CN102690821A - 小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的分子标记及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于作物育种学领域，涉及小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的分子标记及其应用。所述的分子标记选自MAG8217或MAG2462中的任意一种，与Fhb5基因的遗传距离分别为0.02cM和0cM。本发明在国际上首次获得了与Fhb5最为紧密连锁的分子标记。这两个标记都为共显性标记，具有检测方便、扩增稳定、简便等优点。用标记MAG8217和MAG2462检测Fhb5基因，可以确定Fhb5的存在与否以及存在状态，并预测小麦的赤霉病抗性，进而快速筛选携有Fhb5的植株并用于抗病品种的选育。同时利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对表型的影响。利用本发明与Fhb5紧密连锁的分子标记，可以大大节省抗病材料的筛选时间和劳力，并加强预测的准确性，还可以加快Fhb5基因的克隆。
Description
技术领域
本发明属于作物育种学领域，涉及小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的分子标记及其应用。
技术背景
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，提供人类大约20％的能量。在小麦生产中许多生物与非生物逆境直接影响小麦的产量与品质。赤霉病就是其中最重要的一种生物逆境，严重影响小麦的品质和产量。抗病品种的选育和应用是控制赤霉病最经济有效的方法，抗病基因的发掘是抗病育种的前提和基础，而开发与抗病基因紧密连锁的分子标记更是应用抗病基因的关键。
小麦对赤霉病的抗性主要有五种类型(Mesterhazy 1995)，其中抗侵染(Type I)和抗扩展(Type II)(Schroeder and Christensen 1963)是最主要的两种类型。Type I抗性主要反映小麦抵抗病原菌的初侵染，是小麦抵御赤霉菌危害的第一道屏障，在抗性反应中起着至关重要的作用。
许多研究表明小麦对赤霉病的抗性是典型的数量性状，受多基因控制。迄今为止已经定位了200多个抗赤霉病QTL，其中位于5A染色体上的抗赤霉病侵染QTL存在于多个抗性种质中，表达稳定且效应较强。Lin et al(2006)利用望水白×南大2419重组自交系群体在望水白的5A染色体上检测到一个抗侵染主效QTL，可解释15％左右的表型变异，且在各次实验中LOD值都在3以上。Xue et al.(2010a)利用近等基因系证实该QTL的效应。Xue et al.(2010b)利用重组自交系群体和近等基因系群体，通过筛选和鉴定重组体的方法将5A QTL精细定位到相距0.3cM的Xgwm304-XMAG2462区间，并将其命名为Fhb5，且研究表明该基因为显性基因。
由于小麦赤霉病抗性具有典型的数量性状特征，受多基因控制，易受环境影响，早期世代很难对其进行选择。此外，许多抗赤霉病种质的农艺性状较差，地区适应性较强，利用传统育种方法培育抗性品种费时费力可能也得不到预期的结果。分子标记辅助选择育种与传统育种相比，可以在早期世代确定目标基因型，且选择不受基因表达及环境条件的影响，能够提高选择的准确性，从而加快育种进程(Collard and Mackill 2008)。虽然目前已有研究利用分子标记辅助选择技术选育了Fhb5的近等基因系，但是所选育的Fhb5近等基因系旗叶较窄，这在育种中是不利的选择(Xue et al.2010a)。因此与其更紧密连锁分子标记的开发有利于减少选择时的连锁累赘，提高对Fhb5的应用效率。此外，Fhb5虽然被精细定位，但是所在区间所对应的物理距离还是很大，有必要开发更紧密连锁的分子标记加快该基因的克隆研究。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供与小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5更加紧密连锁的分子标记。
本发明的另一个目的是提供该小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的分子标记的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的分子标记，用标记引物MAG8217-F：SEQ ID NO.1，MAG8217-R：SEQ ID NO.2扩增小麦品种DNA，获得的扩增片段为80bp，即为小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5连锁的分子标记MAG8217，该该标记在抗赤霉病品种望水白和感赤霉病品种绵阳99-323中用TaqI酶切消化存在多态，该标记为共显性分子标记，与Fhb5紧密连锁，利用Mapmaker Macintosh V 3.0测得该标记与Fhb5基因的遗传距离为0.02cM；
或用标记引物MAG2462-F：SEQ ID NO.3，MAG2462-R：SEQ ID NO.4扩增小麦品种DNA，获得的扩增片段为130bp，即为小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5连锁的分子标记MAG2462，该标记为共显性分子标记，与Fhb5紧密连锁，利用Mapmaker MacintoshV 3.0测得该标记与Fhb5基因共分离。
所述的分子标记在小麦种质资源中抗赤霉病侵染基因Fhb5的鉴定中的应用。
