CN104342450A - 培育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系cau5的玉米单倍体诱导系的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了培育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系的方法。该方法包括1）将着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因导入玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的杂交第一代植株中，得到含有所述着丝粒特异组蛋白突变体的转基因玉米植株；2）以所述转基因玉米植株为母本与所述玉米单倍体诱导系CAU5进行杂交得到F1代，将所述F1代作为母本与所述玉米单倍体诱导系CAU5进行杂交得到BC1F1代，将所述BC1F1代作为母本与所述玉米单倍体诱导系CAU5进行杂交得到BC2F1代；将所述BC2F1代连续自交至少5代，得到玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系。

Description

培育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系的方法

技术领域

本发明涉及培育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系的方法。

背景技术

单倍体是指具有配子染色体数目的个体。由于单倍体的染色体条数仅为配子体染色体数目，一经加倍，即可获得纯系，而纯系选育是杂种优势利用中非常关键的环节，因此单倍体的利用价值无疑是巨大的。

单倍体育种指通过各种方法获得单倍体，通过染色体加倍获得纯合二倍体，并在单倍体和二倍体水平上选择，以便育成优良的纯系品种的途径。1964年曼陀罗花药培养成功获得单倍体植株（Guha and Maheshwari，1964），随后掀起了单倍体研究的热潮，单倍体研究迅速发展。单倍体育种优势有以下几点：1）缩短育种进程，常规育种中一般需要6到8个世代才能获得稳定的育种材料，而通过单倍体育种获得纯系只需要两代；2）单倍体育种没有基因互作效应，与分子标记结合，可以提高选育的效率，以及选育的准确性（Geiger and Gordillo,2009）;3）单倍体育种有利于产量、抗性等数量性状有利等位基因的快速聚合，经过加倍得到的DH系，无分离现象，稳定性强，可长期应用；4）DH群体有丰富的遗传类型，育种价值高。

单倍体产生方式有：

1、配子体培养产生单倍体

应用植物细胞全能性原理，主要是利用组织培养技术进行雌配子或雄性配子的诱导，常用的有花药培养和小孢子培养，但由于此种方法操作不方便，生产成本高，另外在一些物种中利用离体培养产生单倍体很难，包括玉米，所以商业化应用价值不高。

2、杂交获得单倍体

远缘杂交产生单倍体在许多报道中出现过。用玉米或珍珠粟的花粉给小麦授粉，会刺激小麦形成单倍体（Laurie and Bennett,1988；Gernand et al.,2005）。用球茎大麦给大麦授粉也可以产生单倍体（Kasha and Sadasivaia,1971;Subrahmany andKasha,1973）。通过胚拯救的方式可以增加单倍体的成活率。但同一物种相互杂交产生单倍体的现象比较少见，通常也是利用两个倍性不同的植株杂交得到的。

3、玉米中单倍体的产生方式

遗传诱导目前是诱导玉米单倍体的最有效的方法。Chase于1952年报道了玉米单倍体的自发频率为0.1%左右。之后玉米遗传学家发现了两类特殊的玉米材料，可以用来诱导单倍体。利用诱导系诱导产生单倍体主要有两种。一种是利用雌配子增生（indeterminate gametophyte，ig）突变体作母本与普通玉米材料作父本进行杂交，在其后代中就有一定频率的父本单倍体或母本单倍体的产生（Kermicle，1969；Evans，2007）。另一种是利用来源于Stock6的母本单倍体诱导系作父本与普通材料作母本进行杂交，来产生母本单倍体（Coe，1959）。这一自交系将玉米单倍体诱导率由自发突变的0.1%提高到了1%-2%。国内外在选育优良诱导系上有较大进展，如玉米单倍体诱导系WS14诱导率为2%-5%（Lashermes et al.,1988），玉米单倍体诱导系CAU5（Xuet al.,2013）的平均诱导率约为9%。虽然近年来选育出的单倍体诱导系在诱导率上逐渐提高，但进一步提高诱导率、改良诱导系性状及增强筛选标记，对于单倍体育种的贡献将是巨大的。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种培育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系的方法。

本发明所提供的培育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系的方法，包括：

1）将着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因导入玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的杂交第一代植株中，得到含有所述着丝粒特异组蛋白突变体的转基因玉米植株；所述着丝粒特异组蛋白突变体为a）或b）或c）：

a）着丝粒特异组蛋白与荧光蛋白融合得到的所述荧光蛋白在羧基端的融合蛋白；所述着丝粒特异组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第1-183位氨基酸残基；

b)将SEQ ID No.1的第1-183位氨基酸残基组成的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与着丝粒功能相关的的蛋白质；

c）将b)的蛋白质与所述荧光蛋白融合得到的所述荧光蛋白在羧基端的融合蛋白；

2）以所述转基因玉米植株为母本与所述玉米单倍体诱导系CAU5（父本）进行杂交得到F1代，将所述F1代作为母本与所述玉米单倍体诱导系CAU5（父本）进行杂交得到BC1F1代，将所述BC1F1代作为母本与所述玉米单倍体诱导系CAU5（父本）进行杂交得到BC2F1代；将所述BC2F1代连续自交至少5代，得到玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系。

