KR20180049026A - 어피니티 크로마토그래피 담체 및 생체 물질의 정제 방법 - Google Patents

어피니티 크로마토그래피 담체 및 생체 물질의 정제 방법 Download PDF

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Abstract

기재, 친수성 폴리머 및 어피니티 리간드를 갖는 어피니티 크로마토그래피 담체로서, 상기 기재는 다당류, 아크릴레이트계 중합체, 메타크릴레이트계 중합체 및 스타이렌계 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지고, 상기 친수성 폴리머는 친수성 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이며, 상기 어피니티 리간드는 항체 결합성 단백질 및 항체 결합성 폴리펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이고, 상기 어피니티 크로마토그래피 담체에는 카복시기가 도입되며, 상기 카복시기의 도입량이 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~60mmol/L-gel인, 정제 순도가 우수한 어피니티 크로마토그래피 담체가 제공된다.

Description

어피니티 크로마토그래피 담체 및 생체 물질의 정제 방법
본 발명은, 어피니티 크로마토그래피 담체 및 생체 물질의 정제 방법에 관한 것이다.
최근, 유전자 공학, 단백질 공학 및 세포 공학의 발전에 따라, 항체 의약품으로 불리는, 항체가 갖는 기능을 이용한 의약품의 개발이 활발히 행해지고 있다. 항체 의약품은, 종래의 의약품에 비하여, 표적 분자에 대하여 보다 특이적으로 작용하기 때문에, 부작용을 보다 경감시키고, 또한, 높은 치료 효과를 얻을 수 있는 것이 기대되고 있으며, 실제로 다양한 병태의 개선에 기여하고 있다.
한편, 항체 의약품은, 생체에 대량으로 투여되는 점에서, 다른 재조합 단백질 의약품과 비교한 경우에, 그 순도가 품질에 주는 영향은 크다. 항체 의약품은, 유전자 재조합에 의하여 숙주 세포에 발현시킨 항체를 정제하여 제조되기 때문에, 숙주 세포 및 제조 공정에서 유래하는 불순물의 혼입이 문제가 된다. 예를 들면, 항체 의약품에 불순물로서 잔류한 숙주 세포 유래 단백질(HCP; Host Cell Protein)은, 항체 의약품 투여 시의 아나필락시스 발증과의 관련이 의심되고 있기 때문에, 정제 순도를 개선하여, 불순물을 감소시키는 것이 요구되고 있다.
예를 들면, 특허문헌 1에는, 단백질 제제 등의 분리 정제에 적합한 크로마토그래피 담체로서, 다공성 셀룰로스 입자에, 극한 점도 0.21dL/g~0.90dL/g을 갖는 다당류가 부가되어 이루어지는 다공성 셀룰로스계 젤로서, 다공성 셀룰로스계 젤의 단위 체적당 건조 중량이, 다공성 셀룰로스 입자의 단위 체적당 건조 중량의 1.06배~1.40배인 것을 특징으로 하는 다공성 셀룰로스계 젤에, 리간드로서 설폭시기를 부가하여 이루어지는 크로마토그래피 담체가 개시되어 있다.
또, 예를 들면, 특허문헌 2에는, 특정 분자에 특이적으로 결합하는 기능을 갖는 어피니티 리간드를 수불용성 담체에 고정화하여 이루어지는 어피니티 크로마토그래피 담체가, 생체 성분이나 재조합체를 포함하는 미생물 및 포유류 세포 배양 세포로부터의, 유용 물질의 효율적인 분리 정제에 이용되고 있는 것이 기재되고, 항체 정제의 고순도화를 도모한 어피니티 크로마토그래피 담체로서, 어피니티 리간드와 양이온 교환기를 동일한 담체에 갖는 어피니티 크로마토그래피 담체가 개시되어 있다.
특허문헌 1: 국제 공개공보 제2010/095673호 특허문헌 2: 국제 공개공보 제2014/034457호
그러나, 본 발명자는, 특허문헌 1에 기재된 양이온 교환 크로마토그래피 담체를 검토한바, 본 명세서에 기재한 참고예 1에 나타내는 바와 같이, 항체 흡착 용량은 우수하지만, 정제 순도에 개선의 여지가 있는 것을 지득(知得)했다.
또, 본 발명자는, 특허문헌 2에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체를 검토한바, 어피니티 리간드와 양이온 교환기를 동일 담체에 갖는 어피니티 크로마토그래피 담체가 유리하다고 생각되지만, 본 명세서에 기재한 비교예 4 및 비교예 5에 나타내는 바와 같이, 항체 흡착 용량은 우수하지만, 정제 순도에 개선의 여지가 있는 것을 지득했다.
따라서, 본 발명은, 항체 흡착 용량 및 정제 순도가 우수한 어피니티 크로마토그래피 담체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자는, 상기 목적을 달성하기 위하여 예의 검토를 거듭한 결과, 기재(基材), 친수성 폴리머 및 어피니티 리간드를 갖는 어피니티 크로마토그래피 담체에 있어서, 기재가 다당류, 아크릴레이트계 중합체, 메타크릴레이트계 중합체 및 스타이렌계 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지고, 친수성 폴리머가 친수성 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이며, 어피니티 리간드가 항체 결합성 단백질 및 항체 결합성 폴리펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이고, 어피니티 크로마토그래피 담체에는 카복시기가 도입되며, 카복시기의 도입량이 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~60mmol/L-gel이면, 항체 흡착 용량 및 정제 순도가 우수한 것을 지득하여, 본 발명을 완성시켰다.
즉, 본 발명은 이하의 [1] 내지 [14]를 제공한다.
[1] 기재, 친수성 폴리머 및 어피니티 리간드를 갖는 어피니티 크로마토그래피 담체로서,
상기 기재는 다당류, 아크릴레이트계 중합체, 메타크릴레이트계 중합체 및 스타이렌계 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지고,
상기 친수성 폴리머는 친수성 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이며,
상기 어피니티 리간드는 항체 결합성 단백질 및 항체 결합성 폴리펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이고,
상기 어피니티 크로마토그래피 담체에는 카복시기가 도입되며,
상기 카복시기의 도입량이 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~60mmol/L-gel인, 어피니티 크로마토그래피 담체.
[2] 상기 친수성 폴리머의 극한 점도가 0.10dL/g 이상인, 상기 [1]에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체.
[3] 상기 친수성 폴리머의 피복량이 3mg/g-dry gel~500mg/g-dry gel인, 상기 [1] 또는 [2]에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체.
[4] 상기 기재가 다당류, 아크릴레이트계 중합체 및 메타크릴레이트계 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지는, 상기 [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체.
[5] 상기 친수성 폴리머가 덱스트란, 카복시메틸덱스트란 및 풀루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 상기 [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체.
[6] 상기 기재가 다공질 입자인, 상기 [1] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체.
[7] 상기 어피니티 리간드가 항체와 항원항체반응을 하는, 상기 [1] 내지 [6] 중 어느 하나에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체.
[8] 상기 어피니티 리간드가 프로테인 A 또는 그 개변체인, 상기 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체.
[9] 상기 기재가 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 키토산, 글루코만난 및 이들에 가교 구조를 도입한 가교 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지고,
상기 친수성 폴리머가 덱스트란, 카복시메틸덱스트란 및 풀루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 친수성 다당류이며,
상기 친수성 다당류의 극한 점도가 0.12dL/g~0.30dL/g이고,
상기 친수성 폴리머의 피복량이 10mg/g-dry gel~240mg/g-dry gel이며,
상기 카복시기의 도입량이 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~55mmol/L-gel이고,
상기 어피니티 리간드가 프로테인 A 또는 그 개변체이며, 또한,
상기 어피니티 리간드의 도입량이 0.10mmol/L-gel~1.0mmol/L-gel인, 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체.
[10] 상기 기재가 아크릴레이트계 중합체 및 메타크릴레이트계 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지고,
상기 친수성 폴리머가 덱스트란, 카복시메틸덱스트란 및 풀루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 친수성 다당류이며,
상기 친수성 다당류의 극한 점도가 0.12dL/g~0.30dL/g이고,
상기 친수성 폴리머의 피복량이 10mg/g-dry gel~250mg/g-dry gel이며,
상기 카복시기의 도입량이 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~55mmol/L-gel이고,
상기 어피니티 리간드가 프로테인 A 또는 그 개변체이며, 또한,
상기 어피니티 리간드의 도입량이 0.10mmol/L-gel~1.0mmol/L-gel인, 상기 [1] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체.
[11] 상기 [1] 내지 [10] 중 어느 하나에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체를 이용한 생체 물질의 정제 방법.
[12] 상기 생체 물질의 첨가 시 pH가 5.0~9.0인, 상기 [11]에 기재된 정제 방법.
[13] 상기 생체 물질의 용출 시 pH가 2.0~5.0인, 상기 [11] 또는 [12]에 기재된 정제 방법.
[14] 상기 생체 물질이 항체 또는 항체 유도체인, 상기 [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재된 정제 방법.
본 발명에 의하면, 항체 흡착 용량 및 정제 순도가 우수한 어피니티 크로마토그래피 담체가 제공된다.
본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체는, 항체 결합성 단백질 및 항체 결합성 폴리펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 어피니티 리간드와 양이온 교환기인 카복시기의 양쪽 모두를 갖고, 또한, 카복시기의 도입량을 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~60mmol/L-gel의 범위 내로 함으로써, 비특이적 흡착량을 작게 할 수 있어, 정제 순도를 개선할 수 있었다. 또, 카복시기는 설폭시기보다 이온 강도가 낮아, 비특이적 흡착을 억제할 수 있기 때문에, 유리하다.
이하에, 본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체 및 그 제조 방법에 대하여 상세하게 설명한다.
또한, 수치 범위에 대하여 "~"의 좌우의 수치는, 그 수치 범위에 포함되는 것으로 한다.
[어피니티 크로마토그래피 담체]
본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체는, 기재, 친수성 폴리머 및 어피니티 리간드를 갖는 어피니티 크로마토그래피 담체로서, 상기 기재는 다당류, 아크릴레이트계 중합체, 메타크릴레이트계 중합체 및 스타이렌계 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지고, 상기 친수성 폴리머는 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이며, 상기 어피니티 리간드는 항체 결합성 단백질 및 항체 결합성 폴리펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이고, 상기 어피니티 크로마토그래피 담체에는 카복시기가 도입되며, 상기 카복시기의 도입량이 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~60mmol/L-gel인, 어피니티 크로마토그래피 담체이다.
