**ATTENTION** debut du champ DESC peut contenir fin de CLMS **.
REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention d'un activateur du plasminogéne, carac térisé en ce que l'on traite une poudre acétonique d'organes animaux choisis parmi les poumons et reins de porcs, veaux, boeufs, chevaux, agneaux ou moutons ou les ovaires de porcins, bovins ou ovins, par:
a) mise en suspension de ladite poudre dans une solution aqueuse
saline de faible force ionique au voisinage de la neutralité; b) reprise du précipité obtenu à l'étape a dans une solution aqueuse
saline de force ionique comprise entre 0,6 et 1 à un pH compris
entre 3 et 5; c) précipitation de la solution obtenue après décantation à l'étape b
par addition d'un sel ou d'un solvant organique à un pH compris entre 3 et 5; d) reprise du précipité obtenu à l'étape c par de l'eau ou une solution
saline et précipitation par addition d'un sel à un pH voisin ou
légèrement supérieur à 7, et e) reprise du précipité obtenu à l'étape d par de l'eau et dialyse de la
solution jusqu'à une résistivité de l'ordre de 1000 Q cm à 10 C.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'on effectue, à la fin du procédé, une purification de la solution obtenue.
3. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que le sel utilisé dans l'étape a est choisi parmi l'acétate de potassium ou le chlorure de potassium, à des concentrations comprises entre 1 et lOgil.
4. Procédé selon l'une des revendications I ou 2, caractérisé en ce que le sel utilisé dans l'étape b est choisi parmi les sels de potassium, notamment le chlorure, L'acétate ou le sulfate de potassium.
5. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le sel utilisé dans l'étape c est choisi parmi le sulfate d'ammonium ou le chlorure de potassium à des concentrations comprises entre 100 et 200 g/I.
6. Procédé selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le solvant organique utilisé est l'acétone.
7. Procédé selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le sel utilisé dans l'étape d est choisi parmi le chlorure de sodium, le sulfate d'ammonium et le sulfate de potassium.
8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que les étapes a et b du procédé sont effectuées au voisinage de 4"C.
9. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la poudre acétonique d'organes d'animaux peut être obtenue par: - dispersion dans un bain d'acétone à basse température des
organes broyés et homogénéisés, et - filtration, puis séchage de la suspension obtenue.
10. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la purification est réalisée par précipitation de la solution obtenue à l'étape e au pH isoélectrique de 6,8 à l'aide d'un sel, notamment d'un sel choisi parmi l'acétate de zinc, le chlorure de zinc ou le chlorure de calcium.
11. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la purification comprend au moins une séparation par chromatographie d'exclusion sur un gel mixte dextrane/agarose et polyacrylamide.
12. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la purification comporte au moins une élution de la solution sur un échangeur d'ions.
13. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'échangeur d'ions est une résine échangeuse de cations faiblement acide et que l'élution est réalisée avec des solutions de force ionique constante mais à pH croissant.
14. Procédé selon la revendication 12, caractérisé en ce que l'échangeur d'ions est une résine mixte cationique/anionique et que l'solution est réalisée à force ionique croissante.
15. Procédé selon la revendication 2, caractérisé en ce que la purification comprend au moins une séparation par chromatographie d'affinité sur une résine échangeuse d'ions sur laquelle a été copulé un inhibiteur spécifique de l'activateur du plasminogène.
16. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'organe d'animal traité est l'ovaire de truie.
17. Utilisation de l'activateur du plasminogène, obtenu d'après le procédé selon la revendication 1, comme composant actif dans une composition médicamenteuse.
La présente invention concerne un procédé d'obtention d'un activateur du plasminogène.
Plus particulièrement, la présente invention concerne un procédé d'obtention de l'activateur tissulaire endocellulaire du plasminogène par extraction et purification d'organes animaux. Ledit activateur agissant sur les liaisons peptidiques arginine/valine du plasminogène, par ouverture desdites liaisons sans rupture des ponts disulfure, transformant ainsi le plasminogène en plasmine, suivant le schéma global:
EMI1.1
<tb> <SEP> m's <SEP> (SS)y
<tb> <SEP> H2NLySStIAf <SEP> | <SEP> | <SEP> Arg <SEP> l <SEP> | <SEP> l
<tb> <SEP> |
<SEP> Plasminogène
<tb> <SEP> S-s <SEP> Plasminogêne
<tb> <SEP> + <SEP> activateur
<tb> H2NLys <SEP> j·)X5;rgcoo <SEP> Plasmine
<tb> <SEP> S-S <SEP> P[aFmine
<tb> <SEP> H2NVal
<tb> <SEP> (s <SEP> - <SEP> sh
<tb> <SEP> Lys <SEP> = <SEP> Lysine <SEP> (55 > y
<tb> <SEP> Arg <SEP> = <SEP> Arginine
<tb> <SEP> Val <SEP> = <SEP> Valine
<tb>
La plasmine ou fibrinolysine ainsi formée augmentant la vitesse de Lyse des caillots de fibrine rend le produit selon la présente invention particulièrement précieux comme médicament pour le traitement des thromboses artérielles et veineuses en particulier.
Un activateur du type de celui nommé est déjà connu: il s'agit de l'urokinase, extrait de l'urine des mammifères; à ce propos, on peut consulter les brevets américains Nos 2961382, 2983674 et 2989440.
