DE2633490C3 - Verfahren zur Isolierung von Flavonoidaglykonen und -glykosiden - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Flavonoidglykonen und -glykosiden aus Pflanzenextrakten, die neben den Flavonoiden eine Reihe von Ballaststoffen enthalten.

Flavonoide sind eine sehr wichtige Klasse von Pflanzenpigmenten, welche in der Pflanzenwelt sehr weit verbreitet vorkommen. Es handelt sich um Ab-' kömmlinge des 2-Phenylbenzopyrans und sie sind nach dem C₆-C₃-C₆ Bauprinzip aufgebaut. Unter dem Ausdruck Flavonoide im Sinne der vorliegenden Erfindung sind hierbei Stoffe zu verstehen, die diesem C₆-C₃-C₆ Bauprinzip entsprechen und gemäß dem »Lehrbuch der Pharmakognosie« von E. Steinegger und R. Hansel, 3. Aufl., Springer Verlag 1972, Seite 137 ff. als eigentliche Flavonoide bezeichnet werden. Diese Flavonoide sind durch ihre gute Wirkung auf Herz und Blutgefäße bekanntgeworden.

Die zahlreichen Literaturstellen, die über die Isolierung von Flavonoiden berichten, beziehen sich auf die Darstellung eines einzelnen, bestimmten Flavonoids aus einer bestimmten Droge und stellen durchwegs komplizierte Verfahren dar, denen entweder umständliche Ausschüttlungsverfahren (siehez. B. Hörhammer, L., Wagner, H. und Dhingra, H.,: Arch.pharm., 292, 83 [1959] u. a. m.) oder aufwendige säulenchromatograpnsche Verfahren (siehe z. B. Adamska, M. und Lutomski, J.: Planta med. 20, 124 [1971] u. a. m.) zugrunde liegen. Die Nachteile dieser Verfahren bestehen vor allem im großen Arbeits- und Zeitaufwand.

Es wurde auch schon versucht, sowohl die Trennung von Flavonoidgemischen als auch die Isolierung

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bestimmter Flavonoide über eine Adsorptionschro- Bereich von 7 bis 13 besitzt.
matcgraphie durchzuführen, bei der als Adsorptions- Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demmittel Magnesol, ein saures Magnesiumsilikat, ver- nach ein Verfahren zur Isolierung von Flavonoidglywendet wird. konen und -glykosiden aus diese enthaltenden Ex-So wird z. B. zur Trennung von Flavonoiden gernäß 5 trakten durch Bildung von Komplexen dieser C. H. Ice und S. H. Wender, Anal. Chem. 1961, Flavonoide mit Metallionen, das dadurch gekenn-24, 1916 bzw. US-PS 2738346, das Flavonoidge- zeichnet ist, daß Lösungen der Flavonoide in einem misch in einem wasserfreien Lösungsmittel, z. B. was- gegebenenfalls geringe Mengen Wasser enthaltenden serfreiem Aceton, der Magnesolsäule aufgegeben, organischen Lösungsmittel der Säulenchromatograworauf mit wassergesättigtem Äthylacetat eluiert io phie unter Verwendung von solchen gekörnten Oxywird. Flavonoide, wie Quercetin und Morin oder Xan- den, Hydroxyden oder basischen Salzen zweiwertiger torhamnin, Quercitrin und Quercetrin lassen sich Kationen, die im verwendeten organischen Lösungshierbei fraktioniert eluieren und Rutin läßt sich mit mittel unlöslich, in verdünnten Säuren jedoch löslich dieser Methode feinreinigen. sind und deren wäßrige Suspension einen pH-Wert Vorraussetzung ist allerdings, daß bereits vorgerei- 15 im Bereich von 7 bis 13 besitzen, als Sorptionsmittel nigte Flavonoide eingesetzt werden, das heißt, diesem unterworfen werden, wobei eine oder mehrere hinter-Verfahren muß eine Isolierung der F'avonoide aus einandergeschaltete Säulen verwendet werden kön-Drogenextrakten vorausgegangen sein. nen, die gegebenenfalls mit verschiedenen dieser ge-J. E. Watkin, Chemistry and Industry I960, 378, körnten Sorptionsmittel befüllt sind, worauf die fand, daß manche Flavonoide aus Drogenextrakten 20 Begleitstoffe durch Eluieren mit organischen Löisoliert werden können, wenn sie aus wäßrigem Me- sungsmitteln, in denen die Sorptionsmittel nicht Iösdium an Magnesol adsorbiert, die Begleitstoffe mit lieh sind, ausgewaschen und dann die Flavonoide Wasser ausgewaschen und die Flavonoide mit Wasser, durch Auflösen des Säuleninhalts in verdünnten Säudas geringe Mengen (ungefähr 5%) organische Lö- ren und anschließende Isolierung aus der sauren Lösungsmittel enthält, eluiert werden. So kann z. B. Ru- 25 sung gewonnen werden.

