JPS6348222A - インタ−ロイキン−２活性阻害因子吸着剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、血液中のインターロイキン−２（以下、ＩＬ
−２と略称する）活性阻害因子を吸着除去することによ
り、ＩＬ−２の活性を高め、免疫能を強化させ、疾病の
治癒を促進させるためのＩＬ−２活性阻害因子吸着剤に
関するものである。

（従来の技術） 近年、免疫系と多くの疾病、例えば自己免疫疾患、腫瘍
、感染症などの絡みが解明されつつある中で、プロティ
ンＡの免疫系を介しての医療への利用の可能性が考えら
れている。

プロティンＡは、イムノグロブリン（ＩｇＧ　）や、免
疫複合体と吸着することが知られており〔イムノケミス
トリー、第７巻、１２４〜１２７頁（Ｉｍｍｕｎｏｃｈ
ｅｍｉｓｔｒｙ＋　ＶＯＬ７＋　ＰＰ　１２４〜１２７
）　）　＊免疫複合体は、免疫系のブロッキングファク
ターとして働くことが知られている。このため、プロテ
ィンＡカラムの免疫複合体吸着は、免疫系の活性化と関
係があることが推測されるが、プロテインＡのＩＬ−２
活性阻害因子などその他の免疫抑制物質に対する作用は
未だ明確になっていない。更に、プロティンＡの具体的
、実際的な医療への利用の形態の１つとして、プロティ
ンＡを適当な担体に固定化させたものを用いることが試
みられているが、これまでに、プロティンＡを活性炭の
表面にコーティングしたコロジオン膜に包埋したり〔イ
ングリッシュ・ジャーナル・オブ・メゾシン。

３０５巻、１．１９５頁、１９８１年（Ｅｎｇｌ　、　
Ｊ、　Ｍｅｄ　。

３０５；　１１９５．１９８１）　〕、アガロースやデ
キストラン等の多据類や、ポリスチレン等のプラスチノ
りの支持体にプロティンＡを固定した吸着剤が提案され
ている。

これらの吸着剤は、 ■プロティンＡの固定量が少なく、効果が低い、■プロ
ティンＡの固定が不安定であり、ゾロティｔｌＩ′ ンＡの離脱が生じ、人体等に有害例副作用を与える可能
性がある、 ■担体が生体親和性に乏しく、血液等の体液が接触する
ことにより凝固することがある、■担体の疎水性が大き
いと、アルブミン、グロブリン等が非特異的に吸着し、
プロティンＡによる選択吸着能力が低下する、 等の問題点がある。

プロティンＡを定量的に、かつ安定に担体に固定させる
ためには、イオン吸着、物理的吸着また＋７ げ包埋等では離脱等が生じ、人体に有害な作用を与える
可能性があり、危険であるため、さらに強固な結合が必
要である。一方、固定担体は、生体内で異物と認識され
ると、周辺で血液が凝固した９、抗体が誘発されたりす
るため、血液との接触を妨げられて、効果を減じるばか
りでなく、凝固した血液塊が血管内を移動し、細部で血
栓を生じ重大な障害を起すことがあり、危険である。

さらにまた、担体がポリスチレンのように疎水性が大き
い物質であると、アルブミン、グロブリン等が非特異的
に吸着し、プロティンＡの選択的吸着能力を減少させ、
効果が低下する等の問題点がある。

（発明が解決しようとする問題点） 本発明の目的は、かかる事情に鑑み、他の有害な副作用
が生じること゛なく、免疫能力を高め、疾病の治癒効果
を増大せしめることを目的としたＩＬ−２活性阻害因子
数着剤を提供することにある。

（問題点を解決するだめの手段） 代表的なリンホカインの一つとして知られるＩＬ−２は
、免疫現象に深く関与するＴ細胞増殖因子であり、ヒト
末梢血や、マウス牌細胞と培養することによって細胞障
害活性を有するＬＡＫ細胞（リンホカインアクチベイテ
ノドキラ−セル）が生じ、悪性腫瘍の一種であるメラノ
ーマの転移を抑制することが報告されている〔マズンダ
ー・エイ等；ジャーナル・オブ・エクスベリメンタル・
メゾシン、１５９巻、４９５頁、１９８４年（Ｍａｚｕ
ｍｄｅｒ、　Ａ、　ｅｔａｌ　、　：　Ｊ、Ｅｘｐ　、
　Ｍｅｄ　、　、　１５９．４９５　（１９８４））］
。

