**ATTENTION** debut du champ DESC peut contenir fin de CLMS **.
REVENDICATIONS
1. Procédé d'obtention d'une composition médicamenteuse, caractérisé en ce qu'elle contient à titre d'agent actif un activateur du plasminogène et un polysaccharide sulfaté, I'activateur du plasminogène étant obtenu en ce que l'on traite une poudre acétonique d'organes animaux choisis parmi les poumons et reins de porcs, veaux, boeufs, chevaux, agneaux ou moutons ou les ovaires de porcins, bovins ou ovins, par:
:
a) mise en suspension de ladite poudre dans une solution aqueuse saline de faible force ionique au voisinage de la neutralité,
b) reprise du précipité obtenu à l'étape a) dans une solution aqueuse saline de force ionique comprise entre 0,6 et 1 à un pH compris entre 3 et 5,
c) précipitation de la solution obtenue après décantation à l'étape b) par addition d'un sel ou d'un solvant organique à un pH compris entre 3 et 5,
d) reprise du précipité obtenu à l'étape c) par de l'eau ou une solution saline et précipitation par addition d'un sel à un pH voisin ou légèrement supérieur à 7,
e) reprise du précipité obtenu à l'étape d) par de l'eau et dialyse de la solution jusqu'à une résistivité de l'ordre de 1 000 ohm cm à 10 C, puis,
la composition médicamenteuse étant obtenue par l'addition d'un polysaccharide sulfaté à l'activateur du plasminogène obtenu en haut.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la solution obtenue en e) est purifiée.
3. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que la composition médicamenteuse contenant l'activateur du plasminogène et le polysaccharide sulfaté est préparée sous forme de complexe par addition du polysaccharide sulfaté à l'activateur en solution à un pH voisin de la neutralité, puis précipitation du complexe par acidification de la solution jusqu'à une valeur voisine de 6.
4. Procédé selon les revendications 1 et 2, caractérisé en ce que le polysaccharide sulfaté est un sulfate de dextrane.
5. Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le sulfate de dextrane utilisé a un poids moléculaire compris entre 3 000 et 15 000 et contient entre 10 et 20% de soufre.
6. Procédé selon les revendications 1 et 2, ou selon la revendication 3, caractérisé en ce que le polysaccharide sulfaté est additionné en quantité comprise entre 10 et 30% en poids de l'activateur du plasminogène dosé en protéine.
7. Composition médicamenteuse obtenue par les procédés selon les revendications 1 et 2 ou 3.
La présente invention concerne un procédé d'obtention d'une composition médicamenteuse, contenant un activateur du plasminogène et un polysaccharide sulfaté. Il est rappelé le brevet Suisse 627 783 de la même firma titulaire.
Le procédé inventif pour l'obtention d'une composition mé
dicamenteuse, contenant un activateur du plasminogène et un polysaccharide sulfaté est caractérisé dans la revendication 1.
Dans le mode de réalisation préféré le polysaccharide sulfaté utilisé est un sulfate de dextrane présentant de préférence
un poids moléculaire compris entre environ 3 000 et 15 000 et
contenant entre environ 10 et 20% de soufre.
Ce polysaccharide peut être utilisé, soit en association simple avec l'activateur du plasminogène par simple mélange des
deux produits, soit sous forme de complexant pour l'activateur.
Les essais réalisés ont montré que les activités de l'association
simple et du complexe étaient voisines.
Le polysaccharide sulfaté est utilisé en quantité comprise
entre 10 et 30% en poids de l'activateur dosé en protéine et de
préférence en quantité de l'ordre de 20% en poids de l'activa
teur dosé en protéine.
Le polysaccharide sulfaté est utilisé en quantité comprise
entre 10 et 30% en poids de l'activateur dosé en protéine et de préférence en quantité de l'ordre de 20% en poids de l'activa
teur dosé en protéine.
Le polysaccharide sulfaté utilisé peut être préparé par tout
procédé connu, comme par exemple par estérification du poly
saccharide par un acide soufré minéral ou organique en pré
sence d'une base fixant l'eau. Ainsi le sulfate de dextrane peut
être préparé par dégradation du dextrane à chaud en milieu
acide sulfurique pour réduire le poids moléculaire du dextrane,
puis estérification du dextrane obtenu par l'acide chlorosulfoni
que dans la pyridine.
Lorsque le médicament est préparé sous forme d'un com
plexe, la complexation est effectuée à un pH voisin de la neutra
lité en ajoutant la quantité nécessaire de polysaccharide sulfaté
à l'activateur en solution, puis le pH de la solution est progressi
vement acidifié jusqu'à une valeur voisine de 6, ce qui conduit à
la précipitation du complex désiré. Après récupération du préci
pité, celui-ci peut être redissous dans un tampon à un pH voisin
de 7 et lyophilisé.
