JPWO2017069254A1 - アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法 - Google Patents

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Abstract

基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィ担体であって、上記基材は多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、上記親水性ポリマーは親水性多糖類からなる群から選択される少なくとも１種であり、上記アフィニティリガンドは抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であり、上記アフィニティクロマトグラフィ担体にはカルボキシ基が導入され、上記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌである、精製純度に優れたアフィニティクロマトグラフィ担体が提供される。

Description

本発明は、アフィニティクロマトグラフィ担体および生体物質の精製方法に関する。
近年、遺伝子工学、タンパク質工学および細胞工学の発展に伴い、抗体医薬品と呼ばれる、抗体の有する機能を利用した医薬品の開発が盛んに行われている。抗体医薬品は、従来の医薬品と比べて、標的分子に対してより特異的に働くために、副作用をより軽減させ、かつ、高い治療効果が得られることが期待されており、実際に様々な病態の改善に寄与している。
一方、抗体医薬品は、生体に大量に投与されることから、他の組み換えタンパク質医薬品と比べた場合に、その純度が品質に与える影響は大きい。抗体医薬品は、遺伝子組換えにより宿主細胞に発現させた抗体を精製して製造されるため、宿主細胞および製造工程に由来する不純物の混入が問題となる。例えば、抗体医薬品に不純物として残留した宿主細胞由来タンパク質（ＨＣＰ；Host Cell Protein）は、抗体医薬品投与時のアナフィラキシー発症との関連が疑われているため、精製純度を改善し、不純物を減少させることが求められている。
例えば、特許文献１には、タンパク質製剤などの分離精製に適したクロマトグラフィ担体として、多孔性セルロース粒子に、極限粘度０．２１ｄＬ／ｇ〜０．９０ｄＬ／ｇを有する多糖類が付加してなる多孔性セルロース系ゲルであって、多孔性セルロース系ゲルの単位体積あたりの乾燥重量が、多孔性セルロース粒子の単位体積あたりの乾燥重量の１．０６倍〜１．４０倍であることを特徴とする多孔性セルロース系ゲルに、リガンドとしてスルホキシ基を付加してなるクロマトグラフィ担体が開示されている。
また、例えば、特許文献２には、特定の分子に特異的に結合する機能を有するアフィニティリガンドを水不溶性担体に固定化してなるアフィニティクロマトグラフィ担体が、生体成分や組換え体を含む微生物および哺乳類細胞培養細胞からの、有用物質の効率的な分離精製に利用されていることが記載され、抗体精製の高純度化を図ったアフィニティクロマトグラフィ担体として、アフィニティリガンドと陽イオン交換基を同一の担体に有するアフィニティクロマトグラフィ担体が開示されている。
国際公開第２０１０／０９５６７３号 国際公開第２０１４／０３４４５７号
しかしながら、本発明者は、特許文献１に記載された陽イオン交換クロマトグラフィ担体を検討したところ、本明細書に記載した参考例１に示されるように、抗体吸着容量は優れるが、精製純度に改善の余地があることを知得した。
また、本発明者は、特許文献２に記載されたアフィニティクロマトグラフィ担体を検討したところ、アフィニティリガンドと陽イオン交換基を同一担体に有するアフィニティクロマトグラフィ担体が有利と思われるが、本明細書に記載した比較例４および比較例５に示されるように、抗体吸着容量は優れるが、精製純度に改善の余地があることを知得した。
そこで、本発明は、抗体吸着容量および精製純度に優れたアフィニティクロマトグラフィ担体を提供することを目的とする。
本発明者は、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィ担体において、基材が多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、親水性ポリマーが親水性多糖類からなる群から選択される少なくとも１種であり、アフィニティリガンドが抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であり、アフィニティクロマトグラフィ担体にはカルボキシ基が導入され、カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌであると、抗体吸着容量および精製純度に優れることを知得し、本発明を完成させた。
すなわち、本発明は以下の［１］〜［１４］を提供する。
［１］ 基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィ担体であって、
上記基材は多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
上記親水性ポリマーは親水性多糖類からなる群から選択される少なくとも１種であり、
上記アフィニティリガンドは抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であり、
上記アフィニティクロマトグラフィ担体にはカルボキシ基が導入され、
上記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌである、アフィニティクロマトグラフィ担体。
［２］ 上記親水性ポリマーの極限粘度が０．１０ｄＬ／ｇ以上である、上記［１］に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
［３］ 上記親水性ポリマーの被覆量が３ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜５００ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌである、上記［１］または［２］に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
［４］ 上記基材が多糖類、アクリレート系重合体およびメタクリレート系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなる、上記［１］〜［３］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
［５］ 上記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種である、上記［１］〜［４］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
［６］ 上記基材が多孔質粒子である、上記［１］〜［５］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
［７］ 上記アフィニティリガンドが抗体と抗原抗体反応をする、上記［１］〜［６］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
［８］ 上記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体である、上記［１］〜［７］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
［９］ 上記基材がセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、グルコマンナンおよびこれらに架橋構造を導入した架橋多糖類からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
上記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種の親水性多糖類であり、
上記親水性多糖類の極限粘度が０．１２ｄＬ／ｇ〜０．３０ｄＬ／ｇであり、
上記親水性ポリマーの被覆量が１０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜２４０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌであり、
上記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜５５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌであり、
上記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体であり、かつ、
上記アフィニティリガンドの導入量が０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌである、上記［１］〜［８］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
［１０］ 上記基材がアクリレート系重合体およびメタクリレート系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
上記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種の親水性多糖類であり、
上記親水性多糖類の極限粘度が０．１２ｄＬ／ｇ〜０．３０ｄＬ／ｇであり、
上記親水性ポリマーの被覆量が１０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜２５０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌであり、
上記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜５５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌであり、
上記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体であり、かつ、
上記アフィニティリガンドの導入量が０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌである、上記［１］〜［８］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
［１１］ 上記［１］〜［１０］のいずれか１つに記載のアフィニティクロマトグラフィ担体を用いた生体物質の精製方法。
［１２］ 上記生体物質の添加時ｐＨが５．０〜９．０である、上記［１１］に記載の精製方法。
［１３］ 上記生体物質の溶出時ｐＨが２．０〜５．０である、上記［１１］または［１２］に記載の精製方法。
［１４］ 上記生体物質が抗体または抗体誘導体である、上記［１１］〜［１３］のいずれか１つに記載の精製方法。
本発明によれば、抗体吸着容量および精製純度に優れたアフィニティクロマトグラフィ担体が提供される。
本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体は、抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であるアフィニティリガンドと陽イオン交換基であるカルボキシ基との両方を持ち、かつ、カルボキシ基の導入量をイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌの範囲内としたことにより、非特異的吸着量を小さくすることができ、精製純度を改善することができた。また、カルボキシ基はスルホキシ基よりもイオン強度が低く、非特異的吸着を抑制することができるため、有利である。