Toutefois, il est apparu que l'urokinase était très sensible aux inhibiteurs induits et que son action diminuait très rapidement.
Il était donc intéressant de trouver un activateur ayant une
activité au moins égale à celle de l'urokinase, mais peu sensible aux inhibiteurs; c'est le résultat obtenu par la présente invention.
Le procédé inventif pour l'obtention d'un activateur du plasminogène est caractérisé dans la revendication 1 précédente.
Le sel utilisé dans l'étape a est choisi de préférence parmi l'acétate de potassium et le chlorure de potassium à des concentrations comprises entre environ 1 et 10 g/l.
Le sel utilisé dans l'étape b est de préférence choisi parmi les sels de potassium, en particulier le chlorure de potassium, I'acétate de potassium et le sulfate de potassium, à des concentrations comprises entre 20 et 80 g/l, le pH étant amené au voisinage de 3 à 5 de préférence à l'aide d'un acide tel que l'acide acétique ou l'acide sulfurique, de façon que la force ionique de la solution soit comprise entre 0,6 et 1.
Le sel utilisé dans l'étape c est de préférence choisi parmi le sulfate d'ammonium ou le chlorure de sodium à des concentrations comprises entre 100 et 200 g/l.
Bien qu'il soit possible dans cette étape c de précipiter la solution
par un solvant organique tel que l'acétone, on utilisera de préférence
le relargage à l'aide d'un sel qui augmente le rendement de
l'opération.
Le sel utilisé dans l'étape d est de préférence choisi parmi le chlorure de sodium, le sulfate d'ammonium et le sulfate de potassium, le pH étant amené à une valeur légèrement supérieure à 7 à l'aide d'une base telle que la soude.
Les étapes a et b du procédé sont effectuées de préférence au voisinage de 4"C.
Les organes traités dans le procédé selon la présente invention sont récupérés dès la mort des animaux, puis mécaniquement dégraissés et broyés.
Les organes ainsi broyés grossièrement sont congelés et pourront être, si besoin est, de nouveau broyés sous forme congelée, puis décongelés en suspension dans un tampon de faible force ionique et de pH compris entre S et 7 pour être homogénéisés.
Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, la poudre acétonique d'organes animaux est obtenue par dispersion des organes broyés et homogénéisés dans un bain d'acétone à basse température, par exemple aux environs de - 10"C. La poudre acétonique est obtenue par filtration et séchage de la suspension précédente.
Les étapes de purification comprendront de préférence une étape de précipitation au pH isoélectrique; pour cela, la solution obtenue à l'étape e et présentant une résistivité de 1000 Q ncm est amenée à un pH voisin de 6,8 puis la force ionique de la solution est amenée à 102 à l'aide d'un sel comme le chlorure de calcium, mais de préférence un sel de zinc tel que l'acétate de zinc ou le chlorure de zinc, puis la solution est abandonnée à 0'C pour parfaire la précipitation.
Le précipité ainsi obtenu peut être conservé après dialyse par lyophilisation.
Si l'on désire parfaire la purification, on utilisera une chromatographie d'exclusion sur un gel mixte dextrane/agarose et polyacrylamide tel qu'un gel Sépharose 6 B, cela afin d'éliminer certaines impuretés moléculaires et/ou une chromatographie sur échangeur d'ions afin d'éliminer les impuretés ioniques. Les résines utilisables sont par exemple des échangeurs faiblement acides ou mixtes tels que les résines Bio-rex 70 en éluant à force ionique constante et pH croissant, AG 1 1 As Bio-rad en éluant à pH constant et force ionique croissante ou Biogel HTP par variation de la force ionique.
Les forces ioniques des solutions sont déduites de la résistivité des solutions mesurées par des méthodes connues.
Un schéma général de préparation des molécules à activité enzymatique selon la présente invention va être donné ci-après afin d'illustrer le mode de réalisation préféré de l'invention.
I. Préparation de la poudre acétonique.
Les organes précédemment cités sont récupérés dés la mort des animaux puis mécaniquement dégraissés et broyés.
Après ce broyage, les organes sont rapidement congelés. Ils subiront ultérieurement un broyage sous forme congelée et seront homogénéisés après avoir été décongelés dans un tampon phosphate de faible force ionique et de pH compris entre S et 7.
Les organes ainsi préparés sont dispersés dans un bain d'acétone dont la température ne devra pas être supérieure à - l0C.
Lorsque la mise en contact intime a été suffisante, la suspension est filtrée sous vide modéré.
Le gâteau de filtration est soigneusement séché par circulation d'azote à basse température.
La poudre acétonique ainsi obtenue est de couleur rose et devra subir une fine homogénéisation à la fin du séchage.
II. Obtention d'un extrait enrichi.
a) Prélevage de la poudre acétonique:
Cette opération est destinée à éliminer au préalable une série de pigments et de protéines faiblement liés qui viendraient par la suite parasiter l'extraction.
La poudre acétonique est mise en suspension dans une solution aqueuse d'un sel dont la force ionique restera faible, le pH de la solution restant compris entre 5 et 8, de préférence au voisinage de la neutralité. On laissera l'ensemble à 4"C pendant 1 h sous agitation.