tin aus alkoholischen Pflanzenextrakten isoliert wer- Das Lösungsmittel, in dem die Flavonoide gelöst

den, indem der Alkohol aus dem Extrakt in werden, um auf die Säule aufgebracht zu werden, rich-

Gegenwart von Magnesol im Rotationsverdampfer tet sich naturgemäß nach den Löslichkeitseigenschaf-

entfernt, der dabei anfallende Schlamm in eine Säule ten des zu isolierenden Flavonoids oder Flavonoidge-

übergeführt, diese zur Entfernung der Begleitstoffe 30 misches und kann durch Versuche leicht ermittelt

mit Wasser gewaschen und die Flavonoide mit Wasser, werden. Bewährt haben sich in der Regel z. B. niedere

das mit Äther gesättigt ist, eluiert werden. Nach Zufü- aliphatische Alkohole, aliphatische Ketone, "Ester

gen eines Tropfens Essigsäure kann das Rutin in der niederer aliphatischer Carbonsäuren mit niederen ali-

Elutionslösung zur Kristallisation gebracht werden. phatischen Alkoholen, Benzol, alkylierte oder chlo-

Watkin erklärt dieses Trennungsverfahrf η durch 35 rierte Kohlenwasserstoffe oder Gemische dieser Lö-

die Bildung eines Komplexes des Flavonoides mit den sungsmittel.

geringen Mengen an Mg-Carbonat, das im Magnesol Die gleichen Lösungsmittel können in der Regel

enthalten sei, wobei dieser Komplex offenbar an Ma- 'auch für die Elution der Begleitstoffe dienen. Auch

gnesol adsorbiert wird. die Natur der Begleitstoffe wird die Wahl des EIu-

Die Methode ist allerdings nicht generell für Flavo- 40 tionsmittels beeinflussen, die ja darin löslich sein müs-

noide anwendbar, da die Stärke der Adsorption an sen.

Magnesol mit der Natur des Flavonoides stark Natürlich darf das Lösungsmittel die Säulenfüllung

schwankt und auch bei relativ stark adsorbierten Fla- nicht lösen und muß gegenüber den Flavonoiden inert

vonoiden, wie Rutin, bei der Wasserwäsche zur Ent- sein.