<기재>
기재는, 다당류, 아크릴레이트계 중합체, 메타크릴레이트계 중합체 및 스타이렌계 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 다당류, 아크릴레이트계 중합체 및 메타크릴레이트계 중합체로부터 선택되는 적어도 1종, 보다 바람직하게는 다당류로부터 선택되는 적어도 1종이다. 또, 기재는 1종을 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다.
다당류는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 키토산, 글루코만난 등의 천연 다당류 및 이들 천연 다당류에 가교 구조를 도입한 가교 다당류 등을 들 수 있다. 가교 다당류는, 예를 들면, 천연 다당류가 갖는 수산기에 대하여, 에피클로로하이드린, (폴리)알킬렌글라이콜다이글리시딜에터, 알킬렌다이아이소사이아네이트 등의 가교제를 이용하여 가교 구조를 도입함으로써 제조할 수 있다.
다당류는, 바람직하게는 셀룰로스, 가교 셀룰로스, 아가로스 및 가교 아가로스로부터 선택되는 적어도 1종, 보다 바람직하게는 아가로스 및 가교 아가로스로부터 선택되는 적어도 1종이다.
아크릴레이트계 중합체는, 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 아크릴산 메틸, 아크릴산 에틸, 아크릴산 하이드록시에틸, 아크릴산 하이드록시프로필, 아크릴산 뷰틸, 아크릴산 스테아릴, 아크릴산 2-에틸헥실, 사이클로헥실아크릴레이트, 글리세린모노아크릴레이트, 글리시딜아크릴레이트, 4,5-에폭시뷰틸아크릴레이트, 9,10-에폭시스테아릴아크릴레이트 등의 아크릴산 에스터의 1종을 중합하여 이루어지는 중합체, 2종 이상을 공중합하여 이루어지는 공중합체, 아크릴산 에스터의 1종 이상과 아크릴산 에스터 이외의 바이닐기 함유 화합물의 1종 이상을 공중합하여 이루어지는 공중합체 등을 들 수 있다. 여기에서, 아크릴산 에스터 이외의 바이닐기 함유 화합물로서는, 예를 들면, 에틸렌, 프로필렌 등의 모노바이닐 화합물, 다이바이닐벤젠, 트라이바이닐벤젠 등의 방향족 폴리바이닐 화합물, 뷰타다이엔, 메틸렌비스아크릴아마이드, 아이소사이아누르산 트라이알릴 등의 폴리바이닐 화합물을 들 수 있다. 이들 중합체 또는 공중합체에 대하여, 에피클로로하이드린, (폴리)알킬렌글라이콜다이글리시딜에터, 알킬렌다이아이소사이아네이트 등의 가교제를 이용하여 가교 구조를 도입해도 된다.
메타크릴레이트계 중합체는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 메타크릴산 메틸, 메타크릴산 에틸, 메타크릴산 하이드록시에틸, 메타크릴산 하이드록시프로필, 메타크릴산 뷰틸, 메타크릴산 스테아릴, 메타크릴산 2-에틸헥실, 사이클로헥실메타크릴레이트, 글리세린모노메타크릴레이트, 글리시딜메타크릴레이트, 4,5-에폭시뷰틸메타크릴레이트, 9,10-에폭시스테아릴메타크릴레이트 등의 메타크릴산 에스터의 1종을 중합하여 이루어지는 중합체, 2종 이상을 공중합하여 이루어지는 공중합체, 메타크릴산 에스터의 1종 이상과 메타크릴산 에스터 이외의 바이닐기 함유 화합물의 1종 이상을 공중합하여 이루어지는 공중합체 등을 들 수 있다. 메타크릴산 에스터 이외의 바이닐기 함유 화합물로서는, 예를 들면, 에틸렌, 프로필렌 등의 모노바이닐 화합물, 다이바이닐벤젠, 트라이바이닐벤젠 등의 방향족 폴리바이닐 화합물, 뷰타다이엔, 메틸렌비스아크릴아마이드, 아이소사이아누르산 트라이알릴 등의 폴리바이닐 화합물을 들 수 있다. 이들 중합체 또는 공중합체에 대하여, 에피클로로하이드린, (폴리)알킬렌글라이콜다이글리시딜에터, 알킬렌다이아이소사이아네이트 등의 가교제를 이용하여 가교 구조를 도입해도 된다.
스타이렌계 중합체는, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 스타이렌, 메틸스타이렌, 에틸스타이렌, 하이드록시스타이렌, 클로로스타이렌 등의 스타이렌계 화합물의 1종을 중합하여 이루어지는 중합체, 2종 이상을 중합하여 이루어지는 공중합체, 스타이렌계 화합물의 1종 이상과 스타이렌계 화합물 이외의 바이닐기 함유 화합물의 1종 이상을 공중합하여 이루어지는 공중합체 등을 들 수 있다. 스타이렌계 화합물 이외의 바이닐기 함유 화합물로서는, 예를 들면, 에틸렌, 프로필렌 등의 모노바이닐 화합물, 다이바이닐벤젠, 트라이바이닐벤젠 등의 방향족 폴리바이닐 화합물, 뷰타다이엔, 메틸렌비스아크릴아마이드, 아이소사이아누르산 트라이알릴 등의 폴리바이닐 화합물을 들 수 있다. 이들 중합체 또는 공중합체에 대하여, 에피클로로하이드린, (폴리)알킬렌글라이콜다이글리시딜에터, 알킬렌다이아이소사이아네이트 등의 가교제를 이용하여 가교 구조를 도입해도 된다.
기재는 다공질 입자 또는 다공질 막인 것이 바람직하다. 기재가 다공질 입자 또는 다공질 막이면, 표면적이 커져, 단위 시간당 처리 용량을 크게 할 수 있다.
또, 기재가 다공질 입자 또는 다공질 막인 경우의 세공 용적은, 특별히 한정되지 않지만, 수은 포로시미터에 의하여 측정한 세공 용적이, 바람직하게는 0.2mL/g~10mL/g, 보다 바람직하게는 0.2mL/g~5.0mL/g의 범위 내이다. 세공 용적이 이 범위 내이면, 항체 흡착 용량 및 정제 순도를 개선한다. 또, 기계적 강도가 저하되지 않는다.
또, 기재가 다공질 입자 또는 다공질 막인 경우의 비표면적은, 특별히 한정되지 않지만, BET(Brunauer, Emmett, Teller) 법에 의하여 측정한 비표면적(BET 비표면적)이, 바람직하게는 2m2/g~1500m2/g, 보다 바람직하게는 5m2/g~1000m2/g의 범위 내이다. 비표면적이 이 범위 내이면, 항체 흡착 용량 및 정제 순도를 개선한다.
또, 기재가 다공질 입자인 경우의 평균 입자경은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0.5μm~1000μm, 보다 바람직하게는 1μm~250μm, 더 바람직하게는 2μm~150μm의 범위 내이다. 평균 입자경이 이 범위 내이면, 칼럼에 충전하여 통액(通液)했을 때의 압력 손실이 작고, 통액 속도를 높일 수 있어, 처리 효율이 향상됨과 함께, 항체 흡착 용량 및 정제 순도를 개선한다. 또한, 다공질 입자의 평균 입자경은, 이미 알려진 방법으로 측정할 수 있다. 예를 들면, 광학 현미경으로, 100개 이상의 입자경을 측정하고, 그 분포로부터 체적 메디안 직경을 산출함으로써 평균 입자경이 얻어진다.
기재의 시판품으로서는, 예를 들면, 아가로스계의 담체인 세파로즈 시리즈(GE 헬스케어사제)("SEPHAROSE"는 등록상표), 셀룰로스계의 가교 담체인 셀루파인 시리즈(JNC사제)("CELLUFINE"은 등록상표), 알릴덱스트란과 N,N'-메틸렌비스아크릴아마이드의 가교 폴리머인 세파크릴 시리즈(GE 헬스케어사제)("SEPHACRYL"은 등록상표), 아크릴레이트계의 담체인 도요펄 HW 시리즈(도소사제)("도요펄" 및 "TOYOPEARL"은 등록상표) 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
<친수성 폴리머>
친수성 폴리머는 친수성 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이다. 또, 친수성 폴리머는 1종을 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다.
또한, 본 발명에서는, 폴리머 또는 다당류에 대하여 친수성이란, 적어도 1종류의 친수성기를 포함하는 것을 말한다. 친수성기란, 바람직하게는 카복시기, 카복시기의 알칼리 금속염, 설폭시기, 설폭시기의 알칼리 금속염, 하이드록시기, 아마이드기, 카바모일기, 설폰아마이드기, 설파모일기, 인산기, 인산기의 알칼리 금속염, 옥시 인산기, 옥시 인산기의 알칼리 금속염 등의 관능기를 들 수 있다. 이들 친수성기는, 폴리머 중의 어느 위치에 존재해도 되고, 예를 들면, 폴리머 측쇄에 직접 또는 연결기를 통하여 결합하고 있어도 되며, 폴리머 측쇄 또는 그래프트 측쇄에 결합하고 있어도 된다. 또, 친수성기는 1분자 중에, 바람직하게는 복수 개가 존재한다.
친수성 다당류는, 특별히 한정되지 않지만, 정제 순도를 개선하는 효과가 높은 점에서, 바람직하게는 덱스트란, 카복시메틸덱스트란 및 풀루란으로부터 선택되는 적어도 1종이며, 보다 바람직하게는 덱스트란이다.
기재를 친수성 폴리머로 피복함으로써, 본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체 표면의 친수성을 증가시키고, 비특이적 흡착물의 흡착을 억제하기 때문에, 정제 순도를 개선하는 효과가 있다.
