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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolie-
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rung von Flavoneidaglykonen und -glykosiden aus Pf lanzenextraktes,
die neben den Flavonoiden eine Reihe von Ballaststoffen enthalten.
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Flavonoide sind eine sehr wichtige Klasse von Pflanzenpigmenten, welche
in der Pflanzenwelt sehr weit verbreitet vorkommen. Es handelt sich um Abkömmlinge
des 2-Phenylbenzopyrans und sie sind nach dem C6-C3-C6 Bauprinzip aufgebaut.
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Unter dem Ausdruck Flavonoide im Sinne der vorliegenden Erfindung
sind hierbei Stoffe zu verstehen. die diesem C6-C3-C6 Bauprinzip entsprechen und
gemäß dem Lehrbuch der Pharmakognosie" von E.Steinegger und R. Härisel, 3. Aufl.,
Springer Verlag 1972, Seite 137 ff. als eigentliche Flavonoide bezeichnet werden.
Diese Flavonoide sind durch ihre gute Wirkung auf Herz und Blutgefäße bekannt geworden.
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Die zahlreichen Literaturstellen, die über die Isolierung von Flavonoiden
berichten, beziehen sich auf die Darstellung eines einzelnen, bestimmten Flavonoids
aus einer bestimmten Droge und stellen durchwegs komplizierte Verfahren dar, denen
entweder umständliche Ausschüttlungsverfahren (siehe z.
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-B. Hörhammer, L., Wagner, H. und Dhingra, H.,: Arch.pharm., 292,83(1959)
u.a.m.) oder aufwendige säulenchromatographische Verfahren (siehe z.B. Adamska,
M. und Lutomski, J.: Planta med.
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20, 124 (1971) u.a.m.) zugrunde liegen. Die Nachteile dieser Verfahren
bestehen vor allem im großen Arbeits- und Zeitaufwand.
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Es vurde auch schon versucht, sowohl die Trennung von Flavonoidgemischen
als auch die Isolierung bestimmter Flavonoide über eine Adsorptionschromatographie
durchzuführen, bei der als Adsorptionsmittel Magnesol. ein saures Magnesiumsilikat,
verwendet wird.
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So wird z.B. zur Trennung von Flavonoiden gemäß C.H.Ice und S.H.Wender,
Anal. Chem. 1952. 24, 1916 bzw. US-PS 2,738.346, das Flavonoidgemisch in einem wasserfreien
Lösungsmittel, z.B. wasserfreiem Aceton, der Magnesolsäule aufgegeben, worauf mit
wassergesättigtem Äthylacetat eluiert wird. Flavonoide, wie Quercetin und Morin
oder Xantorhamnin, Quercitrin und Quercetrin lassen sich hierbei fraktioniert eluieren
und Rutin läßt sich mit dieser Methode feinreinigen.
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Voraussetzung ist allerdings, daß bereits vorgereinigte Flavonoide
eingesetzt werden, das heißt, diesem Verfahren muß eine Isolierung der Flavonoide
aus Drogenextrakten vorausgegangen sein.
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J.E.Watkin, Chemistry and Industry 1960, 378, fand, daß manche Flavonoide
aus Drogenextrakten isoliert werden können, wenn sie aus wäßrigem Medium an Magnesol
adsorbiert.
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die Begleitstoffe mit Wasser ausgewaschen und die Flavonoide mit Wasser,
das geringe Mengen (ungefähr 5 %) organische Lösungsmittel enthältt eluiert werden.
So kann z.
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B. Rutin aus alkoholischen Pflanzenextrakten isoliert werden, indem
der Alkohol aus dem Extrakt in Gegenwart von Magnesol im Rotationsverdampfer entfernt,
der dabei anfall ende Schlamm in eine Säule übergeführt, diese zur Entfernung der
Begleitstoffe mit Wasser gewaschen und die Flavonoide
mit Wasser,
das mit Ather gesättigt ist, eluiert werden. Nach Zufügen eines Tropfens Essigsäure
kann das Rutin in der Elutionslösung zur Kristallisation gebracht werden.
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Watkin erklärt dieses Trennungsverfahren durch die Bildung eines Komplexes
des Flavonoides mit den geringen Mengen an Mg-Carbonat, das im Magnesol enthalten
sei, wobei dieser Komplex offenbar an Magnesol adsorbiert wird.