fernung der Begleitstoffe Verluste an Flovonoiden 45 Als Säulenfüllmittel haben sich Magnesiumoxyd, auftreten. Magnesiumhydroxydcarbonat, Magnesiumhydroxyd, Es konnte nun ein Verfahren gefunden werden, das Calciumoxyd oder Zinkoxyd besonders bewährt. generell zur Isolierung von Flavonoiden brauchbar ist, Diese unterscheiden sich in ihrer Basizität, wobei CaI-eine glatte Abtrennung der Begleitstoffe erlaubt, ohne ciumoxyd und Magnesiumoxyd nahe an der Oberdaß Flavonoidverluste in Kauf zu nehmen wären und 50 grenze der erfindungsgemäß zu wählenden Basizität das auch in technischem Maßstab angewendet werden der Sorptionsmittel liegen, während Zinkoxyd sehr kann. Dieses erfindungsgemäße Verfahren beruht nahe an einer neutralen Reaktion liegt,
darauf, daß Flavonoide aus organischen Lösungsmit- Wenn auch das erfindungsgemäße Verfahren im | teln, die wasserfrei sein oder auch etwas Wasser ent- Rahmen der angegebenen Grenzen generell anwend- i halten können, mit säurelöslichen, gekörnten Oxyden, 55 bar ist, so empfiehlt es sich doch, bei der Wahl des | Hydroxyden oder basischen Salzen zweiwertiger Sorptionsmittels der Struktur der zu eluierenden FIa-Kationen bereits bei Durchlauf im Rahmen einer Sau- vonoide Rechnung zu tragen,
lenchromatographie derart feste Komplexe bilden, So werden zwar 3-OH-Flavonoide, wie z. B. 3-Hydaß die meisten Begteitstoffe mit organischen Lö- droxyflavon, Galangin, Kaempferol, Morin oder solsungsmitteln beliebiger Menge eluiert werden kön- 60 ehe Flavonoide, die im Ring B mindestens zwei orthonen. Die Gewinnung der so gereinigten Flavonoide ständige Hydroxylgruppen tragen, z. B. Dihydrofisegelingt dann einfach durch Auflösen des Säuleninhal- tin, Luteolin-5-glucosid, von allen innerhalb der tes in verdünnten Säuren, wobei der Komplex zerstört erfindungsgemäßen Regel zu wählenden Sorptionsund die Flavonoide unschwer isoliert werden können. mitteln einwandfrei zurückgehalten. Unter Ring B ist Wesentlich ist allerdings, daß das Sorptionsmittel so 65 hierbei gemäß E. Steinegger und R. Hansel beschaffen ist, daß es die Flavonoide ausreichend stark »Lehrbuch der Pharmakognosie«, 3. Aufl., Springer bindet (fixiert), was der Fall ist, wenn eine wäßrige Verlag 1972, Seite 138, jener der beiden aromati-Suspension des Sorptionsmittels einen pH-Wert im sehen Ringe zu verstehen, der, falls die C₃-Brücke im

C₆-C₃-C₆ Skelett Bestandteil eines sauerstoffhaltigen, heterocyclischen Ringes ist, nicht an diesen ankondensiert ist. 5-OH-Flavonoide, z. B. Apigenin, Vitexin, Naringenin, Hesperetin bedürfen hingegen einer stärkeren Basizität, um sicher, einwandfrei und ohne Verluste isoliert werden zu können.

Zinkoxyd, das in wäßriger Suspension einen pH-Wert von 7,5 aufweist, ist hierfür nur bedingt geeignet, da diese Flavonoide nicht genügend fest bindet.

Man wird daher für die Isolierung von 5-OH-Flavonoiden bevorzugt solche Sorptionsmittel wählen, deren pH-Wert in wäßriger Suspension zwischen 10 und 13 liegt. Vorzugsweise wird ferner bei der Elution darauf geachtet, daß ein Lösungsmittel verwendet wird, das pH-neutral ist, wobei sich Alkohole am besten bewährt haben.

Andererseits hat es sich gezeigt, daß mancheFlavonoide, z. B. Quercetin, vor allem aber solche, die drei benachbarte Hydroxylgruppen im Ring B besitzen, wie z. B. Myricetin, durch eine zu starke Basizität des Sorptionsmittels zersetzt werden. Sand solche Flavonoide in dem aufzuarbeitenden Pflanzenextrakt enthalten, empfiehlt es sich, ein Sorptionsmittel zu wählen, dessen pH-Wert in wäßriger Suspension zwischen 7 und 9 liegt. Auch hier ist die Anwendung neutraler Lösungsmittel, z. B. von Alkoholen, zur Elution vorteilhaft, um eine Unterschreitung der erfindungsgemäß zu wählenden Basizität der Säulenfüllung mit Sicherheit zu vermeiden.

Diese Anpassung der Basizität des Sorptionsmittels innerhalb der erfindungsgemäßen Grenzen an die spezielle Struktur des zu isolierenden Flavonoids geschieht am besten durch entsprechende Wahl des als Sorptionsmittel dienenden Oxydes, Hydroxydes oder basischen Salzes. So besitzt beispielsweise CaO in wäßriger Suspension einen pH-Wert von 12,6, MgO einen solchen von 11,3, ZnO von 7,5 und Mg-hydroxydcarbonat von 10,1. Diese Werte wurden nach Aufschlämmung von 5 g des betreffenden Sorptionsmittels in 100 ml Wasser und potentiometrische Messung erhalten. Diese Methode stellt ein einfaches Mittel für die Auswahl des für den speziellen Zweck am besten geeigneten Sorptionsmittels dar