Lors de la complexation, on utilise de préférence l'acide
phosphorique pour abaisser le pH de la solution et l'on conduit
la précipitation au voisinage de +4 "C.
Le sel utilisé pour les précipitations aux étapes c), d) est de
préférence le sulfate d'ammonium cirstallisé. Dans l'étape c)
lorsque l'on utilise le sulfate d'ammonium, celui-ci est employé
à une concentration comprise entre envirion 200 et 300 g/l et
dans les étapes d) et e) à une concentration comprise entre
environ 60 et 80 g/l.
Un schéma général de préparation d'un activateur du plas
minogène complexé selon la présente invention va être donné
ci-après afin d'illustrer le mode de mise en oeuvre préféré de
l'invention et afin de mieux mettre en évidence certaines carac
téristiques de la présente invention sans pour autant la limiter.
La poudre acétonique qui constitue la matière première de
base destinée à la préparation de l'activateur du plasminogène
est préparée de préférence comme suit.
Après avoir été décongelés et broyés, les organes traités sont
dispersés dans un bain d'acétone à une température inférieure à
10 et soumis à une agitation vigoureuse. La suspension ainsi
obtenue est filtrée et le gateau de filtration est rincé par de
l'acétone avant d'être séché sous azote.
a) Lavage préliminair:
La poudre acétonique est mise en suspension dans un tam
pon d'acétate ayant une force ionique de l'ordre de 0,02, le pH
de la solution étant voisin de la neutralité. On agite cette solu
tion durant une heure à + 4 "C, puis on essore le résidu de
poudre acétonique et on élimine la solution surnageante.
b) Extraction:
Le résidu est mis en suspension dans un tampon acétate, le
pH étant compris entre 3 et 5, cette suspension est agitée durant
3 heures à + 4 "C. Après essorage, on élimine le résidu de pou
dre non extrait et on passe la solution récupérée au clarificateur.
c)Première précipitation en milieu acide:
L'extrait clarifié obtenu à l'étape b) est précipité en milieu
acide à un pH voisin de 4,5 par addition de sulfate d'ammonium
à une concentration comprise entre 290 et 300 g/l, le précipité
ainsi obtenu est remis en solution dans un tampon acétate, puis
le pH de cette solution est remonté à une valeur comprise entre
7 et 8 avec de la soude concentrée.
d) Deuxième précipitation en milieu faiblement basique:
La solution précédente est à nouveau précipitée par addition
de sulfate d'ammonium à une concentration comprise entre en
viron 60 et 80 g/l. Après passage au clarificateur, le précipité inactif est éliminé et la solution est ajustée à un pH proche de 7.
Troisièmeprécipitation au voisinage de la neutralité:
La solution ainsi obtenue est précipitée une troisième fois
par addition de sulfate d'ammonium à une concentration com
prise entre 60 et 80 g/l. Le précipité formé est passé au clarificateur et lavé avec de l'eau distillée neutre.
Le précipité ainsi obtenu est dispersé dans de l'eau distillée et la solution est acidifiée jusqu'à pH 4. Après centrifugation on recueille le surnageant et on le dilue plusieurs fois par de l'eau distillée jusqu'à une résistivité de 600 à 650 Ohm.cm.
Le pH de la solution est alors amené entre 6,3 et 6,5 avec une résistivité de l'ordre de 450 Ohm.cm.
Le précipité formé est récupéré par centrifugation, puis dispersé dans un tampon phosphate. Le pH de la solution qui est alors voisin de la neutralité est remonté à l'aide d'une base vers des valeurs comprises entre 9 et 10, puis ramené au voisinage de la neutralité.
La solution centrifugée est alors recueillie. C'est sur cette solution que l'on effectue la chromatographie d'affinité.
Le support de chromatographie utilisé est du type AH-Sépharose 4B sur lequel on a préalablement couplé un inhibiteur spécifique de l'activateur du plasminogène par un carbodiimide.
Les inhibiteurs utilisables sont l'acide e-amino-caproîque, l'acide aminoéthylcyclohexanoîque, l'acide trans-4-aminoéthylcyclohexane carboxylique, L'acide paraaminométhylbenzoîque.
La chromatographie d'affinité peut être également réalisée sur un support Sépharose activé au CNBr sur lequel on peut fixer de la lysine ou l'un des produits cités précédemment. Il est possible bien entendu d'utiliser d'autres supports sur lesquels le couplage est réalisable, par exemple la série des Biogels.
On élue la fraction restée fixée sur le support au moyen d'un gradiant de force ionique. On procède alors sur l'éluat au dosage des protéines et de l'activité selon les méthodes décrites plus loin.
