JPS6168422A - Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 - Google Patents
Ｌｐｆ−ｈａの精製方法Info
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- JPS6168422A JPS6168422A JP59190244A JP19024484A JPS6168422A JP S6168422 A JPS6168422 A JP S6168422A JP 59190244 A JP59190244 A JP 59190244A JP 19024484 A JP19024484 A JP 19024484A JP S6168422 A JPS6168422 A JP S6168422A
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- dextran
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- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、百日せき菌が産生ずるＬＰＦ−ＨＡ（Ｌｅｕ
ｃｏｃｙｔｏｓｉｓ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ
ｈｅｍａｇｇｌ＋山ｎ１ｎ）の精山刃１ｎさらに詳し
くは、百日せき菌培養物から得られるＬ Ｐ Ｆ −Ｈ
Ａ含有液を、デキストラン硫酸か化学的に結合されたポ
リサッカライドゲル誘導体に接触せしめ、ＬＰＦ−）Ｉ
Ａを吸着させた後、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡを該ゲルから：
８出することによりＬＰＦ−ＨＡを精製する方法に関す
る。
ｃｏｃｙｔｏｓｉｓ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇｆａｃｔｏｒ
ｈｅｍａｇｇｌ＋山ｎ１ｎ）の精山刃１ｎさらに詳し
くは、百日せき菌培養物から得られるＬ Ｐ Ｆ −Ｈ
Ａ含有液を、デキストラン硫酸か化学的に結合されたポ
リサッカライドゲル誘導体に接触せしめ、ＬＰＦ−）Ｉ
Ａを吸着させた後、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡを該ゲルから：
８出することによりＬＰＦ−ＨＡを精製する方法に関す
る。
産業上分■里公団
ＬＰＦ−ＨＡは、百日せき菌■相菌およびＩＩ相菌が産
生する活性物質であって、毒力（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）
を欠＜１１１相菌やパラ百日せき菌・気管支敗血症菌は
産生しない。このＬＰＦ−ＨＡは百日せき毒素とら称さ
れ、多様な生理活性を有する蛋白質で・あることか知ら
れている。その主な生理活性としては、白血球増多活性
、インシュリン分泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤
血球凝集活性等か知られており、なかでも、そのインシ
ュリン分泌増強活性にちとついて、糖尿病の治療剤とし
ての応用か注目されている。
生する活性物質であって、毒力（ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ）
を欠＜１１１相菌やパラ百日せき菌・気管支敗血症菌は
産生しない。このＬＰＦ−ＨＡは百日せき毒素とら称さ
れ、多様な生理活性を有する蛋白質で・あることか知ら
れている。その主な生理活性としては、白血球増多活性
、インシュリン分泌増強活性、ヒスタミン増感活性、赤
血球凝集活性等か知られており、なかでも、そのインシ
ュリン分泌増強活性にちとついて、糖尿病の治療剤とし
ての応用か注目されている。
これらの生理活性とは別に、最近になって百日せき菌の
感染および発病の防御にＬＰＦ−ＨＡか゛きわめて重要
な役割を演じていることが明らかにされ、百日せき菌感
染防御抗原としても注目されるようになった［Ｐｉｊｔ
ｍａｎ、 Ｍ； Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆｌ １＋ｆｅｃｔ
ｉｏｕｓ Ｄ １ｓｅａｓｅｓ＋↓、 ４０１−４０９