以下に、本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体およびその製造方法について詳細に説明する。
なお、数値範囲について「〜」の左右の数値は、その数値範囲に含まれるものとする。
［アフィニティクロマトグラフィ担体］
本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体は、基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィ担体であって、上記基材は多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、上記親水性ポリマーは多糖類からなる群から選択される少なくとも１種であり、上記アフィニティリガンドは抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であり、上記アフィニティクロマトグラフィ担体にはカルボキシ基が導入され、上記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌである、アフィニティクロマトグラフィ担体である。
〈基材〉
基材は、多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種、好ましくは多糖類、アクリレート系重合体およびメタクリレート系重合体から選択される少なくとも１種、より好ましくは多糖類から選択される少なくとも１種である。また、基材は１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
多糖類は、特に限定されないが、例えば、セルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、グルコマンナン等の天然多糖類およびこれら天然多糖類に架橋構造を導入した架橋多糖類などが挙げられる。架橋多糖類は、例えば、天然多糖類が有する水酸基に対して、エピクロルヒドリン、（ポリ）アルキレングリコールジグリシジルエーテル、アルキレンジイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋構造を導入することにより製造することができる。
多糖類は、好ましくはセルロース、架橋セルロース、アガロースおよび架橋アガロースから選択される少なくとも１種、より好ましくはアガロースおよび架橋アガロースから選択される少なくとも１種である。
アクリレート系重合体は、特に限定されないが、例えば、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ヒドロキシエチル、アクリル酸ヒドロキシプロピル、アクリル酸ブチル、アクリル酸ステアリル、アクリル酸２−エチルヘキシル、シクロヘキシルアクリレート、グリセリンモノアクリレート、グリシジルアクリレート、４，５−エポキシブチルアクリレート、９，１０−エポキシステアリルアクリレート等のアクリル酸エステルの１種を重合してなる重合体、２種以上を共重合してなる共重合体、アクリル酸エステルの１種以上とアクリル酸エステル以外のビニル基含有化合物の１種以上とを共重合してなる共重合体などが挙げられる。ここで、アクリル酸エステル以外のビニル基含有化合物としては、例えば、エチレン、プロピレン等のモノビニル化合物、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物、ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド、イソシアヌル酸トリアリル等のポリビニル化合物が挙げられる。これらの重合体または共重合体に対して、エピクロルヒドリン、（ポリ）アルキレングリコールジグリシジルエーテル、アルキレンジイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋構造を導入してもよい。
メタクリレート系重合体は、特に限定されるものではないが、例えば、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ヒドロキシエチル、メタクリル酸ヒドロキシプロピル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸ステアリル、メタクリル酸２−エチルヘキシル、シクロヘキシルメタクリレート、グリセリンモノメタクリレート、グリシジルメタクリレート、４，５−エポキシブチルメタクリレート、９，１０−エポキシステアリルメタクリレート等のメタクリル酸エステルの１種を重合してなる重合体、２種以上を共重合してなる共重合体、メタクリル酸エステルの１種以上とメタクリル酸エステル以外のビニル基含有化合物の１種以上とを共重合してなる共重合体などが挙げられる。メタクリル酸エステル以外のビニル基含有化合物としては、例えば、エチレン、プロピレン等のモノビニル化合物、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物、ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド、イソシアヌル酸トリアリル等のポリビニル化合物が挙げられる。これらの重合体または共重合体に対して、エピクロルヒドリン、（ポリ）アルキレングリコールジグリシジルエーテル、アルキレンジイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋構造を導入してもよい。
スチレン系重合体は、特に限定されるものではないが、例えば、スチレン、メチルスチレン、エチルスチレン、ヒドロキシスチレン、クロロスチレン等のスチレン系化合物の１種を重合してなる重合体、２種以上を重合してなる共重合体、スチレン系化合物の１種以上とスチレン系化合物以外のビニル基含有化合物の１種以上とを共重合してなる共重合体などが挙げられる。スチレン系化合物以外のビニル基含有化合物としては、例えば、エチレン、プロピレン等のモノビニル化合物、ジビニルベンゼン、トリビニルベンゼン等の芳香族ポリビニル化合物、ブタジエン、メチレンビスアクリルアミド、イソシアヌル酸トリアリル等のポリビニル化合物が挙げられる。これらの重合体または共重合体に対して、エピクロルヒドリン、（ポリ）アルキレングリコールジグリシジルエーテル、アルキレンジイソシアネート等の架橋剤を用いて架橋構造を導入してもよい。
基材は多孔質粒子または多孔質膜であることが好ましい。基材が多孔質粒子または多孔質膜であることにより、表面積が大きくなり、単位時間あたりの処理容量を大きくすることができる。
また、基材が多孔質粒子または多孔質膜である場合の細孔容積は、特に限定されないが、水銀ポロシメーターにより測定した細孔容積が、好ましくは０．２ｍＬ／ｇ〜１０ｍＬ／ｇ、より好ましくは０．２ｍＬ／ｇ〜５．０ｍＬ／ｇの範囲内である。細孔容積がこの範囲内であると、抗体吸着容量および精製純度を改善する。また、機械的強度が低下しない。
また、基材が多孔質粒子または多孔質膜である場合の比表面積は、特に限定されないが、ＢＥＴ（Brunauer、Emmett、Teller）法により測定した比表面積（ＢＥＴ比表面積）が、好ましくは２ｍ２／ｇ〜１５００ｍ２／ｇ、より好ましくは５ｍ２／ｇ〜１０００ｍ２／ｇの範囲内である。比表面積がこの範囲内であると、抗体吸着容量および精製純度を改善する。
また、基材が多孔質粒子である場合の平均粒子径は、特に限定されないが、好ましくは０．５μｍ〜１０００μｍ、より好ましくは１μｍ〜２５０μｍ、さらに好ましくは２μｍ〜１５０μｍの範囲内である。平均粒子径がこの範囲内であると、カラムに充填して通液した時の圧力損失が小さく、通液速度を高くでき、処理効率が向上するとともに、抗体吸着容量および精製純度を改善する。なお、多孔質粒子の平均粒子径は、既知の方法で測定することができる。例えば、光学顕微鏡にて、１００個以上の粒子径を測定し、その分布から体積メジアン径を算出することで平均粒子径が得られる。
基材の市販品としては、例えば、アガロース系の担体であるセファローズシリーズ（ＧＥヘルスケア社製）（“ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ”は登録商標）、セルロース系の架橋担体であるセルファインシリーズ（ＪＮＣ社製）（“ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ”は登録商標）、アリルデキストランとＮ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドの架橋ポリマーであるセファクリルシリーズ（ＧＥヘルスケア社製）（“ＳＥＰＨＡＣＲＹＬ”は登録商標）、アクリレート系の担体であるトヨパールＨＷシリーズ（東ソー社製）（“トヨパール”および“ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ”は登録商標）などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
〈親水性ポリマー〉
親水性ポリマーは親水性多糖類からなる群から選択される少なくとも１種である。また、親水性ポリマーは１種を単独で用いてもよいし、２種以上を組み合わせて用いてもよい。
なお、本発明では、ポリマーまたは多糖類について親水性とは、少なくとも１種類の親水性基を含むことをいう。親水性基とは、好ましくはカルボキシ基、カルボキシ基のアルカリ金属塩、スルホキシ基、スルホキシ基のアルカリ金属塩、ヒドロキシ基、アミド基、カルバモイル基、スルホンアミド基、スルファモイル基、リン酸基、リン酸基のアルカリ金属塩、オキシリン酸基、オキシリン酸基のアルカリ金属塩等の官能基が挙げられる。これらの親水性基は、ポリマー中のどの位置に存在してもよく、例えば、ポリマー側鎖に直接または連結基を介して結合していてもよいし、ポリマー側鎖またはグラフト側鎖に結合していてもよい。また、親水性基は１分子中に、好ましくは複数個が存在する。
親水性多糖類は、特に限定されないが、精製純度を改善する効果が高いことから、好ましくはデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランから選択される少なくとも１種であり、より好ましくはデキストランである。
基材を親水性ポリマーで被覆することで、本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体表面の親水性を増し、非特異的吸着物の吸着を抑制するため、精製純度を改善する効果がある。
親水性ポリマーの分子量は、特に限定されないが、極限粘度で、好ましくは０．１０ｄＬ／ｇ以上、より好ましくは０．１０ｄＬ／ｇ〜０．９０ｄＬ／ｇ、さらに好ましくは０．１２ｄＬ／ｇ〜０．９０ｄＬ／ｇ、いっそう好ましくは０．１２ｄＬ／ｇ〜０．３０ｄＬ／ｇ、よりいっそう好ましくは０．１７ｄＬ／ｇ〜０．２５ｄＬ／ｇの範囲内である。極限粘度がこの範囲内であると、精製純度がさらに向上する。なお、極限粘度は、第１６改正日本薬局方に収載された一般測定法における粘度測定法、第１法「毛細管粘度計法」に従って、数個の異なる濃度の高分子溶液の粘度を求めて粘度の濃度依存性を測定し、得られた直線の濃度を０に外挿することにより求めることができる。
ところで、高分子の極限粘度ηと分子量Ｍとの間には、下記マーク−ホウィンク−桜田の式（Mark-Houwink-Sakurada equation）が成立することから、直接的な測定方法でいくつかの試料の分子量を求め、分子量とそれぞれの極限粘度の値とからＫとαを決めておけば、同じ種類の高分子については、極限粘度ηを測定することによって分子量Ｍが、分子量Ｍを測定することによって極限粘度ηが、それぞれ、求められる。
η＝ＫＭα
ここで、Ｋおよびαは高分子の種類、溶媒の種類および温度によって定まる定数である。
