CN108977574A - 与芝麻隐性核不育系d248a育性位点紧密连锁的分子标记及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种与芝麻隐性核不育系D248A育性位点紧密连锁的分子标记及应用，所述分子标记与不育基因Sims3紧密连锁，遗传距离为1.47 cM，其扩增引物为：正向引物5′‑GTTTCCGACCACGCTTCCTA‑3′，反向引物5′‑GCTCGTCAATGGAGCTAGGG‑3′，利用其引物进行扩增时，可育性状的特征条带为320 bp，不可育性状的特征条带为300bp。在芝麻隐性核不育系选育工作中，通过所述分子标记进行早期鉴定和辅助选择，可在早世代选择目标单株，显著缩小育种群体，极大地减轻了后期的育性鉴定工作量，有效的提高了选择的效率和准确性。
Description
技术领域
本发明属于芝麻分子育种领域，具体涉及一种与芝麻隐性核不育系D248A育性位点紧密连锁的分子标记及其在选育芝麻核不育系中的应用。
背景技术
芝麻是世界上重要的油料作物，2016年全球种植面积超过1058万公顷，总产611万吨。我国是世界第四大芝麻种植国，年种植面积40万公顷左右，总产量60万吨左右，是传统的出口创汇作物。芝麻种子含油量高达50-60％，芝麻油芳香纯正，营养价值高，素有“油中之王”的美誉。芝麻籽、芝麻油是重要的食品工业原料，可制作糕点、糖果、罐头、芝麻酱、人造奶油、人造猪油、芝麻豆腐、芝麻乳等食品，芝麻油还可用于其它工业部门，制成润滑油、药膏、肥皂等，因此在工业上的用途也很广泛。芝麻籽粒中含有芝麻酚林、芝麻素等，除具有抗氧化稳定性外，还具有降血脂、抗高血压、抗菌防癌、延缓人体衰老等功效，因此在医疗保健等方面具有重要作用。芝麻不仅营养价值高，用途广，而且食用方法也多种多样，因此深受广大生产者和消费者的欢迎。随着人民生活水平的提高，我国芝麻的市场需求逐年增大，每年需要进口45万吨才能填补市场缺口。因此，提高我国芝麻的单产和总产，保证我国油料供给安全，是育种家的主攻方向。
实践证明，通过杂种优势利用可以大幅度提高粮食单产。农作物中利用杂种优势的主要方法包括细胞质雄性不育(CMS)和细胞核雄性不育(GMS)。细胞核雄性不育又可细分为隐性核不育(RGMS)和显性核不育(DGMS)。芝麻中存在强大的杂种优势，幅度在10-45％以上，但这些优势尚未得到有效利用(Uzun et al.Heterosis for agronomic traits insesame hybrids of cultivars×closed capsule mutants.Acta Agr Scand B-SP.2004；54:108-112.)。芝麻中已发现了CMS系统，但由于育性不稳定，无法三系配套，因而无法在育种中应用。我国曾经从美国引进过芝麻单基因隐性核不育RGMS材料并转育出不育系ms86-1(不育基因为Sims2)(Tu et al.Studies on the genetic male sterile insesame.Acta Agric Boreali Sin.1995；10:34-39)。另外，我国通过辐射诱变培育出单基因隐性核不育系95ms-5(不育基因为Sims1)(Li et al.Studies on induced mutationand preliminary genetics of male sterile mutants in sesame.Chin J Oil CropSci.1998；20:24-27)，通过自然突变筛选到多基因隐性核不育系0176A(Wang et al.Studyon the recessive-male sterile lines(0176A,54-8A)and their utilization insesame breeding.Chin J Oil Crops Sci.2007；29:51-55)。由于这些不育系还存在着育性不稳定、不彻底，配合力低、配合力差等缺陷，因而在芝麻育种中尚未广泛利用。发明人在芝麻育种实践中，创制了一个新型的隐性核不育系D248A(不育基因为Sims3)，其突出优点是农艺性状优良，配合力高，败育彻底、稳定，恢复系多，容易配制出强优势组合，因而具有很高的应用价值(Liu et al.Development,inheritance and breeding potential of arecessive genic male sterile line D248A in Sesame.SpringerPlus.2013；2:268)。