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Die Methode ist allerdings nicht generell für Flavonoide anwendbar,
da die StArke der Adsorption an Magnesol mit der Natur des Flavonoides stark schwankt
und auch bei relativ stark adsorbierten Flavonoiden, wie Rutin, bei der Wasserwäsche
zur Entfernung der Begleitstoffe Verluste an Flavonoiden auftreten.
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Es konnte nun ein Verfahren gefunden werden, das generell zur Isolierung
von Flavonoiden brauchbar ist, eine glatte Abtrennung der Begleitstoffe erlaubt,
ohne daß FlavonoiB-verluste in Kauf zu nehmen wären und das auch in technischem
Maßstab angewendet werden kann. Dieses erfindungsgemäße Verfahren beruht darauf,
daß Flavonoide aus organischen Lösungsmitteln, die wasserfrei sein oder auch etwas
wasser enthalten können, mit säurelöslichen, gekörnten Oxyden, Hydroxyden oder basischen
Salzen zweiwertiger Kationen bereits bei Durchlauf im Rahmen einer S§ulenchromatographie
derart feste Komplexe bilden, daß die meisten Begleitstoffe mit organischen Lösungsmitteln
beliebiger Menge eluiert werden können. Die Gewinnung der so gereinigten Flavonoide
gelingt dann einfach durch Auflösen des S§uleninhaltes in verdtinnten Säuren, wobei
der Komplex zerstört und die Flavonoide unschwer isoliert werden können. Wesentlich
ist allerdings, daß das Sorptionsmittel
so beschaffen ist, daß
es die Flavonoide ausreichend stark bindet (fixiert), was der Fall ist, wenn eine
wäßrige Suspension des Sorptionsmittels einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 13 besitzt.
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Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demnach ein Verfahren zur
Isolierung von Flavonoidaglykonen und -glykosiden aus diese enthaltenden Extrakten
durch Bildung von Komplexen dieser Flavonoide mit Metallionen, das dadurch gekennzeichnet
ist, daß Lösungen der Flavonoide in einem gegebenenfalls geringe Mengen Wasser enthaltenden
organischen Lösungsmittel der Säulenchromatographie unter Verwendung von solchen
gekörnten Oxyden, Hydroxyden oder basischen Salzen zweivertiger Kationen, die im
verwendeten organischen Lösungsmittel unlöslich, in verdünnten Säuren jedoch löslich
sind und deren wäßrige Suspension einen pH-Wert im Bereich von 7 bis 13 besitzen,
als Sorptionsmittel unterworfen werden, wobei eine oder mehrere hintereinandergeschaltete
Säulen verwendet werden können, die gegebenenfalls mit verschiedenen dieser gekörnten
Sorptionsmittel befüllt sind, worauf die Begleitstoffe durch Eluieren mit organischen
Lösungsmitteln, in denen die Sorptionsmittel nicht löslich sind, ausgewaschen und
die Flavonoide durch Auflösen in verdünnten Säuren mit anschließender Isolierung
durch organisches Lösungsmittel aus der sauren Lösung gewonnen werden.
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Das Lösungsmittel, in dem die Flavonoide gelöst werden, um auf die
Säule aufgebracht zu werden, richtet sich naturgemäß nach den Löslichkeitseigenschaften
des zu isolierenden Flavonoids oder Flavonoidgemisches und kann durch Versuche leicht
ermittelt werden. Bewährt haben sich in der Regel z.
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Niedere aliphatische Alkohole, aliphatische Ketone, Ester
niederer
aliphatischer Carbonsäuren mit niederen aliphatischen Alkoholen, Benzol, alkylierte
oder chlorierte Kohlenwasse;rstoffe oder Gemische dieser Lösungsmittel.
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Die gleichen Lösungsmittel können in der Regel auch für die Elution
der Begleitstoffe dienen. Auch die Natur der Begleitstoffe wird die Wahl des Elutionsmittels
beeinflussen, die ja darin löslich sein müssen.
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Natürlich darf das Lösungsmittel die Säulenfüllung nicht lösen und
muß gegenüber den Flavonoiden inert sein, Als Säulenfüllmittel haben sich Magnesiumoxyd,
Magnesium, hydroxydcarbonat, Magnesiumhydroxyd, C aIciumoxyd oder Zinkoxyd besonders
bewährt. Diese unterscheiden sich in ihrer Basizität, wobei Calciumoxyd und Magnesiumoxyd
nahe an der Obergrenze der erfindungsgemäß zu wählenden Basizität der Sorptionsmittel
liegen, während Zinkoxyd sehr nahe an einer neutralen Reaktion liegt.
