CN114902957A - 一种提高玉米单倍体诱导系诱导率的dna分子 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高玉米单倍体诱导系诱导率的DNA分子。本发明所要保护的一个技术方案是诱导玉米单倍体的方法，包括制备含有H5单倍型的玉米，使用含有H5单倍型的玉米作为玉米单倍体诱导系，诱导母本玉米材料得到玉米单倍体。所述H5单倍型是序列表中序列2的第131位SNP1位点为C、第259位SNP2位点为G、第457位SNP3位点为A且第548位SNP4位点为G的单倍型。所述H5单倍型对应的zmdmp基因序列为序列表中序列1所示的DNA分子。实验证明，使用含有H5单倍型的玉米作为玉米单倍体诱导系对测试种的单倍体诱导率高于其他单倍型或玉米单倍体诱导系CAUHOI，可应用于玉米单倍体诱导。

Description

一种提高玉米单倍体诱导系诱导率的DNA分子
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种提高玉米单倍体诱导系诱导率的DNA分子。
背景技术
单倍体育种技术是用单倍体诱导系诱导普通母本材料，在其后代杂交果穗上可获得一定比例的单倍体籽粒，而后对单倍体进行加倍形成双单倍体(DH)纯系的一项技术。单倍体技术经过两个世代就可获得理论上的纯系，而利用传统选系方法，一般需要6-10代。相对而言，单倍体育种技术可以缩短育种年限，加快进程，节约人力物力。已成为与转基因技术、分子辅助选择育种技术相媲美的现代玉米育种的三大核心技术之一(陈绍江，2012)。
单倍体的产生是单倍体育种技术应用的基础，目前玉米单倍体的产生主要依赖于玉米诱导系的诱导。所谓的诱导系是一类特殊的玉米材料，它与普通材料的杂交后代中可以产生一定比例的单倍体籽粒。诱导系主要有母本单倍体诱导系和父本单倍体诱导系这两种类型，目前在生产上主要利用的是母本单倍体诱导系。Stock6是在玉米中发现的第一个母本单倍体诱导系——紫色糊粉层、粉质胚乳及硬粒、白色籽粒的玉米材料，诱导率1-2％(Coe，1959)。在此基础上，研究者选育出诱导率更高的诱导系。玉米单倍体诱导率是受多基因控制的(Lashermes and Beckert，1988；
Figure BDA0002941363380000011
2005)，具有加性和上位性效应(Prigge，2011)。Prigge(2012)等检测到了8个QTL位点，包括2个主效QTL位点，其中qhir1位于第1条染色体，对父本诱导系诱导能力的贡献达66％，而qhir8位于第9条染色体，解释20％的贡献率。qhir1已被定位到243kb的物理区间(Dong X et al.,2013)，并在该区间克隆到一个磷脂酶基因，该基因(mtl/zmpla1/nld)功能丧失能够诱导单倍体的产生(Kelliher T et al.,2017；Liu C et al,2017；Gilles L M,et al,2017)。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率或如何诱导玉米单倍体。
为了解决上述技术问题，本发明首先提供了诱导玉米单倍体的方法。所述方法包括制备含有H5单倍型的玉米，使用含有H5单倍型的玉米作为玉米单倍体诱导系，诱导母本玉米材料得到玉米单倍体。
所述H5单倍型是SNP1为C、SNP2为G、SNP3为A且SNP4为G的单倍型。
所述SNP1是玉米基因组中的一个SNP位点，为序列表中序列2的第131位核苷酸，其为T或C；所述SNP2是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第259位核苷酸，其为G或A；所述SNP3是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第457位核苷酸，其为A或G；所述SNP4是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第548位核苷酸，其为G或C。
所述作为母本的玉米可为玉米自交系或玉米商用杂交种。
所述单倍型为H5单倍型的玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率高于单倍型为WT单倍型和/或单倍型为H1单倍型的玉米单倍体诱导系的玉米单倍体诱导率。
所述WT单倍型是SNP1为C、SNP2为G、SNP3为A且SNP4为G的单倍型。所述WT单倍型也就是玉米单倍体诱导系CAUHOI中的ZmDMP基因单倍型。
所述H1单倍型是SNP1为C、SNP2为A、SNP3为G且SNP4为C的单倍型。所述H1单倍型也就是玉米单倍体诱导系CAU5中的zmdmp基因单倍型。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种提高玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率的方法。
所述方法包括将H5单倍型导入已有玉米单倍体诱导系得到含有H5单倍型的玉米单倍体诱导系，使用含有H5单倍型的玉米单倍体诱导系诱导母本玉米材料，以提高所述已有玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率。