（１９７９）。
感染および発病の防御にＬＰＦ−ＨＡか゛きわめて重要
な役割を演じていることが明らかにされ、百日せき菌感
染防御抗原としても注目されるようになった［Ｐｉｊｔ
ｍａｎ、 Ｍ； Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆｌ １＋ｆｅｃｔ
ｉｏｕｓ Ｄ １ｓｅａｓｅｓ＋↓、 ４０１−４０９
（１９７９）。
および５ａｔｏ＋ Ｙ； Ｓｅｍ１ｎａｒｓ ｉｎ Ｉ
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ ＩＶ ＋ Ｂａ
ｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ＋ ３８０′３ｓ５（
１９８２） ］。
ｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅｓ ＩＶ ＋ Ｂａ
ｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ＋ ３８０′３ｓ５（
１９８２） ］。
したがって、ＬＰＦ−ＨＡの生理活性を研究するうＬに
、またその生理活性を利用しｒこ医薬品の製造のために
、さらには副作用のより少ない百日せきワクチンを工業
的に製造するために、ＬＰＦ−ＨＡを簡単にかつ大量に
単離精製する方法の開発か望まれている。
、またその生理活性を利用しｒこ医薬品の製造のために
、さらには副作用のより少ない百日せきワクチンを工業
的に製造するために、ＬＰＦ−ＨＡを簡単にかつ大量に
単離精製する方法の開発か望まれている。
従来技術
従来知られているＬＰＦ−ＨＡの採取精製法では、百日
せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽出、透析したもの
を出発材料とし、これをイオン変換クロマ）グラフィー
、ゲルシ濾過［Ａｒａｉ、 Ｈ：Ｂｉｏｃｌ＋１ａｉｃ
ａ ｅｔ ＢｉｏρＩ＋ｙｓｉｃ、＋ Ａｃｔａ＋ ４
４４＋ ７６５（１９７６） ］、あるいは蔗糖濃度勾
配遠心［５ａｔｏ、 ・Ｙ； Ｉｎｆｅｃｔ、
Ｉｍｍｕｎ、 ＋ ６．５９７−７ＯＬ （１９７２）
］などによって精製する方法が採用されている。しかし
なが呟このような方法では、高純度のＬＰＦ−ＨＡを得
ることは難しく、またその収量ら少ない。
せき菌培養物を硫安塩析し、ついで抽出、透析したもの
を出発材料とし、これをイオン変換クロマ）グラフィー
、ゲルシ濾過［Ａｒａｉ、 Ｈ：Ｂｉｏｃｌ＋１ａｉｃ
ａ ｅｔ ＢｉｏρＩ＋ｙｓｉｃ、＋ Ａｃｔａ＋ ４
４４＋ ７６５（１９７６） ］、あるいは蔗糖濃度勾
配遠心［５ａｔｏ、 ・Ｙ； Ｉｎｆｅｃｔ、
Ｉｍｍｕｎ、 ＋ ６．５９７−７ＯＬ （１９７２）
］などによって精製する方法が採用されている。しかし
なが呟このような方法では、高純度のＬＰＦ−ＨＡを得
ることは難しく、またその収量ら少ない。
高純度のＬ Ｐ Ｆ−ＨＡを比較的大量に得る方法とし
て、百日せぎ菌培養上清液をハイドロキシアパタイトの
カラムに通してＬＰＦ−ＨＡを吸着させ、洗浄、溶出後
、コンカナバリンＡ−セファ０−ス（ＣｏｎＡ−３ｅｐ
ｌ＋ａｒｏｓｅ＋ ７フルマシ７社製）によるアフィニ
ティクロマトグラフィーで精製する方法か提案されてい
る［Ｙａｊｉｍａ、 Ｍ： 、ＬＢｉｏｃｈｅｍ ８
３．２９５−３０３ （１９７８） ］。 しｈ化なか
呟このフンカナバリンＡをリガントとすると７フイニテ
イクロマＦグラフイーは、ＬＰＦ−ＨＡのみと親和性を
有するのではなく、糖類や糖脂質、さらに池の糖蛋白質
などら吸着するため、百日せき菌の池の成分、たとえば
Ｆ’ＨＡ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ −ＨｅｍａＨｌｕ
ｔｉｎｉｎ）や菌体膜成分なども吸着し、所望のＬＰＦ
−ＨＡを高純度で単離することが難しく、１憂れたアフ
イニティクロマトグラフイーとはいんない。
て、百日せぎ菌培養上清液をハイドロキシアパタイトの
カラムに通してＬＰＦ−ＨＡを吸着させ、洗浄、溶出後
、コンカナバリンＡ−セファ０−ス（ＣｏｎＡ−３ｅｐ
ｌ＋ａｒｏｓｅ＋ ７フルマシ７社製）によるアフィニ
ティクロマトグラフィーで精製する方法か提案されてい
る［Ｙａｊｉｍａ、 Ｍ： 、ＬＢｉｏｃｈｅｍ ８