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Wenn auch das erfindungsgemäße Verfahren im Rahmen der angegebenen
Grenzen generell anwendbar ist, so empEiehlt es sich doch, bei der-\Rahl des Sorptionsmittels
der Struktur der zu eluierenden Flavonoide Rechnung zu tragen.
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So werden zwar 3-OH-Flavonoide wie z.B. 3-Hydroxyflavon, Galangin,
Kaempferol, Morin oder solche Flavonoide, die im Ring B mindestens zwei orthoständige
Hydroxylgruppen tragen, z.B. Dihydrofisetin, Luteolin-5-glucosid von allen innerhalb
der erfindungsgemäßen Regel zu wählenden Sorptionsmitteln einwandfrei zurtickgehalten.
5-OH-Flavonoide, z.B.
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Apigenin, Vitexin, Naringenin, Hesperetin bedürfen hingegen einer
stärkeren Basizität, um sicher, einwandfrei und ohne
Verluste isoliert
werden zu können.
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Zinkoxyd, das in wäßriger Suspension einen pH-Wert von 7,5 aufweist,
ist hier-für nur bedingt geeignet da es diese Flavonoide nicht genügend fest bindet.
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Man wird daher für die Isolierung von 5-OH-Flavonoiden bevorzugt solche
Sorptionsmittel wählen, deren pH-Wert in wäßriger Suspension zwischen 10 und 13
liegt. Vorzugsweise wird ferner bei der Elution darauf geachtet, daß ein Lösungsmittel
verwendet wird, das pH-neutral ist, wobei sich Alkohole am besten bewährt haben.
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Andererseits hat es sich gezeigt, daß manche Flavonoide, z.B. Quercetin
vor allem aber solche, die drei benachbarte Hydroxylgruppen im Ring B besitzen,
wie z.B. Myricetin, durch eine zu starke Basizität des Sorptionsmittels zersetzt
werden. Sind solche Flavonoide in dem aufzuarbeitenden Pflanzenextrakt enthalten,
empfiehlt es sich, ein Sorptionsmittel zu wählen, dessen pH-Wert in wäßriger Suspension
zwischen 7 und 9 liegt. Auch hier ist die Anwendung neutraler Lösungsmittel, z.B.
von Alkoholen, zur Elution vorteilhaft, um eine Unterschreitung der erfindungsgemäß
zu wählenden Basizität der SäulenfUllung mit Sicherheit zu vermeiden.
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Diese Anpassung der Basizität des Sorptionsmittels innerhalb der erfindungsgemäßen
Grenzen an die spezielle Struktur des zu isolierenden Flavonoids geschieht am besten
durch entsprechende Wahl des als Sorptionsmittel dienenden Oxydes, Hydroxydes oder
basischen Salzes. So besitzt beispielsweise Ca0 in wäßriger Suspension einen pH-Wert
von 12,6, MgO einen solchen von 11,3, ZnO von 7,5 und Mghydroxydcarbonat
von
10,1. Diese Werte wurden nach Aufschlämmung von 5 g des betreffenden Sorptionsmittels
in 100 ml Wasser und potentiometrische Messung erhalten. Diese Methode stellt ein
einfaches Mittel für die Auswahl des für den speziellen Zweck am besten geeigneten
?rptionsmittels dar.
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Es ist jedoch auch möglich, die für die spezielle Flavonoidstruktur
geeignete Basizität des Säulenfüllmittels dadurch einzustellen, daß einem stark
basischen Sorptionsmittel Ammonsalze von starken Mineralsäuren, z.B. Ammonchlorid
oder Ammonsulfat zugesetzt werden, die eine Verminde rung des alkalischen Milieus
bewirken. Natürlich muß darauf geachtet werden, daß der Ammonsalzzusatz so bemessen
ist, daß eine Unterschreitung der Untergrenze des pH-Wertes einer Probe des Sorptionsmittels
in wäßriger Suspension von 7 nicht stattfinden wird. Wesentlich ist auch, daß das
zugesetzte Ammonsalz im verwendeten Elutionsmittel nicht oder praktisch nicht löslich
ist und mit dem Flavonoid keine säureunlöslichen Komplexe bildet. So werden beispielsweise
bei Verwendung eines Gemisches von MgO und Ammonchlorid als Sorptionsmittel, bei
dem auf 8 Teile MgO 2 Teile Ammonchlorid kommen, die 3-OH-Flavonoide anstandslos
zurückgehalten, wobei im Gemisch vorhandenes Quercetin oder Myricetin nicht angegriffen
werden.