所述H5单倍型是SNP1为C、SNP2为G、SNP3为A且SNP4为G的单倍型；
所述SNP1是玉米基因组中的一个SNP位点，为序列表中序列2的第131位核苷酸，其为T或C；所述SNP2是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第259位核苷酸，其为G或A；，所述SNP3是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第457位核苷酸，其为A或G；所述SNP4是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第548位核苷酸，其为G或C。
所述H5单倍型可为H5单倍型玉米。所述将H5单倍型导入已有玉米单倍体诱导系可为通过杂交的方式导入。
所述作为母本的玉米可为玉米自交系或商业玉米杂交种。
所述提高玉米单倍体诱导率是所述含有H5单倍型的玉米单倍体诱导系与所述已有玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率相比。
所述已有玉米单倍体诱导系可为玉米单倍体诱导系CAUHOI或玉米单倍体诱导系CAU5或其他已选育的玉米单倍体诱导系。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了DNA分子。所述DNA分子的核苷酸序列是序列表中的序列1。序列表中序列1的第131位核苷酸为C、序列表中序列1的第259位核苷酸为G、序列表中序列1的第457位核苷酸为A、序列表中序列1的第548位核苷酸为G。所述DNA分子为上文所述H5(CGAG)单倍型对应的zmdmp基因序列。
玉米H5单倍型在提高玉米单倍体诱导系的诱导率中的应用也属于本发明的保护范围。所述H5单倍型是SNP1为C、SNP2为G、SNP3为A且SNP4为G的单倍型。
所述SNP1是玉米基因组中的一个SNP位点，为序列表中序列2的第131位核苷酸，其为T或C；所述SNP2是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第259位核苷酸，其为G或A；，所述SNP3是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第457位核苷酸，其为A或G；所述SNP4是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第548位核苷酸，其为G或C。
所述提高玉米单倍体诱导系的诱导率是将所述单倍型H5导入所述玉米单倍体诱导系后得到的含有H5单倍型的玉米单倍体诱导系与所述玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率相比。所述玉米单倍体诱导系可为CAUHOI或CAU5或其他已选育的玉米单倍体诱导系。
上文所述含有H5单倍型的玉米和/或所述H5单倍型可通过杂交育种得到。所述含有H5单倍型的玉米也可以通过其他方式制备获得。
上文所述含有H5单倍型的玉米和/或H5单倍型的制备方法包括将玉米单倍体诱导系CAUHOI(作为父本)和玉米单倍体诱导系CAU5(作为母本)杂交得到F1代，从所述F1代的后代中选出含有H5单倍型的玉米。所述F1代的后代可为F2代或F3代以上的世代。
上文所述的方法和/或上文所述的DNA分子的下述任一种应用也属于本发明的保护范围：
A1)在提高玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率中的应用；
A2)在诱导玉米单倍体中的应用；
A3)在玉米育种中的应用。
A4)在制备提高玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率的产品中的应用。
上述应用中，所述提高玉米单倍体诱导系的诱导率是将所述H5单倍型导入所述玉米单倍体诱导系后得到的含有H5单倍型的玉米单倍体诱导系与所述玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率相比。所述玉米单倍体诱导系可为CAUHOI或CAU5或其他已选育的玉米单倍体诱导系。
为了解决上述技术问题，本发明还提供了产品。所述产品含有上文所述所述含有H5单倍型的玉米和/或上文所述的DNA分子和/或上文所述的玉米H5单倍型，且可为下述G1)-G3)中的任一种：
G1)提高玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率的产品；
G2)由于诱导玉米单倍体的产品；
G3)用于玉米育种的产品。
检测上文所述SNP1、SNP2、SNP3和SNP4这四个SNP的多态性或基因型的物质和/或上文所述单倍型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率中的应用也属于本发明的保护范围。
上文所述检测所述SNP1、SNP2、SNP3和SNP4这四个SNP的多态性或基因型的物质和/或检测所述单倍型的物质可为如下D1)、D2)或D3)：