친수성 폴리머의 분자량은, 특별히 한정되지 않지만, 극한 점도로, 바람직하게는 0.10dL/g 이상, 보다 바람직하게는 0.10dL/g~0.90dL/g, 더 바람직하게는 0.12dL/g~0.90dL/g, 보다 더 바람직하게는 0.12dL/g~0.30dL/g, 더욱더 바람직하게는 0.17dL/g~0.25dL/g의 범위 내이다. 극한 점도가 이 범위 내이면, 정제 순도가 더욱 향상된다. 또한, 극한 점도는, 제16 개정 일본 약국방에 수재(收載)된 일반 측정법에 있어서의 점도 측정법, 제1법 "모세관 점도계법"에 따라, 몇 개의 다른 농도의 고분자 용액의 점도를 구하여 점도의 농도 의존성을 측정하고, 얻어진 직선의 농도를 0에 외삽(外揷)함으로써 구할 수 있다.
그런데, 고분자의 극한 점도 η와 분자량 M의 사이에는, 하기 마크-하우윙크-사쿠라다의 식(Mark-Houwink-Sakurada equation)이 성립하는 점에서, 직접적인 측정 방법으로 몇 개의 시료의 분자량을 구하고, 분자량과 각각의 극한 점도의 값으로부터 K와 α를 결정해 두면, 같은 종류의 고분자에 대해서는, 극한 점도 η를 측정함으로써 분자량 M이, 분자량 M을 측정함으로써 극한 점도 η가, 각각 구해진다.
η=KMα
여기에서, K 및 α는 고분자의 종류, 용매의 종류 및 온도에 의하여 정해지는 상수이다.
예를 들면, 덱스트란의 극한 점도(ηDextran)와 중량 평균 분자량(MwDextran)은, 하기의 관계식을 충족시키는 것이 알려져 있다.
ηDextran[dL/g]=9×10-4×MwDextran 0.5[dL/g]
친수성 폴리머의 피복량(이하, 간단히 "친수성 폴리머 피복량"이라고 하는 경우가 있음)은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 3mg/g-dry gel~500mg/g-dry gel이고, 보다 바람직하게는 3mg/g-dry gel~350mg/g-dry gel이며, 더 바람직하게는 10mg/g-dry gel~300mg/g-dry gel, 보다 더 바람직하게는 20mg/g-dry gel~240mg/g-dry gel이다. 친수성 폴리머 피복량이 이 범위 내이면, 본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체의 표면의 친수성을 적절하게 높여 비특이적 흡착물의 흡착을 억제함과 함께, 항체가 기재에 확산 침투될 여지가 많이 남아 항체 흡착 용량이 커지기 때문에, 정제 순도가 더 개선된다. 또한, 친수성 폴리머는 기재의 표면을 전부 덮고 있을 필요는 없고, 기재의 적어도 일부를 덮고 있으면 된다.
또한, 친수성 폴리머 피복량[단위: mg/g-dry gel]은, 피복하고 있는 친수성 폴리머의 건조 중량(WP)[단위: mg]을, 피복 전 기재의 건조 중량(W0)[단위: g-dry gel]으로 나눈 값이다. 또, 친수성 폴리머의 건조 중량(WP)은, 담체 전체량의 건조 중량(W1)과 피복 전 기재의 건조 중량(W0)의 차(W1-W0)[단위: mg]이다.
따라서, 친수성 폴리머 피복량은 이하의 식에 의하여 구할 수 있다.
친수성 폴리머 피복량(mg/g-dry gel)=WP/W0=(W1-W0)/W0
상기 피복 전 기재의 건조 중량(W0)은, 다음과 같이 하여 산출할 수 있다.
W0=W0, xg×w0/x
여기에서,
W0, xg: 피복 전 기재의 웨트 젤 xg의 건조 중량
w0: 친수성 폴리머 피복 반응에 이용한 피복 전 기재의 웨트 젤 전체 중량
x: 건조에 이용한 피복 전 기재의 웨트 젤 중량(xg)
이다.
상기 담체 전체량의 건조 중량(W1)도, 동일하게 하여 산출할 수 있다.
<어피니티 리간드>
어피니티 리간드는 항체 결합성 단백질 및 항체 결합성 폴리펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종, 바람직하게는 항체 결합성 단백질로부터 선택되는 적어도 1종이다.
본 발명에 있어서, 폴리펩타이드란, 2잔기~50잔기의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩타이드쇄를 포함하는 분자이며, 대체로, 분자량이 5000 미만인 분자를 말한다. 또, 본 발명에 있어서, 단백질이란, 51잔기 이상의 아미노산 잔기로 이루어지는 펩타이드쇄를 포함하는 분자이며, 대체로, 분자량이 5000 이상인 분자를 말한다.
항체 결합성 단백질은, 항체와 항원항체반응에 의하여 결합하는 단백질이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 L, 프로테인 D, 프로테인 A 개변체 등을 들 수 있다. 항체 결합성 단백질로서는, 프로테인 A 또는 그 개변체가 바람직하다. 프로테인 A 개변체로서는, 알칼리 내성형 프로테인 A가 바람직하다.
항체 결합성 폴리펩타이드는, 항체와 항원항체반응에 의하여 결합하는 폴리펩타이드이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면, 프로테인 A의 항체 결합 도메인의 아미노산 배열예의 일부와 동일한 아미노산 배열예를 갖는 폴리펩타이드 및 그 개변체 등을 들 수 있다. 항체 결합성 폴리펩타이드 개변체로서는, 알칼리 내성형 개변체가 바람직하다.
본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체의 어피니티 리간드의 도입량(이하, 간단히 "어피니티 리간드 도입량"이라고 하는 경우가 있음)은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 0.01mmol/L-gel~100mmol/L-gel, 보다 바람직하게는 0.05mmol/L-gel~50mmol/L-gel, 더 바람직하게는 0.10mmol/L-gel~10mmol/L-gel, 보다 더 바람직하게는 0.10mmol/L-gel~2.0mmol/L-gel, 더욱더 바람직하게는 0.10mmol/L-gel~1.0mmol/L-gel, 보다 더욱더 바람직하게는 0.10mmol/L-gel~0.50mmol/L-gel이다.
<카복시기>
본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체의 카복시기의 도입량(이하, 간단히 "카복시기 도입량"이라고 하는 경우가 있음)은, 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~60mmol/L-gel, 바람직하게는 15mmol/L-gel~55mmol/L-gel, 보다 바람직하게는 15mmol/L-gel~40mmol/L-gel이다. 카복시기 도입량이 이 범위 내이면, 어피니티 리간드 도입량을 적당한 범위 내로 할 수 있어, 항체 흡착 용량을 개선한다. 또, 비특이적 흡착물의 흡착을 억제할 수 있다.
[어피니티 크로마토그래피 담체의 제조 방법]
본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체는, 기재를 친수성 폴리머로 피복하고, 카복시기를 도입하며, 추가로 어피니티 리간드를 도입함으로써 제조할 수 있다.
기재, 친수성 폴리머 및 어피니티 리간드는, 이미 "어피니티 크로마토그래피 담체"에 기재한 바와 같다.
<친수성 폴리머에 의한 피복>
기재를 친수성 폴리머로 피복한다.
기재를 친수성 폴리머로 피복하는 방법은, 친수성 폴리머를 기재에 공유 결합에 의하여 결합시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 기재에 클로로메틸옥시레인(에피클로로하이드린)을 반응시켜 에폭시기를 도입하고, 이에 친수성 폴리머를 반응시키는 방법, 용매 중, 알칼리의 존재하, 기재를 클로로메틸옥시레인(에피클로로하이드린)과 같은 가교제와 반응시켜, 얻어진 반응 생성물을 친수성 폴리머와 반응시키는 방법, 클로로기 등의 할로젠기를 할로젠화제를 이용하여 기재에 도입하고, 윌리엄슨의 에터 합성법을 이용하여 친수성 폴리머를 고정화하는 방법 등을 들 수 있다.
기재를 친수성 폴리머로 피복할 때에는, 친수성 폴리머 피복량이, 바람직하게는 3mg/g-dry gel~500mg/g-dry gel이고, 보다 바람직하게는 3mg/g-dry gel~350mg/g-dry gel이며, 더 바람직하게는 10mg/g-dry gel~300mg/g-dry gel, 보다 더 바람직하게는 20mg/g-dry gel~240mg/g-dry gel이 되도록 한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 친수성 폴리머로 피복하기 직전의 기재를 "피복 전 기재"라고 하고, 이 피복 전 기재에 친수성 폴리머를 피복한 것을 "담체"라고 하는 경우가 있다.
<카복시기의 도입>
담체에 카복시기를 도입한다.
담체에 카복시기를 도입하는 방법은, 카복시기를 갖는 화합물을 담체에 공유 결합에 의하여 결합시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 알칼리 조건하에서 담체에 클로로 아세트산을 반응시켜, 담체 표면의 하이드록시기의 일부에 카복시메틸기를 도입하는 방법, 담체에 알데하이드기를 도입하고, 아미노산 등의 카복시기 및 아미노기를 갖는 화합물의 아미노기를 통하여 환원적 아미노화법으로 알데하이드기에 카복시기를 도입하는 방법 등을 들 수 있다.
담체에 카복시기를 도입할 때에는, 카복시기 도입량이 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~60mmol/L-gel, 바람직하게는 15mmol/L-gel~55mmol/L-gel, 보다 바람직하게는 15mmol/L-gel~40mmol/L-gel이 되도록 한다.
또한, 본 명세서에 있어서, 담체에 카복시기를 도입한 것을 "카복시화 담체"라고 하는 경우가 있다.
<어피니티 리간드의 도입>
카복시화 담체에 어피니티 리간드를 도입(고정화)한다.
카복시화 담체에 어피니티 리간드를 도입(고정화)하는 방법은, 어피니티 리간드를 카복시화 담체에 공유 결합에 의하여 결합시킬 수 있는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면, 카복시기의 일부를 EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide; N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드)/NHS(N-hydroxysuccinimide; N-하이드록시석신이미드)화하고, 프로테인 A 등의 어피니티 리간드와 반응시켜, 반응 후에 미반응의 EDC/NHS화된 카복시기를 재생하는 방법, 프로테인 A 등의 아미노기를 갖는 어피니티 리간드의 경우에는, 카복시기를 보호하여, 알데하이드기를 도입하고, 아미노기를 통하여 환원적 아미노화법으로 알데하이드기에 어피니티 리간드를 도입하는 방법 등을 들 수 있다.