Es ist jedoch auch möglich, die für die spezielle FIavonoidstruktur geeignete Basizität des Säulenfüllmittels dadurch einzustellen, daß einem stark basischen Sorptionsmittel Ammonsalze von starken Mineralsäuren, z. P. Ammonchlorid oder Ammonsulfat zugesetzt werden, die eine Verminderung des alkalischen Milieus bewirken. Natürlich muß darauf geachtet werden, daß der Ammonsalzzusatz so bemessen ist, daß eine Unterschreitung der Untergrenze des pH-Wertes einer Probe des Sorptionsmittels in wäßriger Suspension von 7 nicht stattfinden wird. Wesentlich ist auch, daß das zugesetzte Ammonsalz im verwendeten Eluüonsmittei nicht oder praktisch nicht löslich ist und mit Flavonoid keine säureunlöslichen Komplexe bildet. So werden beispielsweise bei Verwendung eines Gemisches von MgO und Ammonchlorid als Sorptionsmittel, bei dem auf 8 Teile MgO 2 Teile Ammonchlorid kommt-.« 'ie 3-OH-Flavonoide anstandslos zurückgehalten, wobei im Gemisch vorhandenes Quercetin oder Myricetin nicht angegriffen werden.

Sollen Pflanzenextrakte zwecks Isolierung der darin enthaltenen Flavonoide aufgearbeitet werden, die einerseits 5-OH-FlavortOide, andererseits aber solche enthalten, die von einem stärker basischen Sorptionsmittel zersetzt werden, empfiehlt es sich gemäß einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, mit zwei oder mehr Säulen unterschiedlicher Säulenfüllung zu arbeiten. Es empfiehlt sich, aus der Lösung zunächst jene Flavonoide zurückzuhalteii, die leicht zersetzt werden, was gelingt, wenn man die erste Säule mit einem Sorptionsmittel bzw. einem durch Zusatz eines Ammonsalzes entsprechend eingestellten Sorptionsmittel befüllt, dessen pH in wäßriger Suspension zwischen 7 und 9 liegt. Dieses Sorptionsmittel wird weniger leicht zu bindende Flavonoide, z. B. 5-OH-Flavonoide, vor allem bei fortgesetzter Elution nur ungenügend oder gar nicht zurückhalten, so daß es günstig ist, die zweite bzw. letzte Säule mit einem stark basischen Sorptionsmittel, dessen pH in wäßriger Suspension zwischen 10 und 13 liegt, zu befüllen. Werden sämtliche Säulenfüllungen gemeinsam in Säuren gelöst, erhält man das in der Droge enthaltene Flavonoidgemisch in isolierter Form. Werden die einzelnen Säulenfüllungen getrennt aufgelöst, kann man eine grobe Auftrennung der in der Droge enthaltenen Flavonoide erzielen. Diese Arbeitsweise mit mehreren Säulen unterschiedlicher Säulenfüllung kann auch nur zur Erzielung einer groben Auftrennung herangezogenwerden, ohne daß alkaliempfindliche Flavonoide im Gemisch vorliegen, jedoch Flavonoide unterschiedlicher Bindefähigkeit an das Sorptionsmittel zugegen sind. So kann man z. B. durch eine ZnO-Säule, die MgO- oder CaO-befüllten Säulen vorgeschaltet ist, eine grobe Abtrennung von 5-OH-Flavonoiden von 3-OH-FIavonoiden erzielen, da letztere im Gegensatz zu ersteren bereits durch die ZnO-Säule zurückgehalten werden.

Befinden sich im Drogenextrakt im Vergleich zum Flavonoidgehalt große Mengen von Begleitstoffen, wie z. B. Gerbstoffe, ist es zweckmäßig, den Drogenextrakt einer einfachen Vorreinigung zu unterziehen. So ist es z. B. möglich, durch Zusatz von Äthylacetat zum beispielsweise methanolischen oder äthanolisehen Auszug der Droge einen Teil der Gerbstoffe zu fällen. Das äthylacetathaltige Filtrat kann dann direkt dem erfindungsgemäß den Verfahren unterworfen werden, wobei in solchen Fällen, in denen eine ev. Azidität stört, sicherzustellen ist, daß das Äthylazetat keine Säurespuren mehr enthält. Natürlich ist auch jede andere Vorreinigungsmethode brauchbar, wobei deren Wahl von der Natur des Drogenextraktes abhängig zu machen ist.