３．２９５−３０３ （１９７８） ］。 しｈ化なか
呟このフンカナバリンＡをリガントとすると７フイニテ
イクロマＦグラフイーは、ＬＰＦ−ＨＡのみと親和性を
有するのではなく、糖類や糖脂質、さらに池の糖蛋白質
などら吸着するため、百日せき菌の池の成分、たとえば
Ｆ’ＨＡ（Ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ −ＨｅｍａＨｌｕ
ｔｉｎｉｎ）や菌体膜成分なども吸着し、所望のＬＰＦ
−ＨＡを高純度で単離することが難しく、１憂れたアフ
イニティクロマトグラフイーとはいんない。
最近、ヒトハプトグロビンかＬ Ｐ Ｆ −ＨＡに特異
的に結合することが発見されて以来、上記の方法におけ
るフンカナバリンＡの代わりに、このヒトハブ）グロビ
ンをり〃ントとして用いるアフィニティクロマトグラフ
イーでＬＰＦ−ＨＡを精製する方法か試みられている［
ＩｒｏｎｓＬ；Ｂｉｏｃｌ＋１ｍ１ｃａ ｅｔ Ｂｉｏ
ｐｌ＋１ｓｉｃａ Ａｃｊａ＋ ５ＳＯ＋ １７５−Ｉ
Ｓ５（１９７９）およびＣｏｗｅｌｌ、 に Ｓｅｍ１
ｎａｒｓ １ｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ ＩＶ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ
＋３７１〜３７９ （１９８２） ］。このヒトハプト
グロビンをり〃ントとして用いる場合には、新たに肝炎
ウィルス対策の重要な問題が生じる。即ち、ヒトハプト
グロビンは人血液から採取されるため、肝炎ウィルス混
入の恐れがある。さらに池の未知の感染性因子混入の懸
念らなおざりにできないことであり、これは動物血清を
用いる場合も同様である。
的に結合することが発見されて以来、上記の方法におけ
るフンカナバリンＡの代わりに、このヒトハブ）グロビ
ンをり〃ントとして用いるアフィニティクロマトグラフ
イーでＬＰＦ−ＨＡを精製する方法か試みられている［
ＩｒｏｎｓＬ；Ｂｉｏｃｌ＋１ｍ１ｃａ ｅｔ Ｂｉｏ
ｐｌ＋１ｓｉｃａ Ａｃｊａ＋ ５ＳＯ＋ １７５−Ｉ
Ｓ５（１９７９）およびＣｏｗｅｌｌ、 に Ｓｅｍ１
ｎａｒｓ １ｎＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓ
ｅｓ ＩＶ、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｖａｃｃｉｎｅ
＋３７１〜３７９ （１９８２） ］。このヒトハプト
グロビンをり〃ントとして用いる場合には、新たに肝炎
ウィルス対策の重要な問題が生じる。即ち、ヒトハプト
グロビンは人血液から採取されるため、肝炎ウィルス混
入の恐れがある。さらに池の未知の感染性因子混入の懸
念らなおざりにできないことであり、これは動物血清を
用いる場合も同様である。
現在のところ肝炎ウィルス等の混入をチェックする絶対
的な方法はない。一方、かかる肝炎ウィルス等を不活化
するための手段として、６ｆｌ’Ｃ，１０〜１５時間加
熱する方法か知られている。本発明者らは、そのような
加熱処理を行うと、ハプトグロビンのＬＰＦ−）（八に
対する親和性はほとんど喪失され、目的とする効果がな
くなってしまうという重大な欠陥かあることを見出しｊ
こ。
的な方法はない。一方、かかる肝炎ウィルス等を不活化
するための手段として、６ｆｌ’Ｃ，１０〜１５時間加
熱する方法か知られている。本発明者らは、そのような
加熱処理を行うと、ハプトグロビンのＬＰＦ−）（八に
対する親和性はほとんど喪失され、目的とする効果がな
くなってしまうという重大な欠陥かあることを見出しｊ
こ。
また、前記のハイドロキシアパタイトゲルを用いる精製
法でも、ハイドロキシアパタイトが高価であるために、
ＬＰＦ−ＨＡを工業的にかつ安価に採取するには問題が
ある。
法でも、ハイドロキシアパタイトが高価であるために、
ＬＰＦ−ＨＡを工業的にかつ安価に採取するには問題が
ある。
究明ｐ井的
本発明者らは、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡの１文的な単離精製
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日ぜき菌
培養物から得られるＬ Ｐ Ｆ−ＨＡ含有液を、デキス
トラン６に酸か化学的に結合されたぼりサツカライドゲ