D1)所述检测所述SNP1、SNP2、SNP3和SNP4这四个SNP的多态性或基因型的物质和/或所述单倍型的物质含有扩增包括所述SNP1、SNP2、SNP3和SNP4位点在内的玉米基因组DNA片段的PCR引物；
D2)所述检测玉米麦基因组中SNP1、SNP2、SNP3和SNP4位点的多态性或基因型的物质可为含有所述PCR引物的PCR试剂；
D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
所述PCR引物可为引物对4316348、2485121、9-76s、4338045、4339512和或4317885。
本发明通过将玉米单倍体诱导系CAUHOI(作为父本)和CAU5(作为母本)杂交得到F1代玉米，在F1自交后代(F2)筛选具有不同ZmDMP基因单倍型和基因型的单株，获得新的zmdmp基因单倍型为H5(CGAG)单倍型的玉米。实验证明，将H5(CGAG)单倍型的玉米作为母本与父本玉米单倍体诱导系杂交两代后自交得到的BC2F2代中的H5单倍型的玉米与玉米单倍体诱导系相比可显著提高对测验种郑单958的单倍体诱导率。
附图说明
图1为不同单倍型诱导材料的诱导率。a：2019年海南；b：2020年北京。横坐标haplotype：单倍型
图2为重组单倍型的诱导率。a：单倍型H5的诱导率；b：单倍型H6的诱导率。R87、R88、R160和R170分别为重组家系的名称。
图3为CAUHOI背景上H5单倍型玉米的单倍体诱导率与CAUHOI单倍体诱导率的比较。
图4为H5单倍型类型和zmdmp自然突变的H1单倍型类型在CAU5背景上的单倍体诱导率比较。A：H5单倍型类型；B：zmdmp的H1单倍型类型。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的CAU5，在文献“Dong,X.,et al.(2014)."Marker-assistedselection and evaluation of high oil in vivo haploid inducers in maize."Molecular Breeding 34(3):1147-1158.”中公开过，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的CAUHOI，在文献“Li,L.and X.Xu,et al.(2009)."Morphologicaland molecular evidences for DNA introgression in haploid induction via a highoil inducer CAUHOI in maize."Planta 230(2):367-376.”中公开过，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中的172份材料在文献“Yang,X.,et al.,Characterization of aglobal germplasm collection and its potential utilization for analysis ofcomplex quantitative traits in maize.Molecular Breeding,2011.28(4):p.511-526.”中公开过，公众可从申请人处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
下述实施例中所涉的玉米品种郑单958的审定编号为国审玉20000009。记载该品种的非专利文献有“Wu PH,Li HC,Ren J,et al.Mapping of maternal QTLs for in vivohaploid induction rate in maize(Zea mays L.).Euphytica,2014,196(3):413-421”等，公众可从北京德农种业有限公司获得。
实施例1、提高ZmDMP基因最优变异序列的构建及验证
1.诱导系CAUHOI和CAU5的ZmDMP基因的变异
比较玉米单倍体诱导系材料CAUHOI和玉米单倍体诱导系CAU5的ZmDMP基因序列，发现CAU5与CAUHOI相比，在ZmDMP基因的编码区存在6个碱基的替换，其中4个碱基为错义突变，将这4个突变碱基的位点分别命名为SNP1、SNP2、SNP3和SNP4(如表1)。SNP1对应序列表中序列2的第131位，其核苷酸为T或C；SNP2对应序列表中序列2的第259位，其核苷酸为G或A；SNP3对应序列表中序列2的第457位，其核苷酸为A或G；SNP4对应序列表中序列2的第548位，其核苷酸为G或C。序列表中序列2的y表示t或c，r表示g或a，s表示c或g。
表1：ZmDMP基因的单倍型分型
Figure BDA0002941363380000061
注：SNP下面的数字代表其在序列表中序列2上的位置。加粗的碱基代表与WT相比发生突变的碱基。
2.材料收集和基因分型