A la solution ainsi obtenue, on additionne à un pH voisin de la neutralité un polysaccharide sulfaté en quantité égale à 20% de la quantité de protéines présentes dans la solution; le pH de la solution est progressivement acidifié jusqu'à des valeurs proches de 6. L'activateur précipite alors sous forme d'un complexe avec le polysaccharide sulfaté. Le précipité est recueilli par centrifugation, puis est dissous dans un tampon à un pH voisin de 7 avant d'être lyophilisé.
Exemple:
10 kg d'ovaires de truies conservés à - 20 "C sont décon gelés à -5 "C puis broyés à l'aide d'un broyeur à viande avec une grille de 5 mm. Le broyat est ensuite dispersé dans 75 1 d'acétone à -20 "C. Après une agitation vigoureuse durant 1 heure la suspension est filtrée sur Buchner et le gâteau est rincé sur le filtre par de l'acétone à - 20 "C. On démoule alors le gâteau et on le sèche dans une colonne sous un courant ascendant d'azote sec. On obtient 1,3 kg de poudre acétonique pouvant être conservé à +4 "C.
a) La poudre acétonique ainsi obtenue est mise en suspension dans 301 de tampon acétate M/100, pH 6,5. On agite vigoureusement durant I heure à +4 "C, puis on essore. On recueille alors les organes et on élimine le filtrat. Les organes sont ensuite mis une nouvelle fois en suspension dans 10 1 du même tampon acétate, puis agités pendant 15 minutes à +4 "C avant d'être essorés.
b) Après l'essorage précédent, on remet les organes en suspension dans 301 de tampon acétate 0,3 M, pH 4,2 à +4 "C et on soumet l'ensemble à une agitation douce pendant 3 heures à 4 "C. On essore ensuite et on élimine les organes. Le filtrat est alors passé au clarificateur pour éliminer les fines particules en suspension. On recueille l'extrait clarifié.
c) On additionne cet extrait de 250 g/l de sulfate d'ammonium cristallisé. On agite jusqu'à dissolution complète, puis on laisse reposer une nuit à + 4 "C. Le précipité est recueilli au clarificateur et les eaux-mères sont éliminées. On le remet ensuite en solution par agitation 1 heure dans 8 1 de tampon acéta
te 0,1 M, pH 4,2 à + 4 "C. Le pH de la solution est alors
remonté à pH 7,5 par de la soude concentrée.
d) A la reprise à pH 7,5 précédente,on ajoute 64 g/l de
sulfate d'ammonium cristallisé,puis on ajuste le pH à 7,2 avec de
L'acide acétique. On laisse reposer 30 minutes à + 4 "C. Après
passage au clarificateur, le précipité inactif est éliminé et la solu
tion clarifiée est ajustée à pH 6,5.
e) On ajoute alors à cette solution 72,5 g/l de sulfate
d'ammonium en maintenant le pH par de la soude N. On agite
jusqu'à dissolution complète puis on laisse reposer 1 h 30 à +
4 "C. Après clarification, la solution est éliminée. On lave le
précipité sur le clarificateur par passage de 2,5 1 d'eau distillée
neutre.
f) Le précipité précédent est ensuite dispersé dans 500 ml
d'eau distillée.
On ajoute de l'acide acétique dilué jusqu'à l'obtention d'un
pH 4,3 stable, puis on agite 1 heure à + 4 "C. Après centrifuga
tion, l'insoluble de reprise est éliminé et le surnageant dilué 5 à
8 fois par de l'eau distillée jusqu'à ce qu'il ait une résistivité de ,600 à650 Q.
Le pH du surnageant de reprise est alors remonté à pH 6,3
6,5 par de la soude 0,5 N, la résistivité passe à 450 Q. Le
précipité formé est immédiatement recueilli par centrifugation
et le surnageant éliminé.
On disperse ce précipité dans 200 ml de tampon phosphate
M/15, pH 7,2 à + 4 "C, puis on remonte de pH à 9,5-10 par de
la soude (3N). On agite vigoureusement 20 minutes, avant de
ramener le pH à 7,3 par de l'acide phosphorique dilué. On laisse
reposer 30 minutes et on centrifuge.
L'insoluble est ensuite éliminé et le surnageant est passé sur
une colonne contenant un support de type AH-Sépharose 4 B.
Après dosage des protéines (entre 2,5 et 3 mg/ml) on ajoute
alors 2 fois le poids de protéines en glycocolle, puis on dose
l'activité. On obtient à ce stade 0,5 à 0,6 g de protéines titrant
entre 3000 et 4000 u.CTA/mg.
Après dosage des protéines et de l'activité, la fraction active
est additionnée de sulfate de dextrane. Le pH de la solution est
alors progressivement abaissé par de l'acide phosphorique dilué
jusqu'à pH 5,8-5,9. On laisse au repos 30 minutes à + 4 "C,
puis on centrifuge. On recueille le précipité et on élimine le
surnageant. Le complexe est alors dissous dans un tampon à pH
7-7,5, puis lyophilisé.
