEQ ID NO.6所示，具体为：cggcgccgcccactccgccgccgcca。

2.5、以日本晴水稻DNA为模板，以P_NOP-F和P_NOP-R为引物，进行PCR扩增得到扩增产物2。

扩增体系包括：10μl PCR Mix，正向和反向引物各0.2μl，DNA模板1μl，补充8.6μlddH₂O至总体积20μl。

扩增程序：

①98℃预变性3min；

②30循环(98℃10s，65℃30s，72℃2min)；

③最后延伸72℃1min；

④4℃保存。

2.6、以SmaI酶切pSB130-RAmy1A载体，扩增产物2(P_NOP启动子)重组连接至RAmy1A基因上游，构建成pSB130-P_NOP-RAmy1A载体。pSB130-P_NOP-RAmy1A载体如图1所示。

(3)利用农杆菌介导的方法将pSB130-P_NOP-RAmy1A载体转化至日本晴水稻种子，通过检测潮霉素基因获得阳性转基因植株。阳性转基因植株含有RAmy1A基因，在花粉发育过程中高水平表达α淀粉酶，使花粉成熟过程中形成的淀粉粒不断降解，导致不育。

如果RAmy1A基因为纯合子则为不育植株；如果RAmy1A基因为杂合子则为可育植株，但该植株中的一半花粉功能正常，可使雌配子受精发育成正常的种子。而另一半花粉功能异常，不能与雌配子受精发育成种子。

图2为采用本实施例方法获得的转基因植株的花粉镜检图，在开花期观察10株T3代阳性转基因的花粉育性，其中3株产生的花粉为不育花粉，7株产生的花粉一半可育一半不育。

将3株产生不育花粉的植株套袋，在成熟后期观察结实率都为0。

实施例2

利用水稻内源α淀粉酶基因防止转基因花粉漂移的方法应用于ptc1普通核不育系种子的生产繁殖。具体步骤如下：

(1)以引物PTC1-F和PTC1-R扩增PTC1基因的表达框(Seq7)获得PTC1基因；用SmaI酶切pSB130-P_NOP-RAmy1A载体，将PTC1基因连接至pSB130-P_NOP-RAmy1A载体中得到中间载体pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1。