카복시화 담체에 어피니티 리간드를 도입할 때에는, 어피니티 리간드의 도입량이, 바람직하게는 0.01mmol/L-gel~100mmol/L-gel, 보다 바람직하게는 0.05mmol/L-gel~50mmol/L-gel, 더 바람직하게는 0.10mmol/L-gel~10mmol/L-gel, 보다 더 바람직하게는 0.10mmol/L-gel~2.0mmol/L-gel, 더욱더 바람직하게는 0.10mmol/L-gel~1.0mmol/L-gel, 보다 더욱더 바람직하게는 0.10mmol/L-gel~0.50mmol/L-gel이 되도록 한다.
또한, 어피니티 리간드를 카복시화 담체의 카복시기의 일부에 결합한 경우의 어피니티 크로마토그래피 담체의 카복시기 도입량은, "카복시화 담체의 카복시기 도입량-어피니티 크로마토그래피 담체의 어피니티 리간드 도입량"으로 나타낸다.
[생체 물질의 정제 방법, 그 정제 방법에 의하여 정제된 생체 물질]
<생체 물질>
본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체에 의하여 정제되는 생체 물질은, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 바람직하게는 항체 또는 항체 유도체, 보다 바람직하게는 면역 글로불린 G 또는 그 유도체이다.
항체란, 면역 글로불린 또는 그 유연체(類緣體), 프래그먼트 혹은 융합체를 말한다. 여기에서, 유연체란, 면역 글로불린의 구조 또는 기능이 적어도 부분적으로 유지된, 천연의, 또는 인공적으로 제작된, 단백질 또는 단백질 콘주게이트를 말한다. 또, 프래그먼트란, 효소적인 처리 또는 유전자 공학적인 설계에 의하여 제작된, 면역 글로불린의 부분 구조를 갖는 단백질을 말한다. 또, 융합체란, 면역 글로불린 분자의 정상 영역인 Fc(Fragment crystallizable, 결정화 가능 단편) 영역과 다른 기능성 단백질 또는 펩타이드를 융합하여 이루어지는 Fc 융합 단백질(Fc 함유 분자)이 포함된다. 또한, 본 발명에 있어서, 면역 글로불린은, IgG(Immunoglobulin G; 면역 글로불린 G), IgM(Immunoglobulin M; 면역 글로불린 M), IgA(Immunoglobulin A; 면역 글로불린 A), IgD(Immunoglobulin D; 면역 글로불린 D) 및 IgE(Immunoglobulin E; 면역 글로불린 E)의 5종류의 클래스(아이소타입) 중 어느 것이어도 되지만, IgG 또는 IgM이 바람직하고, IgG가 보다 바람직하다.
또, 항체 유도체란, 인간 면역 글로불린의 Fc 영역과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 Fab 영역을 융합시킨 키메라 항체, 인간 면역 글로불린의 몇 개의 Fc 영역과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 몇 개의 Fv 영역을 융합시킨 키메라 항체, 인간 면역 글로불린의 CDR(Complementarity Determining Region; 상보성 결정 영역) 부분을 제외한 잔여 부분과 비인간 포유 동물 면역 글로불린 CDR 부분을 융합시킨 인간형화 항체, 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 Fc 영역과 인간 면역 글로불린의 Fab(Fragment, antigen binding; 항체 결합 단편) 영역을 융합시킨 키메라 항체, 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 몇 개의 Fc 영역과 인간 면역 글로불린의 몇 개의 Fv 영역을 융합시킨 키메라 항체, 인간 면역 글로불린의 CDR 부분을 제외한 잔여 부분과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 CDR 부분을 융합시킨 비인간 포유 동물화 항체, 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 Fc 영역과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 Fab 영역을 융합시킨 키메라 항체, 비인간 포유 동물 글로불린의 몇 개의 Fc 영역과 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 몇 개의 Fv 영역을 융합시킨 키메라 항체, 비인간 포유 동물 면역 글로불린의 CDR(Complementarity Determining Region; 상보성 결정 영역) 부분을 제외한 잔여 부분과 비인간 포유 동물 면역 글로불린 CDR 부분을 융합시킨 비인간 포유 동물형 항체, 및 이들의 화학적 수식을 더한 단백질로서 Fc 영역을 유지하는 단백질을 말한다.
이들은 항체 의약품의 원료로서 이용된다.
<정제 방법>
이하에, 본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체를 이용한 정제 방법의 상세한 설명을, 생체 물질이 면역 글로불린 G인 경우에 대하여 예시하지만, 본 발명은 이에 한정되는 것은 아니다.
어피니티 크로마토그래피 담체를 이용한 생체 물질(특히, 항체)의 정제는, 크게, 흡착 공정, 세정 공정, 이온 강도 조절 공정, 용출 공정의 4공정으로 구성되는 것 외에, 그 후의 재생 공정 및/또는 CIP(cleaning-in-place; 정치(定置) 세정) 공정, 재평형화 공정 등의 재이용을 위한 공정을 포함해도 된다.
흡착 공정에서는, 일반적인 어피니티 크로마토그래피 정제 방법을 이용할 수 있다. 즉, 그 일례에 있어서, 면역 글로불린 G를 포함하는 단백질 용액의 pH가 중성 부근이 되도록 조정한 후, 그 용액을 본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체를 충전한 칼럼에 통과시켜, 어피니티 리간드를 통하여 면역 글로불린 G를 특이적으로 어피니티 크로마토그래피 담체에 흡착시킨다. 예를 들어, 프로테인 A를 어피니티 리간드로 하는 경우, 그 부하 pH, 즉 생체 물질의 첨가 시 pH는, 바람직하게는 5.0~9.0이고, 보다 바람직하게는 5.3~9.0이며, 더 바람직하게는 5.5~9.0이고, 보다 더 바람직하게는 6.0~8.5이다. 포유류 배양 세포에 의하여 생산되는 면역 글로불린 G의 정제에 있어서, 특히 이온 강도의 조절을 필요로 하지 않는 것 외에, 미리 이온 강도를 올려 비특이 흡착을 더 억제할 수도 있다.
세정 공정에서는, 어피니티 리간드가 기능하는 조건 범위의 완충액을 적당량 통과시켜, 칼럼 내부를 세정한다. 즉, pH의 바람직한 범위는 상기 부하 시와 같은 범위여도 되고, 예를 들면, 바람직하게는 pH5.0~9.0이다. 이 시점에서 면역 글로불린 G는 본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체에 흡착되어 있다. 이때, 중성 부근의 pH에서 이온 강도나 조성물의 최적화에 의하여, 불순물을 효과적으로 제거할 수 있는 경우가 있다. 세정 시에 있어서, 카복시기가 기능하지 않는 조건이 바람직하고, 즉, 중성 부근의 pH로 함과 함께 일정 이상의 이온 강도의 세정액의 이용이 바람직하며, 이 과정에서 어피니티 크로마토그래피 담체 및/또는 면역 글로불린 G를 통하여 비특이적으로 칼럼에 잔류하는 불순물을 세정할 수 있다. 이온 강도는, 예를 들면, 바람직하게는 0.2M 이상이며, 보다 바람직하게는 0.5M 이상이다.
이온 강도 조절 공정에서는, 중성 부근에서 이온 강도가 낮은 완충액으로 칼럼을 치환하여, 용출 시의 카복시기에 의한 이온 강도 의존적 용출 기능의 발현에 대비한다.
용출 공정에서는, 산성 pH, 이온 강도의 조합에 의하여, 어피니티 리간드로부터의 용출 시에 양이온 교환 분리 모드를 기능시켜, 양 리간드의 협주적인 작용으로, 단량체 함량이 높은 분획을 저이온 강도 용출 분획으로 회수할 수 있다. 용출액의 pH는 어피니티 리간드로부터의 면역 글로불린 G의 용출 시 pH를 적용할 수 있다. 이 pH는, 어피니티 크로마토그래피 담체와 면역 글로불린 G의 종류에 의하여 결정되는 분리 조건을 중심으로 결정되는 점에서, 특별한 조건 설정을 필요로 하지 않는다.
어피니티 리간드에 프로테인 A를 이용한 경우는, 용출 시 pH는, 바람직하게는 2.0~5.0으로 설정된다. 단, 생체 물질의 산 변성을 피할 목적에서, 보다 바람직하게는 pH2.8 이상, 더 바람직하게는 pH3.0 이상, 보다 더 바람직하게는 pH3.2 이상이다. pH는, 바람직하게는 5.0 이하, 보다 바람직하게는 4.8 이하이다.
어피니티 리간드에 알칼리 내성형 프로테인 A를 이용하는 경우는, 일반적으로, 용출 시 pH는, 바람직하게는 3.5~4.0으로 설정되지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 또, 용출 이온 강도는, 어피니티 리간드와 카복시기의 도입 비율에 의존하는 것 외에, 단위 체적당 면역 글로불린 G의 부하량에도 의존하지만, 그래디언트 실험이나 스텝와이즈 용출 실험에 의하여 최적화 포인트를 용이하게 설정할 수 있다.
본 발명에 의하여 조제되는 어피니티 크로마토그래피 담체로부터의 항체 용출은, 염 농도 그래디언트 용출이어도 스텝와이즈 용출이어도 적용 가능하지만, 용출액량의 저감을 목적으로 한 경우는 이온 강도에 의한 스텝와이즈 용출이 바람직하다. 또한 조작의 단순화를 위해서는, 원스텝 용출에 의한 항체의 회수와 고정제 순도를 달성할 수 있는 조건 설정이 바람직하다.
또한, 세정 공정의 이온 강도와 산성 pH의 조합으로도 응집체가 칼럼에 잔류하여 용출 분획에 혼입되지 않는 경우는, 이온 강도 조절 공정을 생략할 수 있다.
<정제된 생체 물질>
본 발명의 정제 방법에 따라 정제된 생체 물질, 특히 항체 또는 항체 유도체는, 정제의 전후에 그 자체의 구조, 특성은 변화하지 않지만, 정제 순도가 높아져 있다. 단, 어느 정도 높아져 있는지는, 정제 전의 용액 등에 의존하기 때문에, 일률적으로 말할 수 없다.
본 발명에 의하여 조제된 어피니티 크로마토그래피 담체를 이용하여 정제된 면역 글로불린 G는, 단일 분리 모드에 근거하는 어피니티 크로마토그래피 담체보다 높은 모노머 선택성을 나타내고, 그 용출액 중의 모노머 함량이 높다.