上述方法中，所述玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的杂交第一代植株是以玉米自交系HiIIA为母本，玉米自交系HiIIB为父本得到的F1代植株，或是以玉米自交系HiIIA为父本，玉米自交系HiIIB为母本得到的F1代植株。

上述方法中，所述荧光蛋白可为黄色荧光蛋白（YFP）、绿色荧光蛋白（GFP）、增强绿色荧光蛋白（EGFP）、红色荧光蛋白（RFP）等。在本发明的一个实施方式中，所述着丝粒特异组蛋白CENH3的突变体为所述着丝粒特异组蛋白与黄色荧光蛋白融合得到的融合蛋白。

在本发明的一个实施方式中，所述着丝粒特异组蛋白突变体的氨基酸序列具体为SEQ ID No.1。

在本发明的一个实施方式中，所述着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因的编码序列具体为SEQ ID No.2的第9897-11216位。

在本发明的一个实施方式中，所述着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因通过核苷酸是SEQ ID No.2的第8423-11975位所示的表达盒导入所述玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的杂交第一代植株。

在本发明的一个实施方式中，所述着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因通过核苷酸是SEQ ID No.2的表达载体导入所述玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的杂交第一代植株。

上述方法中，所述BC2F1代连续自交至少5代中，从所述BC2F1代开始，每一代从群体中按照染色体有荧光信号且对作为母本的玉米的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株进行自交。

在本发明的一个实施方式中，所述2）中，将所述BC2F1代连续自交5代得到玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系，BC2F1代群体大小为大于等于100株（如120株），从所述BC2F1代群体中按照染色体有荧光信号且对作为母本的玉米的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株作为中选BC2F1单株，所述中选BC2F1单株的株数是所述BC2F1代群体大小的至少6%（如7%）；将所述中选BC2F1单株分别自交得到BC2F2代群体，所述BC2F2代群体大小为大于等于100株（如154株），从所述BC2F2代群体中按照染色体有荧光信号且对所述作为母本的玉米的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株作为中选BC2F2单株，所述中选BC2F2单株的株数是所述BC2F2代群体大小的至少9%（如10%）；将所述中选BC2F2单株分别自交得到BC2F3代群体，所述BC2F3代群体大小为大于等于100株（如211株），从所述BC2F3代群体中按照染色体有荧光信号且对所述作为母本的玉米的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株作为中选BC2F3单株，所述中选BC2F3单株的株数是所述BC2F3代群体大小的至少8%（如9%）；将所述中选BC2F3单株分别自交得到BC2F4代群体，所述BC2F4代群体大小为大于等于100株（如360株），从所述BC2F4代群体中按照染色体有荧光信号且对所述作为母本的玉米的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株作为中选BC2F4单株，所述中选BC2F4单株的株数是所述BC2F4代群体大小的至少3%（如3%）；将所述中选BC2F4单株分别自交得到BC2F5代群体，所述BC2F5代群体大小为大于等于50株（如63株），从所述BC2F5代群体中按照染色体有荧光信号且对所述作为母本的玉米的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株作为中选BC2F5单株，所述中选BC2F5单株的株数是所述BC2F5代群体大小的至少1%（如2%）；将所述中选BC2F5单株分别自交得到BC2F6代群体，该BC2F6代即为诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的单倍体诱导系。

上述方法中，所述作为母本的玉米可为符合育种目标的自交系、基础群体或杂交种。

上述方法中所述的基础群体指由多个自交系或品种按一定方式混合授粉后形成的玉米群体。

上述方法中所述的杂交种指单交种、三交种或者双交种。

在本发明的一个具体实施方式中所述作为母本的玉米为郑单958。

另外，着丝粒特异组蛋白突变体相关的生物材料在培育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系中的应用也属于本发明的保护范围。

所述着丝粒特异组蛋白突变体为a）或b）或c）：

a）着丝粒特异组蛋白与荧光蛋白融合得到的所述荧光蛋白在羧基端的融合蛋白；所述着丝粒特异组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1；

b)将SEQ ID No.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与着丝粒功能相关的的蛋白质；

c）将b)的蛋白质与所述荧光蛋白融合得到的所述荧光蛋白在羧基端的融合蛋白；

所述着丝粒特异组蛋白突变体相关的生物材料为B1）至B5）中的任一种：

B1）编码所述着丝粒特异组蛋白突变体的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系。

上文中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。编码所述着丝粒特异组蛋白突变体的核酸分子具体可为编码所述着丝粒特异组蛋白突变体的基因。所述重组微生物具体可为细菌,病毒、酵母,藻和真菌。所述转基因植物细胞系不为繁殖材料。

本发明中所述表达盒可含有编码所述着丝粒特异组蛋白突变体的基因和启动所述基因转录的启动子。本发明中所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述着丝粒特异组蛋白突变体的DNA，该DNA不但可包括启动所述基因转录的启动子，还可包括终止所述基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。在本发明的一个实施例中，所述表达盒的核苷酸序列是SEQ ID No.2的第8423-11975位。