Ist die Elution der Begleitstoffe beendet, wird der Säuleninhalt in verdünnten wäßrigen anorganischen oder organischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure oder Essigsäure, gelöst. Verdünnte Mineralsäuren, und speziell solche einer Konzentration von 3 bis 10%, haben sich dabei besonders bewährt. Diese Säuren zersetzen während der notwendigen Arbeitszeit die meisten Flavonoidglykone und -glykoside nicht. Bei extrem säureempfindlichen Flavonoiden, z. B. Robinin, muß die Säurekonzentration noch auf etwa 1 % gesenkt werden. Bei einer Pufferung der sauren Lösung auf pH 3 bis 4, z. B. durch Zusatz von Natriumhydrogencarbonat läßt sich die wäßrige saure Lösung notfalls noch länger aufheben.

Aus der wäßrig sauren Lösung lassen sich die FIavonoide durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln von den dabei gebildeten Salzen der Säure abtrennen.
Sind die zu isolierenden Flavonoide stark hydro-

phil, so kann die Isolierung auch über eine Gelfiltration erfolgen. Hierzu muß die saure Lösung durch Zusatz eines schwachen Alkalis, z. B. von Natriumcarbonat, auf einen pH-Wert zwischen 5 und 6 eingestellt werden. Dann gießt man die Lösung über eine mit Wasser ausgeschlämmte Biogelsäule; man eluiert mit Wasser oder wäßrigen organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise wäßriges Methanol, wäßriges Äthanol sowie Mischungen derselben mit Estern, wie Äthylacetat, wobei im Eluat zuerst die Flavonoide und dann die Salze der zweiwertigen Kationen kommen, die bei der Zersetzung der Säulenfüllung entstanden sind. Dadurch ist eine Trennung von diesen Salzen einwandfrei möglich.

Beispiel 1

10g Flos Crataegi, fein pulverisiert, werden mit 100 ml Methanol (99%) durch 1 Stunde bei 60° C am Wasserbad unter ständigem Rühren extrahiert. Nach dem Abkühlen filtriert man. Das Filtrat wird mit 200 ml Äthylacetat versetzt. Die ausgefallenen Begleitstoffe, vorwiegend Gerbstoffe, werden abfiltriert. Das Filtrat wird über eine Calciumoxyd-Adsorptionsäule gegossen. Nach dem Aufbringen des Filtrates wäscht man mit 200 ml Methanol/Äthylacetat (1/2) nach. Nach dem Abtropfen des Elutionsmittels löst man das Calciumoxyd mit den adsorbierten Flavonoiden in HCl (7%). Anschließend entzieht man der wäßrigen salzsauren Lösung durch aufeinanderfolgendes Ausschütteln mit Äther, Äthylacetat und Äthylacetat/Methanol (10/2) die Flavonoide. Nach dem Abdunsten des jeweiligen Lösungsmittels verbleibt ein Flavonoidgemisch als Rückstand, das sind etwa 80% des Flavonoidgehaltes der Droge.

Bereitung der Calciumoxyd-Adsorptionssäule: in eine Glassäule von 40 cm Länge und 2,5 cm 0 schlämmt man ca.-10 g Calciumoxyd mit 100 ml Methanol/Äthylacetat (1/2) ein.

Beispiel 2

10 g Folium Digitalis lanatae, fein pulverisiert, werden mit 100 ml Äthanol (99%) durch 1 Stunde bei 60° C am Wasserbad unter ständigem Rühren extrahiert. Nachdem Abkühlen filtriert man. Das Filtrat wird mit 200 ml Äthylacetat versetzt. Die ausgefallenen Begleitstoffe, vorwiegend Gerbstoffe, werden abfiltriert. Das Filtrat wird über eine Magnesiumoxyd-Säule gegossen. Nach dem Aufbringen des Filtrates wäscht man mit 200 ml Methanol/Äthylacetat (1/2) nach. Nach dem Abtropfen des Elutionsmittels löst man das Magncsiurnoxyd ir.it den adsorbierenden Flavonoiden in HCl (7 %). Anschließend entzieht man der wäßrigen salzsauren Lösung durch aufeinanderfolgendes Ausschütteln mit Äther, Äthylacetat und Äthylacetat-Methanol (10/2) die Flavonoide. Nach dem Abdunsten des jeweiligen Lösungsmittels verbleibt als Rückstand ein Flavonoidgemisch, das mit entsprechenden Methoden noch weiter abgetrennt werden kann. Die Ausbeute beträgt etwas 85 % des Flavonoidgehaltes der Droge. Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn anstelle von Mg-Oxyd Mg-hydroxyd oder Magnesiumhydroxycarbonat [basisches Magnesiumcarbonat Mg₂ (OH)₂ · CO₃] verwendet werden.