Le résidu de poudre acétonique est décanté, la solution est clarifiée par exemple dans une essoreuse à bol décanteur et le culot ainsi obtenu est ajouté au résidu ci-dessus.
b) Extraction:
Dans cette phase, le résidu de l'étape a est repris dans un milieu de force ionique plus élevée et de pH compris entre 3 et 5, la force ionique de la solution étant fixée entre 0,6 et 1 par addition d'un sel de potassium.
On agitera au moins 2h ce milieu d'extraction en maintenant la température à 4"C.
Le rapport en poids de poudre acétonique et de solvant ne devra pas excéder 5%.
Le résidu de poudre acétonique non extrait est éliminé par essorage et la solution récupérée est filtrée sous pression d'azote sur c) Précipitation en milieu acide:
Cette première précipitation de la solution obtenue précédemment est réalisée en milieu acide à un pH voisin de 4,5 à l'aide d'un sel de relargage tel que le sulfate d'ammonium à demi-saturation à 10" C. Le précipité ainsi obtenu est repris dans un volume d'eau ou d'une solution saline dont la résistivité est inférieure à 800 Q cm à 10" C, le volume de cette solution n'excédant pas de préférence le quart du volume de la solution extraite.
d) Précipitation en milieu faiblement basique:
Le pH de la solution obtenue précédemment est remonté à une valeur légèrement supérieure à 7 avec de la soude (pH compris entre 7 et 8). La solution ainsi obtenue est précipitée par addition d'un sel en grande quantité, par exemple du sulfate d'ammonium à 200 g/l, du sulfate de potassium à 200 g/l ou du chlorure de sodium à 185 g/l.
Le précipité est repris par de l'eau, le volume de la reprise étant environ 1/10 volume de l'extrait traité à l'étape b.
e) Dialyse:
La solution ainsi obtenue est dialysée jusqu'à une résistivité de l'ordre de 1000 Q ncm à 10"C; le produit à ce niveau peut suivre les phases ultérieures de purification ou bien être conservé ainsi par lyophilisation.
III. Purification de l'extrait enrichi.
1. Purification par précipitation au voisinage du pH isoélectrique:
Le dialysat obtenu à l'étape e précédente est amené au pH isoélectrique de l'enzyme, c'est-à-dire pH 6,8, puis on ajoute avec précaution une solution saline, de préférence l'acétate de zinc, pour amener la force ionique à 10-2. On laisse précipiter toute une nuit à 0 C sans agitation.
Le précipité est récupéré et redissous dans 1/20 volume de l'extrait de départ.
2. Chromatographie d'exclusion:
Le produit issu de la phase précédente ou de l'étape e est passé sur
une colonne de Sepharose 6 B équilibrée à l'aide d'un tampon
phosphate de force ionique amenée à 0,6 par addition de chlorure de
sodium ou de potassium.
Le rapport de la hauteur de gel au diamètre de la colonne ne
devra pas être inférieur à 10. Le débit de la chromatographie est fixé
entre 0,8 et Il/h pour une colonne de 101 de volume, le volume de
l'échantillon déposé est de 500 à 800 ml pour une colonne telle
qu'envisagée précédemment (ce qui correspond environ à 10 kg
d'organes bruts).
On mène la chromatographie à 4'C et l'on récupère la fraction
éluée entre 15 et 25 1 pour une colonne de 101.
Le produit obtenu peut être concentré par précipitation à froid par l'alcool ou l'acétone (3 volumes) ou bien lyophilisé après dialyse.
3. Pzification sur échangeur d'ions:
Sur une résine échangeuse de cationsfaiblement acide:
On utilise une résine Bio-rex 70 équilibrée dans un tampon acétate équilibré à 4,5. L'élution est réalisée avec des solutions de force ionique constante mais à pH croissant. On recueille le produit dans la fraction éluée entre pH 5,2 et 5,7.
Sur résine mixte:
On utilise une résine mixte AG 11 As équilibrée à une résistivité supérieure à 8000 Q cm. On traite alors une solution de l'extrait enrichi en milieu légèrement acide.
L'élution est réalisée à force ionique croissante et le produit est récupéré pour la fraction éluée à une résistivité voisine de 5000 Q cm.
Sur Biogel HTP:
L'hydroxyle est équilibré dans un tampon phosphate M/100 et à pH 6,8. On agite pendant 30 min la suspension de Biogel HTP dans ce tampon avec 10 ml d'extrait brut par gramme d'absorbant sec.
Après élimination de la solution par filtration ou centrifugation, le culot est récupéré et la résistivité du surnageant est amenée à une valeur inférieure à 80 n cm. Après une nouvelle centrifugation, le surnageant dialysé est lyophilisé.
4. Purification par chromatographie d'affinité:
La chromatographie d'affinité est réalisée sur un support du type
AH-Sépharose 4 B sur lequel a préalablement été couplé un inhibiteur spécifique de l'activateur du plasminogène par un carbodiimide, les inhibiteurs possibles pour cela étant, par exemple, L'acide -aminocaprolque, L'acide aminoéthylcyclohexanolque, l'acide trans4-aminoéthylcyclohexanecarboxylique, L'acide paraaminométhylbenzoique.
La chromatographie d'affinité est également réalisable sur un
Sépharose activé au CNBr sur lequel on peut fixer de la lysine, ou tout autre des produits cités précédemment.
Tous les autres supports sur lesquels ce couplage est réalisable peuvent également être utilisés avec succès, comme par exemple la série des biogels.