实验证明，本发明方法培育的玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系CAU5^YFP比玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导率显著提高，达到11.81%，在抗倒性方面与玉米单倍体诱导系CAU5类似，茎杆更加强壮，雄穗发达，散粉性强，果穗结实性好。玉米的加倍效率较低，利用组培加倍技术可以获得更高的加倍效率，由此看来，单倍体的早期筛选就尤为重要了。一般R1-nj标记在授粉后18天才能显现，所以在幼胚组培阶段很难进行筛选。采用本发明玉米单倍体诱导系CAU5^YFP诱导单倍体，可利用利用荧光信号鉴别单倍体；可以在幼胚和籽粒成熟期两个时期鉴别单倍体。采用本发明玉米单倍体诱导系CAU5^YFP诱导单倍体，利用荧光标记就可以在幼胚进行单倍体鉴定，且鉴定准确率较高。

附图说明

图1为玉米单倍体诱导系CAU5^YFP的选育过程示意图。

图2为玉米单倍体诱导系CAU5^YFP的根尖YFP荧光信号观察。

图3为玉米单倍体诱导系CAU5^YFP农艺性状图。

图4为荧光体式显微镜下玉米单倍体诱导系CAU5与玉米单倍体诱导系CAU5^YFP种子荧光观察对比图。

图5为体式荧光显微镜观察单倍体与二倍体种子荧光差异。

图6为单倍体种子染色体条数鉴定。

图7为二倍体种子染色体条数鉴定。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

玉米单倍体诱导系CAU5（陈绍江,黎亮,李浩川,徐小炜.玉米单倍体育种技术，2012,中国农业大学出版社），公众可以从中国农业大学获得，以重复本申请实验。下文中简称CAU5。

玉米杂交种郑单958（北京德农公司），下文中简称郑单958。

玉米自交系HiIIA和HiIIB（Armstrong C L,Green C E and Phillips R L.Development and availability of germplasm with high Type II culture formationresponse.Maize Genetics Cooperation News Letter,1991,65:92-93.），公众可以从中国农业大学获得，以重复本申请实验。

实施例1、培育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系CAU5^YFP

一、将着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因导入玉米自交系HiIIA（母本）和玉米自交系HiIIB（父本）的杂交第一代植株中，得到含有所述着丝粒特异组蛋白突变体的转基因玉米植株HiII^YFP

转基因的受体为自交系HiIIA和HiIIB的杂交F1代。着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因通过着丝粒特异组蛋白突变体CENH3-YFP编码基因的表达载体pZY101-35S-CENH3-YFP导入玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的杂交第一代（F1）植株。pZY101-35S-CENH3-YFP来自Jiming Jiang实验室（Weiwei Jin,JimingJiang.Histone modifications associated with both A and B chromosomes ofmaize.Chromosome Research(2008)16:1203–1214），pZY101-35S-CENH3-YFP的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，第6399-6423位为LB，第8423-11975位为着丝粒特异组蛋白突变体CENH3-YFP编码基因表达盒35S-CENH3-YFP-OCS，第12212-12236位为RB。着丝粒特异组蛋白突变体CENH3-YFP编码基因表达盒35S-CENH3-YFP-OCS中，SEQ ID No.2的第8423-9889位为35S启动子，SEQ ID No.2的第9897-11216位为着丝粒特异组蛋白突变体CENH3-YFP基因的编码序列,编码SEQ ID No.1所示的着丝粒特异组蛋白突变体CENH3-YFP；SEQ ID No.2的第11234-11975位为OCS终止子。着丝粒特异组蛋白突变体CENH3-YFP基因的编码序列中，SEQ ID No.2的第9897-10445位为着丝粒特异组蛋白基因的编码序列,SEQ ID No.2的第10497-11216位为黄色荧光蛋白YFP基因的编码序列。

首先在田间种植玉米自交系HiIIA和HiIIB，到自交系散粉时分别套袋；然后准备授粉，HiIIA作母本，HiIIB作父本，授粉后10-12天，取授粉果穗籽粒上的未成熟幼胚，通过基因枪转化方法将pZY101-35S-CENH3-YFP转入玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的杂交第一代（F1）植株。筛选着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因CENH3-YFP表达，同时又不损伤正常生长发育的转基因植株，并自交使之纯合。

具体转化过程如下:

1、HiIIA作母本，HiIIB作父本，授粉后10-12天的玉米果穗作为愈伤组织诱导的材料，在超净台分离玉米幼胚，将幼胚胚轴面紧贴于继代培养基（N6+2mg/L2,4-D+0.7g/L L-脯氨酸+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+0.1g/L水解酪蛋白+2.7g/L琼脂（pH5.8），灭菌后加入AgNO₃至其终浓度为0.85mg/L）上，约30个/皿，暗培养7-10天，可见愈伤组织。在继代培养基中培养2周左右，取松散的Ⅱ型愈伤组织，转到高渗培养基（N6+2mg/L2,4-D+0.7g/L L-脯氨酸+0.1g/L肌醇+30g/L蔗糖+0.1g/L水解酪蛋白+36.4g/L山梨醇+36.4g/L甘露醇+2.7g/L琼脂（pH5.8），灭菌后加入AgNO₃至其终浓度为0.85mg/L）中。