PTC1基因组DNA序列(Seq7)，如SEQ ID NO.7所示，具体为：

gtcatgcattcagccgtcagaaaggctcagatttatttccgtggaataaacagaaatctccaaaagacaactctagccttggagttaacaagtggatggtgcttactgattctgcttggaagattggagcaaaaggactagaaagtgcattcttgaaggttctttgtgatcctctttattattattttcctttgtatccctccagtttttctttttcttttgactaattcagttttttttccttgaagggtggtagtgcattgactctgaaaatgatctatgaatcggtaggtatactgttttatgaagttagattgattttactttttcttacagcatcattagacattaatggacttatcatcatggtagttagccaagagactatctggaaagctgctcatggaggctggtaaatatgagataaagaaagaacttctaaagcaggtatatgtattttagttgatatctgtaagcaatttttcctgattttattatttgctcatctcataattcttttaacagaataatagatatactcatgttctggccccacctgaaaaatgcagtagcatagcttgatacacagatcatatacacaagctgtaactatttttttaattgttataataaatatcctttgggagtactgaggtttgccatctgcagggtggacgattagctgctgttaatctggagtctcgagctggtttgcttgcagctaggcaggtaacattctcatctgtcagcagctacttccatgcataattggtatattatgctcccagtattatctgaaaaactgcacattttagatggtcgtttgaataatcctcttgaatgtatgcatgcagggtttggcacgtgcagcatctagatatgttggtcttaggagtgtcatgacgtttcttggaccaatgtatgtttctgctaatatatctggaatctgtttgttgctgtatttttttaaatcaataatacactatcaggtttccgcatgtttctataaaaaatttgacctcttttcctttttggtcaatagtaggttcttatggttaatttatttttgggtgcatgatgtattcatgttttgctacttcaacttgctgttctgagtttactgtttgtcagatctactttttaagtaatgattcattcacaataagcttcttcaaatgctttgttgtgttgaattttgagcagactataaatcagttactgactcttctgttctacaacttcttgctgcatagaatgtgggggacactcttggctgacattgtgatccaaatgcttgggacagactatgctagaattgtgcaggcaatctatgcttttgctcaggtgagcttctgattgttcagtttttcgtccagtaactcactgtccatccattgagttcacatcttagcctttctaacagattcggctgactaggacatcttacatagaatctcatgaagaataatcaacagtgggacatttctggtctggactaacagggcattctgggcccatagtgtacattctgatcatgcagaacatttttggttgagtgctggcgcaattctcccaagaggactcgaggacagtaagttcatactttcacagaagttgtgcagctgatgtaaatgcatagaagttagatgacagaacaattgatagatgctaggtaggatagatggtacagatgacacacaaatcatctatgcttttgaattctccaaggtttaaggctgctgcttaagtgagagcttgttatacattccaggaaaaattaatttactgccactatagaatggtgtaattgtatttaagaaatagctcacaatgaccattagggccacctactctctaaacgcggtagttgtgaatgaatatacatccacttcacacttccacgagggcccgaagttgtagaccatgcattccattctgctccagttaattatgcaacaaaacggttcccctgatcttaaactattgcccccctaacattcagttaggcaaggcatacttcattgacattagtccatgcttatcccagccatatgttacagatatgcttacgtgtaaacaccagggcataatttgcatgttgcaccctgcttattccccttatcaaaacactagcaactaatttatcagtacaggctagatatcattattcaaaatcgcaacaagtatggtatactcacattaccaaaacttgccatacttcatttagctaacatgtctaacatgtggccaacaaaattaaagccacactttagccataggagagtaaacttgccacacttttatgtgccaatgacatgtaggacccacatcatggtgaaggaatcttgttaaaagtgtggcaccaaccaaacgaatgcctaactaagtcaaacctggctaacttgagttgtggcatgatgaggcaaattgtggtagtgaaccaaacaaccccttaatatctacttcctccgtttcaggttataagacttcattgcctacattcatatagatgttaacgaatctagacacatttatataaatgtgtctagattcgttaacatctatatgaatgtatataaatgtgtctagattcgttaaacatctatatgaatgtgggcaatactagaaattcttataacctgaaatggatgtagtactagattgtgtaacaattcagatagctagtgcaattggtgattgattaattttacagtccttatgtatttggaggtatcataatcttaagtgttaatttgtgatacctcctggtcctcaacactagagagatactaagtggtaacactgcaaaatgtggcatctcctggtaccttttaagtaccaaatgcactaggtgcctttgcgcaaaattcccagatgagaggacccaatttgtgatcgtgtgcgacatgtctagaagggtggcccattgtttacattccttcaccagatcgccgaagctttctaaatcgcgggcacttaacgcgtgagaagcccaatgagacctccaaatgctaaccttaaaatcgcagcgctgcacggcgacatggtctcctagctagctgcctagcttctcggcgacgttgattggcagcaactagctagctcgccgtccggccggccggccatggcgcctaagatggtgatcagcctggggagctcgcggcggcggaagcgcggcgagatgctgttccggttcgaggccttctgccagcccggctacccggcgaacttcgccggcgccggcggcttcagggacaacgtgaggacgctgctcggcttcgcgcacctggaggccggcgtccacggcgagaccaagtgctggtcgttccagctcgagctgcaccgccacccccccaccgtcgtgaggctcttcgtcgtcgaggaggaggtcgccgcctcgccgcaccgccagtgccacctctgccgccatattggtccgtcgaacaaactacaattaatcaatcaacctttacataggattgatccgatcgatgccatggtgttgtagggtgggggaggcatctgatatgcagcaagaggtatcacttcttgctgccgaggagggaatcggcggcggaagccgacggcctgtgcttcgcgatcaaccacggcggcggcggtggcgcggagaaagcgtcgtcgaaagggacgacgacgacggcctccagcagaggccacctgctacacggcgtcgtgcacctcaacggctacggccacctcgtcgccctccacggcctcgagggcggctccgacttcgtctccggccaccagatcatggacctctgggaccgcatttgctcagccttgcacgtaaggtagtagtagtatacatgtgcgtgtgcatgcatgcaagcaatgcaacgatgtcgggctgcgtgtgagaacatttgcttgggcatggtgtggtgtatgcaaggacggtgagcctggtggacacggcgaggaagggccacatggagctgaggctgctgcacggcgtcgcgtacggcgagacgtggttcgggcggtgggggtacaggtacggccggccgagctacggcgtcgcgctgccgtcgtaccggcagtcgctgcacgtgctcggctccatgccgctctgcgtgctggtgccgcacctgtcgtgcttcagccaggagctccccatggtggtcaccaagtaccaggccatcagcggccacaagctgctcagcctcggcgacctcctccgcttcatgctcgagctgcgcgcccgcctgccggccacctccgtcacggccatggactaccggggcatcatgtcggaggcctcgtgccggtggtcggcgaagcgcgtcgacatggcggcgcgcgccgtcgtggacgcgctccgccgcgccgagccggcggcgcggtgggtcacgcggcaggaggtgcgcgacgcggcgcgcgcctacatcggcgacacgggcctcctcgacttcgtgctcaagtccctcggcaaccacatcgtcggcaactacgtcgtgcgccgcaccatgaacccggtgaccaaggtgctcgagtactgcctcgaggacgtctccagcgtgctcccggcggtcgccgccggcggcggcgtgccggcgcagggcaagatgagggtgaggttccagctcacgcgtgcgcagctcatgagggacctggtgcacctgtaccggcacgtgctcaaggagcccagccaggcgctcaccggcggcgcgttcggcgcgatcccggtggcggtgcggatggtcctggacatcaagcacttcgtcaaagattaccacgaaggacaagccgcggcgagcagcaatggcggtggcggattcgggcatccccacatcaacctgtgctgcacgctgctcgtgagcaacgggagcccggagctagctccaccgtacgagacggtgaccctgccggcgcacgcgacggtgggcgagctgaagtgggaggcgcagagggtgttcagcgagatgtacctcggcctgaggagcttcgcggcggactccgtcgtcggggtcggcgccgaccaggagggcctcccggtgctcgggctggtcgacgtcggaagcgccgtcgtggtgcaagggagcgtgggcgagcagataaacggggaggaccacgagaggaaggaggaggcggcggcggcggccgtgtgcgaggggagcggcggcggcgagcgcgtcgtggactgcgcgtgcggcgcggtggacgacgacggcgagcgcatggcgtgctgcgacatctgcgaggcgtggcagcacacgcggtgcgccgggatcgcggacaccgaggacgcgccgcacgtcttcctctgcagccggtgcgacaacgacgtcgtgtcgttcccgtccttcaactgttagatgtgatgctgctgctgctactgctactactactgcctctgctgctatatatgatgctacctagtacaagtgatcgagaattcaatttgttttctcggcaaaaccaaaatgaaaacgaaggtaaaaccaagtgaacttcagatcaattcagacttctcaactttcctcccaagagaaaaaaaagaatatgaaaaaccatcgagcccacttaatgtgggccggtgtttgtttattccagcccaggaggatccatggttagaatcacccaatcaggccaggagcccaggacaacatcttctaacaaatgggtctcctagaggtgaattacggctataccatgatgggctgggccgtgaccatgtaacctacctgaaatgaggtgcccatgaattttattgcttccaagttcaactcatcttcataagatagttttcttcaactgtgtgattattatgtcagtggcttagagcaggagaggcttgatgaccagcttaagggttgcacctaatgtctaatgactaagttaagtacctatcaggtaacagtgctactaaactggcaagtgaccaccaaaagatgagctattcacatggcctgcttggaggggcccacttggtggtgtcatgaaaggccttttaggaaaggggcttccctacactgtggacactgctgctgctactactatcctattcctactccacgtttgcatgcatccatgggagaagggagaagctagccatggtttctggttggaagcatccaactaacatcctgaatgattcatgtctagctttgatggcaagaaacatgctttagcccaccaacgcaaaagctaaactgaacctgcaacaatgtgctccccatcgtgcttgcacgcttaattacctttcagatgcttgagatttgagatcctcactttctttccttactgttagaacagtgaacagatcattctccattttatctcttccaaaagccaagtggctgctgagtagtgattagcaagaaggtagaaatttcagtagaaaaagggactagtacatagtgacatactgcacactttgaccattgcaacagcaaagaagtgggaattgttctgaagaagaacaaagcaagaagaaacaaatgacttatcattgaagcaatgaaaagagagggaggaaagttgttttgcttttatctctctcactgtcactctctctgccagtagagggactccatttgtcctgtgtccctagtgagacaacctagctagccttttcttttcccctctctctttctgttcttttgcagttttgcattgcaaggactgaaggccccctttgttagggctctttcactcaccctgatgagatgcctgtttctctctccatctttttcccgtctctttttgtttcattaatctgtctctgacatgttgaggtgatccaccactatggtgtgagggcgataggggcacatggtctggtggctcggctaaaaagggactcatcaactaaaaggaagggagcaagtagcttaagctagcaacagagtgaagataggaagatcgatgtggaagtgactagagaacggcatcttggaagcaagccagcaagaggagctactaactgcttttgctccgttttctgactaataatgtgctcatttgccactctcattttgcctagttcaggacactctctgaagctcttactaactaattcaaaagcaacattaattttaattactggccacctccacagtccacatgc。