また、ヒトに対し、ＩＬ−２の投与により癌治療の可能
性が高いことも報告されている〔マイケル・ティー・エ
ル等；ジャーナル・オブ・イムノロジー；　１３４巻、
１５７頁（１９８５年）　（Ｍｉｃｈａｅｌ　、Ｔ、Ｌ
。

ｅｔａｌ、：Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、、　１３４　、１
５’７　（１９８５）））。

本発明は、ＩＬ−２のこのような活性に着目し、ＩＬ−
２に対するプロティンＡをリガンドとする吸着体の作用
を鋭意検討したところ、キトサンもしくはキチン−キト
サン複合体より構成される担体または前記担体を架橋処
理した担体と、プロティンＡとが結合基を介して共有結
合された吸着剤が、ＩＬ−２の活性を大きく上昇させる
ことを見出した。これは、本発明による吸着剤が、ＩＬ
−２活性阻害因子を吸着除去せしめた結果であることが
判った。

ＩＬ−２活性阻害因子を効率良く吸着させるためには、
プロティンＡを固定する担体が目的に合致する性質を保
有していることが大切である。

本発明による吸着剤は、体外循環による、血液浄化シス
テムに適用されることが通常考えられるが、そのために
は、プロティンＡを結合した吸着体が血液、血漿及び血
清と十分に接触し得る表面積が必要である。このために
は、粒子径を小さくすることが必要であるが、反面、血
液及びその構成物質等の体液を十分な流速で流す必要も
あシ、担体の粒子径を下げると目詰まり等により流速が
低下してし１う。この２つの条件を満すためには、担体
の粒子径が０．１　ｍｕ〜３朋の球状が最適である。

さらに、担体の表面積を多くすると同時に強度を維持す
るためには、０．０５〜３μｍの孔径の細孔が好ましい
。

また、血液凝固等を避けるためには、生体適合性を保持
することが必要であるが、甲殻類の表皮構成成分である
キチン及びこの脱アセチル体であるキトサンが優れた性
質を有しており、さらに強度、加工性、リガンドとの結
合性にも優れ、入手面でも有利であることが明らかに々
っだ。

担体となるキトサンもしくはキチンーキトザン複合体は
、その才までも使用することができるが、強度を増すた
めに架橋処理を施すことができる。

本発明でいう複合体とは、キチンユニットとキトサンユ
ニットのみから構成されているものを意味する。また、
キチンーギトサン複合体のキチンユニット含量について
に°、特に制限は無いが、プロティンＡをキトサンユニ
ットのアミン基を介して結合させる場合にはそれに対応
する量のキトサンユニットが必要である。このとき残余
のキトサンユニット１４、アセチル化によりキチンユニ
ットとすることもできる。

プロディンＡと担体とを直接結合させる方法として、相
体が併有する水酸基またはアミン基にプロティンＡを直
接吸着させる方法と、プロティンＡをこれらの官能基と
共有結合させる方法が考えられるが、担体にプロティン
Ａが直接結合させると、立体障害等により、ＩＬ−２活
性阻害因子の吸着が抑制される。このため、担体及びプ
ロティンＡの間に適当な結合基をはさみ、これをスセー
サーとすることにより立体障害を回避できた。このスペ
ーサーは、その分子の一端でプロティンＡと共有結合し
、他の一端で担体の官能基と共有結合しているため安定
であり、プロティンＡが離脱することがない。

キトサンもしくはキチン−キトサン複合体より構成され
る担体は、アミン基を有しておシ、これらのアミン基は
アルカンジカルボン酸無水物を作用させることにより、
カルボキシル基を有する活性支持基に変換することがで
きる。

反応の溶媒としては通常水が用いられるが、その他テト
ラヒドロフラン、ジオキサンなどのエーテル類、酢酸な
どのカルボン酸類、ピリジンナトも用いられる。また、
特に触媒は用いないでもよいが、塩酸、硫酸などの酸や
、水酸化ナトリウムや炭酸カリウムなどのアルカリの添
加により反応液のＰＨを調整することもできる。