2、将载体膜、铁丝网及圆形钢圈等用70%酒精浸泡灭菌。稀释pZY101-35S-CENH3-YFP至30-60ng/μl。

3、微弹粒子的准备。取50μl冷冻金粉溶液解冻，用手振荡均匀，在超净台中加入适量pZY101-35S-CENH3-YFP的DNA（60-100ng）用手振荡均匀。加入50μlCaCl₂溶液，在低速涡旋器上振荡，边振荡边加入亚精胺。静置后，200rpm离心15s，吸取上清，加入250μl冰冻无水乙醇，洗涤两次，待用。

4、消毒超净台及基因枪表面和内部，在载体膜加上10μl用质粒包裹好的微弹粒子，自然晾干。打开气瓶，压力2000psi，射击参数：Gap distance：20min；微弹载体飞行距离：10mm；微弹飞行距离：7cm；压力：1350psi；真空度25inches Hg。把愈伤组织放在托盘上，插入倒数第二档。打开基因枪的电源，打开真空泵，当读数到25inches Hg，按下射击键直到射击结束，按放气键，真空表归零，取出培养皿，封口膜封好。1小时后倒入上述继代培养基，28℃暗培养。

5、筛选愈伤组织以及植株再生。继代培养7-10天的愈伤组织，放入含有甘露糖的筛选培养基（N6+1.5mg/L2,4-D+0.7g/L L-脯氨酸+0.5g/L MES+5g/L蔗糖+7.5g/L甘露糖+2.7g/L琼脂（pH5.8），灭菌后加入AgNO₃（终浓度为0.85mg/L）和cef（终浓度为100mg/L），28℃暗培养，每三周更换一次培养基，筛选2个月左右，挑选抗性愈伤组织，转入再生培养基（MS+50g/L蔗糖+5g/L甘露糖+0.1g/L肌醇+2.7g/L琼脂（pH5.8）），光照培养。待分化出小苗，转入壮苗培养基。长到10多厘米时洗去培养基，转入土中。收获转基因当代植株所结的种子即T1代种子，生根取根尖检测染色体有无YFP信号，留下有YFP信号的植株，提取叶片基因组DNA通过PCR鉴定进一步验证，将PCR检测阳性的植株进行自交，自交2代，得到HiⅡ^YFP的种子。

其中，PCR检测阳性为用5’-ATGGCTCGAACCAAGCACC-3’和5’-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCGA-3’为引物对待检测植株基因组扩增得到1236bp的PCR产物。

二、选育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系CAU5^YFP

荧光诱导系CAU YFP的选育方法如图1，选育过程中采用了连续2代的以诱导系为轮回亲本的回交后连续自交5代到BC2F6。由于采用了北京与海南一年两季的选育方式，具体选育流程如下：

2008年北京（5月中旬），将HiⅡ^YFP的种子室内发芽6粒，对籽粒根尖进行CENH3-YFP信号的检测，发芽的6粒籽粒中有4粒的根尖染色体具有YFP信号，将这4粒幼苗移植到营养钵中（营养土：蛭石=3:1），待幼苗长至3叶1心时，带土球移栽至地里。作为受体亲本的诱导系CAU5（父本）在5月底直播至大田中（诱导系的生育期较早）。配置杂交组合HiⅡ^YFP（母本）×CAU5，同时还组配了HiⅡ^YFP（母本）×UH400，每个杂交组合各收获2穗（F1代）。

2008年海南（11月初），每个杂交组合的F1代各种植两个穗行，每个穗行各种植10个单株。HiⅡ^YFP（母本）×CAU5的F1代穗行的每个单株以CAU5为父本进行回交，收获得到20个BC1F1果穗；HiⅡ^YFP（母本）×UH400的F1代穗行的每个单株以UH400为父本进行回交，收获得到20个BC1F1果穗。

2009年北京（5月中旬），每个组合选取200个BC1F1籽粒（来自20个不同的果穗）进行籽粒根尖染色体YFP荧光信号的检测，将染色体有YFP荧光信号的单株移栽至田间。HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC1F1单株3行，每行17个单株；HiⅡ^YFP（母本）×UH400组合的BC1F1单株3行，每行17个单株。HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC1F1单株用CAU5为父本对每个单株进行回交，收获得到BC2F1种子。HiⅡ^YFP（母本）×UH400组合的BC1F1单株用UH400为父本对每个单株进行回交，收获得到BC2F1种子。