Bereitung der Magnesiumoxyd, Mg(OH)₂ oder Magnesiumhydroxy-carbonat-Säule: in eine Glassäule von 40 cm Länge und 2,5 cm 0 schlämmt man ca. 10 g Magnesiumoxyd, Mg(OH)₂ oder Magnesium-

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40 hydroxy-carbonat mit 100 ml Methanol/Äthylacetat (1/2) ein.

Beispiel 3

10 g Folium Digitalis purpureae, fein pulverisiert, werden mit 100 ml Benzol (99%) durch 1 Stunde bei 60° C am Wasserbad unter ständigem Rühren extrahiert. Nach dem Abkühlen filtriert man. Das Filtrat wird über eine ZnO-Adsorptionssäule gegossen. Nach dem Aufbringen des Filtrates wäscht man mit 300 ml Äthylacetat/Benzol (1/3) nach. Nach dem Abtropfen des Elutionsmittels löst man das ZnO mit den adsorbierten Flavonoiden in H₂SO₄ (4%). Anschließend entzieht man der wäßrigen schwefelsauren Lösung durch Perforieren mit Benzol über 4 Stunden die Flavonoide. Nach dem Abdunsten des Lösungsmittels verbleibt als Rückstand ein Flavonoidgemisch, das mit entsprechenden Methoden noch weiter aufgetrennt werden kann. Die Ausbeute beträgt etwa 85% des Gehaltes der Droge an 3-Hydroxy- und Ring-B-Dihydroxyflavonoiden.

Bereitung der ZnO-Adsorptionssäule:
In eine Glassäule von 40 cm Länge und 2,5 cm 0 schlämmt man ca. 10 g ZnO mit 100 ml Äthylacetat/ Benzol (1/3) ein.

Beispiel 4

10g der Blüten von Prunus spinosa, fein pulverisiert, werden mit 100 ml Methanol (99%) durch 1 Stunde bei 60° C am Wasserbad unter ständigem Rühren extrahiert. Nach dem Abkühlen filtriert man. Das Filtrat wird mit 200 ml Äthylacetat versetzt. Die ausgefallenen Begleitstoffe, vorwiegend Gerbstoffe, werden abfiltriert. Das Filtrat wird über eine Zinkoxyd-Adsorptionssäule gegossen. Nach dem Aufbringen des Filtrates wäscht man mit 200 ml Methanol/ Äthylacetat (1 /1) nach. Nach dem Abtropfen des EIutionsmitels löst man das Zinkoxyd mit den adsorbierenden Flavonoiden in H₂SO₄ (4%). Anschließend entzieht man der wäßrigen schwefelsauren Lösung durch aufeinanderfolgendes Ausschüttein mit Äther, Äthylacetat und Methyl-Äthylketon die Flavonoide. Nach dem Abdunsten des jeweiligen Lösungsmittels verbleibt als Rückstand ein Flavonoidgemisch, das mit entsprechenden Methoden noch weiter aufgetrennt werden kann. Die Ausbeute entspricht etwa 80% des Gehaltes der Drogen an 3-Hydroxy- und Ring-B-Dihydroxy-Flavonoiden.

Bereitung der Zinkoxyd-Adsorptionssäule:
In eine Glassäule von 40 cm Länge und 2,5 cm 0 schlämmt man ca. 10 g Zinkoxyd mit 100 ml Methanol/Äthylacetat (1/2) ein.

Beispiel 5

2 g Flos Tiliae, fein pulverisiert, werden mit 1 ml wäßriger Hexamethylentetraminlösung (5%), .40 ml Aceton und 2 ml Salzsäure (25 %) am Rückflußkühler 30 Minuten gekocht. Anschließend wird in einen Schütteltrichter filtriert und dem Filtrat 40 ml Wasser hinzugefügt. Nach 4maligem Ausschütteln mit je 30 ml Äthylacetat werden die vereinigten Äthylacetatausschüttelungen über eine MgO-Säule gegossen. Mit 200 ml Äthylacetat wird nachgewaschen. Nach Abtropfenlassen des Elutionsmittels wird die Säulenfüllung in HCl (7 %) aufgelöst. Die Flavonoide werden der salzsauren Lösung durch Perforieren mit Äther entzogen.