PTC1-F(Seq11)，如SEQ ID NO.11所示，具体为：gtcatgcattcagccgtcagaaaggctcaga；

PTC1-R(Seq12)，如SEQ ID NO.12所示，具体为：gcatgtggactgtggaggtggccagtaatt。

扩增体系包括：10μl PCR Mix，正向和反向引物各0.2μl，DNA模板1μl，补充8.6μlddH₂O至总体积20μl。

扩增程序：

①98℃预变性3min；

②30循环(98℃10s，65℃30s，72℃2min)；

③最后延伸72℃1min；

④4℃保存。

(2)以引物DsRed-F和DsRed-R扩增红色荧光蛋白基因DsRed的表达框(Seq8、Seq9、Seq10)；用SmaI酶切pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1载体，将DsRed基因连接至载体pSB130-RAmy1A-PTC1中构建成pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1-DsRed载体。pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1-DsRed载体的结构如图3所示。

ltp启动子序列(Seq8)，如SEQ ID NO.8所示，具体为：

aaaccgtctcttcgtgagaataaccgtggcctaaaaataagccgatgaggataaataaaatgtggtggtacagtacttcaagaggtttactcatcaagaggatgcttttccgatgagctctagtagtacatcggacctcacatacctccattgtggtgaaatattttgtgctcatttagtgatgggtaaattttgtttatgtcactctaggttttgacatttcagttttgccactcttaggttttgacaaataatttccattccgcggcaaaagcaaaacaattttattttacttttaccactcttagctttcacaatgtatcacaaatgccactctagaaattctgtttatgccacagaatgtgaaaaaaaacactcacttatttgaagccaaggtgttcatggcatggaaatgtgacataaagtaacgttcgtgtataagaaaaaattgtactcctcgtaacaagagacggaaacatcatgagacaatcgcgtttggaaggctttgcatcacctttggatgatgcgcatgaatggagtcgtctgcttgctagccttcgcctaccgcccactgagtccgggcggcaactaccatcggcgaacgacccagctgacctctaccgaccggacttgaatgcgctaccttcgtcagcgacgatggccgcgtacgctggcgacgtgcccccgcatgcatggcggcacatggcgagctcagaccgtgcgtggctggctacaaatacgtaccccgtgagtgccctagctagaaacttacacctgcaactgcgagagcgagcgtgtgagtgtagccgagtagatccaccggtcgccacc。

DsRed基因cDNA序列(Seq9)，如SEQ ID NO.9所示，具体为：

atggcctcctccgagaacgtcatcaccgagttcatgcgcttcaaggtgcgcatggagggcaccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggccacaacaccgtgaagctgaaggtgacgaagggcggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtccccccagttccagtacggctccaaggtgtacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacaagaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggcgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggctgcttcatctacaaggtgaagttcatcggcgtgaacttcccctccgacggccccgtgatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctccaccgagcgcctgtacccccgcgacggcgtgctgaagggcgagacccacaaggccctgaagctgaaggacggcggccactacctggtggagttcaagtccatctacatggccaagaagcccgtgcagctgcccggctactactacgtggacgccaagctggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggagcagtacgagcgcaccgagggccgccaccacctgttcctgtagcggcccatggatattcgaacgcgtag。

PINII终止子(Seq10)，如SEQ ID NO.10所示，具体为：

acttgtccatcttctggattggccaacttaattaatgtatgaaataaaaggatgcacacatagtgacatgctaatcactataatgtgggcatcaaagttgtgtgttatgtgtaattactagttatctgaataaaagagaaagagatcatccatatttcttatcctaaatgaatgtcacgtgtctttataattctttgatgaaccagatgcatttcattaaccaaatccatatacatataaatattaatcatatataattaatatcaattgggttagcaaaacaaatctagtctaggtgtgttttgcgaatgcggcc。