收集172份玉米材料，每份材料选取10粒种子浸泡12h，之后置于发芽纸上进行发芽，待三叶一心时期，取叶片，利用CTAB方法提取DNA。利用引物164072扩增并测序ZmDMP基因，其中164072左引物序列：5’-TTGAACTCAAGGGGTCGGAG-3’，右引物序列：5’-ACAGACACCGTCACGCTAAA-3’。分析比较172份材料中ZmDMP基因序列，各个玉米材料的ZmDMP基因型检测结果如表1所示。结果显示SNP1位点有2种基因型(简称SNP1基因型)，即TT或CC，基因型TT是SNP1为T的纯合型，基因型CC是SNP1为C的纯合型；SNP2位点有2种基因型(简称SNP2基因型)，即GG或AA，基因型GG是SNP2为G的纯合型，基因型AA是SNP2为A的纯合型；SNP3位点有2种基因型(简称SNP3基因型)，即AA或GG，基因型AA是SNP3为A的纯合型，基因型GG是SNP3为G的纯合型；SNP4位点有2种基因型(简称SNP3基因型)，即GG或CC，基因型GG是SNP4为G的纯合型，基因型CC是SNP4为C的纯合型。在收集的自然供试材料中，这4个SNP组合即单倍型组合共存在5种单倍型：野生型单倍型WT(TGAG)、单倍型H1(CAGC)、单倍型H2(TAGG)、单倍型H3(TGGC)和单倍型H4(TGGG)。单倍型WT(TGAG)是SNP1为T、SNP2为G、SNP3为A且SNP4为G的组合，单倍型H1(CAGC)是SNP1为C、SNP2为A、SNP3为G且SNP4为C的组合，单倍型H2(TAGG)是SNP1为T、SNP2为A、SNP3为G且SNP4为G的组合，单倍型H3(TGGC)是SNP1为T、SNP2为G、SNP3为G且SNP4为C的组合，单倍型H4(TGGG)是SNP1为T、SNP2为G、SNP3为G且SNP4为G的组合。其中玉米单倍体诱导系材料CAUHOI具有WT(TGAG)单倍型，CAU5具有H1(CAGC)单倍型。
ZmDMP基因的野生型单倍型WT(TGAG)单倍型对应的ZmDMP基因序列为序列表中序列3所示。WT(TGAG)单倍型对应的纯合基因型玉米的ZmDMP的基因型是TTGGAAGG，ZmDMP基因型TTGGAAGG是SNP1基因型为TT、SNP2基因型为GG、SNP3基因型为AA且SNP4基因型为GG的四个SNP组合基因型；ZmDMP基因的突变体单倍型(zmdmp)H1(CAGC)单倍型对应的纯合基因型玉米的zmdmp基因型是CCAAGGCC，zmdmp基因型CCAAGGCC是SNP1基因型为CC、SNP2基因型为AA、SNP3基因型为GG且SNP4基因型为CC的四个SNP组合基因型；ZmDMP基因的突变体单倍型(zmdmp)H2(TAGG)单倍型对应的纯合基因型玉米的基因型是TTAAGGGG，基因型TTAAGGGG是SNP1基因型为TT、SNP2基因型为AA、SNP3基因型为GG且SNP4基因型为GG的四个SNP组合基因型；ZmDMP基因的突变体单倍型(zmdmp)H3(TGGC)单倍型对应的纯合基因型玉米的基因型是TTGGGGCC，基因型TTGGGGCC是SNP1基因型为TT、SNP2基因型为GG、SNP3基因型为GG且SNP4基因型为CC的四个SNP组合基因型；ZmDMP基因的突变体单倍型(zmdmp)H4(TGGG)单倍型对应的纯合基因型玉米的基因型是TTGGGGGG，基因型TTGGGGGG是SNP1基因型为TT、SNP2基因型为GG、SNP3基因型为GG且SNP4基因型为GG的四个SNP组合基因型。其中CAUHOI的ZmDMP的基因型是TTGGAAGG，CAU5的zmdmp的基因型是CCAAGGCC。
3.不同单倍型的诱导材料构建
从步骤2的172份玉米材料中选择具有H1(CAGC)单倍型的3份材料C228、丹340(DAN340)和W22；选择具有H2(TAGG)单倍型的2份材料CN12-1532和大刍草；选择具有H3(TGGC)单倍型的2份材料C116A和C7；选择具有H4(TGGG)单倍型的6分材料B104、CIMBL61、GY237、CIMBL95、DK516M和WH413，共13份材料作为不同单倍型的供体亲本材料(提供H1-H4类型的ZmDMP等位基因)，在2017年北京该13份供体亲本为母本分别与轮回亲本材料CAUHOI(接受H1-H4类型的ZmDMP等位基因)为父本进行杂交得到13份F1代材料。其中CAUHOI中含有zmpla1基因(与诱导单倍体的产生相关的磷脂酶基因)和R1-nj花青素颜色标记基因。
分别将得到的13份F1代材料(作为母本)与轮回亲本CAUHOI(作为父本)回交两代后自交，得到13份BC2F1代材料，从每份BC2F1材料中筛选含有R1-nj颜色标记纯合基因、zmpla1纯合基因且ZmDMP-zmdmp杂合基因的类型的材料，于2019年北京种植，自交得到每份材料的BC2F2代植株。分别从BC2F2植株中分离得到含有不同ZmDMP基因单倍型和基因型的A型和B型单株。A型单株表示与轮回亲本材料CAUHOI的ZmDMP基因型(TTGGAAGG)，即WT单倍型(TGAG)一致的植株，B型表示与对应的13份供体亲本材料的zmdmp基因型，即H1-H4单倍型一致的植株。其中zmpla1基因和zmdmp基因的基因型或单倍型鉴定引物如表2所示，zmdmp基因在zmpla1基因存在时可以明显提高诱导率，因此，在zmpla1基因存在的基础上研究ZmDMP的功能。