On donne ci-après le mode opératoire et les méthodes de
dosages employées pour mesurer les résultats expérimentaux.
La reconnaissance in vivo de l'activité fibrinolytique d'un
Activateur peut être effectuée chez le rat en mesurant le temps
de lyse des euglobulines plasmatiques. Cette technique de réali
sation simple, reproductible, applicable à de petits animaux de
laboratoire, est adaptée au mécanisme d'action du produit à
étudier.
Principe:
Le temps de lyse du caillot des euglobulines du plasma est
une méthode sensibilisée permettant d'apprécier une activité
lytique globale.
En abaissant la force ionique du plasma par dilution en eau
distillée à pH acide, on précipite les euglobulines, tandis que les
pseudo-globulines restent dans le surnageant.
Dans ce surnageant sont aussi éliminées, les antiplasmines
inhibitrices de la fibrinolyse (d'où une plus grande sensibilité de
la méthode). Parmi les euglobulines précipitées on retrouve la
quasi totalité du fibrinogène, plasminogène et de l'activateur du
plasminogène.
Technique:
Prélèvement:
Sang recueilli sur citrate trisodique 5,5 H2O â 3,8% dans le
rapport '/s. (Dès son prélèvement le sang doit être maintenu dans la glace fondante et l'examen pratiqué dans l'heure qui suit le prélèvement). Obtention du plasma par centrifugation à haute vitesse durant 10 minutes.
Réactifs:
- Tampon Michaleis pH 7,35 (fourni par les Lab. STAGO)
- Acide acétique, solution à 1,6 % diluée au t o extemporanément avec de l'eau distillée refroidie à 4 "C.
- Solution de Thrombase à 20 unités Mellanby par ml, dans du chlorure de calcium 0,05 M. 1 ampoule de Thromabse
ROUSSEL contenant 500 Unités Mellanby est reprise par 25 ml de Ca Cl2, 0,05 M. CaCl20,05M (5 ml de Ca Cl2 0,25 M (STAGO) + 20 ml eau distillée).
La solution de Thrombase ainsi préparée est répartie en fractions de 2 ml qui sont conservées au congélateur et décongelées extemporanément.
Methode:
- Dans un tube à centrifuger conique, introduire 0,5 ml de plasma
- ajouter lentement et en agitant 9,5 ml de solution d'acide acétique à 0,016% refroidie à 4 "C.
- mélanger par retournements sur parafilm
- laisser reposer 20 minutes à 4 "C
- centrifuger 10 minutes à 3500 tours/minutes
- éliminer le surnageant
- égoutter les tubes en les retournant sur papier filtre
- essuyer soigneusement les parois du tube en évitant d'atteindre le précipité appliqué au fond du tube
- reprendre le culot d'euglobulines par 0,5 ml de Tampon
Michaelis
- après dissolution complète prélever 0,25 ml de la solution d'euglobulines dans un tube à hémolyse
- porter au bain-marie à 37 "C
- recalcifier par 50 Cil de Thrombase calcique (à 20 U/ml) - déclencher le chronomètre dès que la coagulation s'est produite
- observer régulièrement le caillot et noter le temps qui s'est écoulé jusqu'à sa complète désagrégation (aspect flocons de neige dans un liquide clair).
Expérimentation animale:
Des rats mâles nalfs Iffa-Credo à jeun de nourriture depuis environ 16 heures, d'un poids compris entre 180 et 250 grammes selon les expérimentations, sont répartis en lots témoins et traités homogènes.
Les rats témoins reçoivent par injection dans la veine du pénis 1 ml pour 100 grammes de poids corporel, de tampon phosphate pH 7,2 ou de sérum physiologique selon que le produit à étudier est dissous dans l'un ou l'autre de ces véhicules.
Les rats traités reçoivent par injection dans la veine du pénis 1 ml pour 100 grammes de poids corporel du produit à étudier en solution à la concentration nécessaire pour obtenir la posologie désirée.
15 minutes exactement après les diverses injections, les rats sont légèrement anesthésiés à l'éther, le thorax est ouver et le sang est prélevé par ponction directe dans le ventricule. Il est alors traité selon la technique décrite précédemment.
Les résultats obtenus sont donnés ci-après.
Le sulfate de dextrane utilisé dans les essais est l'hydrodextrane potassique de formule:
EMI3.1
Essai 1: Activité propre du sulfate de dextrane.
Temps de lyse en mn Moyenne
Témoins 115 120 85 108 115 108 108,5
Sulfate de dextrane img/kg 73 120 110 110 50 120 97,1
Sulfate de dextrane 2 mg/kg 93 105 100 95 90 108 98,5
Comme on peut le constater, le sulfate de dextrane aux doses expérimentées ne présente pas d'activité significative.
Essai2: Activités comparées de l'activateur seul et de l'association selon l'invention.