DsRed-F(Seq13)，如SEQ ID NO.13所示，具体为：aaaccgtctcttcgtgagaataaccgtggcct；

DsRed-R(Seq14)，如SEQ ID NO.14所示，具体为：ggccgcattcgcaaaacacacctagactagat。

扩增体系包括：10μl PCR Mix，正向和反向引物各0.2μl，DNA模板1μl，补充8.6μlddH₂O至总体积20μl。

扩增程序：

①98℃预变性3min；

②30循环(98℃10s，65℃30s，72℃2min)；

③最后延伸72℃1min；

④4℃保存。

(3)利用农杆菌介导的方法将pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1-DsRed载体转化ptc1不育突变体幼穗愈伤，将愈伤培养成植株后通过检测DsRed基因获得阳性转基因植株。

在开花期观察阳性转基因的花粉育性，筛选花粉一半可育一半不育的植株作为ptc1普通核不育系的繁殖系。

(4)将繁殖系进行自交，通过种子是否发荧光确定是否为阳性转基因植株。

图4为通过荧光观察转基因植株的育性结果，从图4中可知：采用实施例2的方法可获得一半发荧光和一半不发荧光的种子，其中发荧光的种子含有转基因元件，为繁殖系种子，可继续用于繁殖ptc1普通核不育系。而不发荧光的种子则不含转基因元件，为ptc1普通核不育系种子。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制。虽然本发明已以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限定本发明。任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明的精神实质和技术方案的情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同替换、等效变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。

序列表

<110> 湖南杂交水稻研究中心

<120> 利用水稻RAmy1A基因防止转基因花粉漂移的方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1305

<212> DNA

<213> 水稻(rice)

<400> 1

atgcaggtgc tgaacaccat ggtgaacaaa cacttcttgt ccctttcggt cctcatcgtc 60

ctccttggcc tctcctccaa cttgacagcc gggcaagtcc tgtttcaggg attcaactgg 120

gagtcgtgga aggagaatgg cgggtggtac aacttcctga tgggcaaggt ggacgacatc 180

gccgcagccg gcatcaccca cgtctggctc cctccgccgt ctcactctgt cggcgagcaa 240

ggctacatgc ctgggcggct gtacgatctg gacgcgtcta agtacggcaa cgaggcgcag 300

ctcaagtcgc tgatcgaggc gttccatggc aagggcgtcc aggtgatcgc cgacatcgtc 360

atcaaccacc gcacggcgga gcacaaggac ggccgcggca tctactgcct cttcgagggc 420

gggacgcccg actcccgcct cgactggggc ccgcacatga tctgccgcga cgacccctac 480

ggcgatggca ccggcaaccc ggacaccggc gccgacttcg ccgccgcgcc ggacatcgac 540

cacctcaaca agcgcgtcca gcgggagctc attggctggc tcgactggct caagatggac 600

atcggcttcg acgcgtggcg cctcgacttc gccaagggct actccgccga catggcaaag 660

atctacatcg acgccaccga gccgagcttc gccgtggccg agatatggac gtccatggcg 720

aacggcgggg acggcaagcc gaactacgac cagaacgcgc accggcagga gctggtcaac 780

tgggtcgatc gtgtcggcgg cgccaacagc aacgccacgg cgttcgactt caccaccaag 840

ggcatcctca acgtcgccgt ggagggcgag ctgtggcgcc tccgcggcga ggacggcaag 900

gcgcccggca tgatcgggtg gtggccggcc aaggcgacga ccttcgtcga caaccacgac 960

accggctcga cgcagcacct gtggccgttc ccctccgaca aggtcatgca gggctacgca 1020

tacatcctca cccaccccgg caacccatgc atcttctacg accatttctt cgattggggt 1080

ctcaaggagg agatcgagcg cctggtgtca atcagaaacc ggcaggggat ccacccggcg 1140

agcgagctgc gcatcatgga agctgacagc gatctctacc tcgcggagat cgatggcaag 1200

gtgatcacaa agattggacc aagatacgac gtcgaacacc tcatccccga aggcttccag 1260

gtcgtcgcgc acggtgatgg ctacgcaatc tgggagaaaa tctga 1305

<210> 2

<211> 2249

<212> DNA

<213> 水稻(rice)