植物花粉在发育过程中要经历一系列复杂的过程，任何一个环节出现错误都有可能导致雄性不育。因此，不同方法得到的芝麻雄性不育系，引起不育的基因很可能是不同的，必须针对不同的不育基因开发特异的分子标记。比如，发明人对芝麻隐性核不育系95ms-2进行了遗传图谱定位，获得9个AFLP标记(Zhao et al.Characterization andgenetic mapping of a novel recessive genic male sterile gene in sesame.MolBreed.2013；32:901-908)，但利用这些标记无法对其它不育系(如ms86-1，0176A，D248A，W1098A)的不育基因进行跟踪和选择。为此，发明人通过大量的科学实验，开发出了与芝麻新型核不育系D248A育性位点紧密连锁的分子标记，可供分子标记辅助选择应用。经文献查新，国内未见有关芝麻隐性核不育系D248A的分子标记及其应用的研究报道，也未见相关的专利技术公开或使用。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种与芝麻隐性核不育系D248A育性位点紧密连锁的分子标记及其扩增引物，所述标记与不育基因Sims3紧密连锁，遗传距离为1.47cM，利用所述分子标记开展杂交品种的辅助育种，解决了常规育种方法中存在的无法在早期早代鉴定育性、育种工作量大、周期长等问题，提高了芝麻杂交新品种选育步伐。
本发明另一个目的在于提供了与芝麻隐性核不育系D248A育性位点紧密连锁的分子标记在加快芝麻杂交新品种选育中的应用。通过雄性不育相关分子标记的早期鉴定和辅助选择，可在早世代选择目标单株，显著缩小育种群体，极大减轻了后期的育性鉴定工作量，有效提高了选择的效率和准确性。
本发明提供的一种芝麻雄性不育相关的分子标记，按照下述方法开发获得：
(1)以芝麻隐性核不育系D248A及其保持系D248B(Liu et al.Development,inheritance and breeding potential of a recessive genic male sterile lineD248A in Sesame.SpringerPlus.2013；2:268)为研究材料，杂交得到近等基因系NIL群体；
(2)用CTAB法(Doyle J.DNA protocols for plants—CTAB total DNAisolation.In:Hewitt G M,Johnston A.Molecular Techniques in Taxonomy.Berlin:Springer-Verlag,1991.P283-293)抽取芝麻亲本及NIL群体单株叶片的DNA，采用分子标记引物进行PCR扩增，扩增产物在6g/L变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离，硝酸银染色后获得分子标记资料；
(3)采用大田调查和室内镜检相结合的方法(Liu et al.Development,inheritance and breeding potential of a recessive genic male sterile lineD248A in Sesame.SpringerPlus.2013；2:268)测定每个NIL群体单株的花粉育性，无花粉为不育(记录为‘0’)，花粉正常为可育(记录为‘1’)；
(4)运用作图软件Mapmaker 3.0软件对分子标记数据和群体育性表型进行连锁分析，筛选获得5个紧密连锁的分子标记。其中，SB2293与隐性核不育基因的遗传距离最近，仅有1.47cM。
分子标记SB2293在培育芝麻新不育系中的应用，其步骤是：
(1)以芝麻核不育系D248A为母本，其它优良骨干亲本为父本，进行杂交，构建育种分离群体；
(2)提取分离群体单株的总DNA；
(3)采用分子标记SB2293的引物进行PCR扩增，
引物正向序列为：5′-GTTTCCGACCACGCTTCCTA-3′
引物反向序列为：5′-GCTCGTCAATGGAGCTAGGG-3′；
(4)扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，获得分子量为300bp和320bp的特异性条带；