2009年海南（11月），每个组合BC2F1种子发芽，进行籽粒根尖染色体YFP荧光信号的检测，将染色体有YFP荧光信号的单株移栽至田间。其中，移栽HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F1单株120个（BC2F1代群体），共10行；移栽HiⅡ^YFP（母本）×UH400组合的BC2F1单株120个（BC2F1代群体），共10行；在单株自交的同时利用郑单958（作为母本）进行单倍体诱导率的测定（每个BC2F1单株测定3穗，即BC2F1单株用的是花粉，每个BC2F1单株的花粉分别授给3穗郑单958），收获得到120个果穗的BC2F2种子与测交种子。检测测交种子的单倍体数，计算每个BC2F1单株的测交单倍体诱导率。结果表明HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的120个BC2F1单株（BC2F1代群体）对郑单958的诱导率为5.71±2.00。根据120个BC2F1单株对郑单958的单倍体诱导率，按照对郑单958的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株作为中选BC2F1单株，HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F1的中选单株数为8。

2010年北京（6月初），将8个HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F1中选单株收获的8个BC2F2果穗每个果穗随机取籽粒发芽，进行籽粒根尖染色体YFP荧光信号的检测，将染色体有YFP荧光信号的单株移栽至田间，共移栽了8个穗行，每个穗行19-20株，共154个BC2F2单株（BC2F2代群体），在单株自交的同时利用郑单958（作为母本）进行单倍体诱导率的测定（每个BC2F2单株测定3穗，即BC2F2单株用的是花粉，每个BC2F2单株的花粉分别授给3穗郑单958），收获得到154个果穗的BC2F3种子与测交种子。检测测交种子的单倍体数，计算每个BC2F2单株的测交单倍体诱导率。结果表明HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的154个BC2F2单株（BC2F2代群体）对郑单958的诱导率为5.54±2.10。根据154个BC2F2单株对郑单958的单倍体诱导率，按照对郑单958的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株作为中选BC2F2单株，HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F2的中选单株数为15。

由于HiⅡ^YFP（母本）×UH400组合的BC2F2群体生长不正常，农艺性状差被淘汰。

2010年海南（11月初），将15个HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F2中选单株收获的15个BC2F3果穗每个果穗随机取籽粒发芽，进行籽粒根尖染色体YFP荧光信号的检测，将染色体有YFP荧光信号的单株移栽至田间，共移栽了15个穗行，每个穗行14-15株，共211个BC2F3单株（BC2F3代群体），在单株自交的同时利用郑单958（作为母本）进行单倍体诱导率的测定（每个BC2F3单株测定3穗，即BC2F3单株用的是花粉，每个BC2F3单株的花粉分别授给3穗郑单958），收获得到211个果穗的BC2F4种子与测交种子。检测测交种子的单倍体数，计算每个BC2F3单株的测交单倍体诱导率。结果表明HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的211个BC2F3单株（BC2F3代群体）对郑单958的诱导率为6.12±2.18。根据211个BC2F3单株对郑单958的单倍体诱导率，按照对郑单958的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株作为中选BC2F3单株，HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F3的中选单株数为18。

2011年北京，将18个HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F3中选单株收获的18个BC2F4果穗每个果穗随机取籽粒发芽，进行籽粒根尖染色体YFP荧光信号的检测，将染色体有YFP荧光信号的单株移栽至田间，共移栽了18个穗行，每个穗行20株，共360个BC2F4单株（BC2F4代群体），在单株自交的同时利用郑单958（作为母本）进行单倍体诱导率的测定（每个BC2F4单株测定3穗，即BC2F4单株用的是花粉，每个BC2F4单株的花粉分别授给3穗郑单958），收获得到360个果穗的BC2F5种子与测交种子。检测测交种子的单倍体数，计算每个BC2F4单株的测交单倍体诱导率。结果表明HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的360个BC2F4单株（BC2F4代群体）对郑单958的诱导率为8.61±2.17。根据360个BC2F4单株对郑单958的单倍体诱导率，按照对郑单958的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株作为中选BC2F4单株，HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F4的中选单株数为10。

2011年海南（11月初），将10个HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F4中选单株收获的10个BC2F5果穗每个果穗随机取籽粒发芽，进行籽粒根尖染色体YFP荧光信号的检测，将染色体有YFP荧光信号的单株移栽至田间，共移栽了10个穗行，每个穗行6-7株，共63个BC2F5单株（BC2F5代群体），在单株自交的同时利用郑单958（作为母本）进行单倍体诱导率的测定（每个BC2F5单株测定3穗，即BC2F5单株用的是花粉，每个BC2F5单株的花粉分别授给3穗郑单958），收获得到63个果穗的BC2F6种子与测交种子。检测测交种子的单倍体数，计算每个BC2F5单株的测交单倍体诱导率。结果表明HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的63个BC2F5单株（BC2F5代群体）对郑单958的诱导率为10.64±1.89。根据63个BC2F5单株对郑单958的单倍体诱导率，按照对郑单958的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株作为中选BC2F5单株，HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F5的中选单株数为1。