其中两对引物PLA和pla用于鉴定Zmpla1基因是否为纯合，纯合zmpla1基因的材料，引物pla的琼脂糖凝胶电泳出现单一条带，引物PLA的琼脂糖凝胶电泳无带；纯合ZmPLA1基因的材料，引物pla的琼脂糖凝胶电泳无带，引物PLA的琼脂糖凝胶电泳出现单一条带；杂合ZmPLA1基因的材料，引物pla的琼脂糖凝胶电泳有条带，引物PLA的琼脂糖凝胶电泳出现条带。引物对4316348、2485121、9-76s、4338045、4339512和4317885用于检测ZmDMP基因型和待检测材料含有的ZmDMP单倍型，这6对引物均是鉴别zmdmp基因的多态性引物，其中每个材料使用两对引物检测zmdmp基因，如两对引物的基因型一致，则认为扩增的区段没有发生交换，ZmDMP基因型与该标记条带一致的亲本一样(如：用4316348引物扩增出来的CAUHOI是上带，DAN340为下带，在BC2F2群体中，如果植株的条带是下带，则认为是和DAN340一样的基因型，B型，即单倍型为H1；如果植株的条带是上带，则认为是和CAUHOI一样的基因型，A型，即单倍型为WT。另外一对鉴别DAN340的引物4338045是一样的，是用2对引物双重鉴别)。
表2.ZmDMP不同单倍型材料鉴别引物
Figure BDA0002941363380000081
4.不同单倍型的诱导率结果
将步骤3中的13份材料的BC2F2代中的ZmDMP-zmdmp杂合基因型植株再进行自交一代得到13份材料的BC2F3代植株。BC2F3代植株也按照步骤3中方法分离得到携带不同ZmDMP基因单倍型的A型(和父本轮回亲本CAUHOI相同)和B型(和母本供体亲本相同)单株。选取BC2F2代植株的A型和B型单株各约10株，于2019年海南，以郑单958为母本进行杂交，在其杂交的F1果穗上，根据颜色标记，鉴别单倍体(胚乳有色，胚无色为单倍体)；同样选取BC2F3代植株的A型和B型单株各约10株，于2020年北京，以郑单958为母本进行杂交，在其杂交的F1果穗上根据颜色标记鉴别单倍体。同时按照下列公式进行诱导率的计算。
单倍体诱导率(HIR)＝单倍体籽粒数/(杂合籽粒数+单倍体籽粒数+胚败育籽粒数)×100％。
以郑单958为测验种，13份不同单倍体诱导系材料的单倍体诱导率结果如图1所示，无论在2019年海南还是2020年北京，与WT(TGAG)的CAUHOI类诱导材料相比，H1(CAGC)单倍型单倍体诱导系材料均显著提高了单倍体诱导率，H2(TAGG)、H3(TGGC)和H4(TGGG)单倍型单倍体诱导系材料均显著降低了单倍体诱导率。即与CAUHOI类材料相比，SNP1、SNP2、SNP3且SNP4四个SNP位点核苷酸的同时突变会显著提高单倍体诱导率，如H1(CAGC)单倍型材料；而只是SNP2且SNP3位点核苷酸的突变，或只是SNP3且SNP4位点核苷酸的突变，或只是SNP3位点核苷酸的突变均会降低单倍体诱导率，如H2(TAGG)、H3(TGGC)或H4(TGGG)单倍型。因此推测，与CAUHOI类材料相比，SNP1位点核苷酸的突变可提高单倍体诱导率，SNP2、SNP3和/或SNP4位点的突变均降低单倍体诱导率。
5.ZmDMP基因的新单倍型的构建，并验证步骤4中的推论。
将CAUHOI(作为父本)和CAU5(作为母本)杂交得到F1代玉米，在F1自交后代(F2)筛选具有不同ZmDMP基因单倍型和基因型的单株，获得新的zmdmp基因H5(CGAG)单倍型两个单株(记为R87和R88)和zmdmp基因H6(TAGC)单倍型两个单株(记为R160和R170)。zmdmp基因H5(CGAG)单倍型是SNP1为C、SNP2为G、SNP3为A且SNP4为G的组合，zmdmp基因H6(TAGC)单倍型是SNP1为T、SNP2为A、SNP3为G且SNP4为C的组合。zmdmp基因H5(CGAG)单倍型对应的纯合基因型玉米的zmdmp的基因型是CCGGAAGG，基因型CCGGAAGG是SNP1基因型为CC、SNP2基因型为GG、SNP3基因型为AA且SNP4基因型为GG的四个SNP组合基因型；zmdmp基因H6(TAGC)单倍型对应的纯合基因型玉米的基因型是TTAAGGCC，基因型TTAAGGCC是SNP1基因型为TT、SNP2基因型为AA、SNP3基因型为GG且SNP4基因型为CC的四个SNP组合基因型。
将zmdmp基因H5(CGAG)单倍型两个单株(记为R87和R88)和zmdmp基因H6(TAGC)单倍型单株(记为R160和R170)分别作为母本材料按照步骤3的方法分别与父本材料CAUHOI(ZmDMP基因单倍型和基因型)杂交两代后自交得到的BC2F2代(R87家系、R88家系、R160家系和R170家系)中，分离出A型(与父本ZmDMP基因单倍型和基因型一致)的单株、B型(与母本zmdmp基因单倍型和基因型一致)的单株和H型(ZmDMP基因型是WT与母本的杂合类型，即ZmDMP-zmdmp)的单株。所得H型单株中ZmDMP-zmdmp的基因型是TCGGAAGG，即SNP1位点的基因型为TC，基因型TC是SNP1为T和C的杂合型；SNP2位点的基因型为GG，基因型GG是SNP2为G的纯合型；SNP3位点的基因型为AA，基因型AA是SNP3为A的纯合型；SNP4位点的基因型为GG，基因型GG是SNP4为G的纯合型。分别用郑单958为测验种(母本)测定所得A型、B型和H型的单株作为单倍体诱导系的单倍体诱导率，同时以玉米单倍体诱导系CAUHOI作为对照。