例えば、デキストランの極限粘度（ηＤｅｘｔｒａｎ）と重量平均分子量（ＭｗＤｅｘｔｒａｎ）とは、下記の関係式を満たすことが知られている。
ηＤｅｘｔｒａｎ［ｄＬ／ｇ］＝９×１０−４×ＭｗＤｅｘｔｒａｎ ０．５［ｄＬ／ｇ］
親水性ポリマーの被覆量（以下、単に「親水性ポリマー被覆量」という場合がある。）は、特に限定されないが、好ましくは３ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜５００ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌであり、より好ましくは３ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜３５０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌであり、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜３００ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ、いっそう好ましくは２０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜２４０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌである。親水性ポリマー被覆量がこの範囲内であると、本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体の表面の親水性を適度に増して非特異的吸着物の吸着を抑えるとともに、抗体が基材に拡散浸透する余地が多く残って抗体吸着容量が大きくなるため、精製純度がさらに改善される。なお、親水性ポリマーは基材の表面をすべて覆っている必要はなく、基材の少なくとも一部を覆っていればよい。
なお、親水性ポリマー被覆量［単位：ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ］は、被覆している親水性ポリマーの乾燥重量（ＷＰ）［単位：ｍｇ］を、被覆前基材の乾燥重量（Ｗ０）［単位：ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ］で除した値である。また、親水性ポリマーの乾燥重量（ＷＰ）は、担体全量の乾燥重量（Ｗ１）と被覆前基材の乾燥重量（Ｗ0）の差（Ｗ１−Ｗ０）［単位：ｍｇ］である。
したがって、親水性ポリマー被覆量は以下の式により求めることができる。
親水性ポリマー被覆量（ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ）＝ＷＰ／Ｗ０＝（Ｗ１−Ｗ０）／Ｗ０
上記被覆前基材の乾燥重量（Ｗ0）は、次のようにして算出することができる。
Ｗ０＝Ｗ０，ｘｇ×ｗ０／ｘ
ここで、
Ｗ０，ｘｇ：被覆前基材の湿ゲルｘｇの乾燥重量
ｗ０：親水性ポリマー被覆反応に用いた被覆前基材の湿ゲル全重量
ｘ：乾燥に用いた被覆前基材の湿ゲル重量（ｘｇ）
である。
上記担体全量の乾燥重量（Ｗ１）も、同様にして算出することができる。
〈アフィニティリガンド〉
アフィニティリガンドは抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種、好ましくは抗体結合性タンパク質から選択される少なくとも１種である。
本発明において、ポリペプチドとは、２残基〜５０残基のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を含む分子であり、概ね、分子量が５０００未満の分子をいう。また、本発明において、タンパク質とは、５１残基以上のアミノ酸残基からなるペプチド鎖を含む分子であり、概ね、分子量が５０００以上の分子をいう。
抗体結合性タンパク質は、抗体と抗原抗体反応により結合するタンパク質であれば特に限定されず、例えば、プロテインＡ、プロテインＧ、プロテインＬ、プロテインＤ、プロテインＡ改変体などが挙げられる。抗体結合性タンパク質としては、プロテインＡまたはその改変体が好ましい。プロテインＡ改変体としては、アルカリ耐性型プロテインＡが好ましい。
抗体結合性ポリペプチドは、抗体と抗原抗体反応により結合するポリペプチドであれば特に限定されず、例えば、プロテインＡの抗体結合ドメインのアミノ酸配列の一部と同一のアミノ酸配列を持つポリペプチドおよびその改変体などが挙げられる。抗体結合性ポリペプチド改変体としては、アルカリ耐性型改変体が好ましい。
本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体のアフィニティリガンドの導入量（以下、単に「アフィニティリガンド導入量」という場合がある。）は、特に限定されないが、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、さらに好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、いっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、よりいっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、さらにいっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜０．５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌである。
〈カルボキシ基〉
本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体のカルボキシ基の導入量（以下、単に「カルボキシ基導入量」という場合がある。）は、イオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜５５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜４０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌである。カルボキシ基導入量がこの範囲内であると、アフィニティリガンド導入量を適度な範囲内とすることができ、抗体吸着容量を改善する。また、非特異的吸着物の吸着を抑えることができる。
［アフィニティクロマトグラフィ担体の製造方法］
本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体は、基材を親水性ポリマーで被覆し、カルボキシ基を導入し、さらにアフィニティリガンドを導入することにより製造することができる。
基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドは、既に「アフィニティクロマトグラフィ担体」に記載したとおりである。
〈親水性ポリマーによる被覆〉
基材を親水性ポリマーで被覆する。
基材を親水性ポリマーで被覆する方法は、親水性ポリマーを基材に共有結合によって結合させることができるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、基材にクロロメチルオキシラン（エピクロルヒドリン）を反応させてエポキシ基を導入し、これに親水性ポリマーを反応させる方法、溶媒中、アルカリの存在下、基材をクロロメチルオキシラン（エピクロルヒドリン）のような架橋剤と反応させ、得られた反応生成物を親水性ポリマーと反応させる方法、クロロ基等のハロゲン基をハロゲン化剤を用いて基材に導入し、ウィリアムソンのエーテル合成法を用いて親水性ポリマーを固定化する方法などが挙げられる。
基材を親水性ポリマーで被覆する際には、親水性ポリマー被覆量が、好ましくは３ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜５００ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌであり、より好ましくは３ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜３５０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌであり、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜３００ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ、いっそう好ましくは２０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜２４０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌとなるようにする。
なお、本明細書において、親水性ポリマーで被覆する直前の基材を「被覆前基材」といい、この被覆前基材に親水性ポリマーを被覆したものを「担体」という場合がある。
〈カルボキシ基の導入〉
担体にカルボキシ基を導入する。
担体にカルボキシ基を導入する方法は、カルボキシ基を有する化合物を担体に共有結合によって結合させることができるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、アルカリ条件下で担体にクロロ酢酸を反応させて、担体表面のヒドロキシ基の一部にカルボキシメチル基を導入する方法、担体にアルデヒド基を導入し、アミノ酸等のカルボキシ基およびアミノ基を有する化合物のアミノ基を介して還元的アミノ化法でアルデヒド基にカルボキシ基を導入する方法などが挙げられる。
担体にカルボキシ基を導入する際には、カルボキシ基導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜５５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、より好ましくは１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜４０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌとなるようにする。
なお、本明細書において、担体にカルボキシ基を導入したものを「カルボキシ化担体」という場合がある。
〈アフィニティリガンドの導入〉
カルボキシ化担体にアフィニティリガンドを導入（固定化）する。
カルボキシ化担体にアフィニティリガンドを導入（固定化）する方法は、アフィニティリガンドをカルボキシ化担体に共有結合によって結合させることができるものであれば特に限定されるものではないが、例えば、カルボキシ基の一部をＥＤＣ（N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide）；Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’‐エチルカルボジイミド）／ＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide；Ｎ‐ヒドロキススクシンイミド）化し、プロテインＡ等のアフィニティリガンドと反応させ、反応後に未反応のＥＤＣ／ＮＨＳ化されたカルボキシ基を再生する方法、プロテインＡ等のアミノ基を有するアフィニティリガンドの場合には、カルボキシ基を保護して、アルデヒド基を導入し、アミノ基を介して還元的アミノ化法でアルデヒド基にアフィニティリガンドを導入する方法などが挙げられる。