ル３４本に接触せしめ、Ｌ Ｐ Ｆ −）ＩＡを吸着さ
せ、夾雑物質と分離した後膣ポリサッカライドゲル誘導
体から溶出することにより、高純度のＬ Ｐ Ｆ−１（
Ａかきわめて簡単にしかも非常に高い収率で得られるこ
とを発見し、本発明を完成するに至った。
法を見い出すべく、種々検討を重ねた結果、百日ぜき菌
培養物から得られるＬ Ｐ Ｆ−ＨＡ含有液を、デキス
トラン６に酸か化学的に結合されたぼりサツカライドゲ
ル３４本に接触せしめ、Ｌ Ｐ Ｆ −）ＩＡを吸着さ
せ、夾雑物質と分離した後膣ポリサッカライドゲル誘導
体から溶出することにより、高純度のＬ Ｐ Ｆ−１（
Ａかきわめて簡単にしかも非常に高い収率で得られるこ
とを発見し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の目的は、医療上非常に有用な生物学的
活性物質であるＬＰＦ−ＨＡを、工業的に簡単でかつ大
量に、きわめて高純度にまで精製する方法を提供するこ
とにある。
活性物質であるＬＰＦ−ＨＡを、工業的に簡単でかつ大
量に、きわめて高純度にまで精製する方法を提供するこ
とにある。
発明の構成および効果
本発明は、百日ぜき菌培養物から得られるＬＰＦ−ＨＡ
含有液を、デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリ
サッカライドゲル誘導体に接触せしめ、ＬＰＦ−ＨＡを
吸着させた後、該ゲルからＬ Ｐ Ｆ −ＨＡを溶出す
ることを特徴とｒるｌ−Ｆ’ Ｉ”−ＨＡの精製方法で
ある。
含有液を、デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリ
サッカライドゲル誘導体に接触せしめ、ＬＰＦ−ＨＡを
吸着させた後、該ゲルからＬ Ｐ Ｆ −ＨＡを溶出す
ることを特徴とｒるｌ−Ｆ’ Ｉ”−ＨＡの精製方法で
ある。
本発明において出発材ｉ、［として用いられるｉ日せき
菌培養物としては、百日せきＩ相菌を通常の培地、たと
えばコーエン・ウィラー培地や、ステナー・ショルテ培
地などの液状培地にて、常法）こより静置培養または振
盪培養もしくは通気撹拌培養して得られる培養物である
。この培養物は、遠心分離により菌体を除去しｒこ培養
上清、あるいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの
部分精製標品の形で本発明方法に供される。
菌培養物としては、百日せきＩ相菌を通常の培地、たと
えばコーエン・ウィラー培地や、ステナー・ショルテ培
地などの液状培地にて、常法）こより静置培養または振
盪培養もしくは通気撹拌培養して得られる培養物である
。この培養物は、遠心分離により菌体を除去しｒこ培養
上清、あるいは菌体破壊物遠心上清、あるいはこれらの
部分精製標品の形で本発明方法に供される。
本発明において用いられるデキストラン硫酸−ポリサッ
カライドゲルとは、デキストランの硫酸エステル化物を
ポリサッカライドゲル誘導体に化学的に結合させたちの
である。このゲルを調製するにあたっては、デキストラ
ン硫酸は種々の製品かすでに市販されておｌ）、一般的
に生物関連用として用いられているものを使用すること
かできる。
カライドゲルとは、デキストランの硫酸エステル化物を
ポリサッカライドゲル誘導体に化学的に結合させたちの
である。このゲルを調製するにあたっては、デキストラ
ン硫酸は種々の製品かすでに市販されておｌ）、一般的
に生物関連用として用いられているものを使用すること
かできる。
一方ポリサッカライドゲル誘導体とは、アガロース、デ
キストラン、セルロース等のポリサッカライドに、クロ
マトグラフィー担体として用（・得るように、通常の結
晶精製処理、三次元架橋処理。
キストラン、セルロース等のポリサッカライドに、クロ
マトグラフィー担体として用（・得るように、通常の結
晶精製処理、三次元架橋処理。
形状成型処理等を施したゲル誘導体であり、これらもす
でに市販されており、例えばアガロースゲルとしてセフ
７１１７−ス（Ｓ ｅｇｈａ ｒｏｓｅ ＋ ７フルマ
シア社製）、デキストランゲルとしてセファデックス（
Ｓｅｐｌ＋ａｄｅｘ＋ ７ ｙルア２フ社製）、セルａ
−スゲルとしてアビセフは旭化ｒ＆製）等がある。
でに市販されており、例えばアガロースゲルとしてセフ
７１１７−ス（Ｓ ｅｇｈａ ｒｏｓｅ ＋ ７フルマ