Pour l'ensemble des essais, les dosages indiqués pour l'actî- vateur sont des dosages en protéines.
Cet essai a été réalisé en aveugle.
Temps de lyse en mn Moyenne % action
Témoins 120 155 120 135 130 - 128
Activateur 10 mg/kg 70 85 100 100 85 92 88,7 30,7
Activateur 10 mg/kg 65 52 45 45 35 - 48,4 62,1 + sulfate de dextrane 2 mg/kg
La solution selon l'invention est de façon significative deux fois plus active que la solution d'activateur seul.
Essai 3:
Temps de lyse en mn Moyenne % action
Témoins 145 135 130 145 150 140 140,8
Activateur5mg/kg 125 115 120 105 110 - 115 18,3
Activateur 5 mg/kg + 85 100 85 70 75 100 85,8 39
Sulfate de dextrane I mg/kg
Les résultats sont les mêmes qu'à l'essai 2.
Essai 4:
Temps de lyse en mn Moyenne % action
Témoins 83 80 75 65 95 - 79,6
ActivateurS mgXkg 67 100 100 65 70 85 81,2
Activateur 5 mg/kg + 48 53 48 55 55 50 51,5 35,3
Sulfate de dextrane i mg/kg
A la dose utilisée, ni la fraction active, ni le sulfate de dex- 25 Essai 5: Comparaison entre l'activité de l'association simple trane utilisé ne présentent d'activité significative par contre leur et du complexe selon l'invention.
association fait apparaître une bonne activité significative de l'ordre de 350ou
Temps de lyse en mn Moyenne % action
Témoins 145 140 135 103 - - 130,75
Complexe 85 70 95 75 95 90 85 35
Association 85 80 85 95 80 85 35
On constate que les activités de l'association simple et du complexe sont pratiquement semblables.
Des essais précédents il ressort nettement que l'association d'un polysaccharide sulfaté et d'un activateur du plasminogène constitue un médicament de choix pour le traitement de nombreux accidents circulatoires tels que les thromboses artérielles ou veineuses en particulier.
** ATTENTION ** start of the DESC field may contain end of CLMS **.
CLAIMS
1. Method for obtaining a medicinal composition, characterized in that it contains, as active agent, a plasminogen activator and a sulfated polysaccharide, the plasminogen activator being obtained by treating a powder acetone from animal organs chosen from the lungs and kidneys of pigs, calves, oxen, horses, lambs or sheep or the ovaries of pigs, cattle or sheep, by:
:
a) suspending said powder in an aqueous saline solution of low ionic strength in the vicinity of neutrality,
b) taking up the precipitate obtained in step a) in a saline aqueous solution with an ionic strength between 0.6 and 1 at a pH between 3 and 5,
c) precipitation of the solution obtained after decantation in step b) by addition of a salt or an organic solvent at a pH between 3 and 5,
d) taking up the precipitate obtained in step c) with water or a saline solution and precipitation by adding a salt at a pH close to or slightly above 7,
e) taking up the precipitate obtained in step d) with water and dialysis of the solution to a resistivity of the order of 1000 ohm cm at 10 C, then,
the drug composition being obtained by the addition of a sulfated polysaccharide to the activator of the plasminogen obtained above.
2. Method according to claim 1, characterized in that the solution obtained in e) is purified.
3. Method according to claims 1 and 2, characterized in that the medicinal composition containing the plasminogen activator and the sulfated polysaccharide is prepared in the form of a complex by adding the sulfated polysaccharide to the activator in solution at a pH close to the neutrality, then precipitation of the complex by acidification of the solution to a value close to 6.
4. Method according to claims 1 and 2, characterized in that the sulfated polysaccharide is a dextran sulfate.
5. Method according to claim 4, characterized in that the dextran sulfate used has a molecular weight of between 3,000 and 15,000 and contains between 10 and 20% of sulfur.
6. Method according to claims 1 and 2, or according to claim 3, characterized in that the sulfated polysaccharide is added in an amount between 10 and 30% by weight of the activator of the plasminogen dosed in protein.
7. Drug composition obtained by the methods according to claims 1 and 2 or 3.
The present invention relates to a process for obtaining a medicinal composition, containing a plasminogen activator and a sulfated polysaccharide. It is recalled the Swiss patent 627 783 of the same titular firma.
The inventive process for obtaining a mixed composition
dicamenteuse, containing a plasminogen activator and a sulfated polysaccharide is characterized in claim 1.
In the preferred embodiment, the sulfated polysaccharide used is a dextran sulfate preferably having
a molecular weight between about 3,000 and 15,000 and
containing between about 10 and 20% sulfur.
This polysaccharide can be used, either in simple association with the plasminogen activator by simple mixing of the
two products, either in the form of complexing agent for the activator.
The tests carried out have shown that the activities of the association
Simple and complex were nearby.