カルボキシ化担体にアフィニティリガンドを導入する際には、アフィニティリガンドの導入量が、好ましくは０．０１ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜１００ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、より好ましくは０．０５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、さらに好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、いっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜２．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、よりいっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ、さらにいっそう好ましくは０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜０．５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌとなるようにする。
なお、アフィニティリガンドをカルボキシ化担体のカルボキシ基の一部に結合した場合のアフィニティクロマトグラフィ担体のカルボキシ基導入量は、「カルボキシ化担体のカルボキシ基導入量−アフィニティクロマトグラフィ担体のアフィニティリガンド導入量」で表す。
［生体物質の精製方法、その精製方法により精製された生体物質］
〈生体物質〉
本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体により精製される生体物質は、特に限定されるものではないが、好ましくは抗体または抗体誘導体、より好ましくは免疫グロブリンＧまたはその誘導体である。
抗体とは、免疫グロブリンまたはその類縁体、フラグメントもしくは融合体をいう。ここで、類縁体とは、免疫グロブリンの構造または機能が少なくとも部分的に保持された、天然の、または人工的に作製された、タンパク質またはタンパク質コンジュゲートをいう。また、フラグメントとは、酵素的な処理または遺伝子工学的な設計によって作製された、免疫グロブリンの部分構造を有するタンパク質をいう。また、融合体とは、免疫グロブリン分子の定常領域であるＦｃ（Fragment crystallizable、結晶化可能断片）領域と他の機能性蛋白質またはペプチドを融合してなるＦｃ融合タンパク質（Ｆｃ含有分子）が含まれる。なお、本発明において、免疫グロブリンは、ＩｇＧ（Immunoglobulin G；免疫グロブリンＧ）、ＩｇＭ（Immunoglobulin M；免疫グロブリンＭ）、ＩｇＡ（Immunoglobulin A；免疫グロブリンＡ）、ＩｇＤ（Immunoglobulin D；免疫グロブリンＤ）およびＩｇＥ（Immunoglobulin E；免疫グロブリンＥ）の５種類のクラス（アイソタイプ）のいずれでもよいが、ＩｇＧまたはＩｇＭが好ましく、ＩｇＧがより好ましい。
また、抗体誘導体とは、ヒト免疫グロブリンのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦａｂ領域とを融合させたキメラ抗体、ヒト免疫グロブリンのいくつかのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのいくつかのＦｖ領域とを融合させたキメラ抗体、ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ（Complementarity Determining Region；相補性決定領域）部分を除いた残余の部分と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンＣＤＲ部分とを融合させたヒト型化抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦｃ領域とヒト免疫グロブリンのＦａｂ（Fragment, antigen binding；抗体結合断片）領域とを融合させたキメラ抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのいくつかのＦｃ領域とヒト免疫グロブリンのいくつかのＦｖ領域とを融合させたキメラ抗体、ヒト免疫グロブリンのＣＤＲ部分を除いた残余の部分と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＣＤＲ部分とを融合させた非ヒト哺乳動物化抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＦａｂ領域とを融合させたキメラ抗体、非ヒト哺乳動物グロブリンのいくつかのＦｃ領域と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのいくつかのＦｖ領域とを融合させたキメラ抗体、非ヒト哺乳動物免疫グロブリンのＣＤＲ（Complementarity Determining Region；相補性決定領域）部分を除いた残余の部分と非ヒト哺乳動物免疫グロブリンＣＤＲ部分とを融合させた非ヒト哺乳動物型抗体、およびこれらの化学的修飾を加えたタンパク質であってＦｃ領域を保持するタンパク質をいう。
これらは抗体医薬品の原料として利用される。
〈精製方法〉
以下に、本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体を用いた精製方法の詳細な説明を、生体物質が免疫グロブリンＧの場合について例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。
アフィニティクロマトグラフィ担体を用いた生体物質（特に、抗体）の精製は、大きく、吸着工程、洗浄工程、イオン強度調節工程、溶出工程の４工程で構成されるほか、その後の再生工程および／またはＣＩＰ（cleaning-in-place；定置洗浄）工程、再平衡化工程などの再利用の為の工程を含んでもよい。
吸着工程では、一般的なアフィニティクロマトグラフィ精製方法を用いることができる。すなわち、その一例において、免疫グロブリンＧを含むタンパク質溶液のｐＨが中性付近となるように調整した後、その溶液を本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体を充填したカラムに通過させ、アフィニティリガンドを介して免疫グロブリンＧを特異的にアフィニティクロマトグラフィ担体に吸着させる。たとえば、プロテインＡをアフィニティリガンドとする場合、その負荷ｐＨ、すなわち生体物質の添加時ｐＨは、好ましくは５．０〜９．０であり、より好ましくは５．３〜９．０であり、さらに好ましくは５．５〜９．０であり、いっそう好ましくは６．０〜８．５である。晴乳類培養細胞により生産される免疫グロブリンＧの精製において、特にイオン強度の調製を必要としないほか、あらかじめイオン強度を上げてさらに非特異吸着を抑制することも出来る。
洗浄工程では、アフィニティリガンドが機能する条件範囲の緩衝液を適量通過させ、カラム内部を洗浄する。すなわち、ｐＨの好ましい範囲は前記負荷時と同じ範囲であってもよく、例えば、好ましくはｐＨ５．０〜９．０である。この時点で免疫グロブリンＧは本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体に吸着されている。この時、中性付近のｐＨでイオン強度や組成物の最適化により、不純物を効果的に除去できる場合がある。洗浄時において、カルボキシ基が機能しない条件が好ましく、すなわち、中性付近のｐＨにすると共に一定以上のイオン強度の洗浄液の利用が好ましく、この過程でアフィニティクロマトグラフィ担体および／または免疫グロブリンＧを介して非特異的にカラムに残留する不純物を洗浄することが出来る。イオン強度は、例えば、好ましくは０．２Ｍ以上であり、より好ましくは０．５Ｍ以上である。
イオン強度調節工程では、中性付近でイオン強度が低い緩衝液にカラムを置換し、溶出時のカルボキシ基によるイオン強度依存的溶出機能の発現に備える。
溶出工程では、酸性ｐＨ、イオン強度の組み合わせにより、アフィニティリガンドからの溶出時に陽イオン交換分離モードを機能させ、両リガンドの協奏的な作用で、単量体含量の高い画分を低イオン強度溶出画分に回収することが出来る。溶出液のｐＨはアフィニティリガンドからの免疫グロブリンＧの溶出時ｐＨが適用できる。このｐＨは、アフィニティクロマトグラフィ担体と免疫グロブリンＧの種類により決定される分離条件を中心に決定されることから、特段の条件設定を必要としない。
アフィニティリガンドにプロテインＡを用いた場合は、溶出時ｐＨは、好ましくは２．０〜５．０に設定される。ただし、生体物質の酸変性を避ける目的から、より好ましくはｐＨ２．８以上、さらに好ましくはｐＨ３．０以上、いっそう好ましくはｐＨ３．２以上である。ｐＨは、好ましくは５．０以下、より好ましくは４．８以下である。
アフィニティリガンドにアルカリ耐性型のプロテインＡを用いる場合は、一般的に、溶出時ｐＨは、好ましくは３．５〜４．０に設定されるが、これに限定されるものではない。また、溶出イオン強度は、アフィニティリガンドとカルボキシ基の導入比率に依存するほか、単位体積あたりの免疫グロブリンＧの負荷量にも依存するが、グラジエン卜実験やステップワイズ溶出実験により最適化ポイン卜を容易に設定しうる。
本発明により調製されるアフィニティクロマトグラフィ担体からの抗体溶出は、塩濃度グラジエン卜溶出でもステップワイズ溶出でも適用可能であるが、溶出液量の低減を目的にした場合はイオン強度によるステップワイズ溶出が好ましい。さらに、操作の単純化のためには、ワンステップ溶出による抗体の回収と高精製純度を達成できる条件設定が好ましい。
なお、洗浄工程のイオン強度と酸性ｐＨの組み合わせでも凝集体がカラムに残留し溶出画分に混入しない場合は、イオン強度調節工程を省略することが出来る。
〈精製された生体物質〉
本発明の精製方法によって精製された生体物質、特に抗体または抗体誘導体は、精製の前後でそれ自体の構造、特性は変化しないが、精製純度が高くなっている。ただし、どの程度高くなっているかは、精製前の溶液等に依存するため、一概に言うことはできない。
本発明により調製されたアフィニティクロマトグラフィ担体を用いて精製された免疫グロブリンＧは、単一の分離モードに基づくアフィニティクロマトグラフィ担体よりも高いモノマー選択性を示し、その溶出液中のモノマー含量が高い。
単一分離モードに基づくアフィニティクロマトグラフィ担体を用いた場合にも、溶出時ｐＨおよびイオン強度等の最適化により、モノマー含量を幾分高めることは可能であるが、その効果が低く、効果発現にはより大きな回収率の低下を伴う。本発明のアフィニティクロマトグラフィ担体を用いることにより、特異性の高いアフィニティ精製と、主に陽イオン交換クロマトグラフィにより達成しうるモノマー含量の向上を、高回収率を維持したまま単一のクロマ卜操作で効率的に達成可能であることから、後段プロセスへの負荷の低減が可能となり、プロセス全体の収率向上と単量体含量の向上に貢献できる。すなわち、本発明の新規アフィニティクロマトグラフィ担体の使用により、抗体医薬品の製造プロセスの生産性向上と高純度化に寄与できる。
以下、実施例を挙げて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は何らこれらに制限されるものではない。
［測定方法および評価方法］
１．親水性ポリマー被覆量の測定方法
被覆前基材の湿ゲル５ｇを５０℃で重量変化がなくなるまで減圧乾燥して重量を測定し、親水性ポリマー被覆反応に用いた被覆前基材の湿ゲル重量との積より、被覆前基材の乾燥重量とした。次いで、被覆前基材に親水性ポリマーを被覆して得た担体の湿ゲル５ｇを５０℃で重量変化がなくなるまで減圧乾燥して重量を測定し、親水性ポリマー被覆反応後に得られた担体の湿ゲル重量との積より、担体の乾燥重量とした。担体の乾燥重量と被覆前基材の乾燥重量との差を、被覆前基材を被覆している親水性ポリマーの乾燥重量とした。親水性ポリマー被覆量は、被覆前基材の乾燥重量あたりの親水性ポリマーの乾燥重量として算出した。
２．カルボキシ基導入量の測定方法