<400> 2

ccatcggtgg ccgaaggttc agtgaaggaa ccagtgctga ccgggaaatt cagagaacac 60

taatggagct cttaaaccag ttagatggat ttgatgagct tggaaaggta cacatctttt 120

actgaatagc attagttatg cataggcatg tagtaaatta ctgctaatgc aaatgatttt 180

gtgttgatgt gcatcataat aaggttgtat gagcatgtgc atatacaagc tgatacagtc 240

acacacggtt tctattgctt gtgattggca attgtacaat acttgaataa tagcatgttt 300

tgttctgccg tctttggtaa cgtgacgcat tattttgtcc attgatcaga gtactgattt 360

agatttggaa acatatgttt gtttaagttt ggttccacca atcagctgca caatcaactt 420

tatccgagtt gcttcttgta aacctctttt atttcctttg tgttaagatt gattgactag 480

ctgatagcac atttgatcta catcagtatg gaaatgtaat tttggtatac agattccaga 540

taagagtgct agtttcaaac catttggaag tccttgatgg ttgtcactga ttcctttaat 600

atgatgtgga aaactgtatg tgactcctgg tattgcatgg attgtgtgta acagaatttt 660

cctactttta tacaggtaaa aatgatcatg gcgactaatc gtcctgatgt tttggaccct 720

gcactccttc gtcctgggcg gttggacagg aagattgaaa ttccactgcc aaatgagcag 780

tcgaggatgg aagtcctcaa aattcacgca gctggtattg ctaaacatgg tgaaatcgat 840

tatgaagctg tcgtgaagct agctgaagtg agttaaccta cttaacctga gcatggtaaa 900

atcttgtttt gcattttgtt ctaactgagg ctgttccagg gcttcaatgg tgccgatctg 960

cgcaatgtct gcactgaggc tggcatggct gctattcgag cagagcgcga ctatgtcatt 1020

catgaagatt tcatgaaggt gggttatcac aaacacttct cttctgtctg tctctgcatc 1080

aaaacacaag gttagttcat agttctcacc atttctatct ttgtgacgaa aaatggtttc 1140

aggcggtgcg caagctgaac gacgccaaga agctcgagtc tagtgcgcac tacagcgcgg 1200

actttggcaa ggaatgaggc tgatttggtg atgtgctgac ttcttttttt ttctccatgg 1260

gggaggaact gtcatgctga tcctactcct cacttgcaaa aatcctgcga tgatgatgat 1320

atacacgcca aattgaatta gaaactgatc cctctgaggt caacctgaca aggagttgtg 1380

atcctgtctt ctatttattg tacttcttgt aactttgggc atactcctat atgggatgat 1440

taattcgatt tcatttattc ccacaagcgg ctctgttctt cacgaatgat tggacagatt 1500

atggacgatt gcttatcata aacctacaaa taggttaaaa caaagttcta agcaatattg 1560

atgttgaatt tattttcaag aaagttaagt cgtatctgaa ttgttgacga ggtaaaacaa 1620

tcttctacaa ctgccaatat cccggtgaaa tagcttctgg tttccgaata tatcttcttt 1680

tcaaacagtt ttatgacgaa acgaacaaaa aaaaaagaaa aacgagaaaa accaattttt 1740

ttcaaacggt ttatgacgag attaaaaaaa agagaaaaac cattttttaa tgttttaatt 1800

aaaagaaacc ttctcttttt tttacctgaa gccacccaag cagctcggag ccccggtgcc 1860

acgtgttcgg ccgagacgcc ctctcctctc ccaacgctcc atcccctccc gcaaatccaa 1920

cggccaccga acccctccat cccatcccgc acgaatctcc acgccaagca acgtcccaaa 1980

aacagccagt tcaaaccggc gcgcggaaaa aaccaaccca acccacccca cccctcctcc 2040

aaatccccaa attccaagaa gacgacgacg acgagctcga cccaatccat cctcgccgcg 2100

atttccccgc gagatcgccg atcctgctgg tgcggcggag gagggggagg aggagggagg 2160

ttccggcgtc gaatggtggt tgtcggatga caaggctccg gagtttgtcg tcgagcgcgc 2220

ggctggcggc ggcggagtgg gcggcgccg 2249

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(31)

<223> 根据水稻RAmy1A基因序列设计的引物RAmy1A-F

<400> 3

atgcaggtgc tgaacaccat ggtgaacaaa c 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(31)

<223> 根据水稻RAmy1A基因序列设计的引物RAmy1A-R

<400> 4

tcagattttc tcccagattg cgtagccatc a 31

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(31)

<223> 根据PNOP启动子序列设计的引物PNOP-F

<400> 5

ccatcggtgg ccgaaggttc agtgaaggaa c 31

<210> 6

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(26)

<223> 根据PNOP启动子序列设计的引物PNOP-R

<400> 6

cggcgccgcc cactccgccg ccgcca 26

<210> 7

<211> 7093

<212> DNA

<213> 水稻(rice)