L'activateur du plasminogène est mis en solution dans un tampon phosphate 0,1 M de pH 7-7,2, puis passé sur une colonne contenant l'un de ces supports. L'activateur reste fixé sur le support, tandis que les protéines inactives sont éluées. L'activateur est ensuite élué au moyen d'un gradient de force ionique et la fraction active peut être traitée des deux façons suivantes: 1 précipitation au moyen d'un sel, tel que le sulfate d'ammonium,
dialyse, puis lyophilisation; 2. précipitation sous la forme d'un complexe insoluble en pH acide
avec un polysaccharide, remise en solution du complexe à un pH
neutre et lyophilisation.
Les exemples suivants sont destinés à illustrer l'invention mais ne la limitent aucunement.
La poudre acétonique traitée dans ces exemples est obtenue par le
processus I décrit précédemment en partant d'ovaires de truies.
Exemple 1:
a) 1 kg de poudre acétonique obtenue par le schéma précédemment décrit est mis en suspension dans 501 d'une solution d'acétate de potassium à 10 g/l. On agite durant 1 h, puis on laisse décanter.
On écarte le surnageant limpide.
b) On ajoute alors au précipité précédent 501 d'eau froide, puis
1,5 kg d'acétate de potassium et enfin 1 1 d'acide acétique glacial, on agite vigoureusement pendant au moins 3 h. L'insoluble est éliminé par essorage, puis la solution est filtrée.
c) On ajoute alors à cette solution 7,5 kg de sulfate d'ammonium, on agite jusqu'à complète dissolution et on laisse reposer au moins 3 h. La solution surnageante est écartée et le précipité est redissous dans 10 1 d'acétate de potassium à 10 g/l.
d) Le pH de cette solution est porté à 10 avec de la soude, puis on ajoute 2 kg de sulfate d'ammonium. On laisse précipiter 2h et le précipité recueilli est dissous dans 5 1 d'eau.
e) La solution est dialysée une nuit contre de l'eau courante.
f) L'insoluble formé au cours de la dialyse est écarté, la solution est alors traitée par 500 mg de chlorure de calcium, le pH est ajusté à 6,5 et la solution est à nouveau mise en dialyse contre 30 1 de chlorure de calcium à 100 mg/l. Après 4 h de dialyse, le précipité formé est remis en solution dans 1 I d'eau avec 5 cm3 d'acide acétique. La solution est lyophilisée.
Exemple 2:
a) 1 kg de poudre acétonique obtenue par le procédé général décrit précédemment est mis en suspension dans 501 d'eau froide. On ajoute à cette solution 50 g de chlorure de potassium, on laisse décanter et la solution est éliminée parun filtre flottant.
b) La phase solide est remise en suspension dans 501 d'eau auxquels on ajoute 1,750 kg de chlorure de potassium, puis environ 500 ml d'acide acétique glacial. On homogénéise, on agite pendant 6h, puis on filtre la solution.
c) Celle-ci est alors traitée par 5 kg de chlorure de sodium, le précipité obtenu est redissous dans 101 de chlorure de sodium à 20 g/l.
d) Après neutralisation de la solution à l'aide de soude, on ajoute 1,750 kg de chlorure de sodium. L'insoluble ainsi obtenu est repris dans 51 d'eau et dialysé une nuit contre de l'eau courante.
e) L'insoluble résultant de la dialyse est éliminé et la solution surnageante est précipitée par 3 volumes d'acétone à - 20"C. Le précipité redissous dans un minimum d'eau est disposé au sommet d'une colonne de Sépharose 6 B (10 x 200) équilibrée dans un tampon phosphate à pH 7,2. Le produit est récupéré dans la fraction éluée entre 2 fois et 2 Y2 fois le volume de la colonne. La solution ainsi obtenue est dialysée et lyophilisée.
Exemple 3:
a) 1 kg de poudre acétonique obtenue par le procédé général précédemment décrit est remis en suspension dans 501 d'eau froide auxquels on ajoute 200 g d'acétate de potassium. Le pH de la solution est ajusté à 8 avec de la soude. On agite 15 min, puis on laisse décanter. La solution surnageante est écartée.
b) Le résidu solide obtenu précédemment est mis en solution dans 501 d'eau auxquels on ajoute 3 kg de sulfate de potassium et de l'acide sulfurique jusqu'à un pH inférieur ou égal à 5. On homogénéise puis on agite 3 h à froid. L'insoluble est éliminé et la fraction soluble est filtrée sur filtre EKS.
c) On traite le filtrat par 2 volumes d'acétone à -20"C. Le précipité obtenu après décantation est remis en solution dans 101 d'eau.
d) On ajoute à cette solution 2 kg de sulfate de potassium. Après neutralisation de la solution, on récupère par centrifugation un précipité qui est remis en solution dans 5 1 d'eau.
e) Cette solution ainsi obtenue est passée sur une colonne échangeuse d'ions AG 1 1 A8 équilibrée en milieu légèrement acide (500 g d'échangeur sec par litre d'échantillon). L'élution se fera par force ionique croissante à pH légèrement acide. Le produit actif est récupéré dans la fraction éluée ayant une résistivité de 5000 Q cm.
Etude des propriétés pharmacologiques.
Le produit étudié est le produit obtenu après précipitation de la solution au point isoélectrique.
1. Caractére de la molécule:
Il s'agit d'une molécule de nature glycoprotéinique dont le poids moléculaire est d'environ 40000 avec formation de mono- et polymères communs pour toutes les substances enzymatiques.