シア社製）、デキストランゲルとしてセファデックス（
Ｓｅｐｌ＋ａｄｅｘ＋ ７ ｙルア２フ社製）、セルａ
−スゲルとしてアビセフは旭化ｒ＆製）等がある。
デキストラン硫酸とポリサッカライにゲルとを化学的に
結合させるには種々の方法があるが、例えば臭化シアン
を用いるアンゲルソンらの方法（特開昭５２−１１４０
１ｉ３号）や、臭化シアンを用い、スペーサーとしてリ
ノンを介して結合させる方法［Ｂｒｙａｎ Ｍ、 Ｔ
ｕｒｎｅｒ ら； Ｂｉｏｃｌ＋１ｍ１ｃａ ｅｔＢ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ＋ ６５９＋ ７
−１４（１９８１）１等の通常よく用いられる方法で行
なえばよい。
結合させるには種々の方法があるが、例えば臭化シアン
を用いるアンゲルソンらの方法（特開昭５２−１１４０
１ｉ３号）や、臭化シアンを用い、スペーサーとしてリ
ノンを介して結合させる方法［Ｂｒｙａｎ Ｍ、 Ｔ
ｕｒｎｅｒ ら； Ｂｉｏｃｌ＋１ｍ１ｃａ ｅｔＢ
ｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ＋ ６５９＋ ７
−１４（１９８１）１等の通常よく用いられる方法で行
なえばよい。
なお、デキストラン硫酸−７ガロースゲルについてはす
でに市販されてお１）、例えばデキストラン硫酸−セフ
ァロースＣＬ４Ｂ （７フルマシア社製）がある。
でに市販されてお１）、例えばデキストラン硫酸−セフ
ァロースＣＬ４Ｂ （７フルマシア社製）がある。
本発明において、デキストラン硫酸−ポリサラうライド
γ゛ルを用いて、百日せき菌か産生するＬＰＦ−ＨＡを
精製採取するにあたっては、たと几ば、次のような方法
で行なわれる。
γ゛ルを用いて、百日せき菌か産生するＬＰＦ−ＨＡを
精製採取するにあたっては、たと几ば、次のような方法
で行なわれる。
原材料液であるＬＰＦ−ＨＡ含有液は、百日せき菌培養
物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比電導度が０．
Ｓ〜５．ｔ）ｍｓ／ｃｍとなるように希釈した後、吸着
操作に付すことらできるが、この上清中にはデキストラ
ン硫酸−ボリサツカライドク゛ルに対して同しく親和性
を有するＦ−ＨＡ（Ｆ ｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ −１＋
ｅ＋ｏａＨ２１ｕＥｉｎｉｎ）か含まれているｒコメ、
あうカルめ、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡは吸着せｆＦ−＠八を
吸着する条件にて、デキストラン硫酸−ポリサッカライ
ドゲルによるクロマトグラフィーを行ない（比電導度５
．０−２５ 、 （Ｊｍｓ／ｃｎ＋、ｐＨ５−９の緩衝
液で平衡化されたデキストラン硫酸−ｌリサツ力うイト
′ゲル充填カラムに比電導度５．０−２５．（Ｌｎｓ／
ａＩＩｌ、 ｐＨ５〜９に調整した原材料液を通液する
）、その素通り画分であるところのＦＬＨＡを含まずＬ
ＰＦ−ＨＡを大量に含んだ画分の１１，５ｊ１４炭酸ナ
トリウム水、Ｈ液に溶解し、この溶液に、Ｉ） 、 Ｓ
Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で平衡化させｔこセファ０−
スＣＬ−４Ｂ（７フルマシア・ファインケミカルズ社製
）２０１ｎｌを入れゆるやかに撹拌する。撹拌下に、ｌ
（＋ （１…１の蒸留水に１０号の臭化ンアンを溶解し
た液を加見る。反応液に５Ｎ・１水酸化ナトリウム水溶
液を添加しつつｐＨを１１に１５分間保持する。その後
、ｐＨを下降するに１ｆせ、室温にて撹拌下１７時間保
持する。
物の遠心上清を、蒸留水または緩衝液で比電導度が０．
Ｓ〜５．ｔ）ｍｓ／ｃｍとなるように希釈した後、吸着
操作に付すことらできるが、この上清中にはデキストラ
ン硫酸−ボリサツカライドク゛ルに対して同しく親和性
を有するＦ−ＨＡ（Ｆ ｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ −１＋
ｅ＋ｏａＨ２１ｕＥｉｎｉｎ）か含まれているｒコメ、
あうカルめ、Ｌ Ｐ Ｆ −ＨＡは吸着せｆＦ−＠八を
吸着する条件にて、デキストラン硫酸−ポリサッカライ
ドゲルによるクロマトグラフィーを行ない（比電導度５