The sulfated polysaccharide is used in an amount included
between 10 and 30% by weight of the protein-dosed activator and
preferably in an amount of around 20% by weight of the activa
protein dosage.
The sulfated polysaccharide is used in an amount included
between 10 and 30% by weight of the activator dosed in protein and preferably in an amount of the order of 20% by weight of the activa
protein dosage.
The sulfated polysaccharide used can be prepared by any
known process, such as for example by poly esterification
saccharide with a mineral or organic sulfur acid in pre
sence of a base fixing the water. So dextran sulfate can
be prepared by degradation of hot dextran in the medium
sulfuric acid to reduce the molecular weight of dextran,
then esterification of the dextran obtained with chlorosulfoni acid
than in pyridine.
When the drug is prepared as a com
complex, complexation is carried out at a pH close to neutra
lity by adding the necessary amount of sulfated polysaccharide
to the activator in solution, then the pH of the solution is increased
acutely acidified to a value close to 6, which leads to
precipitation of the desired complex. After recovery of the preci
pity, it can be redissolved in a buffer at a neighboring pH
of 7 and freeze-dried.
When complexing, the acid is preferably used
phosphoric to lower the pH of the solution and we conduct
precipitation near +4 "C.
The salt used for precipitation in stages c), d) is
preferably cirstallized ammonium sulfate. In step c)
when ammonium sulphate is used, it is used
at a concentration between about 200 and 300 g / l and
in steps d) and e) at a concentration between
about 60 and 80 g / l.
A general scheme for the preparation of a plas activator
complexed minogen according to the present invention will be given
below to illustrate the preferred mode of implementation of
the invention and in order to better highlight certain characteristics
of the present invention without however limiting it.
The acetone powder which constitutes the raw material of
base for the preparation of the plasminogen activator
is preferably prepared as follows.
After being thawed and ground, the treated organs are
dispersed in an acetone bath at a temperature below
10 and subjected to vigorous agitation. The suspension as well
obtained is filtered and the filter cake is rinsed with
acetone before being dried under nitrogen.
a) Preliminary washing:
The acetone powder is suspended in a tam
acetate pon having an ionic strength of the order of 0.02, the pH
of the solution being close to neutrality. We shake this solution
tion for one hour at + 4 "C, then the residue of
acetone powder and the supernatant solution is removed.
b) Extraction:
The residue is suspended in an acetate buffer, the
pH being between 3 and 5, this suspension is stirred for
3 hours at + 4 "C. After spinning, the louse residue is removed
dre not extracted and the recovered solution is passed to the clarifier.
c) First precipitation in an acid medium:
The clarified extract obtained in step b) is precipitated in the middle
acid at a pH close to 4.5 by addition of ammonium sulfate
at a concentration between 290 and 300 g / l, the precipitate
thus obtained is redissolved in an acetate buffer, then
the pH of this solution rose to a value between
7 and 8 with concentrated soda.
d) Second precipitation in weakly basic medium:
The previous solution is again precipitated by addition
ammonium sulphate at a concentration between
about 60 and 80 g / l. After passage through the clarifier, the inactive precipitate is removed and the solution is adjusted to a pH close to 7.
Third precipitation near neutrality:
The solution thus obtained is precipitated a third time
by adding ammonium sulphate to a com concentration
taken between 60 and 80 g / l. The precipitate formed is passed to the clarifier and washed with neutral distilled water.
The precipitate thus obtained is dispersed in distilled water and the solution is acidified to pH 4. After centrifugation, the supernatant is collected and diluted several times with distilled water to a resistivity of 600 to 650 Ohm.cm.
The pH of the solution is then brought between 6.3 and 6.5 with a resistivity of the order of 450 Ohm.cm.
The precipitate formed is recovered by centrifugation, then dispersed in a phosphate buffer. The pH of the solution, which is then close to neutrality, is raised using a base to values between 9 and 10, then brought back to the vicinity of neutrality.
The centrifuged solution is then collected. It is on this solution that the affinity chromatography is carried out.
The chromatography support used is of the AH-Sepharose 4B type on which a specific inhibitor of the plasminogen activator has previously been coupled with a carbodiimide.
The inhibitors which can be used are e-amino-caproic acid, aminoethylcyclohexanoic acid, trans-4-aminoethylcyclohexane carboxylic acid, paraaminomethylbenzoic acid.
The affinity chromatography can also be carried out on a Sepharose support activated with CNBr on which one can fix lysine or one of the products mentioned above. It is of course possible to use other supports on which coupling is possible, for example the Biogels series.
The fraction which remains fixed on the support is eluted by means of an ionic strength gradient. The eluate is then used to assay the proteins and the activity according to the methods described below.
To the solution thus obtained, a sulfated polysaccharide is added at a pH close to neutrality in an amount equal to 20% of the amount of proteins present in the solution; the pH of the solution is gradually acidified to values close to 6. The activator then precipitates in the form of a complex with the sulfated polysaccharide. The precipitate is collected by centrifugation, then is dissolved in a buffer at a pH close to 7 before being lyophilized.