단일 분리 모드에 근거하는 어피니티 크로마토그래피 담체를 이용한 경우에도, 용출 시 pH 및 이온 강도 등의 최적화에 의하여, 모노머 함량을 약간 높이는 것은 가능하지만, 그 효과가 낮고, 효과 발현에는 보다 큰 회수율의 저하를 수반한다. 본 발명의 어피니티 크로마토그래피 담체를 이용함으로써, 특이성이 높은 어피니티 정제와, 주로 양이온 교환 크로마토그래피에 의하여 달성할 수 있는 모노머 함량의 향상을, 고회수율을 유지한 채 단일 크로마토 조작으로 효율적으로 달성 가능한 점에서, 후단(後段) 프로세스로의 부하의 저감이 가능해져, 프로세스 전체의 수율 향상과 단량체 함량의 향상에 공헌할 수 있다. 즉, 본 발명의 신규 어피니티 크로마토그래피 담체의 사용에 의하여, 항체 의약품의 제조 프로세스의 생산성 향상과 고순도화에 기여할 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들에 제한되는 것은 아니다.
[측정 방법 및 평가 방법]
1. 친수성 폴리머 피복량의 측정 방법
피복 전 기재의 웨트 젤 5g을 50℃에서 중량 변화가 없어질 때까지 감압 건조하여 중량을 측정하고, 친수성 폴리머 피복 반응에 이용한 피복 전 기재의 웨트 젤 중량과 곱하여, 피복 전 기재의 건조 중량으로 했다. 이어서, 피복 전 기재에 친수성 폴리머를 피복하여 얻은 담체의 웨트 젤 5g을 50℃에서 중량 변화가 없어질 때까지 감압 건조하여 중량을 측정하고, 친수성 폴리머 피복 반응 후에 얻어진 담체의 웨트 젤 중량과 곱하여, 담체의 건조 중량으로 했다. 담체의 건조 중량과 피복 전 기재의 건조 중량의 차를, 피복 전 기재를 피복하고 있는 친수성 폴리머의 건조 중량으로 했다. 친수성 폴리머 피복량은, 피복 전 기재의 건조 중량당 친수성 폴리머의 건조 중량으로서 산출했다.
2. 카복시기 도입량의 측정 방법
카복시화 담체 1g을 3mL의 순수로 현탁하고, 내경 15mm의 디스포저블 칼럼에 따르고, 흡인 여과로 용매를 제거했다. 0.2mol/L의 염산 3mL로 4회 세정하고, 그 후 순수 4mL로 세정을 반복했다. 세정 후, 베드 (칼럼에 퇴적한 담체 부분) 높이를 측정함으로써, 카복시화 담체의 체적을 산출했다. 카복시화 담체를 취출하고, 100mL용량 비커로 옮겨, 40mL의 0.1mol/L의 식염수로 현탁하고, 자동 적정 장치 "COM-1600"(히라누마 산교사제)을 이용하여, 0.1mol/L의 수산화 나트륨 수용액으로 적정했다. 종점까지의 적정액량으로부터 카복시화 담체 1L당 이온 교환 용량(meq/L-gel)을 산출했다. 또한, 단위를 "mmol/L-gel"로 환산했다(1meq/L-gel=1mmol/L-gel). 카복시기 도입량은 이온 교환 용량으로 나타냈다.
3. 어피니티 리간드 도입량(프로테인 A 고정화량)의 측정 방법
프로테인 A 고정화 반응 후의 프로테인 A액, 반응액 및 세정액을, 각각 젤 여과 크로마토그래피(하기)로, 280nm에 있어서의 흡광도의 피크 면적값으로부터, 각 용액에 포함되는 프로테인 A양을 산출했다.
프로테인 A 고정화 반응 전의 프로테인 A액, 반응액 및 세정액에 포함되는 프로테인 A양과의 차로부터, 프로테인 A 고정화량을 산출했다.
(젤 여과 크로마토그래피의 조건)
크로마토 시스템: 아크타 아반트 25(AKTA avant 25)(GE 헬스케어사제)("AKTAAVANT"는 등록상표)
칼럼: 탈염 칼럼 "하이트랩 디솔팅(HiTrap Desalting)(GE 헬스케어사제)("HITRAP"은 등록상표)
버퍼: 20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4
유속: 3mL/min
4. 항체 흡착 용량의 평가 방법
(1) 항체 흡착 용량의 측정
실시예로 제조한 어피니티 크로마토그래피 담체, 비교예로 제조한 크로마토그래피 담체 또는 시판 중인 크로마토그래피 담체 1mL를 글래스 칼럼 "트리콘 10/20 칼럼(Tricorn 10/20 column)"(GE 헬스케어사제)("TRICORN"은 등록상표)에 충전하고, 크로마토 시스템 "아크타 아반트 25(AKTA avant 25)"(GE 헬스케어사제)("AKTAAVANT"는 등록상표)에 접속하여, 항체 흡착 용량의 측정을 행했다.
칼럼을 평형화액(20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4)으로 평형화한 후에, 인간 IgG 항체(Immunoglobulin G: 면역 글로불린 G)를 표준 버퍼(20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4)로 5mg/mL로 조정한 용액 15mL를 유속 0.42mL/min으로 첨가했다. 그 후, 부하 후 세정액(20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보내 세정한 후에, 용출 전 세정액(20mM 인산 버퍼, 1M NaCl, pH7.4)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보냈다. 그 후, 용출액(100mM 시트르산 버퍼, 150mM NaCl, pH3.2)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보냈다. 추가로 연속하여, 정치 세정(CIP; cleaning in place)액(0.1M 수산화 나트륨 수용액)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보내고, 그 후, 재평형화액(20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4)을, 같은 유속으로 5mL 흘려 보냈다. 이때, 280nm의 흡광도를 모니터링하여 얻어진 IgG 용출 피크로부터, 각 분획에 있어서의 용출액의 항체 용출량을 산출했다. 용출 전 세정액으로부터 CIP액까지 용출한 항체량을 항체 흡착 용량으로서 산출했다.
(2) 항체 흡착 용량의 평가
항체 흡착 용량의 평가는, 이하의 평가 기준에 따라, 카복시기와 프로테인 A만을 도입한 경우의 항체 흡착 용량을 기준으로 하여 행했다. 즉, 실시예 1~7, 비교예 1~6, 비교예 8 및 참고예 1(기재가 다당류인 실시예, 비교예 및 참고예)에 대해서는 비교예 4를, 실시예 8 및 비교예 7(기재가 메타크릴레이트계 중합체인 실시예 및 비교예)에 대해서는 비교예 7을, 각각 기준으로 하여 항체 흡착 용량을 평가했다.
항체 흡착 용량이 기준의 40% 이상…항체 흡착 용량의 평가 "A"
항체 흡착 용량이 기준의 40% 미만…항체 흡착 용량의 평가 "C"
5. 정제 순도의 평가 방법
(1) 정제 순도의 산출
실시예 또는 비교예로 제조한 어피니티 크로마토그래피 담체 또는 시판 중인 크로마토그래피 담체 1mL를 글래스 칼럼 "트리콘 10/20 칼럼(Tricorn 10/20 column)"(GE 헬스케어사제)("TRICORN"은 등록상표)에 충전하고, 크로마토 시스템 "아크타 아반트 25(AKTA avant 25)"(GE 헬스케어사제)("AKTAAVANT"는 등록상표)에 접속하여, 각 분획에서 용출되는 HCP(host cell protein; 숙주 세포 유래 단백질)양 및 IgG(Immunoglobulin G; 면역 글로불린 G)양의 측정을 행했다.
칼럼을 평형화액(20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4)으로 평형화한 후에, IgG, CHO-S(Chinese Hamster Ovary S) 세포 유래 HCP가, 각각 1.6mg/mL, 0.32mg/mL가 되도록 표준 버퍼(20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4)를 이용하여 조제한 IgG/HCP 혼합액을, 상술한 (1)로 얻어진 항체 흡착 용량의 8할의 항체량이 부하되는 용액량을 유속 0.21mL/min으로 첨가했다. 그 후, 부하 후 세정액(20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4)을 0.42mL/min로 5mL 흘려 보내 세정한 후에, 용출 전 세정액(20mM 인산 버퍼, 1M NaCl, pH7.4)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보냈다. 그 후, 용출액(100mM 시트르산 버퍼, 150mM NaCl, pH3.2)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보냈다. 추가로 연속하여, CIP액(0.1M 수산화 나트륨 수용액)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보내고, 그 후, 재평형화액(20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보냈다. 이때, 280nm의 흡광도를 모니터링하여 얻어진 IgG 용출 피크로부터, 각 분획에 있어서의 용출액의 IgG 용출량을 산출했다. 또, 각 분획의 용출액을 회수하고, 숙주 세포 유래 단백질 검출 키트 "CHO HCP 3rd Generation ELISA kit"(시그너스 테크놀로지즈사제)를 이용한 ELISA법에 의하여, 각 분획에 있어서의 용출액의 HCP양을 산출했다.
산출한 용출액의 IgG양 및 HCP양을 이용하여, 정제 순도는 용출액에 있어서의 HCP 혼입량, 즉, 용출액 중의 IgG양당 HCP양으로 하고, 이하의 식에 의하여 산출했다.
정제 순도(ppm)=HCP 혼입량(ppm)=용출액의 HCP양/용출액의 IgG양
(2) 정제 순도의 평가
정제 순도의 평가는, 이하의 평가 기준에 따라, 카복시기와 프로테인 A만을 도입한 경우의 HCP 혼입량(ppm)을 기준으로 하여 행했다. 즉, 실시예 1~7, 비교예 1~6, 비교예 8 및 참고예 1(기재가 다당류인 실시예, 비교예 및 참고예)에 대해서는 비교예 4를, 실시예 8 및 비교예 7(기재가 메타크릴레이트계 중합체인 실시예 및 비교예)에 대해서는 비교예 7을, 각각 기준으로 하여 HCP 혼입량을 평가했다.