．０−２５ 、 （Ｊｍｓ／ｃｎ＋、ｐＨ５−９の緩衝
液で平衡化されたデキストラン硫酸−ｌリサツ力うイト
′ゲル充填カラムに比電導度５．０−２５．（Ｌｎｓ／
ａＩＩｌ、 ｐＨ５〜９に調整した原材料液を通液する
）、その素通り画分であるところのＦＬＨＡを含まずＬ
ＰＦ−ＨＡを大量に含んだ画分の１１，５ｊ１４炭酸ナ
トリウム水、Ｈ液に溶解し、この溶液に、Ｉ） 、 Ｓ
Ｍ炭酸ナトリウム水溶液で平衡化させｔこセファ０−
スＣＬ−４Ｂ（７フルマシア・ファインケミカルズ社製
）２０１ｎｌを入れゆるやかに撹拌する。撹拌下に、ｌ
（＋ （１…１の蒸留水に１０号の臭化ンアンを溶解し
た液を加見る。反応液に５Ｎ・１水酸化ナトリウム水溶
液を添加しつつｐＨを１１に１５分間保持する。その後
、ｐＨを下降するに１ｆせ、室温にて撹拌下１７時間保
持する。
反応終了後、グラスフィルター上でろ過し、ゲルを＋３
．１５Ｍ塩化す）ＩＪウム添加リン酸緩衝液（＋＋０７
．２ ）で充分に洗浄して＝１デキストラン硫酸−７〃
ロースゲル２（ｌｎ＋１を得る。
．１５Ｍ塩化す）ＩＪウム添加リン酸緩衝液（＋＋０７
．２ ）で充分に洗浄して＝１デキストラン硫酸−７〃
ロースゲル２（ｌｎ＋１を得る。
実施例１
前記調製例１と同様にして得られたデキストラン６４１
酸アがロースゲル５ｍｌをカラム（４０ｍ＋ａφＸ ２
０ （１ｍｍ）に充填し蒸留水１（１０＋ｎｌ を通液
する。このカラムに百日せきＩ相菌東浜株静置培養液の
遠心上清１０（ｈｌを蒸留水で８倍に希釈した液（比電
導度的３．ＯＩＩｓ／ｃｍ）、を通液する。約３００＋
ｎｌのＯ、ｆ’１２ Ｍマツキルペン緩ｉ！ｉ液（ｐｔ
（５、２）をカラムに通液上ゲルを洗浄した後、塩化ナ
トリウムｆ） 、 Ｉ） ２ Ｍマツキルペン緩衝ｔＬ
（ｐＨ５，２）１０ｔ）＋ａｌを用い、塩化ナトリウム
０−４ 、０ Ｍの濃度勾配にて滲出を行ない、２ｍｌ
ずつ分画して分取した後、ＬＰＦ−ＨＡを含有する両分
的１２ｍ１をプールする。
酸アがロースゲル５ｍｌをカラム（４０ｍ＋ａφＸ ２
０ （１ｍｍ）に充填し蒸留水１（１０＋ｎｌ を通液
する。このカラムに百日せきＩ相菌東浜株静置培養液の
遠心上清１０（ｈｌを蒸留水で８倍に希釈した液（比電
導度的３．ＯＩＩｓ／ｃｍ）、を通液する。約３００＋
ｎｌのＯ、ｆ’１２ Ｍマツキルペン緩ｉ！ｉ液（ｐｔ
（５、２）をカラムに通液上ゲルを洗浄した後、塩化ナ
トリウムｆ） 、 Ｉ） ２ Ｍマツキルペン緩衝ｔＬ
（ｐＨ５，２）１０ｔ）＋ａｌを用い、塩化ナトリウム
０−４ 、０ Ｍの濃度勾配にて滲出を行ない、２ｍｌ
ずつ分画して分取した後、ＬＰＦ−ＨＡを含有する両分
的１２ｍ１をプールする。
原材料液および精製ＬＰＦ−ＨＡ画分の分析結果および
実験成績を第１表に示す。
実験成績を第１表に示す。
第１表
１）ト、Ｐ Ｆ −ＨＡのｉｎ ｖｉｊｒｏテスト：ハ
プト−ＥＬＩ Ｓ Ａ法［佐藤ら、第２８回毒素シンポ
ジウム予稿集１４１−１４４（１９８１）を参照］に上
るＬＰＦ−ＨＡの単位 ２） キルダール法蛋白窒素測定値Ｘ６．２５により蛋
白質含量として表示 ３） １３．２５μｇ蛋白質／１１１の含量に希釈後
、生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じ
て不活化して実施した。
プト−ＥＬＩ Ｓ Ａ法［佐藤ら、第２８回毒素シンポ
ジウム予稿集１４１−１４４（１９８１）を参照］に上
るＬＰＦ−ＨＡの単位 ２） キルダール法蛋白窒素測定値Ｘ６．２５により蛋
白質含量として表示 ３） １３．２５μｇ蛋白質／１１１の含量に希釈後
、生物学的製剤基準（薬発２８７号、１９８１）に準じ
て不活化して実施した。
手続補正書は弐ノ
昭和６０年２月８日
Claims (5)
- （１）百日せき菌が産生するＬＰＦ−ＨＡを精製取得す
るに際し、該ＬＰＦ−ＨＡ含有液を、デキストラン硫酸
が化学的に結合されたポリサッカライドゲル誘導体に接
触せしめ、ＬＰＦ−ＨＡを吸着させて不純物と分離した
後、該ポリサッカライドゲル誘導体よりＬＰＦ−ＨＡを
溶出することを特徴とするＬＰＦ−ＨＡの精製方法。 - （２）該デキストラン硫酸が化学的に結合されたポリサ
ッカライドゲル誘導体が、デキストラン硫酸−アガロー
スゲル、デキストラン硫酸−デキストランゲルおよびデ
キストラン硫酸−セルロースゲルから選ばれる前記第（
１）項の方法。 - （３）該吸着処理を、温度０〜３０℃、比電導度０．５