Son point isoélectrique (ou pH isoélectrique) est de 6,8.
Cette molécule est soluble dans un tampon de phosphate ayant une force ionique de 2000 Q cm.
2. Propriétés pharmacologiques:
Le produit obtenu titre 300 à 500 unités CTA/mg. Le site actif se fixe sur les liaisons peptiques arginine/valine du plasminogéne qui sont ouvertes sans rupture des ponts disulfure en transformant ainsi le plasminogène en plasmine.
La molécule acquiert ainsi une grande mobilité par rotation autour des ponts disulfure, ce qui lui permet de developper son activité enzymatique et de se fixer sur les récepteurs.
Les tests effectués in vitro sur des plaques de fibrine suivant la technique d'Astrup montrent que le produit des diamètres de lyse pour une solution à 40 Fg/cm3 est supérieur à 400 mm2.
Sur plaque chauffée 30 min à 80"C (destruction du plasminogène), aucune zone de lyse ne peut être mise en éyidence.
Aucune activité estérasique ne peut être mise en évidence vis-à-vis des esters d'amino-acide suivants: L-lysine, L-phénylalanine, Ltryptophane, etc. Seuls l'ester méthylique de paratosyle arginine et le paranitrophényl-N-carbobenzoxy-L-tyrosine sont lysés.
Les tests réalisés in vivo selon la technique de von Kaula par mesure du temps de lyse des euglobulines plasmatiques chez le rat par injection intraveineuse d'une solution isotonique à 25 mg/kg du produit précédemment décrit provoque une diminution de 50% du temps de lyse du caillot d'euglobulines, ce qui traduit une activation importante du système fibrinolytique circulant.
Le produit selon la présente invention est donc particulièrement utile comme médicament dans le traitement des thromboses artérielles et veineuses et des dépôts fibrineux. Le produit est administré de préférence en injection intraveineuse lente ou en perfusion.
** ATTENTION ** start of the DESC field may contain end of CLMS **.
CLAIMS
1. Process for obtaining an activator of plasminogen, characteristic in that an acetone powder of animal organs chosen from the lungs and kidneys of pigs, calves, oxen, horses, lambs or sheep or the ovaries is treated of pigs, cattle or sheep, by:
a) suspending said powder in an aqueous solution
saline of low ionic strength in the vicinity of neutrality; b) taking up the precipitate obtained in step a in an aqueous solution
saline with an ionic strength between 0.6 and 1 at a pH
between 3 and 5; c) precipitation of the solution obtained after decantation in step b
by adding a salt or an organic solvent at a pH between 3 and 5; d) taking up the precipitate obtained in step c with water or a solution
saline and precipitation by adding a salt at a similar pH or
slightly greater than 7, and e) taking up the precipitate obtained in step d with water and dialysis of the
solution up to a resistivity of the order of 1000 Q cm at 10 C.
2. Method according to claim 1, characterized in that one carries out, at the end of the process, a purification of the solution obtained.
3. Method according to claim 1, characterized in that the salt used in step a is chosen from potassium acetate or potassium chloride, at concentrations between 1 and 10gil.
4. Method according to one of claims I or 2, characterized in that the salt used in step b is chosen from potassium salts, in particular chloride, acetate or potassium sulfate.
5. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the salt used in step c is chosen from ammonium sulfate or potassium chloride at concentrations between 100 and 200 g / I.
6. Method according to one of claims 1 to 3, characterized in that the organic solvent used is acetone.
7. Method according to one of claims 1 to 5, characterized in that the salt used in step d is chosen from sodium chloride, ammonium sulfate and potassium sulfate.
8. Method according to one of claims 1 to 6, characterized in that steps a and b of the method are carried out in the vicinity of 4 "C.
9. Method according to one of claims 1 to 7, characterized in that the acetone powder of animal organs can be obtained by: - dispersion in an acetone bath at low temperature of
crushed and homogenized organs, and - filtration, then drying of the suspension obtained.
10. Method according to claim 2, characterized in that the purification is carried out by precipitation of the solution obtained in step e at an isoelectric pH of 6.8 using a salt, in particular a salt chosen from zinc acetate, zinc chloride or calcium chloride.
11. Method according to claim 2, characterized in that the purification comprises at least one separation by exclusion chromatography on a mixed dextran / agarose and polyacrylamide gel.
12. Method according to claim 2, characterized in that the purification comprises at least one elution of the solution on an ion exchanger.
13. The method of claim 12, characterized in that the ion exchanger is a weakly acidic cation exchange resin and that the elution is carried out with solutions of constant ionic strength but at increasing pH.
14. Method according to claim 12, characterized in that the ion exchanger is a mixed cationic / anionic resin and that the solution is carried out with increasing ionic strength.
15. The process as claimed in claim 2, characterized in that the purification comprises at least one separation by affinity chromatography on an ion exchange resin on which a specific inhibitor of the plasminogen activator has been coupled.
16. Method according to claim 1, characterized in that the animal organ treated is the sow's ovary.
17. Use of the plasminogen activator, obtained according to the method according to claim 1, as active component in a medicinal composition.
The present invention relates to a process for obtaining a plasminogen activator.