Bereitung der MgO-Adsorptionssäule:

12 g MgO werden mit 150 mg Äthylacetat in eine Säule von 40 cm Länge und 2,5 cm 0 eingeschlämmt.

Um zu demonstrieren, daß sich Flavonoide der verschiedensten Strukturtypen durch das erfindungsgemäße Verfahren anstandslos isolieren lassen, wurde die Isolierbarkeit an folgenden Modellösungen untersucht:

Beispiel 6

5 mg Myricetin werden in 10 ml Methanol gelöst, diese Lösung wird über eine ZnO-Adsorptionssäule gegossen. Anschließend wird mit je 100 ml Äther/ Chloroform (1/1) nachgewaschen. Das Myricetin bleibt in der Säule fest verankert. Nach dem Abtropfen des Elutionsmittels löst man das ZnO in HCl (8 %) auf. Der salzsauren Lösung wird das Myricetin durch Perforieren mit Äthylacetat entzogen. Das Flavonoid wird als Originalverbindung zurückerhalten.
Bereitung der ZnO-Adsorptionssäule:
In eine Glassäule von 40 cm Länge und 2,5 cm 0 schlämmt man 15 g ZnO mit 100 ml Dioxan ein.

Beispiel 7

3 mg Apigenin und 3 mg Quercetin werden in 30 ml Äthylmethylketon gelöst. Diese Lösung wird über eine trockene Säule von 8 Teile MgO und 2 Teile Ammonchlorid gegossen. Anschließend wird mit 200 ml Äthylmethylketon nachgewaschen. Apigenin wird aus der Säule eluiert, während Quercetin in der Säule verankert bleibt. Das Quercetin wird durch Auflösen der Säule in H₂SO₄ (8%) und anschließendes Perforieren mit Äthylazetat zurückgewonnen. Das Apigenin kann durch eine nachfolgende MgO-Säule isoliert werden.

Bereitung der MgO/NH₄Cl-Adsorptiont>säule:
8 g MgO werden mit 2 g Ammonchlorid verrieben

und in eine Glassäule von 40 cm Länge und 1,5 cm 0 eingefüllt.

Beispiel 8

3 mg Myricetin, 3 mg Apigenin und 3 mg Vitexin werden in 20 ml Methanol gelöst. Das Flavonoidgemisch wird über eine Säule von ZnO gegossen, die direkt mit einer Säule von MgO verbunden ist. Hierauf wird mit 200 ml Äthylacetat/Methanol (2/1) eluiert, wobei das aus der ZnO-Säule austretende Eluat unmittelbar über die MgO-Säule abtropfen gelassen wird. Nach Abtropfenlassen des Elutionsmittels werden die MgO-Säule und die ZnO-Säule voneinander getrennt in HCl (8%) aufgelöst. Myricetin wird aus der aufgelösten ZnO-Zone und Apigenin und Vitexin aus der aufgelösten MgO-Zone durch Perforieren mit Äthylacetat unzersetzt erhalten.

Bereitung der kombinierten ZnO-, MgO-Adsorptionssäule:

8 g MgO und 7 g ZnO voneinander getrennt werden mit je 100 ml Äthylacetat/Methanol (2/1) in zwei Glassäulen von 40 cm Länge und 2,5 cm 0 eingeschlämmt.

Beispiel 9

2 mg Luteolin, 2 mg Kaempferol, 2 mg Quercetin werden in 10 ml Methanol gelöst und über eine ZnO-Adsorptionssäule gegossen. Mit 100 ml Methanol wird nachgewaschen. Nach Abtropfenlassen des EIutionsmittels löst man das ZnO mit den adsorbierten Flavonoiden in HCl (7 %). Anschließend werden der wäßrigen, salzsauren Lösung durch Ausschütteln mit Äthylacetat die Flavonoide entzogen.
Bereitung der ZnO-Adsorptionssäule:

7 g ZnO werden in eine Glassäule von 40 cm Länge und 1,5 cm 0 mit 70 ml Methanol eingeschlämmt.