Example:
10 kg of sow ovaries stored at - 20 "C are frozen at -5" C and then ground using a meat grinder with a 5 mm grid. The ground material is then dispersed in 75 l of acetone at -20 "C. After vigorous stirring for 1 hour the suspension is filtered on Buchner and the cake is rinsed on the filter with acetone at - 20" C. The cake is then removed from the mold and dried in a column under an ascending stream of dry nitrogen. 1.3 kg of acetone powder are obtained, which can be stored at +4 "C.
a) The acetone powder thus obtained is suspended in 301 of acetate buffer M / 100, pH 6.5. Vigorously stirred for 1 hour at + 4 ° C., then drain. The organs are then collected and the filtrate is removed. The organs are then again suspended in 10 l of the same acetate buffer, then agitated for 15 minutes at +4 "C before being wrung.
b) After the previous spin, the organs are resuspended in 301 of 0.3 M acetate buffer, pH 4.2 at +4 "C and the whole is subjected to gentle stirring for 3 hours at 4" C . We then wring and remove the organs. The filtrate is then passed to the clarifier to remove the fine particles in suspension. The clarified extract is collected.
c) This extract of 250 g / l of crystallized ammonium sulfate is added. The mixture is stirred until complete dissolution, then it is left to stand overnight at + 4 "C. The precipitate is collected in the clarifier and the mother liquors are eliminated. It is then put back into solution by stirring for 1 hour in 8 l of aceta buffer.
te 0.1 M, pH 4.2 to + 4 "C. The pH of the solution is then
brought back to pH 7.5 with concentrated sodium hydroxide.
d) When resuming at the previous pH 7.5, 64 g / l of
ammonium sulfate crystallized, then the pH is adjusted to 7.2 with
Acetic acid. Leave to stand for 30 minutes at + 4 "C. After
passage to the clarifier, the inactive precipitate is eliminated and the solu
The clarified tion is adjusted to pH 6.5.
e) 72.5 g / l of sulfate are then added to this solution
of ammonium while maintaining the pH with sodium hydroxide N.
until complete dissolution and then let stand 1 h 30 to +
4 "C. After clarification, the solution is eliminated. The
precipitated on the clarifier by passing 2.5 l of distilled water
neutral.
f) The preceding precipitate is then dispersed in 500 ml
distilled water.
Diluted acetic acid is added until a
pH 4.3 stable, then stirred for 1 hour at + 4 "C. After centrifugation
tion, the insoluble material is removed and the supernatant diluted 5 to
8 times with distilled water until it has a resistivity of, 600 to 650 Q.
The pH of the recovery supernatant then rose to pH 6.3
6.5 with 0.5 N sodium hydroxide, the resistivity increases to 450 Q. The
precipitate formed is immediately collected by centrifugation
and the supernatant removed.
This precipitate is dispersed in 200 ml of phosphate buffer
M / 15, pH 7.2 to + 4 "C, then the pH rises to 9.5-10 with
soda (3N). Shake vigorously 20 minutes before
reduce the pH to 7.3 with dilute phosphoric acid. We let
stand 30 minutes and centrifuge.
The insoluble material is then removed and the supernatant is passed over
a column containing an AH-Sepharose 4 B type support.
After determination of the proteins (between 2.5 and 3 mg / ml), add
then 2 times the weight of protein in glycocolle, then we dose
the activity. 0.5 to 0.6 g of protein is obtained at this stage.
between 3000 and 4000 u.CTA / mg.
After determination of proteins and activity, the active fraction
is added dextran sulfate. The pH of the solution is
then gradually lowered by dilute phosphoric acid
up to pH 5.8-5.9. Leave to stand for 30 minutes at + 4 "C,
then centrifuged. The precipitate is collected and the
supernatant. The complex is then dissolved in a pH buffer
7-7.5, then lyophilized.
The procedure and the methods of
assays used to measure experimental results.
In vivo recognition of the fibrinolytic activity of a
Activator can be performed in rats by measuring time
of plasma euglobulin lysis. This real technique
simple, reproducible position, applicable to small animals of
laboratory, is adapted to the mechanism of action of the product to
to study.
Principle:
The lysis time of the plasma euglobulin clot is
an educated method allowing to appreciate an activity
overall lytic.
By lowering the ionic strength of the plasma by dilution with water
distilled at acidic pH, the euglobulins are precipitated, while the
pseudo-globulins remain in the supernatant.
In this supernatant are also eliminated, the antiplasmin
fibrinolysis inhibitors (resulting in greater sensitivity of
the method). Among the precipitated euglobulins we find the
almost all of fibrinogen, plasminogen and activator of
plasminogen.