カルボキシ化担体１ｇを３ｍＬの純水に懸濁し、内径１５ｍｍのディスポーザブルカラムに注ぎ、吸引ろ過で溶媒を除去した。０．２ｍｏｌ／Ｌの塩酸３ｍＬで４回洗浄し、その後純水４ｍＬで洗浄を繰返した。洗浄後、ベッド（カラムに堆積した担体部分）高を測定することで、カルボキシ化担体の体積を算出した。カルボキシ化担体を取り出し、１００ｍＬ容ビーカーに移し、４０ｍＬの０．１ｍｏｌ／Ｌの食塩水に懸濁し、自動滴定装置「ＣＯＭ−１６００」（平沼産業社製）を用い、０．１ｍｏｌ／Ｌの水酸化ナトリウム水溶液で滴定した。終点までの滴定液量からカルボキシ化担体１Ｌあたりのイオン交換容量（ｍｅｑ／Ｌ−ｇｅｌ）を算出した。さらに、単位を「ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ」に換算した（１ｍｅｑ／Ｌ−ｇｅｌ＝１ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ）。カルボキシ基導入量はイオン交換容量で表した。
３．アフィニティリガンド導入量（プロテインＡ固定化量）の測定方法
プロテインＡ固定化反応後のプロテインＡ液、反応液および洗浄液を、それぞれ、ゲルろ過クロマトグラフィ（下記）にかけ、２８０ｎｍにおける吸光度のピーク面積値より、各溶液に含まれるプロテインＡ量を算出した。
プロテインＡ固定化反応前のプロテインＡ液、反応液および洗浄液に含まれるプロテインＡ量との差より、プロテインＡ固定化量を算出した。
（ゲルろ過クロマトグラフィの条件）
クロマトシステム：アクタアヴァント２５（AKTA avant 25）（ＧＥヘルスケア社製）（“ＡＫＴＡＡＶＡＮＴ”は登録商標）
カラム：脱塩カラム「ハイトラップデソルティング（HiTrap Desalting）（ＧＥヘルスケア社製）（“ＨＩＴＲＡＰ”は登録商標）
バッファー：２０ｍＭ リン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４
流速：３ｍＬ／ｍｉｎ
４．抗体吸着容量の評価方法
（１）抗体吸着容量の測定
実施例で製造したアフィニティクロマトグラフィ担体、比較例で製造したクロマトグラフィ担体または市販のクロマトグラフィ担体１ｍＬをガラスカラム「トリコーン １０／２０ カラム（Tricorn 10/20 column）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＴＲＩＣＯＲＮ”は登録商標）に充填し、クロマトシステム「アクタアヴァント２５（AKTA avant 25）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＡＫＴＡＡＶＡＮＴ”は登録商標）に接続し、抗体吸着容量の測定を行った。
カラムを平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した後に、ヒトＩｇＧ抗体（Immunoglobulin G：免疫グロブリンＧ）を標準バッファー（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で５ｍｇ／ｍＬに調整した溶液１５ｍＬを流速０．４２ｍＬ／ｍｉｎにて添加した。その後、負荷後洗浄液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流して洗浄した後に、溶出前洗浄液（２０ｍＭリン酸バッファー、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流した。その後、溶出液（１００ｍＭクエン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．２）を同じ流速で５ｍＬ流した。さらに連続して、定置洗浄（ＣＩＰ；cleaning in place）液（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を同じ流速で５ｍＬ流し、その後、再平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を、同じ流速で５ｍＬ流した。このとき、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングして得られたＩｇＧ溶出ピークより、各分画における溶出液の抗体溶出量を算出した。溶出前洗浄液からＣＩＰ液までに溶出した抗体量を抗体吸着容量として算出した。
（２）抗体吸着容量の評価
抗体吸着容量の評価は、以下の評価基準に従い、カルボキシ基とプロテインAのみを導入した場合の抗体吸着容量を基準として行った。すなわち、実施例１〜７、比較例１〜６、比較例８および参考例１（基材が多糖類である実施例、比較例および参考例）については比較例４を、実施例８および比較例７（基材がメタクリレート系重合体である実施例および比較例）については比較例７を、それぞれ基準として抗体吸着容量を評価した。
抗体吸着容量が基準の４０％以上・・・抗体吸着容量の評価「Ａ」
抗体吸着容量が基準の４０％未満・・・抗体吸着容量の評価「Ｃ」
５．精製純度の評価方法
（１）精製純度の算出
実施例または比較例で製造したアフィニティクロマトグラフィ担体または市販のクロマトグラフィ担体１ｍＬをガラスカラム「トリコーン １０／２０ カラム（Tricorn 10/20 column）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＴＲＩＣＯＲＮ”は登録商標）に充填し、クロマトシステム「アクタアヴァント２５（AKTA avant 25）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＡＫＴＡＡＶＡＮＴ”は登録商標）に接続し、各分画で溶出されるＨＣＰ（host cell protein；宿主細胞由来タンパク質）量およびＩｇＧ（Immunoglobulin G；免疫グロブリンＧ）量の測定を行った。
カラムを平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で平衡化した後に、ＩｇＧ、ＣＨＯ−Ｓ（Chinese Hamster Ovary S）細胞由来ＨＣＰが、それぞれ、１．６ｍｇ／ｍＬ、０．３２ｍｇ／ｍＬになるように標準バッファー（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を用いて調製したＩｇＧ／ＨＣＰ混合液を、上述した（１）で得られた抗体吸着容量の８割の抗体量が負荷されるような溶液量を流速０．２１ｍＬ／ｍｉｎにて添加した。その後、負荷後洗浄液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を０．４２ｍＬ／ｍｉｎで５ｍＬ流して洗浄した後に、溶出前洗浄液（２０ｍＭリン酸バッファー、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流した。その後、溶出液（１００ｍＭクエン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．２）を同じ流速で５ｍＬ流した。さらに連続して、ＣＩＰ液（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を同じ流速で５ｍＬ流し、その後、再平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流した。このとき、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングして得られたＩｇＧ溶出ピークより、各分画における溶出液のＩｇＧ溶出量を算出した。また、各分画の溶出液を回収し、宿主細胞由来タンパク質検出キット「ＣＨＯ ＨＣＰ ３ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ」（シグナステクノロジーズ社製）を用いたＥＬＩＳＡ法により、各分画における溶出液のＨＣＰ量を算出した。
算出した溶出液のＩｇＧ量およびＨＣＰ量を用いて、精製純度は溶出液におけるＨＣＰ混入量、すなわち、溶出液中のＩｇＧ量あたりのＨＣＰ量として、以下の式により算出した。
精製純度（ｐｐｍ）＝ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）＝溶出液のＨＣＰ量／溶出液のＩｇＧ量
（２）精製純度の評価
精製純度の評価は、以下の評価基準に従い、カルボキシ基とプロテインＡのみを導入した場合のＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）を基準として行った。すなわち、実施例１〜７、比較例１〜６、比較例８および参考例１（基材が多糖類である実施例、比較例および参考例）については比較例４を、実施例８および比較例７（基材がメタクリレート系重合体である実施例および比較例）については比較例７を、それぞれ、基準としてＨＣＰ混入量を評価した。
ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が２０％以上減少した・・・・・精製純度の評価「Ａ」
ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が０％超２０％未満減少した・・・精製純度の評価「Ｂ」
ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が減少しない・・・・・・・・・・精製純度の評価「Ｃ」
［実施例１］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
（１）湿ゲルの調製
架橋アガロース系基材「セファローズ６ ファスト・フロー（Sepharose 6 Fast Flow）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ”は登録商標）を、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、基材スラリーを得た。この基材スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
なお、表１の「基材」欄において「セファローズ6FF」は「セファローズ６ ファスト・フロー」を意味する。
（２）被覆前基材の調製 − エポキシ基の導入
得られた湿ゲル１００ｇ、純水１５２ｍＬおよびクロロメチルオキシラン５０ｇを、５００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、４５℃の温浴中で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。フラスコ内の温度が４５℃になるまで撹拌を行った。４５℃の温浴中で、フラスコ内の温度を約４５℃に維持しながら、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液４１ｇを２時間かけてフラスコ内に滴下した。水酸化ナトリウム水溶液の全量を滴下した後、さらに１時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、被覆前基材の湿ゲルを得た。
（３）担体の調製 − 親水性ポリマーによる被覆
デキストラン７０（極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ；重量平均分子量約７０，０００）１３ｇおよび純水１５４ｍＬを、５００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、室温で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。デキストラン７０が完全に溶解するまで撹拌を行った。溶解後、被覆前基材の湿ゲル９０ｇをこの三口フラスコに加え、室温で、さらに撹拌した。三口フラスコ内の混合液が均一なってから、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液４．２ｇを加えた。水酸化ナトリウム水溶液を加えた後、室温で１６時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、担体の湿ゲルを得た。