〜５．０ｍｓ／ｃｍの条件下に行なう前記第（１）項ま
たは第（２）項記載の方法。 - （４）ＬＰＦ−ＨＡを吸着したゲルからの溶出を、比電
導度５．０〜１００．０ｍｓ／ｃｍの緩衝液を用いて行
なう前記第（１）〜（３）項のいずれか１つの方法。 - （５）該溶出処理に先だって、吸着ゲルを、比電導度０
．５〜５．０／ｃｍの緩衝液で洗浄する前記第（４）項
記載の方法。
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59190244A JPS6168422A (ja) | 1984-09-10 | 1984-09-10 | Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 |
| KR1019850005097A KR890001003B1 (ko) | 1984-07-19 | 1985-07-16 | Lpf-ha의 정제방법 |
| AU45093/85A AU571713B2 (en) | 1984-07-19 | 1985-07-17 | Method of purification of lpf-ha from bordetella pertussis |
| EP85108983A EP0170162B1 (en) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Method for the purification of leukocytosis-promoting factor haemagglutinin |
| DE8585108983T DE3577658D1 (de) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Verfahren zur reinigung vom leukocytosis-foerderungsfaktor haemagglutinin. |
| CA000487035A CA1239104A (en) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Method for the purification of lpf-ha |
| AT85108983T ATE52694T1 (de) | 1984-07-19 | 1985-07-18 | Verfahren zur reinigung vom leukocytosisf¯rderungsfaktor haemagglutinin. |
| US07/122,576 US4885359A (en) | 1984-07-19 | 1987-11-16 | Method for the purification of LPF-HA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59190244A JPS6168422A (ja) | 1984-09-10 | 1984-09-10 | Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6168422A true JPS6168422A (ja) | 1986-04-08 |
| JPS6241692B2 JPS6241692B2 (ja) | 1987-09-04 |
Family
ID=16254905
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59190244A Granted JPS6168422A (ja) | 1984-07-19 | 1984-09-10 | Ｌｐｆ−ｈａの精製方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS6168422A (ja) |
-
1984
- 1984-09-10 JP JP59190244A patent/JPS6168422A/ja active Granted
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6241692B2 (ja) | 1987-09-04 |
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