HCP 혼입량(ppm)이 20% 이상 감소했다……정제 순도의 평가 "A"
HCP 혼입량(ppm)이 0% 초과 20% 미만 감소했다…정제 순도의 평가 "B"
HCP 혼입량(ppm)이 감소하지 않는다……정제 순도의 평가 "C"
[실시예 1]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
(1) 웨트 젤의 조제
가교 아가로스계 기재 "세파로즈 6 패스트·플로(Sepharose 6 Fast Flow)"(GE 헬스케어사제)("SEPHAROSE"는 등록상표)를, 글래스 필터 상에서, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 기재 슬러리를 얻었다. 이 기재 슬러리로부터, 흡인 여과에 의하여 순수를 제거하여, 웨트 젤을 얻었다.
또한, 표 1의 "기재"란에 있어서 "세파로즈 6 FF"는 "세파로즈 6 패스트·플로"를 의미한다.
(2) 피복 전 기재의 조제 - 에폭시기의 도입
얻어진 웨트 젤 100g, 순수 152mL 및 클로로메틸옥시레인 50g을, 500mL용량 3구 플라스크에 넣고, 45℃의 온욕(溫浴) 중에서, 플라스크 내용물의 교반을 개시했다. 플라스크 내의 온도가 45℃가 될 때까지 교반을 행했다. 45℃의 온욕 중에서, 플라스크 내의 온도를 약 45℃로 유지하면서, 50%(w/w) 수산화 나트륨 수용액 41g을 2시간에 걸쳐 플라스크 내에 적하했다. 수산화 나트륨 수용액의 전체량을 적하한 후, 추가로 1시간 반응시키고, 글래스 필터 상에서, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 피복 전 기재의 웨트 젤을 얻었다.
(3) 담체의 조제 - 친수성 폴리머에 의한 피복
덱스트란 70(극한 점도 0.23dL/g; 중량 평균 분자량 약 70,000) 13g 및 순수 154mL를, 500mL용량 3구 플라스크에 넣고, 실온에서 플라스크 내용물의 교반을 개시했다. 덱스트란 70이 완전하게 용해될 때까지 교반을 행했다. 용해 후, 피복 전 기재의 웨트 젤 90g을 이 3구 플라스크에 첨가하고, 실온에서 더욱 교반했다. 3구 플라스크 내의 혼합액이 균일하게 되고 나서, 50%(w/w) 수산화 나트륨 수용액 4.2g을 첨가했다. 수산화 나트륨 수용액을 첨가한 후, 실온에서 16시간 반응시키고, 글래스 필터 상에서, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 담체의 웨트 젤을 얻었다.
또, 얻어진 담체의 덱스트란 피복량을, 상술한 "친수성 폴리머 피복량의 측정 방법"에 따라 측정했다. 얻어진 친수성 폴리머 피복량을, 표 1의 "친수성 폴리머 피복량"의 란에 나타낸다.
(4) 카복시화 담체의 조제 - 카복시기의 도입
얻어진 담체의 웨트 젤 12g, 클로로 아세트산 나트륨 6.2g 및 순수 24mL를, 100mL용량 3구 플라스크에 넣고, 50℃의 온욕 중에서, 플라스크 내용물의 교반을 개시했다. 클로로 아세트산 나트륨이 완전하게 용해될 때까지 교반을 행했다. 용해 후, 50℃의 온욕 중에서, 플라스크 내 온도를 약 50℃로 유지하면서, 50%(w/w) 수산화 나트륨 수용액 8.8g을 1시간에 걸쳐 적하했다. 수산화 나트륨 수용액의 전체량을 적하한 후, 추가로 3시간 반응시키고, 글래스 필터 상에서, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 카복시화 담체의 웨트 젤을 얻었다.
또, 얻어진 카복시화 담체의 카복시기 도입량을, 상술한 "카복시기 도입량의 측정 방법"에 따라 측정했다. 얻어진 카복시기 도입량을, 표 1의 카복시기 도입량의 란에 나타낸다.
또한, 어피니티 크로마토그래피 담체의 카복시기 도입량은, "카복시화 담체의 카복시기 도입량-어피니티 리간드 도입량"으로 나타냈다.
(5) 프로테인 A 고정 카복시화 담체의 조제 - 어피니티 리간드의 도입
얻어진 카복시화 담체를, 습윤 체적으로서 2.5mL만큼, 디스포저블 칼럼에 넣고, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 담체 슬러리를 얻었다. 이 담체 슬러리로부터, 흡인 여과에 의하여 순수를 제거하여, 웨트 젤을 얻었다.
얻어진 웨트 젤 2.0g을 반응 용기에 담아, EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide; N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드) 용액 2mL를 첨가하고, 실온에서 10분간, 전도 교반했다. 그 후, 반응 용기에 NHS(N-hydroxysuccinimide; N-하이드록시석신이미드) 용액 2mL를 첨가하고, 실온에서 30분간, 전도 교반했다. 여기에서, EDC 용액은, DMSO(dimethyl sulfoxide; 다이메틸설폭사이드) 2mL에 EDC 0.2g을 용해하여 조제한 것이며, NHS 용액은, DMSO 2mL에 NHS 0.2g을 용해하여 조제한 것이다.
반응 젤 용액을 디스포저블 칼럼으로 옮기고, 빙랭한 1mM 염산 6mL로 세정하여, EDC/NHS 활성화된 카복시화 담체를 얻었다.
얻어진 EDC/NHS 활성화 카복시화 담체 1.5g을 반응 용기에 넣고, 계속해서, 10mg/mL 프로테인 A 용액 1.5mL를 반응 용기에 첨가하고, 25℃에서 2시간 흔들었다. 상기 10mg/mL 프로테인 A 용액은, 유전자 재조합 천연형 프로테인 A "rSPA"(리플리젠사제)를, 20mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid; 2-(N-모폴리노)에테인설폰산) 버퍼(pH4.5)에 용해하여 조제한 것이다.
용매를 1M 염화 나트륨 수용액 및 0.5M 에탄올아민 수용액으로 치환하고, 세정하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 얻었다.
또, 얻어진 프로테인 A 고정 카복시화 담체의 프로테인 A 고정화량(어피니티 리간드 도입량)을, 상술한 "어피니티 리간드 도입량(프로테인 A 고정화량)의 측정 방법"에 따라 측정했다. 얻어진 프로테인 A 고정화량을, 표 1의 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[실시예 2]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
카복시화 담체의 조제(카복시기의 도입) 시의 클로로 아세트산 나트륨의 사용량을 6.2g에서 3.6g으로 변경한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 제조했다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 친수성 폴리머 피복량, 카복시기 도입량, 어피니티 리간드 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "친수성 폴리머 피복량", "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[실시예 3]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
카복시화 담체의 조제(카복시기의 도입) 시의 클로로 아세트산 나트륨의 사용량을 6.2g에서 11.7g으로 변경한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 제조했다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 친수성 폴리머 피복량, 카복시기 도입량, 어피니티 리간드 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "친수성 폴리머 피복량", "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[실시예 4]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
담체의 조제(친수성 폴리머에 의한 피복) 시의 덱스트란 70(극한 점도 0.23dL/g, 중량 평균 분자량 약 70,000)의 사용량을 13g에서 66g으로 변경한 점, 및 카복시화 담체의 조제(카복시기의 도입) 시의 클로로 아세트산 나트륨의 사용량을 6.2g에서 2.0g으로 변경한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 제조했다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 친수성 폴리머 피복량, 카복시기 도입량, 어피니티 리간드 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "친수성 폴리머 피복량", "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[실시예 5]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
웨트 젤의 조제 시의 가교 아가로스계 기재를 "세파로즈 4 패스트·플로(Sepharose 4 Fast Flow)"(GE 헬스케어사제)("SEPHAROSE"는 등록상표)로 변경한 점, 및 카복시화 담체의 조제(카복시기의 도입) 시의 클로로 아세트산 나트륨의 사용량을 2.0g에서 3.9g으로 변경한 점을 제외하고, 실시예 4와 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 제조했다.
또한, 표 1의 "기재"란에 있어서 "세파로즈 4 FF"는 "세파로즈 4 패스트·플로"를 의미한다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 친수성 폴리머 피복량, 카복시기 도입량, 어피니티 리간드 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "친수성 폴리머 피복량", "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[실시예 6]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
담체의 조제(친수성 폴리머에 의한 피복) 시의 덱스트란 70(극한 점도 0.23dL/g, 중량 평균 분자량 약 70,000) 대신에 덱스트란 40(극한 점도 0.17dL/g, 중량 평균 분자량 약 40,000)을 이용한 점, 및 카복시화 담체의 조제(카복시기의 도입) 시의 클로로 아세트산 나트륨의 사용량을 3.9g에서 4.5g으로 변경한 점을 제외하고, 실시예 5와 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 제조했다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 친수성 폴리머 피복량, 카복시기 도입량, 어피니티 리간드 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "친수성 폴리머 피복량", "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[실시예 7]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
담체의 조제(친수성 폴리머에 의한 피복) 시의 덱스트란 70(극한 점도 0.23dL/g, 중량 평균 분자량 약 70,000) 대신에 덱스트란 19(극한 점도 0.12dL/g, 중량 평균 분자량 약 19,000)를 이용한 점, 및 카복시화 담체의 조제(카복시기의 도입) 시의 클로로 아세트산 나트륨의 사용량을 3.9g에서 5.7g으로 변경한 점을 제외하고, 실시예 5와 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 제조했다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 친수성 폴리머 피복량, 카복시기 도입량, 어피니티 리간드 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "친수성 폴리머 피복량", "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[실시예 8]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
(1) 웨트 젤의 조제
메타크릴레이트계 다공계 기재 "도요펄 HW-65F(TOYOPEARL HW-65F)"(도소사제)("도요펄" 및 "TOYOPEARL"은 등록상표)를, 글래스 필터 상에서, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 기재 슬러리를 얻었다. 이 기재 슬러리로부터, 흡인 여과에 의하여 순수를 제거하여, 웨트 젤을 얻었다.
(2) 피복 전 기재의 조제 - 에폭시기의 도입
얻어진 웨트 젤 100g, 순수 152mL 및 클로로메틸옥시레인 50g을, 500mL용량 3구 플라스크에 넣고, 45℃의 온욕 중에서, 플라스크 내용물의 교반을 개시했다. 플라스크 내의 온도가 45℃가 될 때까지 교반을 행했다. 45℃의 온욕 중에서, 플라스크 내의 온도를 약 45℃로 유지하면서, 50%(w/w) 수산화 나트륨 수용액 41g을 2시간에 걸쳐 플라스크 내에 적하했다. 수산화 나트륨 수용액의 전체량을 적하한 후, 추가로 1시간 반응시키고, 글래스 필터 상에서, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 웨트 젤을 얻었다. 이 반응을 3회 반복함으로써, 피복 전 기재의 웨트 젤을 얻었다.