また、得られた担体のデキストラン被覆量を、上述した「親水性ポリマー被覆量の測定方法」に従って測定した。得られた親水性ポリマー被覆量を、表１の「親水性ポリマー被覆量」の欄に示す。
（４）カルボキシ化担体の調製 − カルボキシ基の導入
得られた担体の湿ゲル１２ｇ、クロロ酢酸ナトリウム６．２ｇおよび純水２４ｍＬを、１００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、５０℃の温浴中で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。クロロ酢酸ナトリウムが完全に溶解するまで撹拌を行った。溶解後、５０℃の温浴中で、フラスコ内温度を約５０℃に維持しながら、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液８．８ｇを１時間かけて滴下した。水酸化ナトリウム水溶液の全量を滴下した後、さらに３時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、カルボキシ化担体の湿ゲルを得た。
また、得られたカルボキシ化担体のカルボキシ基導入量を、上述した「カルボキシ基導入量の測定方法」に従って測定した。得られたカルボキシ基導入量を、表１のカルボキシ基導入量の欄に示す。
なお、アフィニティクロマトグラフィ担体のカルボキシ基導入量は、「カルボキシ化担体のカルボキシ基導入量−アフィニティリガンド導入量」で表した。
（５）プロテインＡ固定カルボキシ化担体の調製 − アフィニティリガンドの導入
得られたカルボキシ化担体を、湿潤体積として２．５ｍＬ分、ディスポーザブルカラムに入れ、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、担体スラリーを得た。この担体スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
得られた湿ゲル２．０ｇを反応容器にとり、ＥＤＣ（N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide）；Ｎ‐（３‐ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’‐エチルカルボジイミド）溶液２ｍＬを加え、室温で、１０分間、転倒撹拌した。その後、反応容器にＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide；Ｎ‐ヒドロキススクシンイミド）溶液２ｍＬを加え、室温で、３０分間、転倒撹拌した。ここで、ＥＤＣ溶液は、ＤＭＳＯ（dimethyl sulfoxide；ジメチルスルホキシド）２ｍＬにＥＤＣ ０．２ｇを溶解して調製したものであり、ＮＨＳ溶液は、ＤＭＳＯ ２ｍＬにＮＨＳ ０．２ｇを溶解して調製したものである。
反応ゲル溶液をディスポーザブルカラムに移し、氷冷した１ｍＭ塩酸６ｍＬで洗浄し、ＥＤＣ／ＮＨＳ活性化されたカルボキシ化担体を得た。
得られたＥＤＣ／ＮＨＳ活性化カルボキシ化担体１．５ｇを反応容器に入れ、続いて、１０ｍｇ／ｍＬプロテインＡ溶液１．５ｍＬを反応容器に加え、２５℃で、２時間、振盪した。上記１０ｍｇ／ｍＬプロテインＡ容液は、遺伝子組換え天然型プロテインＡ「ｒＳＰＡ」（レプリジェン社製）を、２０ｍＭ ＭＥＳ（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）バッファー（ｐＨ４．５）に溶解して調製したものである。
溶媒を１Ｍ塩化ナトリウム水溶液および０．５Ｍエタノールアミン水溶液に置換し、洗浄し、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を得た。
また、得られたプロテインＡ固定カルボキシ化担体のプロテインＡ固定化量（アフィニティリガンド導入量）を、上述した「アフィニティリガンド導入量（プロテインＡ固定化量）の測定方法」に従って測定した。得られたプロテインＡ固定化量を、表１の「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例２］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから３．６ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例３］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから１１．７ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例４］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
担体の調製（親水性ポリマーによる被覆）の際のデキストラン７０（極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約７０，０００）の使用量を１３ｇから６６ｇに変更した点、および、カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから２．０ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例５］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
湿ゲルの調製の際の架橋アガロース系基材を「セファローズ４ ファスト・フロー（Sepharose 4 Fast Flow）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ”は登録商標）に変更した点、および、カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を２．０ｇから３．９ｇに変更した点を除き、実施例４と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
なお、表１の「基材」欄において「セファローズ４ＦＦ」は「セファローズ４ ファスト・フロー」を意味する。
さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例６］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
担体の調製（親水性ポリマーによる被覆）の際のデキストラン７０（極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約７０，０００）に代えてデキストラン４０（極限粘度０．１７ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約４０，０００）を用いた点、および、カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を３．９ｇから４．５ｇに変更した点を除き、実施例５と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例７］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
担体の調製（親水性ポリマーによる被覆）の際のデキストラン７０（極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約７０，０００）に代えてデキストラン１９（極限粘度０．１２ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約１９，０００）を用いた点、および、カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を３．９ｇから５．７ｇに変更した点を除き、実施例５と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［実施例８］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
（１）湿ゲルの調製
メタクリレート系多孔系基材「トヨパールＨＷ−６５Ｆ（TOYOPEARL HW-65F）」（東ソー社製）（“トヨパール”および“ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ”は登録商標）を、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、基材スラリーを得た。この基材スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
（２）被覆前基材の調製 − エポキシ基の導入
得られた湿ゲル１００ｇ、純水１５２ｍＬおよびクロロメチルオキシラン５０ｇを、５００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、４５℃の温浴中で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。フラスコ内の温度が４５℃になるまで撹拌を行った。４５℃の温浴中で、フラスコ内の温度を約４５℃に維持しながら、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液４１ｇを２時間かけてフラスコ内に滴下した。水酸化ナトリウム水溶液の全量を滴下した後、さらに１時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、湿ゲルを得た。この反応を３回繰返すことで、被覆前基材の湿ゲルを得た。
（３）担体の調製 − 親水性ポリマーによる被覆
デキストラン７０（極限粘度０．２３ｄＬ／ｇ；重量平均分子量約７０，０００）１３ｇに代えてデキストラン４０（極限粘度０．１７ｄＬ／ｇ、重量平均分子量約４０，０００）１２６ｇを用いた点を除き、実施例１と同様にして、担体の湿ゲルを得た。
また、得られた担体のデキストラン被覆量を、実施例１と同様に、上述した「親水性ポリマー被覆量の測定方法」に従って測定した。得られた親水性ポリマー被覆量を、表１の「親水性ポリマー被覆量」の欄に示す。
（４）カルボキシ化担体の調製 − カルボキシ基の導入
クロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから３．４ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、カルボキシ化担体の湿ゲルを得た。
また、得られたカルボキシ化担体のカルボキシ基導入量を、実施例１と同様に、上述した「カルボキシ基導入量の測定方法」に従って測定した。得られたカルボキシ基導入量を、表１の「カルボキシ基導入量」の欄に示す。
（５）プロテインＡ固定カルボキシ化担体の調製 − アフィニティリガンドの導入
実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を得た。
また、得られたプロテインＡ固定カルボキシ化担体のプロテインＡ固定化量を、実施例１と同様に、上述した「アフィニティリガンド導入量（プロテインＡ固定化量）の測定方法」に従って測定した。得られたプロテインＡ固定化量を、表１の「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例１］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから１．８ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例２］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