单倍体诱导率(HIR)＝单倍体籽粒数/(杂合籽粒数+单倍体籽粒数+胚败育籽粒数)×100％。
结果如图2和图3所示，R87家系中A型单株、B型单株和H型单株的单倍体诱导率分别为2.38％、4.14％和3.03％，R88家系中A型单株、B型单株和H型单株的单倍体诱导率分别为1.99％、4.04％和3.02％；对照玉米单倍体诱导系CAUHOI的单倍体诱导率为2.50％。H5(CGAG)单倍体诱导材料中的两个交换家系(即R87交换家系和R88交换家系)中，B型单株(具有H5单倍型)的单倍体诱导率均显著高于杂合H型，显著高于A型(具有WT单倍型)(图2中a)；H6(TAGC)单倍体诱导材料中的两个交换家系中，A型(具有WT单倍型)单株的单倍体诱导率均显著高于杂合H型，显著高于B型(具有H6单倍型)(图2中b)。即相对于CAUHOI材料4个SNP位点核苷酸类型(WT单倍型)，SNP1位点核苷酸突变(H5单倍型)提高了对郑单958单倍体诱导率；SNP2、SNP3且SNP4位点的突变(H6单倍型)降低了对郑单958单倍体诱导率。SNP1位点发生核苷酸突变且SNP2、SNP3和SNP4位点核苷酸不发生突变的类型对应的zmdmp基因单倍型H5(CGAG)单倍型，是在172份实验材料中不存在的提高单倍体诱导率的新类型。H5(CGAG)单倍型对应的zmdmp基因序列为序列表中序列1所示(序列表中序列1的第131位核苷酸为C、第259位核苷酸为G、第457位核苷酸为A、第548位核苷酸为G)。H5(CGAG)单倍型对应的zmdmp基因型为CCGGAAGG，zmdmp基因型CCGGAAGG是SNP1基因型为CC、SNP2基因型为GG、SNP3基因型为AA且SNP4基因型为GG的四个SNP组合基因型；H5(CGAG)单倍型对应序列表中序列2的SNP1为C、SNP2为G、SNP3为A且SNP4为G的组合。
上述结果表明，在CAUHOI背景上，zmdmp基因单倍型为H5单倍型的玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率高于单倍型为WT单倍型的玉米单倍体诱导系；同时，H5(CGAG)单倍型的B型单株(图3中由H5代表)对郑单958的单倍体诱导率显著高于对照单倍体诱导系CAUHOI(图3)。因此，将H5(CGAG)单倍型导入CAUHOI单倍体诱导系得到的含有H5单倍型的玉米单倍体诱导系，可显著提高CAUHOI单倍体诱导系的玉米单倍体诱导率。
6.ZmDMP基因的新单倍型H5(CGAG)的验证
将步骤5中得到的zmdmp基因单倍型是H5(CGAG)单倍型的R87家系和R88家系的B型单株(具有H5单倍型)(作为母本)分别与CAU5(作为父本)进行杂交后回交2代，再自交得到BC2F2，从BC2F2中筛选出具有和父本CAU5的单倍型相同的新的A型单株(具有H1单倍型)和新的B类型单株(具有H5单倍型)，用郑单958为测验种测定其单倍体诱导率，同时以玉米单倍体诱导系CAU5作为对照。
结果如图4所示，所得新的B型单株(具有H5单倍型)的单倍体诱导率(8.14％)显著高于新的A型单株(具有H1单倍型)的单倍体诱导率(6.26％)，即在CAU5背景上，zmdmp基因单倍型为H5(CGAG)的玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率高于H1单倍型(CAGC)玉米单倍体诱导系的单倍体诱导系。因此，将H5(CGAG)单倍型导入CAU5单倍体诱导系，可显著提高CAU5单倍体诱导系的玉米单倍体诱导率。进一步说明步骤5中通过人工创制的ZmDMP新单倍型H5(CGAG)是最优的单倍型，其对应的基因型为CCGGAAGG；将H5(CGAG)单倍型或基因型CCGGAAGG导入玉米单倍体诱导系材料可显著提高玉米单倍体诱导系的玉米单倍体诱导率。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 中国农业大学
<120> 一种提高玉米单倍体诱导系诱导率的DNA分子
<130> GNCSQ210511
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 1
atggatcgca gcaacgccgg tgcggtgtcc gtcgaggtgc gcggcggcgg cggcggctcg 60
ccgccgggcg cgggaaggaa gcgccgcgcg gtggcgaggg gcgtgcagaa gacgctctcc 120
aagacgtcca cgctggccaa cttcctcccc acgggcacgc tgctaacctt cgagatgcta 180
ctcccggccg ccgcaggcga cggcacctgc tcggcggtca gcgccgcgat gctcagggcc 240