2012年北京（5月初），将该1个HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F5中选单株收获的1个BC2F6果穗随机取24个籽粒发芽，进行籽粒根尖染色体YFP荧光信号的检测，结果表明每个籽粒的染色体均有YFP荧光信号，将该24个BC2F6单株（BC2F6代群体）移栽至田间，在单株自交的同时利用郑单958（作为母本）进行单倍体诱导率的测定（每个BC2F6单株测定10穗，即BC2F6单株用的是花粉，每个BC2F6单株的花粉分别授给10穗郑单958），收获得到24个果穗的BC2F7种子与测交种子。检测测交种子的单倍体数，计算每个BC2F6单株的测交单倍体诱导率。结果表明由HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F5中选单株收获的1个BC2F6果穗中随机取的24个单株对郑单958的诱导率为11.81±1.09（表1），每个单株的诱导率均高于玉米单倍体诱导系CAU5对郑单958的诱导率8.77%。

由HiⅡ^YFP（母本）×CAU5组合的BC2F5中选单株收获的1个BC2F6果穗（共150个BC2F6籽粒）即为玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系，命名为玉米单倍体诱导系CAU5^YFP（表1）。

上述方法中，单倍体诱导率的测定方法为：以被测单株为父本，以郑单958为母本（测验种），杂交后测定每个单株对母本材料郑单958的单倍体诱导率。其中，单倍体鉴别及单倍体诱导率的计算方法如下：

利用R1-nj标记挑选出紫色糊粉层无色胚子粒为拟单倍体，由于挑选出的拟单倍体存在一定的误选率，需要对拟单倍体进行田间种植。田间条件下，单倍体植株较二倍体杂合植株生长势弱，叶片上冲，与杂合二倍体植株差异明显。取田间鉴定为单倍体的根尖固定，酶解制片，进行细胞学鉴定，单倍体的染色条数为10条，二倍体的染色条数为20条。验证结果表明田间鉴定结果和细胞学鉴定结果一致。

每个被测单株的单倍体诱导率（HIR）的确定，是将该父本诱导的拟单倍体收集在一起，进行田间种植，由田间鉴定结果，得出某一父本的单倍体诱导率（HIR）=(拟单倍体籽粒数/有标记的总籽粒数)×（田间单倍体数/出苗总数）×100%。

上述方法中，玉米单倍体诱导系CAU5对郑单958的玉米单倍体诱导率在田间测定，测定方法如下：取24个CAU5单株的花粉混合后给10株郑单958（母本）授粉，在田间进行杂交诱导玉米单倍体，收获杂交种子，检测杂交种子的单倍体数，计算玉米单倍体诱导系CAU5对郑单958的单倍体诱导率，结果表明共收获2179粒杂交种子，其中191粒为单倍体，单倍体诱导系CAU5对郑单958的单倍体诱导率为8.77%。

表1 玉米单倍体诱导系CAU5^YFP的选育进程

年份	世代	当代单株数	群体诱导率均值(μ0)（%）
				09海南	BC2F1	120	5.71±2.00
10北京	BC2F2	154	5.54±2.10
				10海南	BC2F3	211	6.12±2.18
11北京	BC2F4	360	8.61±2.17
				11海南	BC2F5	63	10.64±1.89
12北京	BC2F6	24	11.81±1.09

表1中，诱导率是对郑单958的玉米单倍体诱导率。

上述方法中，鉴别染色体是否具有YFP荧光信号的方法如下：

取旺盛生长的4天大小的根尖放到载玻片上，滴一滴1×PBS溶液，盖上盖玻片，轻敲玻片至根尖捣碎，即可直接在BX61荧光显微镜下观察拍照。

三、玉米单倍体诱导系CAU5^YFP的性状

1、染色体上有荧光信号

取玉米单倍体诱导系CAU5^YFP旺盛生长的根尖，按照步骤二的方法观察荧光信号，结果表明玉米单倍体诱导系CAU5^YFP的细胞核中共有20条染色体，每条染色体的着丝粒位置均有明显YFP信号，说明CENH3-YFP蛋白表达并定位到着丝粒上（图2）。

2、农艺性状鉴定

步骤二的玉米单倍体诱导系CAU5^YFP24个单株的田间鉴定结果表明，玉米单倍体诱导系CAU5^YFP在抗倒性方面与玉米单倍体诱导系CAU5类似，但茎杆更加强壮，雄穗发达，散粉性强，果穗结实性好（如图3）。

实施例2、玉米单倍体诱导系CAU5^YFP诱导玉米单倍体

实验在田间采用随机区组设计，该实验包括2个处理：玉米单倍体诱导系CAU5^YFP处理和玉米单倍体诱导系CAU5处理，实验方法如下：

玉米单倍体诱导系CAU5^YFP处理的实验方法如下：从实施例1的玉米单倍体诱导系CAU5^YFP中随机取24个单株，将24个单株的花粉混合后给10株郑单958（母本）授粉，在田间进行杂交诱导玉米单倍体，收获杂交种子，检测杂交种子的单倍体数，计算玉米单倍体诱导系CAU5^YFP对郑单958的单倍体诱导率，结果表明总共收获2640粒杂交种子，其中312粒为单倍体，玉米单倍体诱导系CAU5^YFP对郑单958的单倍体诱导率为11.81%（表2）。