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Sollen Pflanzenextrakte zwecks Isolierung der darin enthaltenen Flavonoide
aufgearbeitet werden, die einerseits 5-OH-Flavonoide, andererseits aber solche enthalten,
die von einem stärker basischen Sorptionsmittel zersetzt werden, empfiehlt es sich
gemäß einer Ausführungsfdrm des erfindungsgemäßen Verfahrens, mit zwei oder mehr
Säulen unter
schiedlicher SSulenfUllung zu arbeiten. Es empfiehlt
sich, aus der Lösung zunächst jene Flavonoide zurückzuhalten, die leicht zersetzt
werden, was gelingt, wenn man die erste Säule mit einem Sorptionsmittel bzw. einem
durch Zusatz eines Ammonsalzes entsprechend eingestellten Sorptionsmittel befüllt,
dessen pH in wäßriger Suspension zwischen 7 und 9 liegt. Dieses Sorptionsmittel
wird weniger leicht zu bindende Flavonoide, z.B. 5-OH-Flavonoide, vor allem bei
fortgesetzter Elution nur ungenügend oder gar nicht zurückhalten, sodaß e sglnstig
ist, die zweite bzw. letzte Säule mit einem stark basischen Sorptionsmittel, dessen
pH in wäßriger Suspension zwischen 10 und 13 liegt, zu befüllen. Werden sämtliche
Säulenfüllungen gemeinsam in Säuren gelöst, erhält man das in der Droge enthaltene
Flavonoidgemisch in isolierter Form. Werden die einzelnen Säulenfüllungen getrennt
auf gelöst, kann man eine grobe Auftrennung der in der Droge enthaltenen Flavonoide
erzielen. Diese Arbeitsweise mit mehreren Säulen unterschiedlicher Säulenfüllung
kann auch nur zur Erzielung einer groben Auftrennung herangezogen werden, ohne daß
alkaliempfindliche Flavonoide im Gemisch vorliegen, jedoch Flavonoide unterschiedlicher
Bindungsfähigkeit an das Sorptionsmittel zugegen sind. So kann man z.B. durch eine
ZnO-Säule, die MgO- oder CaO-befüllten Säulen vorgeschaltet ist, eine probe Abtrennung
von 5-OH-Flavonoiden von 3-OH-Flavonoiden erzielen, da letztere im Gegensatz zu
ersteren bereits durchfdie ZnO-Säule zurückgehalten werden.
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Befinden sich im Drogenextrakt im Vergleich zum Flavonoidgehalt große
Mengen von Begleitstoffen, wie z.B. Gerbstoffe, ist es zweckmäßig, den Drogenextrakt
einer einfachen Vorreinigung zu unterziehen.
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So ist es z.B. möglich, durch Zusatz von Äthylacetat zum beispielsweise
methanolischen oder äthanolischen Auszug der
Droge einen Teil der
Gerbstoffe zu fällen. Das äthylacetathältige Filtrat kann dann direkt dem erfindungsgemässen
Verfahren unterworfen werden, wobei in solchen Fällen, in denen eine ev. Azidität
stört, sicherzustellen ist, daß das Äthylazetat keine Säurespuren-mehr enthält.
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Natürlich ist auch jede andere Vorreinigungsmethode brauchbar, wobei
deren Wahl von der Natur des Drogenextraktes abhängig zu machen ist.
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Ist die Elution der Begleitstoffe beendet, wird der Säuleninhalt in
verdünnten wäßrigen anorganischen oder organischen Säuren, wie Salzsäure, Schwefelsäure,
Salpetersäure oder Essigsäure, gelöst. Verdünnte Mineralsäuren, und speziell solche
einer Konzentration von 3 bis 10 %, haben sich dabei besonders bewährt. Diese Säuren
zersetzen während der notwendigen Arbeitszeit die meisten Flavonoidaglykone und
-glykoside nicht. Bei extrem säureempfindlichen Flavonoiden, z.B. Robinin, muß die
Säurekonzentration noch auf etwa 1 % gesenkt werden, Bei einer Pufferung der sauren
Lösung auf pH 3 bis 4, z.B. durch Zusatz von Natriumhydrogencarbonat läßt sich die
wäßrige saure Lösung notfalls auch länger aufheben.