(5)320bp特异性条带出现时，预测芝麻单株为可育；300bp特异性条带出现时，预测芝麻单株为不育；两个条带同时出现时，为杂合基因型，表型为可育；
(6)在早世代即可选择携带有300bp特征条带的单株进行回交和兄妹交，可快速转育出新的不育系。
本发明的积极效果是有效解决了常规育种方法中存在的芝麻育性无法早世代和早期鉴定、育种群体鉴定工作量大、周期长等缺点，并且利用分子标记技术开展雄性不育辅助育种，可显著提高雄性不育的选择效率，加快芝麻不育系的遗传改良步伐。在芝麻分离群体中，采用分子标记SB2293进行鉴定和选择，大田育种群体可以缩小90％，成功率100％，最快4个世代即可选育出新的不育系。
附图说明
图1为芝麻隐性细胞核雄性不育系D248A及其保持系D248B的花药图片。花药浅绿色、皱瘪为不育(图A)，浅白色、饱满为可育(图B)。
图2为花粉醋酸洋红染色后显微镜观察图片。花粉皱瘪、染色较浅为不育(图a)，花粉饱满、染色较深为可育(图b)。
图3为芝麻隐性核不育基因的遗传图谱。与不育基因标记最近的分子标记是SB2993，其遗传图距是1.47cM。
图4为利用分子标记辅助选择技术选育芝麻新不育系示意图。为简明起见，可育基因SiMS3用字母A代替，不育基因Sims3用字母a代替。在BC1F1世代，利用标记鉴定出基因型为Aa的优良单株自交，在BC1F2代选择基因型为aa和Aa的单株兄妹交，则可快速培育新的隐性核不育系。
图5为分子标记SB2993在“D248A×中芝12”BC2F2分离群体中的检测情况。M为分子量标准物100bp DNA ladder，箭头所指为特异性条带，其中320bp为可育基因SiMS3特征条带，300bp为不育基因Sims3特征条带。两条特征带同时出现时为杂合基因型(*号标注)。
具体实施方式
实施例1：芝麻隐性核不育紧密连锁分子标记的获得
为更好地理解本发明，本发明以芝麻隐性核不育系D248A和保持系D248B为例，构建了一个NIL育性分离群体，详细说明获得与雄性不育紧密连锁分子标记的方法。但应当理解，上述举例并不构成对本发明的任何限制。在下面的实验步骤中，除非特别说明，否则所有操作均按照《分子克隆实验指南》(第三版)(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002)所提供的方法进行。具体方法如下：
(一)群体构建：
以芝麻隐性核不育系D248A为母本，其保持系D248B为父本，经一次杂交构建了一个NIL育性分离群体，共372个单株。
2006年夏在芝麻育成品种驻芝四号中发现了1株雄性不育株，当年以此不育株为母本，同系内可育株为父本进行杂交，第二年种植杂种F1，再以出现的不育株为母本，可育株为父本进行杂交，以此类推，经过10多代的杂交，育成了稳定的雄性不育系D248A。该不育系已在文献(Liu Hongyan,Yang Minmin,Wu Kun,Zhou Xinan,ZhaoYingzhong.Development,inheritance and breeding potential of a recessive genicmale sterile line D248A in Sesame(Sesamum indicum L.).SpringerPlus.2013,2:268)中公开。
(二)花粉育性的鉴定：
采用文献报道的方法(Liu et al.Development,inheritance and breedingpotential of a recessive genic male sterile line D248A inSesame.SpringerPlus.2013；2:268)，对亲本及NIL群体372个单株花期的花粉育性进行鉴定，以大田鉴定结果为主，室内鉴定为辅，获取群体的育性表型数据，具体的步骤是：
(1)大田观察：在芝麻初花期，每个单株在田间观察3-5朵花，如果花药呈浅绿色且空瘪，则判定为不育；花药乳白色，饱满则为可育(图1)；
(2)室内镜检：每个单株取3-5花，将花粉挤到载玻片上，加一滴醋酸洋红溶液染色，在显微镜下放大100倍观察；若花粉红色、外形饱满则为可育，染色浅、空瘪的判定为不育(图2)。
(三)DNA提取：
采集亲本及NIL群体的372个单株的幼嫩叶片，采用CTAB法提取叶片的总DNA，具体提取步骤如下：