More particularly, the present invention relates to a process for obtaining the endocellular tissue activator of plasminogen by extraction and purification of animal organs. Said activator acting on the arginine / valine peptide bonds of plasminogen, by opening said bonds without breaking the disulfide bridges, thus transforming plasminogen into plasmin, according to the overall scheme:
EMI1.1
<tb> <SEP> m's <SEP> (SS) y
<tb> <SEP> H2NLySStIAf <SEP> | <SEP> | <SEP> Arg <SEP> l <SEP> | <SEP> l
<tb> <SEP> |
<SEP> Plasminogen
<tb> <SEP> S-s <SEP> Plasminogêne
<tb> <SEP> + <SEP> activator
<tb> H2NLys <SEP> j ·) X5; rgcoo <SEP> Plasmine
<tb> <SEP> S-S <SEP> P [aFine
<tb> <SEP> H2NVal
<tb> <SEP> (s <SEP> - <SEP> sh
<tb> <SEP> Lys <SEP> = <SEP> Lysine <SEP> (55> y
<tb> <SEP> Arg <SEP> = <SEP> Arginine
<tb> <SEP> Val <SEP> = <SEP> Valine
<tb>
The plasmin or fibrinolysin thus formed increasing the rate of lysis of fibrin clots makes the product according to the present invention particularly valuable as a medicament for the treatment of arterial and venous thromboses in particular.
An activator of the type of that named is already known: it is urokinase, extracted from the urine of mammals; in this regard, one can consult the American patents Nos 2961382, 2983674 and 2989440.
However, it appeared that urokinase was very sensitive to induced inhibitors and that its action decreased very quickly.
It was therefore interesting to find an activator having a
activity at least equal to that of urokinase, but not very sensitive to inhibitors; this is the result obtained by the present invention.
The inventive method for obtaining a plasminogen activator is characterized in the preceding claim 1.
The salt used in step a is preferably chosen from potassium acetate and potassium chloride at concentrations of between approximately 1 and 10 g / l.
The salt used in step b is preferably chosen from potassium salts, in particular potassium chloride, potassium acetate and potassium sulfate, at concentrations of between 20 and 80 g / l, the pH being brought to the vicinity of 3 to 5 preferably using an acid such as acetic acid or sulfuric acid, so that the ionic strength of the solution is between 0.6 and 1.
The salt used in step c is preferably chosen from ammonium sulphate or sodium chloride at concentrations of between 100 and 200 g / l.
Although it is possible in this step c to precipitate the solution
by an organic solvent such as acetone, preferably used
salting out using a salt which increases the yield of
the operation.
The salt used in stage d is preferably chosen from sodium chloride, ammonium sulphate and potassium sulphate, the pH being brought to a value slightly higher than 7 using a base such as sodium hydroxide.
Steps a and b of the process are preferably carried out in the vicinity of 4 "C.
The organs treated in the process according to the present invention are recovered as soon as the animals die, then mechanically degreased and ground.
The organs thus roughly ground are frozen and can be, if necessary, ground again in frozen form, then thawed in suspension in a buffer of low ionic strength and of pH between S and 7 to be homogenized.
In a preferred embodiment of the invention, the acetone powder of animal organs is obtained by dispersing the ground and homogenized organs in an acetone bath at low temperature, for example around −10 "C. The acetone powder is obtained by filtration and drying of the previous suspension.
The purification steps will preferably include a precipitation step at isoelectric pH; for this, the solution obtained in step e and having a resistivity of 1000 Q ncm is brought to a pH close to 6.8 then the ionic strength of the solution is brought to 102 using a salt such as calcium chloride, but preferably a zinc salt such as zinc acetate or zinc chloride, then the solution is left at 0 ° C. to perfect the precipitation.
The precipitate thus obtained can be stored after dialysis by lyophilization.
If it is desired to perfect the purification, use an exclusion chromatography on a mixed dextran / agarose and polyacrylamide gel such as a Sepharose 6 B gel, this in order to remove certain molecular impurities and / or chromatography on a heat exchanger. 'ions to remove ionic impurities. The resins which can be used are, for example, weakly acidic or mixed exchangers such as Bio-rex 70 resins eluting at constant ionic strength and increasing pH, AG 1 1 As Bio-rad by eluting at constant pH and increasing ionic strength or Biogel HTP by variation in ionic strength.
The ionic strengths of the solutions are deduced from the resistivity of the solutions measured by known methods.
A general scheme for the preparation of molecules with enzymatic activity according to the present invention will be given below in order to illustrate the preferred embodiment of the invention.
I. Preparation of the acetone powder.
The aforementioned organs are recovered as soon as the animals die, then mechanically degreased and ground.
After this grinding, the organs are quickly frozen. They will subsequently undergo grinding in frozen form and will be homogenized after having been thawed in a phosphate buffer of low ionic strength and of pH between S and 7.
The organs thus prepared are dispersed in an acetone bath, the temperature of which should not be higher than −10 ° C.
When the intimate contact has been sufficient, the suspension is filtered under moderate vacuum.
The filter cake is carefully dried by circulation of nitrogen at low temperature.
The acetone powder thus obtained is pink in color and must undergo a fine homogenization at the end of the drying.
II. Obtaining an enriched extract.
a) Pre-aging of the acetone powder:
This operation is intended to eliminate beforehand a series of weakly bound pigments and proteins which would subsequently interfere with the extraction.