反応に用いられるアルカンジカルボン酸無水物としでは
、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水
物、ピメリン酸無水物、スペリン酸無水物、アゼライン
酸無水物、セパシン酸無水物、１，１０−デカンジカル
がン酸無水物、１，１２−ドデカンソカルボン酸無水物
、１，１４−テトラデカンジカルボン酸無水物などを例
示することができる。

反応条件については必ずしも制限はないが、−般に次の
ような条件を選択して反応を行なうのが好ましい。

前記担体の重量（ａｌとアルカンジカルボン酸無水物の
重量（ｂ）の比： ａ　：　ｂ　＝　１　：　０．０５〜１．０より好まし
くは、 ａ　：　ｂ＝１　：　０．１〜３ 反応温度：０〜１５０°Ｃ１より好１しくは室温〜１０
０℃、反応時間＝１〜６０時間、より好ましぐば１〜３
０時間、反応圧カニ常圧〜ＩＱａｔｍ、より好ましくは
常圧。

反応後の後処理についても特別な要件は無く、ｒ別、洗
浄等通常行なわれている方法にて適宜実施される。

以上により得られたカルボキシル基を有する担体は、次
いでモノカルボン酸無水物またはハロゲン化アシルを作
用させることにより、残余のアミン基をアシル化するこ
とができる。

このときの反応の条件は、前述のアルカンジカルボン酸
無水物の場合と同様にして行うことができるが、アシル
化剤としてハロゲン化アシルを用いる場合は溶媒として
は水以外のものを用いた方がよく、また触媒としてはア
ルカリが好ましい。

反応に用いられるモノカルボン酸無水物としては、無水
酢酸、無水プロピオン酸、無水酪酸などが例示され、１
だハロゲン化アシルとしては、塩化アセチル、臭化アセ
チル、塩化ノロピオニル、塩化ブチリルなどを例示する
ことができる。

カルボキシル基にプロティンＡを共有結合させるに際し
ては、適宜縮合剤や反応試薬などを用いて適当な溶媒下
で行なうことができる。縮合剤や反応試薬としては、例
えば、Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド、ジシクロへキシ
ルカルボジイミド、または１−エチル−３−（３−ツメ
チルアミツブロビル）カルボジイミド等々を例示するこ
とができる。また溶媒としては通常水が用いられるが必
要に応じてリン酸や酢酸緩衝液として用いることもでき
、また塩化ナトリウムなどの無機塩類を添加して用いる
ことも可能である。

プロティンＡとの反応条件については必ずしも制限はな
いが、一般に火力ような範囲で行なうことが適当である
。

カルボキシル基を結合させた本発明に係る担体とプロテ
ィンＡの重量比：１：０．０３〜０．３、好ましくは１
：０．０５〜０．２；反応温度：０°Ｃ〜室温、好まし
くは４°Ｃ〜室温；反応時間＝１〜７２時間、好ましく
は２〜１２時間。

反応後の後処理についても特別な要件は無く、Ｐ別、洗
浄等通常行なわれている方法にて適宜実施される。

リガンドとするプロティンＡは、黄色ブドウ球菌細胞壁
から得たもの、または遺伝子操作により大腸菌または酵
母菌等によって産生されたものが用いられる。

また、結合されるプロティンＡの量は、本発明による吸
着剤１ｇ当り１■〜３０■程度が必要である。

（発明の効果） 本発明によるプロティンＡを固定化した吸着剤は、ＩＬ
−２活性阻害因子を吸着除去せしめることにより、ＩＬ
−２の活性を上昇させうる作用を有することが判明した
が、これは従来のゾロティンＡの免疫複合体除去等に起
因するとされる免疫系の活性化とは異なるもので疾病に
対する新らしい医療手段を提供するものであり、特に悪
性腫瘍に対する治療効果が期待される。さらに本発明に
よる吸着剤は前述の従来技術にみられる問題点を総て解
決する担体を用い、これに適当な結合基を介してプロテ
ィンＡを共有結合させたものである為、プロティンＡの
活性を落さずに必要充分な量を担持させたものを得るこ
とが可能であり、また使用時の脱落もなく、非特異的吸
着も少ない等高い効率で安全に使用しうるものであるば
かりでなく、強度の高い適当な粒径を有する多孔性ビー
ズであるという物理的性質は範囲の広い利用手段に有利
に対応し得るものとしてその効果は大きい。