(1)将新鲜或-20℃冰冻保存的叶片0.5g放入1.5ml离心管中，用玻璃棒磨为匀浆，加入800μl CTAB提取液(50mmol/L Tris-HCl,pH8.0；20mmol/L EDTA,pH8.0；50mmol/LNaCl,1g/L CTAB)并摇匀，65℃水浴30min；
(2)取出离心管，加入400μl的纯氯仿，在振荡仪上2000rpm震荡30秒，然后室温(20－25℃以下相同)下12000rpm离心6min，取上清液(约400μl)；
(3)在上清液中加入两倍体积的无水乙醇(约800μl)，冰上静置30min后，再12000rpm离心8min收集DNA沉淀；
(4)DNA沉淀自然风干后，加入双蒸水200μl溶解即可使用。
(四)分子标记分析：
分子标记分析的具体步骤是：
(1)PCR反应体系：总体积为10μl，具体成分如下：
| DNA模板(25ng/μl) | 1.0μl |
| 正向引物(50ng/μl) | 0.5μl |
| 反向引物(50ng/μl) | 0.5μl |
| 10×PCR Buffer | 1.0μl |
| dNTPs(10mmol/L) | 0.2μl |
| MgCl2(25mmol/L) | 0.8μl |
| Taq(5U/μl) | 0.5μl |
| ddH2O | 5.5μl |
其中，Taq酶购自Fermentas公司，所使用的PCR Buffer的主要成分为：750mmol/LTris-HCl,200mmol/L(NH4)2SO4和0.1％(v/v)Tween20，pH 8.8。PCR反应在美国Bio-Rad公司生产的PTC-200型PCR仪上进行。
筛选所用的1500对分子标记引物来源于文献(Wei et al.Development ofsimple sequence repeat(SSR)markers of sesame from a genomesurvey.Molecules.2014；19:5150-5162；Dixit et al.Development of polymorphicmicrosatellite markers in sesame.Mol Ecol Notes.2005；5:736-738)，另外179个标记引物为发明人新设计。所有引物序列委托上海生工生物工程技术服务有限公司进行商业化合成。引物干粉用超纯水稀释到50ng/μl，－20℃保存备用。
(2)PCR扩增程序：95.0℃预变性3min；94.0℃变性30s，60.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，每个循环复性温度降低0.5℃，共10个循环；94.0℃变性30s，55.0℃复性30s，72.0℃延伸45s，共30个循环；72.0℃延伸10min，4℃保存。反应完成后，在扩增产物中加入等体积的变性凝胶电泳上样缓冲液(配制方法：在100ml去离子甲酰胺中，加入pH8.0的0.5mol/LEDTA溶液2ml，二甲苯青FF干粉5mg，溴酚蓝干粉5mg，充分溶解后摇匀)，95℃变性5min后立即冰浴冷却，4℃放置备用；
(3)电泳检测：PCR产物在6g/L变性聚丙烯酰胺凝胶上分离，电极缓冲液为1×TBE，上样量为2.5μl，恒压1500V电泳分离。凝胶染色采用硝酸银快速染色法，胶板无需固定，直接在1g/L硝酸银溶液中浸泡10min，超纯水漂洗30s，然后转入预冷的显色液(5g氢氧化钠干粉，1L超纯水溶解，然后加入3ml37％(v/v)的甲醛)快速摇动至条带出现为止，最后用10％(v/v)冰醋酸溶液固定。胶板自然晾干，人工读带并拍照保存，获得分子标记数据。
(五)分子标记引物筛选：
首先以D248A和D248B的DNA为模板，采用上述步骤(四)的流程对所有分子标记引物进行初步筛选，在亲本间呈现多态性的引物重复验证，获得候选的标记27个。
根据NIL群体的花粉育性鉴定结果，随机挑选出雄性不育单株10株，等量混合其DNA构建一个“不育”样品池；同样，挑选花粉可育的10个单株选择构建一个“可育”样品池。利用亲本间有差异的SSR引物继续在两个样品池之间进一步筛选，获得在两个样品池之间有多态性的SSR引物7对。
(六)遗传连锁分析：
