CN108139371A - 亲和层析载体及生物物质的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种纯化纯度优异的亲和层析载体。上述亲和层析载体具有基材、亲水性聚合物及亲和配体，上述基材包含选自包括多糖类、丙烯酸酯类聚合物、甲基丙烯酸酯类聚合物及苯乙烯类聚合物的组中的至少1种，上述亲水性聚合物为选自包括亲水性多糖类的组中的至少1种，上述亲和配体为选自包括抗体结合性蛋白质及抗体结合性多肽的组中的至少1种，上述亲和层析载体中导入有羧基，上述羧基的导入量以离子交换容量计为15mmol/L‑gel～60mmol/L‑gel。

Description

亲和层析载体及生物物质的纯化方法
技术领域
本发明涉及一种亲和层析载体及生物物质的纯化方法。
背景技术
近年来，随着基因工程、蛋白质工程及细胞工程的发展，被称作抗体医药品的利用抗体所具有的功能的医药品的研发活跃进行。与现有的医药品相比，抗体医药品对靶分子更具特异性地发挥作用，因此可期待进一步减轻副作用且得到高疗效，实际上有助于改善各种病情。
另一方面，抗体医药品大量给药于活体，因此与其他重组蛋白质医药品相比时，其纯度对品质带来的影响大。抗体医药品是纯化通过基因重组在宿主细胞中显现的抗体来制造的，因此源自宿主细胞及制造工序的杂质的混入成为问题。例如，在抗体医药品中作为杂质而残留的宿主细胞蛋白(HCP；Host Cell Protein)被怀疑与抗体医药品给药时的过敏症状有关联，因此要求改善纯化纯度，减少杂质。
例如，专利文献1中，作为适于分离纯化蛋白质制剂等的的层析载体，公开有在多孔性纤维素类凝胶上加成次硫酸基(sulfoxy group)作为配体而成的层析载体，该多孔性纤维素类凝胶是在多孔性纤维素粒子上加成具有特性粘度0.21dL/g～0.90dL/g的多糖类而成的，其特征在于，多孔性纤维素类凝胶的每单位体积的干燥重量为多孔性纤维素粒子的每单位体积的干燥重量的1.06倍～1.40倍。
并且，例如，专利文献2中记载有将亲和层析载体利用于来自包括活体成分或重组体的微生物及哺乳类细胞的培养细胞的有用物质的高效分离纯化，所述亲和层析载体是将具有特异性地结合于特定分子的功能的亲和配体固定于水不溶性载体而成，作为实现了抗体纯化的高纯度化的亲和层析载体，公开有在同一载体上具有亲和配体和阳离子交换基团的亲和层析载体。
以往技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2010/095673号
专利文献2：国际公开第2014/034457号
发明内容
发明要解决的技术课题
本发明人对专利文献1中所记载的阳离子交换层析载体进行了研究，其结果得知，如本说明书中所记载的参考例1所示，抗体吸附容量优异，但在纯化纯度方面有改善的余地。
并且，本发明人对专利文献2中所记载的亲和层析载体进行了研究，其结果认为在同一载体上具有亲和配体和阳离子交换基团的亲和层析载体有利，并且得知如本说明书中所记载的比较例4及比较例5所示，抗体吸附容量优异，但在纯化纯度方面有改善的余地。
因此，本发明的目的在于提供一种抗体吸附容量及纯化纯度优异的亲和层析载体。
用于解决技术课题的手段
本发明人为了实现上述目的而重复进行了深入研究，其结果得知，若在具有基材、亲水性聚合物及亲和配体的亲和层析载体中，基材包含选自包括多糖类、丙烯酸酯类聚合物、甲基丙烯酸酯类聚合物及苯乙烯类聚合物的组中的至少1种，亲水性聚合物为选自包括亲水性多糖类的组中的至少1种，亲和配体为选自包括抗体结合性蛋白质及抗体结合性多肽的组中的至少1种，亲和层析载体中导入有羧基，羧基的导入量以离子交换容量计为15mmol/L-gel～60mmol/L-gel，则抗体吸附容量及纯化纯度优异，并完成了本发明。
即，本发明提供以下[1]～[14]。
[1]一种亲和层析载体，其具有基材、亲水性聚合物及亲和配体，上述亲和层析载体中，
上述基材包含选自包括多糖类、丙烯酸酯类聚合物、甲基丙烯酸酯类聚合物及苯乙烯类聚合物的组中的至少1种，
上述亲水性聚合物为选自包括亲水性多糖类的组中的至少1种，
上述亲和配体为选自包括抗体结合性蛋白质及抗体结合性多肽的组中的至少1种，