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Aus der wäßrig sauren Lösung lassen sich die Flavonoide durch Extraktion
mit organischen Lösungsmitteln von den dabei gebildeten Salzen der Säure abtrennen.
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Sind die zu isolierenden Flavonoide stark hydrophil, so kann die Isolierung
auch über eine Gelfiltration erfolgen. Hierzu muß die saure Lösung durch Zusatz
eines schuachen Alkalis, z*B. von Natriumbicarbonat, auf einen pH-Wert zwischen
5 und 6 eingestellt werden. Dann gießt man die Lösung über eine mit Wasser aufgeschlämmte
Biogelsäule; Man
eluiert mit Wasser oder wäßrigen organischen Lösungsmitteln,
wie beispielsweise wäßriges Methanol, wäßriges Äthanol sowie Mischungen derselben
mit Estern, wie Äthylacetat, wobei im Eluat zuerst die Flavonoide und dann die Salze
der zweinrertigen Kationen kommen, die bei der Zersetzung der Säulenfililung entstanden
sind. Dadurch ist eine Trennung von diesen Salzen einwandfrei möglich.
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Beispiel 1s 10 g Flos Crataegi, fein pulverisiert, werden mit 100
ml Methanol (99 %) durch 1 Stunde bei 60°C am Wasserbad unter ständigem Rühren extrahiert.
Nach dem Abkühlen filtriert man. Das Filtrat wird mit 200 ml Äthylacetat versetzt.
Die ausgefallenen Begleitstoffe, vorwiegend Gerbstoffe, werden abfiltriert. Das
Filtrat wird über eine Calciumoxyd-Adsorptionssäule gegossen. Nach dem Aufbringen
des Filtrates wäscht man mit 200 ml Methanol/ Äthylacetat (1/2) nach. Nach dem Abtropfen
des Elutionsmittels löst man das Calciumoxyd mit den adsorbierten Flavonoiden in
HCl <7 %). Anschließend entzieht man der wäßrigen Salz sauren Lösung durch aufeinanderfolgendes
Ausschütteln mit Äther, Äthylacetat und Äthylacetat/Methanol (10/2) die Flavonoide.
Nach dem Abdunrten des jeweiligen Lösungsmittels verbleibt ein Flavonoidgemisch
als Rückstand, das sind etwa 80 O/o des Flavonoidgehaltes der Droge.
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Bereitung der Calciumoxyd-Adsorptionssäule: in eine Glassäule von
40 cm Länge und 2,5 cm 91 schlämme man ca. 10 g Calciumoxyd mit 100 ml Methanol/Äthylacetat
(1/2) ein.
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Beispiel 2: 10 g Folium Digitalis lanatae, fein pulverisiert, werden
mit 100 ml Äthanol (99 %) durch 1 Stunde bei 600C am Wasserbad unter ständigem Rühren
extrahiert. Nach dem Abkühlen filtriert man. Das Filtrat wird mit 200 ml Äthylacetat
versetzt. Die ausgefallenen Begleitstoffe, vorwiegend Gerbstoffe, werden abfiltriert.
Das Filtrat wird Uber eine Magnesiumoxyd-Säule gegossen. Nach dem Aufbringen des
Filtrates wäscht man mit 200 ml Methanol/Äthylacetat (1/2)
nach.
Nach dem Abtropfen des Elutionsmittels löst man das Magnesiumoxyd mit den adsorbierten
Flavonoiden in IICl (7 %). Anschließend entzieht man der wäßrigen salzsauren Lösung
durch aufeinanderfolgendes Ausschütteln mit Äther, Äthylacetat und Äthylacetat-Methanol
(10/2) die Flavonoide. Nach dem Abdunsten des jeweiligen Lösungsmittels verbleibt
als Rückstand ein Flavonoidgemisch, das mit entsprechenden Methoden noch weiter
aufgetrennt werden kann. Die Ausbeute beträgt etwa 85 % des Flavonoidgehaltes der
Droge. Die gleichen Ergebnisse werden erhalten, wenn anstelle von Mg-Oxyd Mg-hydroxyd
oder Magnesiumhydroxycarbonat (basisches Magnesiumcarbonat Mg2 (OH)2.CO3) verwendet
werden.