Technical:
Sample:
Blood collected on trisodium citrate 5.5 H2O at 3.8% in the
reports. (As soon as it is collected, the blood must be kept in the melting ice and the examination carried out within one hour of the collection). Obtaining plasma by centrifugation at high speed for 10 minutes.
Reagents:
- Michaleis buffer pH 7.35 (supplied by Labs. STAGO)
- Acetic acid, 1.6% solution diluted at t o extemporaneously with distilled water cooled to 4 "C.
- Thrombase solution at 20 Mellanby units per ml, in 0.05 M calcium chloride. 1 ampoule of Thromabse
ROUSSEL containing 500 Mellanby Units is taken up in 25 ml of Ca Cl2, 0.05 M. CaCl20.05M (5 ml of 0.25 M Ca Cl2 (STAGO) + 20 ml distilled water).
The Thrombase solution thus prepared is divided into 2 ml fractions which are stored in the freezer and thawed immediately.
Method:
- In a conical centrifuge tube, introduce 0.5 ml of plasma
- add slowly and with stirring 9.5 ml of 0.016% acetic acid solution cooled to 4 "C.
- mix by inversion on parafilm
- let stand 20 minutes at 4 "C
- centrifuge 10 minutes at 3500 rpm
- eliminate the supernatant
- drain the tubes by turning them over on filter paper
- carefully wipe the walls of the tube, avoiding reaching the precipitate applied to the bottom of the tube
- take the pellet of euglobulins with 0.5 ml of Buffer
Michaelis
- after complete dissolution take 0.25 ml of the euglobulin solution in a hemolysis tube
- bring to a bain-marie at 37 "C
- recalcify with 50 Cil of Calcium Thrombase (at 20 U / ml) - start the stopwatch as soon as coagulation has occurred
- regularly observe the clot and note the time which has elapsed until its complete disintegration (appearance of snowflakes in a clear liquid).
Animal experimentation:
Male Iffa-Credo male rats fasted for food for about 16 hours, weighing between 180 and 250 grams according to the experiments, are divided into control batches and treated homogeneously.
Control rats receive by injection into the penile vein 1 ml per 100 grams of body weight, phosphate buffer pH 7.2 or physiological saline depending on whether the product to be studied is dissolved in one or other of these vehicles .
The treated rats receive by injection into the vein of the penis 1 ml per 100 grams of body weight of the product to be studied in solution at the concentration necessary to obtain the desired dosage.
Exactly 15 minutes after the various injections, the rats are slightly anesthetized with ether, the chest is opened and the blood is drawn by direct puncture into the ventricle. It is then treated according to the technique described above.
The results obtained are given below.
The dextran sulfate used in the tests is the potassium hydrodextran of formula:
EMI3.1
Test 1: Own activity of dextran sulfate.
Lysis time in minutes Average
Witnesses 115 120 85 108 115 108 108.5
Dextran sulfate img / kg 73 120 110 110 50 120 97.1
Dextran sulfate 2 mg / kg 93 105 100 95 90 108 98.5
As can be seen, the dextran sulfate at the doses tested does not show any significant activity.
Trial 2: Comparative activities of the activator alone and of the association according to the invention.
For all of the tests, the dosages indicated for the activator are protein dosages.
This test was carried out blind.
Lysis time in minutes Average% action
Witnesses 120 155 120 135 130 - 128
Activator 10 mg / kg 70 85 100 100 85 92 88.7 30.7
Activator 10 mg / kg 65 52 45 45 35 - 48.4 62.1 + dextran sulfate 2 mg / kg
The solution according to the invention is significantly twice as active as the activator solution alone.
Trial 3:
Lysis time in minutes Average% action
Witnesses 145 135 130 145 150 140 140.8
Activator 5 mg / kg 125 115 120 105 110 - 115 18.3
Activator 5 mg / kg + 85 100 85 70 75 100 85.8 39
Dextran sulfate I mg / kg
The results are the same as in test 2.
Test 4:
Lysis time in minutes Average% action
Witnesses 83 80 75 65 95 - 79.6
Activator S mgXkg 67 100 100 65 70 85 81.2
Activator 5 mg / kg + 48 53 48 55 55 50 51.5 35.3
Dextran sulfate i mg / kg
At the dose used, neither the active fraction nor the dex sulfate 25 Test 5: Comparison between the activity of the single trane combination used has significant activity, however, and the complex according to the invention.
association shows good significant activity of around 350 or
Lysis time in minutes Average% action
Witnesses 145 140 135 103 - - 130.75
Complex 85 70 95 75 95 90 85 35
Association 85 80 85 95 80 85 35
It can be seen that the activities of the simple association and the complex are practically similar.
From previous tests it is clear that the combination of a sulfated polysaccharide and a plasminogen activator constitutes a drug of choice for the treatment of many circulatory accidents such as arterial or venous thromboses in particular.