（実施例） 以下に本発明による吸着剤の効果について代表的な例を
示し、更に具体的に説明する。但し、これらは説明の為
の単なる例示であって、本発明はこれらに何ら制限され
ないのは言うまでもない。

参考例１ 粒径０．１　ｍｍのキトサン多孔性ビーズ（商品名ショ
ウデソクスキトパール、芳香族系架橋品）１．ＯＩに無
水グルタル酸１．０ｇの水５ｍｌにおける溶液を加え、
４規定水酸化す）　ＩＪＪウム溶液を加えてＰＨを６に
調整した後、室温で一旦振盪した。ビーズを枦取し、０
．１規定炭酸水素す）　ＩＪＪウム溶液、０．１規定塩
酸及び水の順に洗浄した。次いでビーズに０．２モル酢
酸す）　ＩＪウム水水溶液５ｍ合加え、無水酢酸０．５
９を加えた後、室温で２時間振盪した。ビーズを涙取し
大量の水で洗い乾燥させた。

このビーズ（カルボキシル基：乾燥グル１ｇ当り０．３
５ミリモル）を無水・ジオキサンで充分洗浄しく１３） た後、無水ジオキサン４　ｍｌ中に加え、更にＮ−ヒド
ロキシコハク酸イミド８０ダ及びジシクロへキシルカル
ボジイミド１４４■を加えて室温で２時間振盪した後、
ビーズを炉取し、無水ジオキサン２０ｍ１．メタノ−ｋ
　６　ｒｎｌ　、冷水３ｍｌの順で素早く洗浄した。こ
のビーズをプロティンＡ６■の０．０１’モル炭酸水素
ナトリウムの水２ｍｌにおける溶液に加え室温で２時間
振盪後、４℃で一夜放置した。

ビーズを涙取し１モル塩化ナトリウム水溶液及び水で洗
浄した後、１モル）　ＩＪスス−酸緩衝液（ＰＨＰＨ８
−０）２に加え室温で１時間振盪した後、再びビーズを
枦取して水洗した。

こうして得られた吸着剤は、乾燥ビーズ１ｇ当りプロテ
ィンＡを３．０　ｍｇ担持させていることが未反応によ
る回収プロティンＡの量から確かめられた。

参考例２ 参考例１で用いたキトサン多孔性ビーズ（商品名ショウ
デックスキトパール、芳香族架橋品）の代りにキトサン
多孔性ビーズ（商品名ショウデックスギト・々−ル、脂
肪族架橋品）を用い、その他は参考例１と同様の操作を
行って乾燥ビーズ１ｇ当りプロティンＡを３．５　ｍ９
担持させている吸着剤を得た。

実施例 吸着実験：免疫反応促進因子ＩＬ−２に対するビーズの
吸着性能（ｒｌ　０．１９のビーズにＩＬ−２’ｉｉ５
％含有する水溶液０．４　ｍｌを添加し、次に示す方法
で検討した。

吸着剤　　　　　　　　ＩＬ−２溶液 遠心分離 こうして得られた吸着率（＠を次に示す。

参考例１の吸着剤　　　　　　　−４２，９受診者例２
の吸着剤　　　　　　　−３３，８係比較吸着例 ■参考例１に用いたキトサンビーズ＋１３．５　％■参
考例２に用いたキトサンビーズ　＋１２．２％■コンカ
ナバリンＡを■に担持させたもの　→−１８８受■コン
カナバリンＡを■に担持させたもの＋１７，７％特許出
願人　　昭和電工株式会社 川澄化学工業株式会社

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. キトサンもしくはキチン−キトサン複合体より構成され
   る担体または前記担体を架橋処理した担体と、プロテイ
   ンＡとが結合基を介して共有結合されていることを特徴
   とするインターロイキン−２活性阻害因子吸着剤。