小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的分子标记方法，用上述的任意一对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记MAG8217的引物MAG8217-F和MAG8217-R能够扩增出80bp的扩增片段，或者用分子标记MAG2462的引物MAG2462-F和MAG2462-R能够扩增出130bp的扩增片段，则标志着待检小麦存在抗赤霉病侵染基因Fhb5
本发明所述的分子标记在筛选抗赤霉病小麦中的应用。
利用上述的分子标记筛选抗赤霉病小麦的方法为：用上述的任意一对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记MAG8217的引物MAG8217-F和MAG8217-R能够扩增出80bp的扩增片段，或者用分子标记MAG2462的引物MAG2462-F和MAG2462-R能够扩增出130bp的扩增片段，则标志着待检小麦为存在抗赤霉病侵染基因Fhb5的抗赤霉病小麦。
所述的分子标记的引物在克隆抗赤霉病侵染基因Fhb5中的应用。
上述小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的分子标记是通过以下方法获得的：
(一)望水白Fhb5近等基因系NMAS015与其轮回亲本绵阳99-323F2:3群体的创建与Fhb5区段重组体的筛选：
(1)NMAS015(♀)与小麦品种绵阳99-323
进行杂交得到杂种F1，F1自交产生F2群体；
(2)利用Fhb5的边界标记筛选F2群体中在该区段发生重组的杂合单株，利用相同标记在其F3代筛选在该区段发生重组的纯合单株。
(二)重组体抗病表型的鉴定
(3)重组体开花前十天左右在田间撒播感病麦粒接种，一周后重复一次。接种15天后调查病小穗率评价其抗侵染性；
(三)分子标记分析
(4)用SDS法提取抗病亲本NMAS015、感病亲本绵阳99-323及F2群体各单株的DNA；用25对SSR引物(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)和24对EST标记引物对NMAS015，绵阳99-323，中国春以及中国春缺失系5AS1-0.40-0.75，C-5AS1-0.40(Endo and Gill 1996)进行多态性分析和特异性分析。
(5)选择在亲本间扩增出多态、且能缺失定位到5AS1-0.40-0.75/C-5AS1-0.40bin的分子标记在F2代群体单株中扩增获取群体各单株的基因型资料，并且利用这些标记检测杂合重组体后代F3家系各单株的基因型；
PCR反应体系为12.5μl，其中10×buffer 1.25μl，25mM MgCl20.75μl，2.5mMdNTPs 1μl，左右引物各0.2μM，Taq酶(5u/μl)0.1μl，模板DNA 10ng，加水至12.5μl；
PCR扩增程序为94℃预变性3min后，94℃变性30sec，60℃退火1min，72℃延伸1min，循环35次，最后72℃延伸8min；在PE9600扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果。
(四)分子标记获得
(6)根据连锁交换规律，结合F2代群体各单株基因型资料与杂合重组体F3家系的田间抗病表型，利用软件MapmakerMacintoshV3.0构建望水白Fhb5的遗传连锁图，获得了与Fhb5最为紧密连锁的分子标记MAG8217和MAG2462。
有益效果
本发明在国际上首次获得了与Fhb5紧密连锁的分子标记MAG8217和MAG2462。可以加速抗病基因Fhb5在小麦抗病育种中的应用，并且还可以用于Fhb5基因的克隆。
1、获得了与Fhb5紧密连锁的分子标记MAG8217和MAG2462。在已知的分子标记中与Fhb5连锁最为紧密的是MAG2462，与Fhb5基因共分离，能够帮助该基因向推广品种中转移以及与其它抗病基因的聚合。
2、鉴定方便。这两个分子标记都为共显性标记，具有检测方便、扩增稳定、简便等优点。用标记MAG2462检测Fhb5基因，可以确定Fhb5的存在与否以及存在状态，并预测小麦的赤霉病抗性，进而快速筛选携有Fhb5的植株并用于抗病品种的选育。同时利用分子标记进行实验室检测可以避免环境对品种的影响。
3、提高抗病品种的选择鉴定效率，节约成本。在传统的抗赤霉病育种过程中，需要将携带有抗病基因的亲本与栽培品种进行一系列杂交，对后代群体单株进行抗病性鉴定，并且需要多年多点的表型鉴定；并且抗病表型鉴定易受环境的影响，表型鉴定结果有一定的误差。因此抗病品种的选育不仅费时，而且难度大，成本高。通过检测与抗赤霉病侵染基因Fhb5紧密连锁的分子标记，可以将表型鉴定的工作大大减少，并且在苗期就可鉴定出携有抗病基因Fhb5的单株，从而淘汰非目标植株。因此，通过检测与抗赤霉病侵染基因Fhb5共分离的分子标记MAG2462进行选择，不仅节约育种成本同时大大提高抗病品种的选择效率。
4、减少连锁累赘。由于小麦的赤霉病抗性往往和一些不良的农艺性状有一定的相关。早期借助分子标记选育的携带有Fhb5的抗赤霉病株系总表现较窄的旗叶，这可能由于QTL初步定位的区间比较大，致使选择导入的区间比较大，造成了一些连锁累赘。利用与抗赤霉病侵染基因Fhb5紧密连锁的分子标记可以减少选择时的连锁累赘，提高选择效率。
5、可用于克隆抗赤霉病侵染基因Fhb5研究。图位克隆抗赤霉病侵染基因Fhb5的前提在于获得与Fhb5紧密连锁的分子标记。MAG8217和MAG2462在所有已知分子标记中与Fhb5连锁最为紧密。
附图说明
图1MAG8217和MAG2462与小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的遗传连锁图，右边为遗传连锁图的标记，左侧数据为标记间的遗传距离。