<400> 7

gtcatgcatt cagccgtcag aaaggctcag atttatttcc gtggaataaa cagaaatctc 60

caaaagacaa ctctagcctt ggagttaaca agtggatggt gcttactgat tctgcttgga 120

agattggagc aaaaggacta gaaagtgcat tcttgaaggt tctttgtgat cctctttatt 180

attattttcc tttgtatccc tccagttttt ctttttcttt tgactaattc agtttttttt 240

ccttgaaggg tggtagtgca ttgactctga aaatgatcta tgaatcggta ggtatactgt 300

tttatgaagt tagattgatt ttactttttc ttacagcatc attagacatt aatggactta 360

tcatcatggt agttagccaa gagactatct ggaaagctgc tcatggaggc tggtaaatat 420

gagataaaga aagaacttct aaagcaggta tatgtatttt agttgatatc tgtaagcaat 480

ttttcctgat tttattattt gctcatctca taattctttt aacagaataa tagatatact 540

catgttctgg ccccacctga aaaatgcagt agcatagctt gatacacaga tcatatacac 600

aagctgtaac tattttttta attgttataa taaatatcct ttgggagtac tgaggtttgc 660

catctgcagg gtggacgatt agctgctgtt aatctggagt ctcgagctgg tttgcttgca 720

gctaggcagg taacattctc atctgtcagc agctacttcc atgcataatt ggtatattat 780

gctcccagta ttatctgaaa aactgcacat tttagatggt cgtttgaata atcctcttga 840

atgtatgcat gcagggtttg gcacgtgcag catctagata tgttggtctt aggagtgtca 900

tgacgtttct tggaccaatg tatgtttctg ctaatatatc tggaatctgt ttgttgctgt 960

atttttttaa atcaataata cactatcagg tttccgcatg tttctataaa aaatttgacc 1020

tcttttcctt tttggtcaat agtaggttct tatggttaat ttatttttgg gtgcatgatg 1080

tattcatgtt ttgctacttc aacttgctgt tctgagttta ctgtttgtca gatctacttt 1140

ttaagtaatg attcattcac aataagcttc ttcaaatgct ttgttgtgtt gaattttgag 1200

cagactataa atcagttact gactcttctg ttctacaact tcttgctgca tagaatgtgg 1260

gggacactct tggctgacat tgtgatccaa atgcttggga cagactatgc tagaattgtg 1320

caggcaatct atgcttttgc tcaggtgagc ttctgattgt tcagtttttc gtccagtaac 1380

tcactgtcca tccattgagt tcacatctta gcctttctaa cagattcggc tgactaggac 1440

atcttacata gaatctcatg aagaataatc aacagtggga catttctggt ctggactaac 1500

agggcattct gggcccatag tgtacattct gatcatgcag aacatttttg gttgagtgct 1560

ggcgcaattc tcccaagagg actcgaggac agtaagttca tactttcaca gaagttgtgc 1620

agctgatgta aatgcataga agttagatga cagaacaatt gatagatgct aggtaggata 1680

gatggtacag atgacacaca aatcatctat gcttttgaat tctccaaggt ttaaggctgc 1740

tgcttaagtg agagcttgtt atacattcca ggaaaaatta atttactgcc actatagaat 1800

ggtgtaattg tatttaagaa atagctcaca atgaccatta gggccaccta ctctctaaac 1860

gcggtagttg tgaatgaata tacatccact tcacacttcc acgagggccc gaagttgtag 1920

accatgcatt ccattctgct ccagttaatt atgcaacaaa acggttcccc tgatcttaaa 1980

ctattgcccc cctaacattc agttaggcaa ggcatacttc attgacatta gtccatgctt 2040

atcccagcca tatgttacag atatgcttac gtgtaaacac cagggcataa tttgcatgtt 2100

gcaccctgct tattcccctt atcaaaacac tagcaactaa tttatcagta caggctagat 2160

atcattattc aaaatcgcaa caagtatggt atactcacat taccaaaact tgccatactt 2220

catttagcta acatgtctaa catgtggcca acaaaattaa agccacactt tagccatagg 2280

agagtaaact tgccacactt ttatgtgcca atgacatgta ggacccacat catggtgaag 2340

gaatcttgtt aaaagtgtgg caccaaccaa acgaatgcct aactaagtca aacctggcta 2400

acttgagttg tggcatgatg aggcaaattg tggtagtgaa ccaaacaacc ccttaatatc 2460

tacttcctcc gtttcaggtt ataagacttc attgcctaca ttcatataga tgttaacgaa 2520

tctagacaca tttatataaa tgtgtctaga ttcgttaaca tctatatgaa tgtatataaa 2580

tgtgtctaga ttcgttaaac atctatatga atgtgggcaa tactagaaat tcttataacc 2640

tgaaatggat gtagtactag attgtgtaac aattcagata gctagtgcaa ttggtgattg 2700

attaatttta cagtccttat gtatttggag gtatcataat cttaagtgtt aatttgtgat 2760

acctcctggt cctcaacact agagagatac taagtggtaa cactgcaaaa tgtggcatct 2820

cctggtacct tttaagtacc aaatgcacta ggtgcctttg cgcaaaattc ccagatgaga 2880

ggacccaatt tgtgatcgtg tgcgacatgt ctagaagggt ggcccattgt ttacattcct 2940

tcaccagatc gccgaagctt tctaaatcgc gggcacttaa cgcgtgagaa gcccaatgag 3000

acctccaaat gctaacctta aaatcgcagc gctgcacggc gacatggtct cctagctagc 3060

tgcctagctt ctcggcgacg ttgattggca gcaactagct agctcgccgt ccggccggcc 3120

ggccatggcg cctaagatgg tgatcagcct ggggagctcg cggcggcgga agcgcggcga 3180

gatgctgttc cggttcgagg ccttctgcca gcccggctac ccggcgaact tcgccggcgc 3240

cggcggcttc agggacaacg tgaggacgct gctcggcttc gcgcacctgg aggccggcgt 3300

ccacggcgag accaagtgct ggtcgttcca gctcgagctg caccgccacc cccccaccgt 3360

cgtgaggctc ttcgtcgtcg aggaggaggt cgccgcctcg ccgcaccgcc agtgccacct 3420

ctgccgccat attggtccgt cgaacaaact acaattaatc aatcaacctt tacataggat 3480

tgatccgatc gatgccatgg tgttgtaggg tgggggaggc atctgatatg cagcaagagg 3540

tatcacttct tgctgccgag gagggaatcg gcggcggaag ccgacggcct gtgcttcgcg 3600

atcaaccacg gcggcggcgg tggcgcggag aaagcgtcgt cgaaagggac gacgacgacg 3660

gcctccagca gaggccacct gctacacggc gtcgtgcacc tcaacggcta cggccacctc 3720

gtcgccctcc acggcctcga gggcggctcc gacttcgtct ccggccacca gatcatggac 3780

ctctgggacc gcatttgctc agccttgcac gtaaggtagt agtagtatac atgtgcgtgt 3840

gcatgcatgc aagcaatgca acgatgtcgg gctgcgtgtg agaacatttg cttgggcatg 3900

gtgtggtgta tgcaaggacg gtgagcctgg tggacacggc gaggaagggc cacatggagc 3960

tgaggctgct gcacggcgtc gcgtacggcg agacgtggtt cgggcggtgg gggtacaggt 4020