The acetone powder is suspended in an aqueous solution of a salt whose ionic strength will remain low, the pH of the solution remaining between 5 and 8, preferably in the vicinity of neutrality. The whole is left at 4 "C for 1 hour with stirring.
The residue of acetone powder is decanted, the solution is clarified for example in a wringer with a settling bowl and the pellet thus obtained is added to the above residue.
b) Extraction:
In this phase, the residue from step a is taken up in a medium with a higher ionic strength and a pH of between 3 and 5, the ionic strength of the solution being fixed between 0.6 and 1 by addition of a salt. potassium.
This extraction medium will be stirred for at least 2 hours while maintaining the temperature at 4 "C.
The weight ratio of acetone powder and solvent should not exceed 5%.
The residue of non-extracted acetone powder is removed by draining and the recovered solution is filtered under nitrogen pressure on c) Precipitation in an acid medium:
This first precipitation of the solution obtained previously is carried out in an acid medium at a pH close to 4.5 using a salting out salt such as ammonium sulfate at semi-saturation at 10 "C. The precipitate thus obtained is taken up in a volume of water or of a saline solution whose resistivity is less than 800 Q cm at 10 "C, the volume of this solution preferably not exceeding a quarter of the volume of the extracted solution.
d) Precipitation in weakly basic medium:
The pH of the solution obtained previously rose to a value slightly above 7 with sodium hydroxide (pH between 7 and 8). The solution thus obtained is precipitated by adding a large amount of salt, for example ammonium sulfate at 200 g / l, potassium sulfate at 200 g / l or sodium chloride at 185 g / l.
The precipitate is taken up in water, the volume of the recovery being approximately 1/10 volume of the extract treated in step b.
e) Dialysis:
The solution thus obtained is dialyzed to a resistivity of the order of 1000 Q ncm at 10 "C; the product at this level can follow the subsequent stages of purification or else be thus preserved by lyophilization.
III. Purification of the enriched extract.
1. Purification by precipitation near the isoelectric pH:
The dialysate obtained in the preceding stage e is brought to the isoelectric pH of the enzyme, that is to say pH 6.8, then a salt solution, preferably zinc acetate, is carefully added to bring the ionic strength at 10-2. It is left to precipitate overnight at 0 ° C. without stirring.
The precipitate is recovered and redissolved in 1/20 volume of the starting extract.
2. Exclusion chromatography:
The product from the previous phase or step e is passed over
a Sepharose 6 B column balanced using a buffer
phosphate of ionic strength brought to 0.6 by addition of chloride
sodium or potassium.
The ratio of the gel height to the column diameter does not
should not be less than 10. The flow rate of the chromatography is fixed
between 0.8 and II / h for a column of 101 volume, the volume of
the sample deposited is 500 to 800 ml for a column such
than previously considered (which corresponds to approximately 10 kg
gross organs).
The chromatography is carried out at 4 ° C. and the fraction is recovered
eluted between 15 and 25 1 for a column of 101.
The product obtained can be concentrated by cold precipitation with alcohol or acetone (3 volumes) or lyophilized after dialysis.
3. Pzification on ion exchanger:
On a weakly acidic cation exchange resin:
Use a Bio-rex 70 resin balanced in an acetate buffer balanced to 4.5. The elution is carried out with solutions of constant ionic strength but at increasing pH. The product is collected in the fraction eluted between pH 5.2 and 5.7.
On mixed resin:
A mixed AG 11 As resin balanced with a resistivity greater than 8000 Q cm is used. A solution of the enriched extract is then treated in a slightly acid medium.
The elution is carried out with increasing ionic strength and the product is recovered for the fraction eluted at a resistivity close to 5000 Q cm.
On Biogel HTP:
The hydroxyl is balanced in an M / 100 phosphate buffer and at pH 6.8. The suspension of Biogel HTP in this buffer is stirred for 30 min with 10 ml of crude extract per gram of dry absorbent.
After elimination of the solution by filtration or centrifugation, the pellet is recovered and the resistivity of the supernatant is brought to a value less than 80 n cm. After a further centrifugation, the dialyzed supernatant is lyophilized.
4. Purification by affinity chromatography:
Affinity chromatography is carried out on a support of the type
AH-Sepharose 4 B to which a specific inhibitor of the plasminogen activator has previously been coupled with a carbodiimide, the possible inhibitors for this being, for example, -aminocaprolic acid, aminoethylcyclohexanolic acid, trans4- acid aminoethylcyclohexanecarboxylic, paraaminomethylbenzoic acid.
Affinity chromatography is also possible on a
Sepharose activated with CNBr on which one can fix lysine, or any other of the products mentioned above.
All the other supports on which this coupling can be carried out can also be used with success, such as for example the series of biogels.
The plasminogen activator is dissolved in a 0.1 M phosphate buffer of pH 7-7.2, then passed over a column containing one of these supports. The activator remains attached to the support, while the inactive proteins are eluted. The activator is then eluted using an ionic strength gradient and the active fraction can be treated in the following two ways: 1 precipitation using a salt, such as ammonium sulphate,
dialysis, then lyophilization; 2. precipitation in the form of a complex insoluble in acid pH
with a polysaccharide, re-solution of the complex at a pH
neutral and lyophilization.
The following examples are intended to illustrate the invention but do not limit it in any way.
The acetone powder treated in these examples is obtained by
process I described above starting from sow ovaries.