玉米单倍体诱导系CAU5处理的实验方法如下：取24个CAU5单株的花粉混合后给10株郑单958（母本）授粉，在田间进行杂交诱导玉米单倍体，收获杂交种子，检测杂交种子的单倍体数，计算玉米单倍体诱导系CAU5对郑单958的单倍体诱导率，结果表明共收获2179粒杂交种子，其中191粒为单倍体，单倍体诱导系CAU5对郑单958的单倍体诱导率为8.77%（表2）。

表2 CAU5与CAU^YFP对郑单958的单倍体诱导率对比

诱导系	总子粒数	单倍体诱导率（%）
			CAU5	2179	8.77
CAUYFP	2640	11.81

该实例中，单倍体鉴别及单倍体诱导率的计算方法同实施例1。

实施例3、通过观察种子荧光鉴定玉米单倍体诱导系CAU5^YFP诱导的玉米单倍体

实施例1培育的玉米单倍体诱导系CAU5^YFP不仅可以作为单倍体诱导系，使后代中产生单倍体，还可稳定表达荧光融合蛋白CENH3-YFP，并定位在着丝粒位置，如图2。通过在体式荧光显微镜直接观察种子的荧光信号，也可看出玉米单倍体诱导系CAU5^YFP与玉米单倍体诱导系CAU5种子的荧光差异，如图4，左边两粒为玉米单倍体诱导系CAU5^YFP的籽粒，右边两粒为玉米单倍体诱导系CAU5籽粒，玉米单倍体诱导系CAU5^YFP显现出更加明显的YFP信号，玉米单倍体诱导系CAU5也能显现出一定的自发荧光，但两者有明显差异。利用玉米单倍体诱导系CAU5^YFP作父本，将该系与玉米自交系郑单958杂交，得到的种子中胚和胚乳都有强荧光信号的为二倍体，只有胚乳有较强荧光信号的为单倍体，可直接通过用检测荧光的设备照射种子而区分二倍体和单倍体,如图5。二倍体的种子胚的区域YFP信号明显强于单倍体胚区域YFP的信号。图5为玉米籽粒胚面，左边为单倍体，右边为二倍体。单倍体胚的荧光明显弱于二倍体胚的荧光。

将玉米单倍体诱导系CAU5^YFP作父本，与玉米自交系郑单958杂交得到的种子发根，取根尖固定，酶解制片，进行细胞学鉴定，如图6和图7，单倍体的染色体条数为10条，二倍体为20条。其中，细胞学鉴定的方法如下：

1）切取根尖浸于2mM8-羟基喹啉，室温预处理2h；

2）ddH₂O冲洗根尖三次，每次5min，将根尖擦干水分，用卡诺氏固定液（乙醇：冰醋酸为3：1）固定，于-20℃保存；

3）酶解：固定好的根尖用ddH₂O冲洗根尖三次，每次5min，擦净根尖水分，置于2％纤维素酶+1%果胶酶混合液中，37℃酶解2小时；

4）酶解完全的根尖浸泡于ddH₂O，将其置于载玻片上，去除水分。滴加适量固定液于根尖上，用镊子迅速敲碎，去除未敲碎部分，再滴加15μl固定液于根尖上，酒精灯中充分燃烧，斜置玻片，晾干待用，得到根尖染色体。

实施例4、通过观察幼胚荧光鉴定玉米单倍体诱导系CAU5^YFP诱导的玉米单倍体

1、幼胚压片检测YFP信号

将玉米单倍体诱导系CAU5^YFP作父本，给玉米自交系郑单958（母本）授粉后13天至15天的未成熟籽粒检测YFP荧光信号，将未成熟籽粒用镊子解剖开，取出幼胚，利用荧光显微镜BX51进行压片检测YFP信号。在观察到的210个籽粒中，所有籽粒的胚乳都能观察到YFP荧光信号，在观察胚的荧光信号时，有187个籽粒的幼胚有YFP信号，23个胚无YFP信号。将该23个无YFP信号的幼胚做细胞学鉴定，都为单倍体。结果如表1所示。幼胚压片检测YFP信号的方法准确率高。

表3对郑单958×CAU5^YFP授粉后13天至15天的未成熟籽粒YFP荧光信号检测结果

	正常籽粒	败育籽粒
			筛选的籽粒数量	4021	1057
抽样观察的籽粒	210	356
			具有胚的籽粒	210	8
具有CENH3-YFP信号的胚的数量	187	8
			具有CENH3-YFP信号的胚乳的数量	210	356
拟单倍体数	23	＼

2、体式荧光显微镜观察杂交幼胚中的YFP荧光强度，鉴定其中的单倍体

将玉米单倍体诱导系CAU5^YFP作父本，给玉米自交系郑单958（母本）授粉后13天至15天的的363个幼胚，来观察杂交幼胚中的YFP荧光强度，鉴定其中的单倍体,并以郑单958自交的10个幼胚作为对照。