acggccggcc gagctacggc gtcgcgctgc cgtcgtaccg gcagtcgctg cacgtgctcg 4080

gctccatgcc gctctgcgtg ctggtgccgc acctgtcgtg cttcagccag gagctcccca 4140

tggtggtcac caagtaccag gccatcagcg gccacaagct gctcagcctc ggcgacctcc 4200

tccgcttcat gctcgagctg cgcgcccgcc tgccggccac ctccgtcacg gccatggact 4260

accggggcat catgtcggag gcctcgtgcc ggtggtcggc gaagcgcgtc gacatggcgg 4320

cgcgcgccgt cgtggacgcg ctccgccgcg ccgagccggc ggcgcggtgg gtcacgcggc 4380

aggaggtgcg cgacgcggcg cgcgcctaca tcggcgacac gggcctcctc gacttcgtgc 4440

tcaagtccct cggcaaccac atcgtcggca actacgtcgt gcgccgcacc atgaacccgg 4500

tgaccaaggt gctcgagtac tgcctcgagg acgtctccag cgtgctcccg gcggtcgccg 4560

ccggcggcgg cgtgccggcg cagggcaaga tgagggtgag gttccagctc acgcgtgcgc 4620

agctcatgag ggacctggtg cacctgtacc ggcacgtgct caaggagccc agccaggcgc 4680

tcaccggcgg cgcgttcggc gcgatcccgg tggcggtgcg gatggtcctg gacatcaagc 4740

acttcgtcaa agattaccac gaaggacaag ccgcggcgag cagcaatggc ggtggcggat 4800

tcgggcatcc ccacatcaac ctgtgctgca cgctgctcgt gagcaacggg agcccggagc 4860

tagctccacc gtacgagacg gtgaccctgc cggcgcacgc gacggtgggc gagctgaagt 4920

gggaggcgca gagggtgttc agcgagatgt acctcggcct gaggagcttc gcggcggact 4980

ccgtcgtcgg ggtcggcgcc gaccaggagg gcctcccggt gctcgggctg gtcgacgtcg 5040

gaagcgccgt cgtggtgcaa gggagcgtgg gcgagcagat aaacggggag gaccacgaga 5100

ggaaggagga ggcggcggcg gcggccgtgt gcgaggggag cggcggcggc gagcgcgtcg 5160

tggactgcgc gtgcggcgcg gtggacgacg acggcgagcg catggcgtgc tgcgacatct 5220

gcgaggcgtg gcagcacacg cggtgcgccg ggatcgcgga caccgaggac gcgccgcacg 5280

tcttcctctg cagccggtgc gacaacgacg tcgtgtcgtt cccgtccttc aactgttaga 5340

tgtgatgctg ctgctgctac tgctactact actgcctctg ctgctatata tgatgctacc 5400

tagtacaagt gatcgagaat tcaatttgtt ttctcggcaa aaccaaaatg aaaacgaagg 5460

taaaaccaag tgaacttcag atcaattcag acttctcaac tttcctccca agagaaaaaa 5520

aagaatatga aaaaccatcg agcccactta atgtgggccg gtgtttgttt attccagccc 5580

aggaggatcc atggttagaa tcacccaatc aggccaggag cccaggacaa catcttctaa 5640

caaatgggtc tcctagaggt gaattacggc tataccatga tgggctgggc cgtgaccatg 5700

taacctacct gaaatgaggt gcccatgaat tttattgctt ccaagttcaa ctcatcttca 5760

taagatagtt ttcttcaact gtgtgattat tatgtcagtg gcttagagca ggagaggctt 5820

gatgaccagc ttaagggttg cacctaatgt ctaatgacta agttaagtac ctatcaggta 5880

acagtgctac taaactggca agtgaccacc aaaagatgag ctattcacat ggcctgcttg 5940

gaggggccca cttggtggtg tcatgaaagg ccttttagga aaggggcttc cctacactgt 6000

ggacactgct gctgctacta ctatcctatt cctactccac gtttgcatgc atccatggga 6060

gaagggagaa gctagccatg gtttctggtt ggaagcatcc aactaacatc ctgaatgatt 6120

catgtctagc tttgatggca agaaacatgc tttagcccac caacgcaaaa gctaaactga 6180

acctgcaaca atgtgctccc catcgtgctt gcacgcttaa ttacctttca gatgcttgag 6240

atttgagatc ctcactttct ttccttactg ttagaacagt gaacagatca ttctccattt 6300

tatctcttcc aaaagccaag tggctgctga gtagtgatta gcaagaaggt agaaatttca 6360

gtagaaaaag ggactagtac atagtgacat actgcacact ttgaccattg caacagcaaa 6420

gaagtgggaa ttgttctgaa gaagaacaaa gcaagaagaa acaaatgact tatcattgaa 6480

gcaatgaaaa gagagggagg aaagttgttt tgcttttatc tctctcactg tcactctctc 6540

tgccagtaga gggactccat ttgtcctgtg tccctagtga gacaacctag ctagcctttt 6600

cttttcccct ctctctttct gttcttttgc agttttgcat tgcaaggact gaaggccccc 6660

tttgttaggg ctctttcact caccctgatg agatgcctgt ttctctctcc atctttttcc 6720

cgtctctttt tgtttcatta atctgtctct gacatgttga ggtgatccac cactatggtg 6780

tgagggcgat aggggcacat ggtctggtgg ctcggctaaa aagggactca tcaactaaaa 6840

ggaagggagc aagtagctta agctagcaac agagtgaaga taggaagatc gatgtggaag 6900

tgactagaga acggcatctt ggaagcaagc cagcaagagg agctactaac tgcttttgct 6960

ccgttttctg actaataatg tgctcatttg ccactctcat tttgcctagt tcaggacact 7020

ctctgaagct cttactaact aattcaaaag caacattaat tttaattact ggccacctcc 7080

acagtccaca tgc 7093

<210> 8

<211> 831

<212> DNA

<213> 水稻(rice)

<400> 8

aaaccgtctc ttcgtgagaa taaccgtggc ctaaaaataa gccgatgagg ataaataaaa 60

tgtggtggta cagtacttca agaggtttac tcatcaagag gatgcttttc cgatgagctc 120

tagtagtaca tcggacctca catacctcca ttgtggtgaa atattttgtg ctcatttagt 180

gatgggtaaa ttttgtttat gtcactctag gttttgacat ttcagttttg ccactcttag 240

gttttgacaa ataatttcca ttccgcggca aaagcaaaac aattttattt tacttttacc 300

actcttagct ttcacaatgt atcacaaatg ccactctaga aattctgttt atgccacaga 360

atgtgaaaaa aaacactcac ttatttgaag ccaaggtgtt catggcatgg aaatgtgaca 420

taaagtaacg ttcgtgtata agaaaaaatt gtactcctcg taacaagaga cggaaacatc 480

atgagacaat cgcgtttgga aggctttgca tcacctttgg atgatgcgca tgaatggagt 540

cgtctgcttg ctagccttcg cctaccgccc actgagtccg ggcggcaact accatcggcg 600

aacgacccag ctgacctcta ccgaccggac ttgaatgcgc taccttcgtc agcgacgatg 660

gccgcgtacg ctggcgacgt gcccccgcat gcatggcggc acatggcgag ctcagaccgt 720

gcgtggctgg ctacaaatac gtaccccgtg agtgccctag ctagaaactt acacctgcaa 780

ctgcgagagc gagcgtgtga gtgtagccga gtagatccac cggtcgccac c 831

<210> 9

<211> 704

<212> DNA

<213> 水稻(rice)