カルボキシ化担体の調製（カルボキシ基の導入）の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を６．２ｇから２２．７ｇに変更した点を除き、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量、カルボキシ基導入量、アフィニティリガンド導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」、「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例３］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
（１）担体の調製 − 親水性ポリマーによる被覆
実施例１と同様にして担体の湿ゲルを得た。また、得られた担体のデキストラン被覆量を、実施例１と同様に、上述した「親水性ポリマー被覆量の測定方法」に従って測定した。得られた親水性ポリマー被覆量を、表１の「親水性ポリマー被覆量」の欄に示す。
（２）プロテインＡ固定化担体の調製 − アフィニティリガンドの導入
得られた担体を、湿潤体積として４ｍＬ分、ディスポ―サブルカラムに入れ、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、担体スラリーを得た。この担体スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
得られた湿ゲルを反応容器にとり、純水にてスラリー体積を５ｍＬとした後に、２５０ｍＭクエン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ３．５）１ｍＬ加えた。さらに、１６０ｍＭ過ヨウ素酸ナトリウム水溶液２ｍＬを加えた後、室温で０．５時間転倒撹拌し、フィルター上で純水およびリン酸バッファーを用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、吸引ろ過によって純水もしくはリン酸バッファーを除去して、アルデヒド基導入担体の湿ゲルを得た。
得られたアルデヒド基導入担体の湿ゲル１．５ｇを反応容器にとり、２０ｍｇ／ｍＬプロテインＡ溶液３ｍＬを反応容器に加え、室温で、２時間、転倒撹拌した。上記２０ｍｇ／ｍＬプロテインＡ溶液は、遺伝子組み換え天然型プロテインＡ「ｒＳＰＡ」（レプリジェン社製）を、２００ｍＭ ＭＥＳ（2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid；２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸）バッファー（ｐＨ７．４）に溶解して調製したものである。
続いて、トリエチルアミノボラン１１ｍｇを反応容器に加え、２５℃で、１６時間、振盪した。溶媒を２００ｍＭ ＭＥＳバッファー（ｐＨ７．４）に置換し、洗浄し、洗浄液を除去した後に、２０ｍＭトリス塩酸バッファー３ｍＬ、トリエチルアミノボラン１１ｍｇを反応容器に加え、室温で、２時間、転倒撹拌した。溶媒を純水、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液に置換し、洗浄し、プロテインＡ固定化担体を得た。
また、得られたプロテインＡ固定化担体のプロテインＡ固定化量（アフィニティリガンド導入量）を、上述した「アフィニティリガンド導入量（プロテインＡ固定化量）の測定方法」に従って測定した。得られたプロテインＡ固定化量を、表１の「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例４］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
架橋アガロース系基材「セファローズ６ ファスト・フロー（Sepharose 6 Fast Flow）」（ＧＥヘルスケア社製）を、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、基材スラリーを得た。この基材スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
得られた湿ゲル１２ｇ、クロロ酢酸ナトリウム４．７ｇおよび純水２４ｍＬを１００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、５０℃の温浴中で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。クロロ酢酸ナトリウムが完全に溶解するまで撹拌を行った。溶解後、５０℃の温浴中で、フラスコ内温度を約５０℃に維持しながら、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液８．８ｇを１時間かけて滴下した。水酸化ナトリウム水溶液の全量を滴下した後、さらに３時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、カルボキシ化担体の湿ゲルを得た。
得られたカルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を得た。
さらに、実施例１と同様にして、カルボキシ化担体のカルボキシ基導入量およびプロテインＡ固定カルボキシ化担体のプロテインＡ導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例５］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
湿ゲルの調製の際の架橋アガロース系基材を「セファローズ４ ファスト・フロー（Sepharose 4 Fast Flow）」（ＧＥヘルスケア社製）に変更した点、および、カルボキシ化担体の調製の際のクロロ酢酸ナトリウムの使用量を４．７ｇから９．３ｇに変更した点を除き、比較例４と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を製造した。
さらに、実施例１と同様にして、カルボキシ化担体のカルボキシ基導入量およびプロテインＡ固定カルボキシ化担体のプロテインＡ導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例６］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の準備
アフィニティクロマトグラフィ担体として、プロテインＡ導入担体「マブセレクトＳｕＲｅ（MabSelect SuRe）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＭＡＢＳＥＬＥＣＴ”は登録商標）を準備した。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
準備したプロテインＡ導入担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例７］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
メタクリレート系多孔系基材「トヨパールＨＷ−６５Ｆ（TOYOPEARL HW-65F）」（東ソー社製）（“トヨパール”および“ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ”は登録商標）を、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、基材スラリーを得た。この基材スラリーから、吸引ろ過によって純水を除去して、湿ゲルを得た。
得られた湿ゲル１２ｇ、クロロ酢酸ナトリウム３．８ｇおよび純水２４ｍＬを１００ｍＬ容の三口フラスコに入れ、５０℃の温浴中で、フラスコ内容物の撹拌を開始した。クロロ酢酸ナトリウムが完全に溶解するまで撹拌を行った。溶解後、５０℃の温浴中で、フラスコ内温度を約５０℃に維持しながら、５０％（ｗ／ｗ）水酸化ナトリウム水溶液８．８ｇを１時間かけて滴下した。水酸化ナトリウム水溶液の全量を滴下した後、さらに３時間反応し、グラスフィルター上で、純水を用いて懸濁およびろ過を繰り返すことによって洗浄し、カルボキシ化担体の湿ゲルを得た。
得られたカルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様にして、プロテインＡ固定カルボキシ化担体を得た。
さらに、実施例１と同様にして、カルボキシ化担体のカルボキシ基導入量およびプロテインＡ固定カルボキシ化担体のプロテインＡ導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「カルボキシ基導入量」および「アフィニティリガンド導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したプロテインＡ固定カルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［比較例８］
１．アフィニティクロマトグラフィ担体の製造
実施例１と同様にして、カルボキシ化担体の湿ゲルを得た。
得られた湿ゲルをアフィニティクロマトグラフィ担体として用いた。
さらに、実施例１と同様にして、親水性ポリマー被覆量およびカルボキシ基導入量を測定した。測定結果を、それぞれ、表１の「親水性ポリマー被覆量」および「カルボキシ基導入量」の欄に示す。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
製造したカルボキシ化担体を用いて、実施例１と同様に、上述した「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
［参考例１］
１．クロマトグラフィ担体の準備
クロマトグラフィ担体として、スルホキシ基導入担体「セルファインＭＡＸ Ｓ−ｒ（Cellufine MAX S-r）」（ＪＮＣ社製）（“ＣＥＬＬＵＦＩＮＥ”は登録商標）を準備した。
２．抗体吸着容量および精製純度の評価
準備したスルホキシ基導入担体を用いて、後述する「抗体吸着容量の評価方法」および「精製純度の評価方法」に従って、抗体吸着容量および精製純度の評価を行った。抗体吸着容量および精製純度の評価結果を、それぞれ、表１の「抗体吸着容量（評価）」および「精製純度（評価）」の欄に示す。
３．スルホキシ基導入量の測定
また、上述した「カルボキシ基導入量の測定方法」に準じて、スルホキシ基導入量を測定したところ、スルホキシ基導入量は、１５０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌであった。
４．抗体吸着容量の評価方法
市販のクロマトグラフィ担体１ｍＬをガラスカラム「トリコーン １０／２０ カラム（Tricorn 10/20 column）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＴＲＩＣＯＲＮ”は登録商標）に充填し、クロマトシステム「アクタアヴァント２５（AKTA avant 25）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＡＫＴＡＡＶＡＮＴ”は登録商標）に接続し、抗体吸着容量の測定を行った。