Example 1:
a) 1 kg of acetone powder obtained by the scheme described above is suspended in 501 of a potassium acetate solution at 10 g / l. The mixture is stirred for 1 h, then allowed to settle.
We remove the clear supernatant.
b) 501 of cold water is then added to the preceding precipitate, then
1.5 kg of potassium acetate and finally 1 1 of glacial acetic acid, stirred vigorously for at least 3 h. The insoluble material is removed by spinning, then the solution is filtered.
c) 7.5 kg of ammonium sulphate are then added to this solution, the mixture is stirred until complete dissolution and the mixture is left to stand for at least 3 hours. The supernatant solution is discarded and the precipitate is redissolved in 10 l of potassium acetate at 10 g / l.
d) The pH of this solution is brought to 10 with sodium hydroxide, then 2 kg of ammonium sulfate are added. It is left to precipitate for 2 h and the collected precipitate is dissolved in 5 l of water.
e) The solution is dialyzed overnight against running water.
f) The insoluble material formed during dialysis is discarded, the solution is then treated with 500 mg of calcium chloride, the pH is adjusted to 6.5 and the solution is again put on dialysis against 30 l of chloride. calcium at 100 mg / l. After 4 h of dialysis, the precipitate formed is redissolved in 1 I of water with 5 cm 3 of acetic acid. The solution is lyophilized.
Example 2:
a) 1 kg of acetone powder obtained by the general process described above is suspended in 501 of cold water. 50 g of potassium chloride are added to this solution, the mixture is left to settle and the solution is removed by a floating filter.
b) The solid phase is resuspended in 501 of water to which 1.750 kg of potassium chloride are added, then about 500 ml of glacial acetic acid. Homogenize, stir for 6 h, then filter the solution.
c) This is then treated with 5 kg of sodium chloride, the precipitate obtained is redissolved in 101 of sodium chloride at 20 g / l.
d) After neutralizing the solution using sodium hydroxide, 1.750 kg of sodium chloride are added. The insoluble material thus obtained is taken up in 51 of water and dialyzed overnight against running water.
e) The insoluble material resulting from dialysis is eliminated and the supernatant solution is precipitated with 3 volumes of acetone at -20 "C. The precipitate redissolved in a minimum of water is placed at the top of a column of Sepharose 6 B (10 x 200) equilibrated in a phosphate buffer at pH 7.2 The product is recovered in the fraction eluted between 2 times and 2 Y2 times the volume of the column.The solution thus obtained is dialyzed and lyophilized.
Example 3:
a) 1 kg of acetone powder obtained by the general process described above is resuspended in 501 of cold water to which 200 g of potassium acetate are added. The pH of the solution is adjusted to 8 with sodium hydroxide. The mixture is stirred for 15 min, then allowed to settle. The supernatant solution is discarded.
b) The solid residue obtained above is dissolved in 501 of water to which 3 kg of potassium sulphate and sulfuric acid are added to a pH less than or equal to 5. It is homogenized and then stirred for 3 h at cold. The insoluble material is eliminated and the soluble fraction is filtered on an EKS filter.
c) The filtrate is treated with 2 volumes of acetone at -20 ° C. The precipitate obtained after decantation is redissolved in 101 of water.
d) 2 kg of potassium sulphate are added to this solution. After neutralization of the solution, a precipitate is recovered by centrifugation which is redissolved in 5 l of water.
e) This solution thus obtained is passed through an AG 1 1 A8 ion exchange column equilibrated in a slightly acid medium (500 g of dry exchanger per liter of sample). The elution will be by increasing ionic strength at slightly acidic pH. The active product is recovered in the eluted fraction having a resistivity of 5000 Q cm.
Study of pharmacological properties.
The product studied is the product obtained after precipitation of the solution at the isoelectric point.
1. Character of the molecule:
It is a molecule of glycoprotein nature whose molecular weight is around 40,000 with the formation of mono- and common polymers for all enzymatic substances.
Its isoelectric point (or isoelectric pH) is 6.8.
This molecule is soluble in a phosphate buffer having an ionic strength of 2000 Q cm.
2. Pharmacological properties:
The product obtained titers 300 to 500 CTA units / mg. The active site binds to the arginine / valine peptide bonds of plasminogen which are open without breaking the disulfide bridges, thereby transforming plasminogen into plasmin.
The molecule thus acquires great mobility by rotation around the disulfide bridges, which allows it to develop its enzymatic activity and to bind to receptors.
Tests carried out in vitro on fibrin plates using the Astrup technique show that the product of the lysis diameters for a 40 Fg / cm3 solution is greater than 400 mm2.
On a plate heated 30 min to 80 "C (destruction of plasminogen), no lysis zone can be demonstrated.
No esterase activity can be demonstrated with respect to the following amino acid esters: L-lysine, L-phenylalanine, Ltryptophane, etc. Only the methyl ester of paratosyl arginine and paranitrophenyl-N-carbobenzoxy-L-tyrosine are lysed.
The tests carried out in vivo according to the von Kaula technique by measuring the lysis time of plasma euglobulins in rats by intravenous injection of an isotonic solution at 25 mg / kg of the product described above causes a reduction of 50% in lysis time of the clot of euglobulins, which indicates a significant activation of the circulating fibrinolytic system.
The product according to the present invention is therefore particularly useful as a medicament in the treatment of arterial and venous thromboses and fibrinous deposits. The product is preferably administered by slow intravenous injection or by infusion.