(3) 담체의 조제 - 친수성 폴리머에 의한 피복
덱스트란 70(극한 점도 0.23dL/g; 중량 평균 분자량 약 70,000) 13g 대신에 덱스트란 40(극한 점도 0.17dL/g, 중량 평균 분자량 약 40,000) 126g을 이용한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여, 담체의 웨트 젤을 얻었다.
또, 얻어진 담체의 덱스트란 피복량을, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "친수성 폴리머 피복량의 측정 방법"에 따라 측정했다. 얻어진 친수성 폴리머 피복량을, 표 1의 "친수성 폴리머 피복량"의 란에 나타낸다.
(4) 카복시화 담체의 조제 - 카복시기의 도입
클로로 아세트산 나트륨의 사용량을 6.2g에서 3.4g으로 변경한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여, 카복시화 담체의 웨트 젤을 얻었다.
또, 얻어진 카복시화 담체의 카복시기 도입량을, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "카복시기 도입량의 측정 방법"에 따라 측정했다. 얻어진 카복시기 도입량을, 표 1의 "카복시기 도입량"의 란에 나타낸다.
(5) 프로테인 A 고정 카복시화 담체의 조제 - 어피니티 리간드의 도입
실시예 1과 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 얻었다.
또, 얻어진 프로테인 A 고정 카복시화 담체의 프로테인 A 고정화량을, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "어피니티 리간드 도입량(프로테인 A 고정화량)의 측정 방법"에 따라 측정했다. 얻어진 프로테인 A 고정화량을, 표 1의 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[비교예 1]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
카복시화 담체의 조제(카복시기의 도입) 시의 클로로 아세트산 나트륨의 사용량을 6.2g에서 1.8g으로 변경한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 제조했다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 친수성 폴리머 피복량, 카복시기 도입량, 어피니티 리간드 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "친수성 폴리머 피복량", "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[비교예 2]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
카복시화 담체의 조제(카복시기의 도입) 시의 클로로 아세트산 나트륨의 사용량을 6.2g에서 22.7g으로 변경한 점을 제외하고, 실시예 1과 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 제조했다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 친수성 폴리머 피복량, 카복시기 도입량, 어피니티 리간드 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "친수성 폴리머 피복량", "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[비교예 3]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
(1) 담체의 조제 - 친수성 폴리머에 의한 피복
실시예 1과 동일하게 하여 담체의 웨트 젤을 얻었다. 또, 얻어진 담체의 덱스트란 피복량을, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "친수성 폴리머 피복량의 측정 방법"에 따라 측정했다. 얻어진 친수성 폴리머 피복량을, 표 1의 "친수성 폴리머 피복량"의 란에 나타낸다.
(2) 프로테인 A 고정화 담체의 조제 - 어피니티 리간드의 도입
얻어진 담체를, 습윤 체적으로서 4mL만큼, 디스포저블 칼럼에 넣고, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 담체 슬러리를 얻었다. 이 담체 슬러리로부터, 흡인 여과에 의하여 순수를 제거하여, 웨트 젤을 얻었다.
얻어진 웨트 젤을 반응 용기에 담아, 순수로 슬러리 체적을 5mL로 한 후에, 250mM 시트르산 나트륨 버퍼(pH3.5) 1mL를 첨가했다. 추가로 160mM 과아이오딘산 나트륨 수용액 2mL를 첨가한 후, 실온에서 0.5시간 전도 교반하고, 필터 상에서 순수 및 인산 버퍼를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하고, 흡인 여과에 의하여 순수 혹은 인산 버퍼를 제거하여, 알데하이드기 도입 담체의 웨트 젤을 얻었다.
얻어진 알데하이드기 도입 담체의 웨트 젤 1.5g을 반응 용기에 담아, 20mg/mL 프로테인 A 용액 3mL를 반응 용기에 첨가하고, 실온에서 2시간, 전도 교반했다. 상기 20mg/mL 프로테인 A 용액은, 유전자 재조합 천연형 프로테인 A "rSPA"(리플리젠사제)를, 200mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid; 2-(N-모폴리노)에테인설폰산) 버퍼(pH7.4)에 용해하여 조제한 것이다.
계속해서, 트라이에틸아미노보레인 11mg을 반응 용기에 첨가하고, 25℃에서, 16시간, 흔들었다. 용매를 200mM MES 버퍼(pH7.4)로 치환하고, 세정하여, 세정액을 제거한 후에, 20mM 트리스 염산 버퍼 3mL, 트라이에틸아미노보레인 11mg을 반응 용기에 첨가하고, 실온에서 2시간, 전도 교반했다. 용매를 순수, 1M 염화 나트륨 수용액으로 치환하고, 세정하여, 프로테인 A 고정화 담체를 얻었다.
또, 얻어진 프로테인 A 고정화 담체의 프로테인 A 고정화량(어피니티 리간드 도입량)을, 상술한 "어피니티 리간드 도입량(프로테인 A 고정화량)의 측정 방법"에 따라 측정했다. 얻어진 프로테인 A 고정화량을, 표 1의 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[비교예 4]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
가교 아가로스계 기재 "세파로즈 6 패스트·플로(Sepharose 6 Fast Flow)"(GE 헬스케어사제)를, 글래스 필터 상에서, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 기재 슬러리를 얻었다. 이 기재 슬러리로부터, 흡인 여과에 의하여 순수를 제거하여, 웨트 젤을 얻었다.
얻어진 웨트 젤 12g, 클로로 아세트산 나트륨 4.7g 및 순수 24mL를 100mL용량 3구 플라스크에 넣고, 50℃의 온욕 중에서, 플라스크 내용물의 교반을 개시했다. 클로로 아세트산 나트륨이 완전하게 용해될 때까지 교반을 행했다. 용해 후, 50℃의 온욕 중에서, 플라스크 내 온도를 약 50℃로 유지하면서, 50%(w/w) 수산화 나트륨 수용액 8.8g을 1시간에 걸쳐 적하했다. 수산화 나트륨 수용액의 전체량을 적하한 후, 추가로 3시간 반응시키고, 글래스 필터 상에서, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 카복시화 담체의 웨트 젤을 얻었다.
얻어진 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 얻었다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 카복시화 담체의 카복시기 도입량 및 프로테인 A 고정 카복시화 담체의 프로테인 A 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[비교예 5]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
웨트 젤의 조제 시의 가교 아가로스계 기재를 "세파로즈 4 패스트·플로(Sepharose 4 Fast Flow)"(GE 헬스케어사제)로 변경한 점, 및 카복시화 담체의 조제 시의 클로로 아세트산 나트륨의 사용량을 4.7g에서 9.3g으로 변경한 점을 제외하고, 비교예 4와 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 제조했다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 카복시화 담체의 카복시기 도입량 및 프로테인 A 고정 카복시화 담체의 프로테인 A 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[비교예 6]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 준비
어피니티 크로마토그래피 담체로서, 프로테인 A 도입 담체 "맵셀렉트 SuRe(MabSelect SuRe)"(GE 헬스케어사제)("MABSELECT"는 등록상표)를 준비했다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
준비한 프로테인 A 도입 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[비교예 7]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
메타크릴레이트계 다공계 기재 "도요펄 HW-65F(TOYOPEARL HW-65F)"(도소사제)("도요펄" 및 "TOYOPEARL"은 등록상표)를, 글래스 필터 상에서, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 기재 슬러리를 얻었다. 이 기재 슬러리로부터, 흡인 여과에 의하여 순수를 제거하여, 웨트 젤을 얻었다.
얻어진 웨트 젤 12g, 클로로 아세트산 나트륨 3.8g 및 순수 24mL를 100mL용량 3구 플라스크에 넣고, 50℃의 온욕 중에서, 플라스크 내용물의 교반을 개시했다. 클로로 아세트산 나트륨이 완전하게 용해될 때까지 교반을 행했다. 용해 후, 50℃의 온욕 중에서, 플라스크 내 온도를 약 50℃로 유지하면서, 50%(w/w) 수산화 나트륨 수용액 8.8g을 1시간에 걸쳐 적하했다. 수산화 나트륨 수용액의 전체량을 적하한 후, 추가로 3시간 반응시키고, 글래스 필터 상에서, 순수를 이용하여 현탁 및 여과를 반복함으로써 세정하여, 카복시화 담체의 웨트 젤을 얻었다.
얻어진 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게 하여, 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 얻었다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 카복시화 담체의 카복시기 도입량 및 프로테인 A 고정 카복시화 담체의 프로테인 A 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "카복시기 도입량" 및 "어피니티 리간드 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 프로테인 A 고정 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[비교예 8]
1. 어피니티 크로마토그래피 담체의 제조
실시예 1과 동일하게 하여, 카복시화 담체의 웨트 젤을 얻었다.
얻어진 웨트 젤을 어피니티 크로마토그래피 담체로서 이용했다.
또한 실시예 1과 동일하게 하여, 친수성 폴리머 피복량 및 카복시기 도입량을 측정했다. 측정 결과를, 각각 표 1의 "친수성 폴리머 피복량" 및 "카복시기 도입량"의 란에 나타낸다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
제조한 카복시화 담체를 이용하여, 실시예 1과 동일하게, 상술한 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
[참고예 1]
1. 크로마토그래피 담체의 준비
크로마토그래피 담체로서, 설폭시기 도입 담체 "셀루파인 MAX S-r(Cellufine MAX S-r)"(JNC사제)("CELLUFINE"은 등록상표)을 준비했다.
2. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가
준비한 설폭시기 도입 담체를 이용하여, 후술하는 "항체 흡착 용량의 평가 방법" 및 "정제 순도의 평가 방법"에 따라, 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가를 행했다. 항체 흡착 용량 및 정제 순도의 평가 결과를, 각각 표 1의 "항체 흡착 용량(평가)" 및 "정제 순도(평가)"의 란에 나타낸다.
3. 설폭시기 도입량의 측정
또, 상술한 "카복시기 도입량의 측정 방법"에 준하여, 설폭시기 도입량을 측정한바, 설폭시기 도입량은, 150mmol/L-gel였다.