在体式荧光显微镜（OLYMPUS DP72）下观察，基本设置为分辨率1360×1024，曝光时间10-11ms，在测量光强度曲线工具中，将面积固定的圆形标记置于幼胚中心，得出圆形面积内的荧光强度平均值记为该幼胚的荧光强度。以作为对照的幼胚为参照调整显微镜曝光时间及目镜倍数，目镜倍数为1.5倍时检测最佳。

正常双受精的二倍体幼胚含有父本基因，具有较强的荧光；单倍体的幼胚由于没有父本基因，荧光强度值明显小于二倍体。通过正常的郑单958自交的二倍体幼胚作为对照，比较待鉴定幼胚与对照的荧光强度，可鉴定出单倍体。在进行单倍体鉴定时，对照组不含荧光标记的普通郑单958幼胚荧光强度均值为1.366，鉴定出的单倍体荧光强度均值为1.363，二倍体荧光强度均值为3.575。在杂交幼胚中，选取荧光强度小于1.366的幼胚，以及在1.366-1.8之间的幼胚，列为拟单倍体，并利用染色体计数方法验证其倍性。在363个幼胚中，拟单倍体数为48，拟单倍体频率为13.22%，利用细胞学方法观察其中存活的10个愈伤组织，单倍体为9个，二倍体为1个，说明利用荧光标记的方法，鉴定单倍体的准确率为90%，要高于紫色遗传标记法。这种方法虽然不及幼胚直接压片观察YFP信号的准确率高，但是幼胚不受到破坏，可以后续进行利用，如进行单倍体加倍，这样就起到了提前挑选单倍体的作用，提高了育种效率。

利用荧光标记鉴定单倍体的准确率高，并且可以弥补紫色遗传标记法不适用于有色籽粒的缺点，应用范围更加广泛，通过荧光观察设备观察种子的荧光强度鉴定单倍体的方法的便于大规模自动化筛选玉米单倍体。

Claims (10)

1.培育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系的方法，包括：1）将着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因导入玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的杂交第一代植株中，得到含有所述着丝粒特异组蛋白突变体的转基因玉米植株；所述着丝粒特异组蛋白突变体为a）或b）或c）：

a）着丝粒特异组蛋白与荧光蛋白融合得到的所述荧光蛋白在羧基端的融合蛋白；所述着丝粒特异组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第1-183位氨基酸残基；

b)将SEQ ID No.1的第1-183位氨基酸残基组成的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与着丝粒功能相关的的蛋白质；

c）将b)的蛋白质与所述荧光蛋白融合得到的所述荧光蛋白在羧基端的融合蛋白；

2）以所述转基因玉米植株为母本与所述玉米单倍体诱导系CAU5进行杂交得到F1代，将所述F1代作为母本与所述玉米单倍体诱导系CAU5进行杂交得到BC1F1代，将所述BC1F1代作为母本与所述玉米单倍体诱导系CAU5进行杂交得到BC2F1代；将所述BC2F1代连续自交至少5代，得到玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述荧光蛋白为黄色荧光蛋白、绿色荧光蛋白、增强绿色荧光蛋白或红色荧光蛋白。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述着丝粒特异组蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.1。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因的编码序列为SEQ ID No.2的第9897-11216位。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：所述着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因通过核苷酸是SEQ ID No.2的第8423-11975位所示的表达盒导入所述玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的杂交第一代植株。

6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述着丝粒特异组蛋白突变体的编码基因通过核苷酸是SEQ ID No.2的表达载体导入所述玉米自交系HiIIA和玉米自交系HiIIB的杂交第一代植株。

7.根据权利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述BC2F1代连续自交至少5代中，从所述BC2F1代开始，每一代从群体中按照染色体有荧光信号且对作为母本的玉米的单倍体诱导率由高到低的顺序选择单株进行自交。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于：所述作为母本的玉米为郑单958。

9.着丝粒特异组蛋白突变体相关的生物材料在培育玉米单倍体诱导率高于玉米单倍体诱导系CAU5的玉米单倍体诱导系中的应用；

所述着丝粒特异组蛋白突变体为a）或b）或c）：

a）着丝粒特异组蛋白与荧光蛋白融合得到的所述荧光蛋白在羧基端的融合蛋白；所述着丝粒特异组蛋白的氨基酸序列为SEQ ID No.1的第1-183位氨基酸残基；

b)将SEQ ID No.1的第1-183位氨基酸残基组成的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与着丝粒功能相关的的蛋白质；

c）将b)的蛋白质与所述荧光蛋白融合得到的所述荧光蛋白在羧基端的融合蛋白；

所述着丝粒特异组蛋白突变体相关的生物材料为B1）至B5）中的任一种：

B1）编码所述着丝粒特异组蛋白突变体的核酸分子；

B2）含有B1）所述核酸分子的表达盒；

B3）含有B1）所述核酸分子的重组载体、或含有B1）所述表达盒的重组载体；

B4）含有B1）所述核酸分子的重组微生物、或含有B2）所述表达盒的重组微生物、或含有B4）所述重组载体的重组微生物；

B5）含有B1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B1）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B3）所述重组载体的转基因植物细胞系。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述着丝粒特异组蛋白突变体的氨基酸序列为SEQ ID No.2。