ctgctcgcgc tctgcgccgc ctcctgcttc ctcttccact tcaccgacag cttccgcgcc 300
ccggacggga aggtgtacta cggcttcgtc acgccgcggg gcctgtcgct gttcaggacc 360
gggctcggcg tcgaggtgcc cagggaggaa aggtaccggc tcgccttcgt cgacgtcgtg 420
cacgctgtca tgtccgtgct ggtctttgcg gccgtcacgc tcgccgacta ccgggtctcc 480
gggtgcctcg tcgccggcca ccgcaaggag atggacgagg tgatggagag cttcccgctc 540
atggtgggcg ccgtgtgcag cggcctcttc ctcttgttcc ccaacacccg ctacggcatc 600
ggttgtttgg ctccgtaa 618
<210> 2
<211> 618
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<400> 2
atggatcgca gcaacgccgg tgcggtgtcc gtcgaggtgc gcggcggcgg cggcggctcg 60
ccgccgggcg cgggaaggaa gcgccgcgcg gtggcgaggg gcgtgcagaa gacgctctcc 120
aagacgtcca ygctggccaa cttcctcccc acgggcacgc tgctaacctt cgagatgcta 180
ctcccggccg ccgcaggcga cggcacctgc tcggcggtca gcgccgcgat gctcagggcc 240
ctgctcgcgc tctgcgccrc ctcctgcttc ctcttccact tcaccgacag cttccgcgcc 300
ccggacggga aggtgtacta cggcttcgtc acgccgcggg gcctgtcgct gttcaggacc 360
gggctcggcg tcgaggtgcc cagggaggaa aggtaccggc tcgccttcgt cgacgtcgtg 420
cacgctgtca tgtccgtgct ggtctttgcg gccgtcrcgc tcgccgacta ccgggtctcc 480
gggtgcctcg tcgccggcca ccgcaaggag atggacgagg tgatggagag cttcccgctc 540
atggtggscg ccgtgtgcag cggcctcttc ctcttgttcc ccaacacccg ctacggcatc 600
ggttgtttgg ctccgtaa 618
<210> 3
<211> 618
<212> DNA
<213> 玉米（Zea mays）
<400> 3
atggatcgca gcaacgccgg tgcggtgtcc gtcgaggtgc gcggcggcgg cggcggctcg 60
ccgccgggcg cgggaaggaa gcgccgcgcg gtggcgaggg gcgtgcagaa gacgctctcc 120
aagacgtcca tgctggccaa cttcctcccc acgggcacgc tgctaacctt cgagatgcta 180
ctcccggccg ccgcaggcga cggcacctgc tcggcggtca gcgccgcgat gctcagggcc 240
ctgctcgcgc tctgcgccgc ctcctgcttc ctcttccact tcaccgacag cttccgcgcc 300
ccggacggga aggtgtacta cggcttcgtc acgccgcggg gcctgtcgct gttcaggacc 360
gggctcggcg tcgaggtgcc cagggaggaa aggtaccggc tcgccttcgt cgacgtcgtg 420
cacgctgtca tgtccgtgct ggtctttgcg gccgtcacgc tcgccgacta ccgggtctcc 480
gggtgcctcg tcgccggcca ccgcaaggag atggacgagg tgatggagag cttcccgctc 540
atggtgggcg ccgtgtgcag cggcctcttc ctcttgttcc ccaacacccg ctacggcatc 600
ggttgtttgg ctccgtaa 618

Claims (10)

1.诱导玉米单倍体的方法，其特征在于：制备含有H5单倍型的玉米，使用含有H5单倍型的玉米作为玉米单倍体诱导系，诱导母本玉米材料得到玉米单倍体；
所述H5单倍型是SNP1为C、SNP2为G、SNP3为A且SNP4为G的单倍型；