4. 항체 흡착 용량의 평가 방법
시판 중인 크로마토그래피 담체 1mL를 글래스 칼럼 "트리콘 10/20 칼럼(Tricorn 10/20 column)"(GE 헬스케어사제)("TRICORN"은 등록상표)에 충전하고, 크로마토 시스템 "아크타 아반트 25(AKTA avant 25)"(GE 헬스케어사제)("AKTAAVANT"는 등록상표)에 접속하여, 항체 흡착 용량의 측정을 행했다.
칼럼을 평형화액(10mM 아세트산 버퍼, pH4.7)으로 평형화한 후에, 인간 IgG 항체(Immunoglobulin G: 면역 글로불린 G)를 표준 버퍼(10mM 아세트산 버퍼, pH4.7)로 5mg/mL로 조정한 용액 30mL를 유속 0.42mL/min으로 첨가했다. 그 후, 부하 후 세정액(10mM 아세트산 버퍼, pH4.7)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보내 세정한 후에, 용출액 1(20mM 인산 버퍼, pH7.4) 및 용출액 2(20mM 인산 버퍼, 1M NaCl, pH7.4)에 의하여 염 농도를 단계적으로 올리면서 같은 유속으로 30mL 흘려 보냈다. 그 후, CIP액(0.1M 수산화 나트륨 수용액)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보내고, 계속해서 평형화액(20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보냈다. 이때, 280nm의 흡광도를 모니터링하여 얻어진 IgG 용출 피크로부터, 각 분획에 있어서의 용출액의 항체 용출량을 산출했다. 용출 전 세정액으로부터 CIP액까지 용출한 항체량을 항체 흡착 용량으로서 산출했다.
항체 흡착 용량의 평가는, 이하의 평가 기준에 따라, 카복시기와 프로테인 A만을 도입한 경우의 항체 흡착 용량을 기준으로 하여 행했다. 즉, 비교예 4를 기준으로 하여 항체 흡착 용량을 평가했다.
항체 흡착 용량이 기준의 40% 이상…항체 흡착 용량의 평가 "A"
항체 흡착 용량이 기준의 40% 미만…항체 흡착 용량의 평가 "C"
5. 정제 순도의 평가 방법
시판 중인 크로마토그래피 담체 1mL를 글래스 칼럼 "트리콘 10/20 칼럼(Tricorn 10/20 column)"(GE 헬스케어사제)("TRICORN"은 등록상표)에 충전하고, 크로마토 시스템 "아크타 아반트 25(AKTA avant 25)"(GE 헬스케어사제)("AKTAAVANT"는 등록상표)에 접속하여, 각 분획에서 용출되는 HCP(host cell protein; 숙주 세포 유래 단백질)양 및 IgG(Immunoglobulin G; 면역 글로불린 G)양의 측정을 행했다.
칼럼을 평형화액(10mM 아세트산 버퍼, pH4.7)으로 평형화한 후에, IgG, CHO-S(Chinese Hamster Ovary S) 세포 유래 HCP가, 각각 1.6mg/mL, 0.64mg/mL가 되도록 표준 버퍼(10mM 아세트산 버퍼, pH4.7)를 이용하여 조제한 IgG/HCP 혼합액을, 상술한 (1)로 얻어진 항체 흡착 용량의 8할의 항체량이 부하되는 용액량을 유속 0.21mL/min으로 첨가했다. 그 후, 용출액 1(20mM 인산 버퍼, pH7.4) 및 용출액 2(20mM 인산 버퍼, 1M NaCl, pH7.4)에 의하여 염 농도를 단계적으로 올리면서 유속 0.42mL/min으로 30mL 흘려 보냈다. 그 후, CIP액(0.1M 수산화 나트륨 수용액)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보내고, 계속해서 평형화액(20mM 인산 버퍼, 150mM NaCl, pH7.4)을 같은 유속으로 5mL 흘려 보냈다. 이때, 280nm의 흡광도를 모니터링하여 얻어진 IgG 용출 피크로부터, 각 분획에 있어서의 용출액의 IgG 용출량을 산출했다. 또, 각 분획의 용출액을 회수하고, 숙주 세포 유래 단백질 검출 키트 "CHO HCP 3rd Generation ELISA kit"(시그너스 테크놀로지즈사제)를 이용한 ELISA법에 의하여, 각 분획에 있어서의 용출액의 HCP양을 산출했다.
산출한 용출액의 IgG양 및 HCP양을 이용하여, 정제 순도는 용출액에 있어서의 HCP 혼입량, 즉, 용출액 중의 IgG양당 HCP양으로 하고, 이하의 식에 의하여 산출했다.
정제 순도(ppm)=HCP 혼입량(ppm)=용출액의 HCP양/용출액의 IgG양
정제 순도의 평가는, 이하의 평가 기준에 따라, 카복시기와 프로테인 A만을 도입한 경우의 HCP 혼입량(ppm)을 기준으로 하여 행했다. 즉, 비교예 4를 기준으로 하여 HCP 혼입량을 평가했다.
HCP 혼입량(ppm)이 20% 이상 감소했다……정제 순도의 평가 "A"
HCP 혼입량(ppm)이 0% 초과 20% 미만 감소했다…정제 순도의 평가 "B"
HCP 혼입량(ppm)이 감소하지 않는다……정제 순도의 평가 "C"
[표 1]
Figure pct00001
<결과의 설명>
실시예 1~8의 어피니티 크로마토그래피 담체는, 항체 흡착 용량 및 정제 순도가 모두 "B" 이상의 평가이며, 항체 흡착 용량 및 정제 순도 모두가 우수했다.
한편, 비교예 1~8은, 항체 흡착 용량 및 정제 순도 중 적어도 한 쪽이 "C" 평가이며, 항체 흡착 용량 및 정제 순도 중 적어도 한 쪽이 뒤떨어져 있었다.
또, 실시예 6과 실시예 8을 대비하면, 기재가 가교 아가로스계인 실시예 6의 정제 순도가 "A" 평가인 데에 대하여, 기재가 메타크릴레이트계인 실시예 8의 정제 순도는 "B" 평가인 점에서, 가교 아가로스계 기재인 쪽이 메타크릴레이트계 기재보다, 정제 순도가 우수하다는 것이 시사되었다. 또한, 친수성 폴리머 피복량이 크게 다른 실시예 1과 실시예 4에서는, 정제 순도의 평가가 모두 "A" 평가인 점에서, 실시예 6과 실시예 8의 사이에서 정제 순도의 평가가 다르게 된 원인은, 기재가 가교 아가로스계(실시예 6)인지, 메타크릴레이트계(실시예 8)인지에 의한 것이라고 생각된다.

Claims (14)

  1. 기재, 친수성 폴리머 및 어피니티 리간드를 갖는 어피니티 크로마토그래피 담체로서,
    상기 기재는 다당류, 아크릴레이트계 중합체, 메타크릴레이트계 중합체 및 스타이렌계 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지고,
    상기 친수성 폴리머는 친수성 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이며,
    상기 어피니티 리간드는 항체 결합성 단백질 및 항체 결합성 폴리펩타이드로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종이고,
    상기 어피니티 크로마토그래피 담체에는 카복시기가 도입되며,
    상기 카복시기의 도입량이 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~60mmol/L-gel인, 어피니티 크로마토그래피 담체.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 친수성 폴리머의 극한 점도가 0.10dL/g 이상인, 어피니티 크로마토그래피 담체.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 친수성 폴리머의 피복량이 3mg/g-dry gel~500mg/g-dry gel인, 어피니티 크로마토그래피 담체.
  4. 청구항 1 내지 청구항 3 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기재가 다당류, 아크릴레이트계 중합체 및 메타크릴레이트계 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지는, 어피니티 크로마토그래피 담체.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 친수성 폴리머가 덱스트란, 카복시메틸덱스트란 및 풀루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인, 어피니티 크로마토그래피 담체.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기재가 다공질 입자인, 어피니티 크로마토그래피 담체.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 어피니티 리간드가 항체와 항원항체반응을 하는, 어피니티 크로마토그래피 담체.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 어피니티 리간드가 프로테인 A 또는 그 개변체인, 어피니티 크로마토그래피 담체.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기재가 셀룰로스, 아가로스, 덱스트란, 키토산, 글루코만난 및 이들에 가교 구조를 도입한 가교 다당류로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지고,
    상기 친수성 폴리머가 덱스트란, 카복시메틸덱스트란 및 풀루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 친수성 다당류이며,
    상기 친수성 다당류의 극한 점도가 0.12dL/g~0.30dL/g이고,
    상기 친수성 폴리머의 피복량이 10mg/g-dry gel~240mg/g-dry gel이며,
    상기 카복시기의 도입량이 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~55mmol/L-gel이고,
    상기 어피니티 리간드가 프로테인 A 또는 그 개변체이며, 또한,
    상기 어피니티 리간드의 도입량이 0.10mmol/L-gel~1.0mmol/L-gel인, 어피니티 크로마토그래피 담체.
  10. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 기재가 아크릴레이트계 중합체 및 메타크릴레이트계 중합체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종으로 이루어지고,
    상기 친수성 폴리머가 덱스트란, 카복시메틸덱스트란 및 풀루란으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 친수성 다당류이며,
    상기 친수성 다당류의 극한 점도가 0.12dL/g~0.30dL/g이고,
    상기 친수성 폴리머의 피복량이 10mg/g-dry gel~240mg/g-dry gel이며,
    상기 카복시기의 도입량이 이온 교환 용량으로 15mmol/L-gel~55mmol/L-gel이고,
    상기 어피니티 리간드가 프로테인 A 또는 그 개변체이며, 또한,
    상기 어피니티 리간드의 도입량이 0.10mmol/L-gel~1.0mmol/L-gel인, 어피니티 크로마토그래피 담체.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 기재된 어피니티 크로마토그래피 담체를 이용한 생체 물질의 정제 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 생체 물질의 첨가 시 pH가 5.0~9.0인, 정제 방법.
  13. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 생체 물질의 용출 시 pH가 2.0~5.0인, 정제 방법.
  14. 청구항 11 내지 청구항 13 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 생체 물질이 항체 또는 항체 유도체인, 정제 방법.
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