参照文献(Lander et al.MAPMAKER:an interactive computer package forconstructing primary genetic linkage maps of experimental and naturalpopulations.Genomics,1987；1:174-181)的方法，将雄性不育鉴定表型数据与分子标记数据输入电脑，采用作图软件Mapmaker进行连锁遗传分析，利用Kosambi函数(Kosambi D.Theestimation of map distances from recombination values.Ann Eugen.1944,12:172-175)将遗传交换率转化为遗传距离。
建立了一个包含5个标记的遗传连锁图谱。其中与育性位点遗传距离最近的分子标记是SB2293，遗传图距是1.4 7cM(图3)。
标记SB2293对应的引物是：
正向序列：5′-GTTTCCGACCACGCTTCCTA-3′
反向序列：5′-GCTCGTCAATGGAGCTAGGG-3′
该标记扩增的特异性PCR片段大小是300bp和320bp，具体来说，可育基因SiMS3的特征条带为320bp，不育基因Sims3的特征条带为300bp，两条特征条带同时出现时为杂合基因型。
实施例2：芝麻隐性核不育分子标记在育种中的应用
一种芝麻雄性不育的分子标记在芝麻不育系培育中的应用，其步骤是：
(一)育种群体构建
以芝麻隐性核不育系D248A为母本，优良骨干亲本中芝12(中国农业科学院油料作物研究所选育，种子市场可购买)为父本，杂交得到F1，与父本回交得到BC1F1，从中选优良杂合型单株自交得BC1F2，从后代中选隐性纯合单株和杂合单株进行兄妹交，后代育性分离比例稳定在1：1，即为新的不育系(图4)。
(二)育性鉴定、DNA提取和分子标记检测
花粉育性鉴定、DNA提取和标记分析与实施例1相同，具体请参见步骤(一)至(四)。特异性标记SB2293所用引物序列参见步骤(六)，该标记扩增的特异性PCR片段大小是300和320bp。
(二)利用特异性标记SB2293对芝麻隐性核不育的早期早代鉴定效果
在F1代，理论上所有单株在育性基因位点处于显性杂合状态，表型应为可育，无需进行分子标记鉴定。在大田中，花期调查了群体所有的34株，发现全部可育，与理论预测吻合。选择长势最好的一个单株与父本回交。
在BC1F1代，理论上所有单株均为可育，但其中一半单株为显性杂合型(基因型Aa)，其自交后代可分离出不育株；另外一半为显性纯合型(基因型AA)，自交后代无法分离出不育株，应予以淘汰。花期调查了群体的全部176个单株，全部可育。在传统育种方法中，由于无法识别单株的基因型，因此通常需要随机选择多个优良单株自交构建BC1F2群体(预期仅有一半的群体会有育性分离，供进一步育种应用；另一半群体无育性分离，予以丢弃)。利用本发明实施例1提供的方法，鉴定出3个基因型为显性杂合的优良单株自交，形成BC1F2群体。
在BC1F2代，3个群体均出现不育株，比例分别为18.3％，28.2％，24.9％(理论值为25％)。由此可见，分子标记辅助鉴定结果与实际完全相符，育种群体数量可减少一半，从而大大提高效率，减少工作量。选择最接近理论分离比例的群体继续开展育种工作，这个群体共423个单株。为了选育新不育系，需要从这个群体中选择可育株(其中1/3为显性纯合型，2/3为显性杂合型)与隐性纯合型不育株进行兄妹交。使用传统的育种方法，只能随机选择可育株为父本进行兄妹交，后代出现育性分离的组合数仅占67％(即选中显性杂合型单株为父本)。采用本发明提供的方法，鉴定出10株显性杂合型单株(图5)，配置了10个兄妹交组合。这些兄妹交后代全部出现育性分离，成功率100％，而且9个组合的不育：可育比例符合1﹕1，可作为新的不育系和保持系使用。
如果芝麻育种群体的种子首先在室内发芽，并用本发明提供的分子标记对育性基因位点进行检测，挑选符合要求的目标单株移栽到大田种植，则可将大田群体单株数量减少90％以上(控制在10株以内)，从而极大减轻大田的工作量，缩短育种周期，实现新不育系的快速定向选育。
Claims (2)
1.与芝麻隐性核不育系D248A育性位点紧密连锁的分子标记，其特征在于，所述分子标记的扩增引物为：正向引物5′-GTTTCCGACCACGCTTCCTA-3′，反向引物5′-GCTCGTCAATGGAGCTAGGG-3′，可育性状的特征条带为320bp，不可育性状的特征条带为300bp。
2.权利要求1所述分子标记在芝麻隐性核不育系选育中的应用。
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