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Bereitung der Magnesilumoxyd, Mg(OH)2 oder Magnesiumhydroxy-carbonat-Säule:
in eine Glassäule von 40 cm Länge und 2,5 cm # schlämmt man ca. 10 g Magnesiumoxyd,
Mg(OH)2 oder Magnesiunhydroxy-carbonat mit 100 ml Methanol/Äthylacetat (1/2) ein.
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Beispiel 3: 10 g Folium Digitalis purpureae, fein pulverisiert, werden
mit 100 ml Benzol (99 %) durch 1 Stunde bei 600C am Wasserbad unter ständigem RUhren
extrahiert. Nach dem AbkUhlen filtriert man. Das Filtrat wird über eine ZnO-Adsorptionssäule
gegossen. Nach dem Aufbringen des Filtrates wäscht man mit 300 ml Äthylacetat/Benzol
(1/3) nach.
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Nach dem Abtropfen des Elutionsmittels löst man das ZnO mit den adsorbierten
Flavonoiden in H2SOg (4 %). Anschließend entzieht man der wäßrigen schwefelsauren
Lösung durch Perforieren
mit Benzol über 4 Stunden die Flavonoide.
Nach dem Abdunsten des Lösungsmittels verbleibt als Rückstand ein Flavonoidgemisch,
das mit entsprechenden Methoden noch weiter aufgetrennt werden kann. Die Ausbeute
beträgt etwa 85 % des Gehaltes der Droge an 3-Hydroxy-und Ring-B-Dihydroxyflavonoiden.
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Bereitung der ZnO-Adsorptionssäule: In eine Glassäule von 40 cm Länge
und 2,5 cm ß schlämmt man ca. 10 g ZnO mit 100 ml Äthylacetat/flnzol (1/3) ein.
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Beispiel 4: 10 g der Blüten von Prunus spinosa, £ein pulverisiert,
werden mit 100 ml Methanol (99 %) durch 1 Stunde bei 600C am Wasserbad unter ständigem
Rühren extrahiert. Näch, dem Abkühlen filtriert man. Das Filtrat wird mit 200 ml
Äthylacetat versetzt. Die ausgefallenen Begleitstoffe, vorwiegend Gerbstoffe, werden
abfiltriert. Das Filtrat wird über eine Zinkoxyd-Adsorptionssäule gegossen. Nach
dem Aufbringen des Filtrates wäscht man mit 200 ml Methanol/Athylacetat (1/1) nach.
Nach dem Abtropfen des Elutionsmittels löst man das Zinkoxyd mit den adsorbierten
Flavonoiden in H2504 (4 %). Anschließend entzieht man der wäßrigen schwefelsauren
Lösung durch aufeinanderfolgendes Ausschütteln mit Äther, Äthylacetat und Methyl-Äthylketon
die Flavonoide.
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Nach dem Abdunsten des jeweiligen Lösungsmittels verbleibt als Rückstand
ein Flavonoidgemisch, das mit entsprechenden Methoden noch weiter aufgetrennt werden
kann. Die Ausbeute entspricht etwa 80 % des Gehaltes der Drogen an 3-Hydroxy-und
Ring-B-Dihydroxy-Fl avonoiden.
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Bereitung der Zinkoxyd-Adsorptionssäule: In eine Glassäule von 40
cm Länge und 2,5 cm pl schlämmt man ca. 10 g Zinkoxyd mit 100 ml Methanol/Äthylacetat
(i/2) ein.
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Beispiel 5: 2 g Flos Tiliae, fein pulverisiert, werden mit 1 ml wäßriger
Hexamethylentetraminlösung (5 %), 40 ml Aceton und 2 ml Salzsäure (25 O/o) am Rückflußkühler
30 Minuten gekocht. Anschließend wird in einen Schütteitrichter filtriert und dem
Filtrat 40 ml Wasser hinzugefügt. Nach 4-maligem Ausschütteln mit je 30 ml Äthylacetat
werden die vereinigten Äthylacetatausschüttelungen über eine MgO-Säule gegossen.