所述SNP1是玉米基因组中的一个SNP位点，为序列表中序列2的第131位核苷酸，其为T或C；所述SNP2是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第259位核苷酸，其为G或A；所述SNP3是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第457位核苷酸，其为A或G；所述SNP4是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第548位核苷酸，其为G或C。
2.一种提高玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率的方法，所述方法包括将H5单倍型导入已有玉米单倍体诱导系得到含有H5单倍型的玉米单倍体诱导系，使用含有H5单倍型的玉米单倍体诱导系诱导母本玉米材料，以提高所述已有玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率；所述H5单倍型是SNP1为C、SNP2为G、SNP3为A且SNP4为G的单倍型；
所述SNP1是玉米基因组中的一个SNP位点，为序列表中序列2的第131位核苷酸，其为T或C；所述SNP2是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第259位核苷酸，其为G或A；，所述SNP3是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第457位核苷酸，其为A或G；所述SNP4是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第548位核苷酸，其为G或C。
3.DNA分子，其特征在于：所述DNA分子的核苷酸序列是序列表中的序列1；序列表中序列1的第131位核苷酸为C、序列表中序列1的第259位核苷酸为G、序列表中序列1的第457位核苷酸为A、序列表中序列1的第548位核苷酸为G。
4.玉米H5单倍型在提高玉米单倍体诱导系的诱导率中的应用；所述H5单倍型是SNP1为C、SNP2为G、SNP3为A且SNP4为G的单倍型；
所述SNP1是玉米基因组中的一个SNP位点，为序列表中序列2的第131位核苷酸，其为T或C；所述SNP2是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第259位核苷酸，其为G或A；，所述SNP3是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第457位核苷酸，其为A或G；所述SNP4是玉米基因组的一个SNP位点，为序列表中序列2的第548位核苷酸，其为G或C。
5.根据权利要求1或2所述的方法或权利要求4所述的应用，其特征在于：所述含有H5单倍型的玉米和/或所述H5单倍型是通过杂交育种得到的。
6.根据权利要求5所述的方法或应用，其特征在于：所述含有H5单倍型的玉米和/或H5单倍型的制备方法包括将玉米单倍体诱导系CAUHOI和玉米单倍体诱导系CAU5杂交得到F1代，从所述F1代的后代中选出含有H5单倍型的玉米。
7.权利要求1或2所述的方法和/或权利要求3所述的DNA分子的下述任一种应用：
A1)在提高玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率中的应用；
A2)在诱导玉米单倍体中的应用；
A3)在玉米育种中的应用；
A4)在制备提高玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率的产品中的应用。
8.产品，其特征在于所述产品含有权利要求1中所述含有H5单倍型的玉米和/或权利要求3所述的DNA分子和/或权利要求4中所述的玉米H5单倍型，且可为下述G1)-G3)中的任一种：
G1)提高玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率的产品；
G2)由于诱导玉米单倍体的产品；
G3)用于玉米育种的产品。
9.检测权利要求1中所述SNP1、SNP2、SNP3和SNP4这四个SNP的多态性或基因型的物质和/或检测权利要求1中所述单倍型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米单倍体诱导系的单倍体诱导率中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述检测权利要求1中所述SNP1、SNP2、SNP3和SNP4这四个SNP的多态性或基因型的物质和/或检测权利要求1中所述单倍型的物质为如下D1)、D2)或D3)：
D1)所述检测权利要求1中所述SNP1、SNP2、SNP3和SNP4这四个SNP的多态性或基因型的物质和/或检测权利要求1中所述单倍型的物质含有扩增包括所述SNP1、SNP2、SNP3和SNP4位点在内的玉米基因组DNA片段的PCR引物；
D2)所述检测玉米麦基因组中SNP1、SNP2、SNP3和SNP4位点的多态性或基因型的物质为含有所述PCR引物的PCR试剂；
D3)含有D1)所述PCR引物或D2)所述PCR试剂的试剂盒。
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