<400> 9

atggcctcct ccgagaacgt catcaccgag ttcatgcgct tcaaggtgcg catggagggc 60

accgtgaacg gccacgagtt cgagatcgag ggcgagggcg agggccgccc ctacgagggc 120

cacaacaccg tgaagctgaa ggtgacgaag ggcggccccc tgcccttcgc ctgggacatc 180

ctgtcccccc agttccagta cggctccaag gtgtacgtga agcaccccgc cgacatcccc 240

gactacaaga agctgtcctt ccccgagggc ttcaagtggg agcgcgtgat gaacttcgag 300

gacggcggcg tggcgaccgt gacccaggac tcctccctgc aggacggctg cttcatctac 360

aaggtgaagt tcatcggcgt gaacttcccc tccgacggcc ccgtgatgca gaagaagacc 420

atgggctggg aggcctccac cgagcgcctg tacccccgcg acggcgtgct gaagggcgag 480

acccacaagg ccctgaagct gaaggacggc ggccactacc tggtggagtt caagtccatc 540

tacatggcca agaagcccgt gcagctgccc ggctactact acgtggacgc caagctggac 600

atcacctccc acaacgagga ctacaccatc gtggagcagt acgagcgcac cgagggccgc 660

caccacctgt tcctgtagcg gcccatggat attcgaacgc gtag 704

<210> 10

<211> 316

<212> DNA

<213> 水稻(rice)

<400> 10

acttgtccat cttctggatt ggccaactta attaatgtat gaaataaaag gatgcacaca 60

tagtgacatg ctaatcacta taatgtgggc atcaaagttg tgtgttatgt gtaattacta 120

gttatctgaa taaaagagaa agagatcatc catatttctt atcctaaatg aatgtcacgt 180

gtctttataa ttctttgatg aaccagatgc atttcattaa ccaaatccat atacatataa 240

atattaatca tatataatta atatcaattg ggttagcaaa acaaatctag tctaggtgtg 300

ttttgcgaat gcggcc 316

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(31)

<223> 根据PTC1基因序列设计的引物PTC1-F

<400> 11

gtcatgcatt cagccgtcag aaaggctcag a 31

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(32)

<223> 根据PTC1基因序列设计的引物PTC1-R

<400> 12

gcatgtggac tgtggaggtg gccagtaatt 30

<210> 13

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(32)

<223> 根据红色荧光蛋白基因DsRed序列设计的引物DsRed-F

<400> 13

aaaccgtctc ttcgtgagaa taaccgtggc ct 32

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (1)..(32)

<223> 根据红色荧光蛋白基因DsRed序列设计的引物DsRed-R

<400> 14

ggccgcattc gcaaaacaca cctagactag at 32

Claims (9)

1.一种利用水稻RAmy1A基因防止转基因花粉漂移的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、将水稻花粉特异性启动子和水稻RAmy1A基因连接至表达载体的目标T-DNA区得到pSB130-P_NOP-RAmy1A载体；

所述水稻RAmy1A基因的DNA序列如SEQ ID NO.1所示；

所述花粉特异性启动子为P_NOP启动子，所述P_NOP启动子的DNA序列如SEQ ID NO.2所示；

S2、将所述pSB130-P_NOP-RAmy1A载体导入水稻愈伤组织中获得花粉败育的水稻植株。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述S1具体为：

S1-1、根据水稻RAmy1A基因设计引物对，以水稻DNA为模版，进行PCR扩增得到扩增产物1，将所述扩增产物1连接至表达载体中得到pSB130-RAmy1A载体；

S1-2、根据P_NOP启动子序列设计引物对，以水稻DNA为模版，进行PCR扩增得到扩增产物2；将所述扩增产物2连接至所述pSB130-RAmy1A载体中得到pSB130-P_NOP-RAmy1A载体。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，根据水稻RAmy1A基因设计引物对包括RAmy1A-F和RAmy1A-R；所述RAmy1A-F的DNA序列如SEQ ID NO.3所示；所述RAmy1A-R的DNA序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，根据P_NOP启动子序列设计引物对包括P_NOP-F和P_NOP-R；所述P_NOP-F的DNA序列如SEQ ID NO.5所示；所述P_NOP-R的DNA序列如SEQ ID NO.6所示。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述S1-1中所述表达载体为pSB130。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：

S3、将PTC1基因和红色荧光蛋白DsRed基因连接至所述pSB130-P_NOP-RAmy1A载体中得到pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1-DsRed载体；

S4、将所述pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1-DsRed载体导入PTC1基因发生突变的水稻普通核不育系的幼穗愈伤组织中，筛选花粉一半可育一半不育的植株作为ptc1普通核不育系的繁殖系；

S5、将所述ptc1普通核不育系的繁殖系自交，其中发荧光的种子含有转基因元件，为繁殖系种子，可继续用于繁殖ptc1普通核不育系；而不发荧光的种子则不含转基因元件，为ptc1普通核不育系种子。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述S3具体为：

S3-1、根据PTC1基因设计引物对，进行PCR扩增获得PTC1基因，将所述PTC1基因连接至pSB130-P_NOP-RAmy1A载体中获得pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1载体；

S3-2、根据DsRed基因设计引物对；进行PCR扩增获得DsRed基因，将所述DsRed基因连接至pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1载体中获得pSB130-P_NOP-RAmy1A-PTC1-DsRed载体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述S3-1中所述根据PTC1基因设计引物对包括PTC1-F和PTC1-R，所述PTC1-F的DNA序列如SEQ ID NO.11所示；所述PTC1-R的DNA序列如SEQ ID NO.12所示。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述S3-1中所述根据DsRed基因设计引物对包括DsRed-F和DsRed-R，所述DsRed-F的DNA序列如SEQ ID NO.13所示；所述DsRed-R的DNA序列如SEQ ID NO.14示。

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