カラムを平衡化液（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．７）で平衡化した後に、ヒトＩｇＧ抗体（Immunoglobulin G：免疫グロブリンＧ）を標準バッファー（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．７）で５ｍｇ／ｍＬに調整した溶液３０ｍＬを流速０．４２ｍＬ／ｍｉｎにて添加した。その後、負荷後洗浄液（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．７）を同じ流速で５ｍＬ流して洗浄した後に、溶出液１（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）および溶出液２（２０ｍＭリン酸バッファー、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）によって塩濃度を段階的に上げながら同じ流速で３０ｍＬ流した。その後、ＣＩＰ液（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を同じ流速で５ｍＬ流し、続いて平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流した。このとき、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングして得られたＩｇＧ溶出ピークより、各分画における溶出液の抗体溶出量を算出した。溶出前洗浄液からＣＩＰ液までに溶出した抗体量を抗体吸着容量として算出した。
抗体吸着容量の評価は、以下の評価基準に従い、カルボキシ基とプロテインAのみを導入した場合の抗体吸着容量を基準として行った。すなわち、比較例４を基準として抗体吸着容量を評価した。
抗体吸着容量が基準の４０％以上・・・抗体吸着容量の評価「Ａ」
抗体吸着容量が基準の４０％未満・・・抗体吸着容量の評価「Ｃ」
５．精製純度の評価方法
市販のクロマトグラフィ担体１ｍＬをガラスカラム「トリコーン １０／２０ カラム（Tricorn 10/20 column）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＴＲＩＣＯＲＮ”は登録商標）に充填し、クロマトシステム「アクタアヴァント２５（AKTA avant 25）」（ＧＥヘルスケア社製）（“ＡＫＴＡＡＶＡＮＴ”は登録商標）に接続し、各分画で溶出されるＨＣＰ（host cell protein；宿主細胞由来タンパク質）量およびＩｇＧ（Immunoglobulin G；免疫グロブリンＧ）量の測定を行った。
カラムを平衡化液（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．７）で平衡化した後に、ＩｇＧ、ＣＨＯ−Ｓ（Chinese Hamster Ovary S）細胞由来ＨＣＰが、それぞれ、１．６ｍｇ／ｍＬ、０．６４ｍｇ／ｍＬになるように標準バッファー（１０ｍＭ酢酸バッファー、ｐＨ４．７）を用いて調製したＩｇＧ／ＨＣＰ混合液を、上述した（１）で得られた抗体吸着容量の８割の抗体量が負荷されるような溶液量を流速０．２１ｍＬ／ｍｉｎにて添加した。その後、溶出液１（２０ｍＭリン酸バッファー、ｐＨ７．４）および溶出液２（２０ｍＭリン酸バッファー、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）によって塩濃度を段階的に上げながら流速０．４２ｍＬ／ｍｉｎで３０ｍＬ流した。その後、ＣＩＰ液（０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液）を同じ流速で５ｍＬ流し、続いて平衡化液（２０ｍＭリン酸バッファー、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を同じ流速で５ｍＬ流した。このとき、２８０ｎｍの吸光度をモニタリングして得られたＩｇＧ溶出ピークより、各分画における溶出液のＩｇＧ溶出量を算出した。また、各分画の溶出液を回収し、宿主細胞由来タンパク質検出キット「ＣＨＯ ＨＣＰ ３ｒｄ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔ」（シグナステクノロジーズ社製）を用いたＥＬＩＳＡ法により、各分画における溶出液のＨＣＰ量を算出した。
算出した溶出液のＩｇＧ量およびＨＣＰ量を用いて、精製純度は溶出液におけるＨＣＰ混入量、すなわち、溶出液中のＩｇＧ量あたりのＨＣＰ量として、以下の式により算出した。
精製純度（ｐｐｍ）＝ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）＝溶出液のＨＣＰ量／溶出液のＩｇＧ量
精製純度の評価は、以下の評価基準に従い、カルボキシ基とプロテインＡのみを導入した場合のＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）を基準として行った。すなわち、比較例４を基準としてＨＣＰ混入量を評価した。
ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が２０％以上減少した・・・・・・精製純度の評価「Ａ」
ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が０％超２０％未満減少した・・・精製純度の評価「Ｂ」
ＨＣＰ混入量（ｐｐｍ）が減少しない・・・・・・・・・・精製純度の評価「Ｃ」
<結果の説明>
実施例１〜８のアフィニティクロマトグラフィ担体は、抗体吸着容量および精製純度がいずれも「Ｂ」以上の評価であり、抗体吸着容量および精製純度のいずれもが優れていた。
一方、比較例１〜８は、抗体吸着容量および精製純度のうち少なくとも一方が「Ｃ」評価であり、抗体吸着容量および精製純度の少なくとも一方が劣っていた。
また、実施例６と実施例８とを対比すると、基材が架橋アガロース系である実施例６の精製純度が「Ａ」評価であったのに対して、基材がメタクリレート系である実施例８の精製純度は「Ｂ」評価であったことから、架橋アガロース系基材の方がメタクリレート系基材よりも、精製純度が優れることが示唆された。なお、親水性ポリマー被覆量が大きく異なる実施例１と実施例４では、精製純度の評価がいずれも「Ａ」評価であることから、実施例６と実施例８との間で精製純度の評価が異なることとなった原因は、基材が架橋アガロース系（実施例６）であるか、メタクリレート系（実施例８）であるかによるものであると考えられる。

Claims (14)

  1. 基材、親水性ポリマーおよびアフィニティリガンドを有するアフィニティクロマトグラフィ担体であって、
    前記基材は多糖類、アクリレート系重合体、メタクリレート系重合体およびスチレン系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
    前記親水性ポリマーは親水性多糖類からなる群から選択される少なくとも１種であり、
    前記アフィニティリガンドは抗体結合性タンパク質および抗体結合性ポリペプチドからなる群から選択される少なくとも１種であり、
    前記アフィニティクロマトグラフィ担体にはカルボキシ基が導入され、
    前記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜６０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌである、アフィニティクロマトグラフィ担体。
  2. 前記親水性ポリマーの極限粘度が０．１０ｄＬ／ｇ以上である、請求項１に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  3. 前記親水性ポリマーの被覆量が３ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜５００ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌである、請求項１または２に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  4. 前記基材が多糖類、アクリレート系重合体およびメタクリレート系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなる、請求項１〜３のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  5. 前記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種である、請求項１〜４のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  6. 前記基材が多孔質粒子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  7. 前記アフィニティリガンドが抗体と抗原抗体反応をする、請求項１〜６のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  8. 前記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  9. 前記基材がセルロース、アガロース、デキストラン、キトサン、グルコマンナンおよびこれらに架橋構造を導入した架橋多糖類からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
    前記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種の親水性多糖類であり、
    前記親水性多糖類の極限粘度が０．１２ｄＬ／ｇ〜０．３０ｄＬ／ｇであり、
    前記親水性ポリマーの被覆量が１０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜２４０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌであり、
    前記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜５５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌであり、
    前記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体であり、かつ、
    前記アフィニティリガンドの導入量が０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  10. 前記基材がアクリレート系重合体およびメタクリレート系重合体からなる群から選択される少なくとも１種からなり、
    前記親水性ポリマーがデキストラン、カルボキシメチルデキストランおよびプルランからなる群から選択される少なくとも１種の親水性多糖類であり、
    前記親水性多糖類の極限粘度が０．１２ｄＬ／ｇ〜０．３０ｄＬ／ｇであり、
    前記親水性ポリマーの被覆量が１０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌ〜２４０ｍｇ／ｇ−ｄｒｙ ｇｅｌであり、
    前記カルボキシ基の導入量がイオン交換容量で１５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜５５ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌであり、
    前記アフィニティリガンドがプロテインＡまたはその改変体であり、かつ、
    前記アフィニティリガンドの導入量が０．１０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌ〜１．０ｍｍｏｌ／Ｌ−ｇｅｌである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体。
  11. 請求項１〜１０のいずれか１項に記載のアフィニティクロマトグラフィ担体を用いた生体物質の精製方法。
  12. 前記生体物質の添加時ｐＨが５．０〜９．０である、請求項１１に記載の精製方法。
  13. 前記生体物質の溶出時ｐＨが２．０〜５．０である、請求項１１または１２に記載の精製方法。
  14. 前記生体物質が抗体または抗体誘導体である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の精製方法。
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