Claims (12)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Isolierung von Flavonoidaglykonen und -glykosiden aus diese enthaltenden Extrakten durch Bildung von Komplexen dieser FIavonoide mit Metallionen, dadurch gekennzeichnet, daß Lösungen der Flavonoide in einem gegebenenfalls geringe Mengen Wasser enthaltenden organischen Lösungsmittel der Säulen-Chromatographie unter Verwendung von solchen gekörnten Oxyden, Hydroxyden oder basischen Salzen zweiwertiger Kationen, die im verwendeten organischen Lösungsmittel unlöslich, in verdünnten Säuren jedoch löslich sind und deren wäßrige Suspensionen einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 13 besitzen, als Sorptionsmittel unterworfen werden, wobei eine oder mehrere hintereinandergeschaltete Säulen verwendet werden können, die gegebenenfalls mit verschiedenen dieser gekörnten Sorptionsmittel befüllt sind, worauf die Begleitstoffe durch Eluieren mit organischen Lösungsmitteln, in denen die Sorptionsmittel nicht löslich sind, ausgewaschen und dann die Flavonoide durch Auflösen des Säuleninhalts in verdünnten Säuren und anschließende Isolierung aus der sauren Lösung gewonnen werden.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Lösungsmittel für die Flavonoide und zur Elution der Begleitstoffe niedere aliphatische Alkohole, aliphatische Ketone, Ester niederer aliphatischer Carbonsäuren mit niederen aliphatischen Alkoholen, Benzol, alkylierte Benzole oder chlorierte Kohlenwasserstoffe oder Gemische dieser Lösungsmittel verwendet werden.

3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß als Säulenfüllung gekörntes Magnesiumoxyd, Magnesiumhydroxydcarbonat, Magnesiumhydroxyd, Calciumoxyd oder Zinkoxyd eingesetzt werden.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß dem Sorptionsmittel zur Verminderung seiner Basizität innerhalb des erfindungsgemäßen Bereiches Ammonsalze starker Mineralsäuren zugesetzt werden.

5. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Isolierung der Flavonoide aus 5-Hydroxyflavonoide enthaltenden Extrakten als Säulenfüllmittel solche gekörnte Sorptionsmittel eingesetzt werden, deren pH-Wert in wäßriger Suspension zwischen 10 und 13 liegt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß für die Bereitung der Säule und zur Aufgabe der Flavonoid-Lösung ein pH-neutrales Lösungsmittel, insbesondere niedere aliphatische Alkohole, verwendet werden.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß zur Isolierung der Flavonoide aus Extrakten, die Flavonoide mit 3 zu- ω einander ortho-ständigen OH-Gruppen im Ring B enthalten, als Säulenfüllmittel solche gekörnte Sorptionsmittel eingesetzt werden, deren pH-Wert in wäßrigen Suspensionen zwischen 7 und 9 liegt, wobei zur Säulenbereitung und Aufgäbe der Flavonoide pH-neutrale Lösungsmittel, insbesondere niedere aliphatische Alkohole angewendet werden.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß zur Isolierung der Flavonoide aus Konzentraten, die sowohl 5-Hydroxyflavonoide als auch Flavonoide mit 2 oder 3 Hydroxygruppen im Ring B enthalten, zwei oder mehrere hintereinandergeschaltete Chromatographiesäulen verwendet werden, wobei mindestens in der ersten Säule als gekörntes Sorptionsmittel ein solches verwendet wird, dessen pH-Wert in wäßriger Suspension zwischen 7 und 9 liegt, während mindestens in der letzten Säule als gekörntes Sorptionsmittel ein solches eingesetzt wird, dessen pH-Wert in der wäbrigen Suspension zwischen 10 und 13 liegt.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß als verdünnte Säuren verdünnte Mineralsäuren verwendet werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß Mineralsäuren einer Konzentration von 1 bis 10 Gew.% angewendet werden.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Flavonoide aus der sauren wäßrigen Lösung durch Extraktion mit organischen Lösungsmitteln gewonnen werden.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Flavonoide aus der sauren wäßrigen Lösung nach Einstellung eines pH-Wertes von 5 bis 6 durch Gelfiltration mit Wasser, oder wasserhaltigen organischen Lösungsmitteln als Elutionsmittel gewonnen werden.