图2MAG2462扩增带型。M为PUC19/MspI，左侧是分子量标记条带大小(bp)。1为绵阳99-323，2为NMAS015，3、4、13、14、18为感病基因型单株，5、7、8、9、10、15、16为抗病基因型单株，6、11、12、17为杂合基因型单株。箭头所指为特异扩增条带。
图3MAG8217扩增带型。1为绵阳99-323，2为NMAS015，3、4、5、6、7、8、9、10、11、13、14、15为感病基因型单株，12、17、19为抗病基因型单株，16、18、20、21为杂合基因型单株。箭头所指为特异扩增条带。
具体实施方式
实施例1
上述小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的分子标记是通过以下方法获得的：
(一)望水白Fhb5近等基因系NMAS015与其轮回亲本绵阳99-323F2:3群体的创建与Fhb5区段重组体的筛选：
(1)NMAS015(♀)与小麦品种绵阳99-323
进行杂交得到杂种F1，F1自交产生包含有2816个单株的F2群体；
(2)利用Fhb5的边界标记Xgwm304和Xgwm415(
et al.1998)在F2群体中筛到4个在该区段发生重组的杂合单株，利用相同标记在其F3代筛选得到10个在该区段发生重组的纯合单株。
(二)重组体抗病表型的鉴定
开花前十天左右在田间撒播感病麦粒对这些纯合重组体接种，一周后重复一次。接种15天后调查病小穗率。鉴定结果表明：这些重组体抗性分离明显，携带有Fhb5基因的株系与感病亲本相比，抗性有显著提高(表1)。
(三)多态性分子标记的筛选及重组体基因型分析
(1)首先利用其他图谱中位于Fhb5区段的25对SSR引物(http://wheat.pw.usda.gov/GG2/index.shtml)和24对EST标记引物对Fhb5近等基因系NMAS015和绵阳99-323进行多态性筛选，最终得到1个在亲本间有多态的SSR标记和1个在亲本间有多态的EST-STS标记，即MAG2462和MAG8217这两个分子标记。
(3)利用在亲本间有多态的分子标记MAG8217和MAG2462分析所有纯合重组体，这些重组体仅可分成2种重组类型(表1)。
(四)分子标记的获得
根据连锁交换规律，结合F2代群体各单株基因型资料与杂合重组体F3家系的田间抗病表型(表1)，利用软件Mapmaker Macintosh V3.0构建了望水白Fhb5的遗传连锁图，获得了与Fhb5紧密连锁的分子标记MAG8217和MAG2462，它们分别距Fhb5基因0.02cM、0cM。MAG8217和MAG2462分子标记引物扩增带型见图2和图3。
表1NMAS015-绵阳99-323F2:3群体中纯合重组体的基因型和表型
W代表望水白基因型，M代表绵阳99-323基因型，C1代表感病对照绵阳99-323，C2代表抗病对照NMAS015。*代表在P＝0.01水平上与感病对照绵阳99-323的表型差异显著。
Claims (6)
1.小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的分子标记，其特征在于：
用标记引物MAG8217-F：SEQ ID NO.1，MAG8217-R：SEQ ID NO.2扩增小麦品种DNA，获得的扩增片段为80bp，即为小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5连锁的分子标记MAG8217，该标记为共显性分子标记，与Fhb5紧密连锁，利用Mapmaker Macintosh V3.0测得该标记与Fhb5基因的遗传距离为0.02cM；
或用标记引物MAG2462-F：SEQ ID NO.3，MAG2462-R：SEQ ID NO.4扩增小麦品种DNA，获得的扩增片段为130bp，即为小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5连锁的分子标记MAG2462，该标记为共显性分子标记，与Fhb5紧密连锁，利用Mapmaker MacintoshV 3.0测得该标记与Fhb5基因共分离。
2.权利要求1所述的分子标记在小麦种质资源中抗赤霉病侵染基因Fhb5的鉴定中的应用。
3.小麦抗赤霉病侵染基因Fhb5的分子标记方法，其特征在于用权利要求1所述的任意一对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记MAG8217的引物MAG8217-F和MAG8217-R能够扩增出80bp的扩增片段，或者用分子标记MAG2462的引物MAG2462-F和MAG2462-R能够扩增出130bp的扩增片段，则标志着待检小麦存在抗赤霉病侵染基因Fhb5。
4.权利要求1所述的分子标记在筛选抗赤霉病小麦中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于利用权利要求1所述的分子标记在筛选抗赤霉病小麦的方法为：用权利要求1所述的任意一对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物，如果用分子标记MAG8217的引物MAG8217-F和MAG8217-R扩增出80bp的扩增片段，或者用分子标记MAG2462的引物MAG2462-F和MAG2462-R能够扩增出130bp的扩增片段，则标志着待检小麦为存在抗赤霉病侵染基因Fhb5的抗赤霉病小麦。
6.权利要求1所述的分子标记的引物在克隆抗赤霉病侵染基因Fhb5中的应用。
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