Mit 200 ml Äthylacetat wird nachgewaschen. Nach Abtropfenlassen des Elutionsmittels
wird die Säulenfüllung in HCl (7 % ) aufgelöst. Die Flavonoide werden der salzsauren
Lösung durch Perforieren mit Äther entzogen.
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Bereitung der MgO-Adsorptionssäule: 12 g MgO werden mit 150 ml Äthylacetat
in eine Säule von 40 cm Länge und 2,5 cm # eingeschlämmt.
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Um zu demonstrieren, daß sich Flavonoide der verschiedensten Strukturtypen
durch das erfindungsgemäße Verfahren anstandslos isolieren lassen, wurde die Isolierbarkeit
an folgenden Modellösungen untersucht: Beispiel 6s 5 mg Myricetin werden in 10 ml
Methanol gelöst, diese Lösung wird über eine ZnO-AdsorptionssEule gegossen. Anschließend
wird
mit je 100 ml Äther/Chloroform (1/1) nachgewaschen. Das Myricetin bleibt in der
Säule fest verankert Nach dem Abtropfen des Elutionsmittels löst man das ZnO in
HCl (8 %) auf. Der salzsauren Lösung wird das Myricetin durch Perforieren mit Äthylacetat
entzogen.
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Das Flavonoid wird als Originalverbindung zurückerhalten.
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Bereitung der ZnO-Adsorptionssäule: In eine Glassäule von 40 cm Länge
und 2,5 cm pl schlämme man 15 g ZnO mit 100 ml Dioxan ein.
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Beispiel 7: 3 mg Apigenin und 3 mg Quercetin werden in 30 ml Äthylmethylketon
gelöste Diese Lösung wird über eine trockene Säule von 8 Teile MgO und 2 Teile Ammonchlorid
gegossen.
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Anschließend wird mit 200 ml Äthylmethylketon nachgewaschen. Apigenin
wird aus der Säule eluiert, während Quercetin in der Säule verankert bleibt. Das
Quercetin wird durch Auflösen der Säule in H2504 (8 %) und anschließendes Perforieren
mit Äthylazetat zurückgewonnen.
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Das Apigenin kann dann durch eine nachfolgende MgO-S§ule isoliert
werden.
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Bereitung der MgO/NH4Cl-Adsorptionssäule: 8 g MgO werden mit 2 g Ammonchlorid
verrieben und in eine Glassäule von 40 cm Länge und 1.5 cm j2f eingefüllt Beispiel
8: 3 mg Myricetin, 3 mg Apigenin und 3 mg Vitexin werden in 20 ml Methanol gelöst.
Das Flavonoidgemisch wird über eine
Säule von ZnO gegossen, die
direkt mit einer Säule von MgO verbunden ist. Hierauf wird mit 200 ml Xthylacetat/
Methanol (2/1) eluiert, wobei das aus der ZnO-Säule allstretende Eluat unmittelbar
über die MgO-Säule abtropfen gelassen wird. Nach Abtropfenlassen des Elutionsmittels
werden die MgO-SEule und die ZnO-Säule vonernander getrennt in lICl (8 %) aufgelöst,
Myricetin wird aus der aufgelösten ZnO-Zone und Apigenin und Vitexin aus der aufgelösten
MgO-Zone durch Perforieren mit Äthylacetat unzersetzt erhalten.
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Bereitung der kombinierten ZnO-, MgO-Adsorptionssäule: 8 g MgO und
7 g ZnO voneinander getrennt werden mit Je 100 ml Äthylacetat/Methanol (2/1) in
zwei Glassäulen von 40 cm Länge und 2,5 cm # eingeschlämmt.
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Beispiel g: 2 mg Luteolin, 2 mg raemp£erol, 2 mg Quercetin werden
in 10 ml Methanol gelöst und über eine ZnO-Adsorptionssäule gegossen. Mit 100 ml
Methanol wird nachgewaschen. Nach Abtropfenlassen des ELutionsmittels löst man das
ZnO mit den adsorbierten Flavonoiden in HCl (7 %). Anschließend werden der wäßrigen,
salzsauren Lösung durch Ausschütteln mit Äthylacetat die Flavonoide entzogen.
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Bereitung der ZnO-Adsorptionssäule: 7 g ZnO werden in eine Glassäule
von 40 cm Länge und 1,5 cm # mit 70 ml Methanol eingeschlämmt.