上述亲和层析载体中导入有羧基，
上述羧基的导入量以离子交换容量计为15mmol/L-gel～60mmol/L-gel。
[2]根据上述[1]所述的亲和层析载体，其中，
上述亲水性聚合物的特性粘度为0.10dL/g以上。
[3]根据上述[1]或[2]所述的亲和层析载体，其中，
上述亲水性聚合物的包覆量为3mg/g-dry gel～500mg/g-dry gel。
[4]根据上述[1]～[3]中任一项所述的亲和层析载体，其中，
上述基材包含选自包括多糖类、丙烯酸酯类聚合物及甲基丙烯酸酯类聚合物的组中的至少1种。
[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的亲和层析载体，其中，
上述亲水性聚合物为选自包括葡聚糖、羧甲基葡聚糖及短梗霉聚糖的组中的至少1种。
[6]根据上述[1]～[5]中任一项所述的亲和层析载体，其中，
上述基材为多孔粒子。
[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的亲和层析载体，其中，
上述亲和配体与抗体进行抗原抗体反应。
[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的亲和层析载体，其中，
上述亲和配体为蛋白A或其变体。
[9]根据上述[1]～[8]中任一项所述的亲和层析载体，其中，
上述基材包含选自包括纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、葡甘露聚糖及向它们中导入交联结构而成的交联多糖类的组中的至少1种，
上述亲水性聚合物为选自包括葡聚糖、羧甲基葡聚糖及短梗霉聚糖的组中的至少1种亲水性多糖类，
上述亲水性多糖类的特性粘度为0.12dL/g～0.30dL/g，
上述亲水性聚合物的包覆量为10mg/g-dry gel～240mg/g-dry gel，
上述羧基的导入量以离子交换容量计为15mmol/L-gel～55mmol/L-gel，
上述亲和配体为蛋白A或其变体，且
上述亲和配体的导入量为0.10mmol/L-gel～1.0mmol/L-gel。
[10]根据上述[1]～[8]中任一项所述的亲和层析载体，其中，
上述基材包含选自包括丙烯酸酯类聚合物及甲基丙烯酸酯类聚合物的组中的至少1种，
上述亲水性聚合物为选自包括葡聚糖、羧甲基葡聚糖及短梗霉聚糖的组中的至少1种亲水性多糖类，
上述亲水性多糖类的特性粘度为0.12dL/g～0.30dL/g，
上述亲水性聚合物的包覆量为10mg/g-dry gel～240mg/g-dry gel，
上述羧基的导入量以离子交换容量计为15mmol/L-gel～55mmol/L-gel，
上述亲和配体为蛋白A或其变体，且
上述亲和配体的导入量为0.10mmol/L-gel～1.0mmol/L-gel。
[11]一种生物物质的纯化方法，上述纯化方法使用了上述[1]～[10]中任一项所述的亲和层析载体。
[12]根据上述[11]所述的纯化方法，其中，
上述生物物质的添加时pH为5.0～9.0。
[13]根据上述[11]或[12]所述的纯化方法，其中，
上述生物物质的洗脱时pH为2.0～5.0。
[14]根据上述[11]～[13]中任一项所述的纯化方法，其中，
上述生物物质为抗体或抗体衍生物。
发明效果
根据本发明，可提供一种抗体吸附容量及纯化纯度优异的亲和层析载体。
具体实施方式
本发明的亲和层析载体通过具有作为选自包括抗体结合性蛋白质及抗体结合性多肽的组中的至少1种的亲和配体和作为阳离子交换基团的羧基这两者，且将羧基的导入量以离子交换容量计设在15mmol/L-gel～60mmol/L-gel的范围内，能够减少非特异性吸附量，从而能够改善纯化纯度。并且，与次硫酸基相比，羧基的离子强度更低，能够抑制非特异性吸附，因此有利。
以下，对本发明的亲和层析载体及其制造方法进行详细说明。
另外，关于数值范围，“～”左右的数值包括在该数值范围内。
[亲和层析载体]
本发明的亲和层析载体为具有基材、亲水性聚合物及亲和配体的亲和层析载体，其中，上述基材包含选自包括多糖类、丙烯酸酯类聚合物、甲基丙烯酸酯类聚合物及苯乙烯类聚合物的组中的至少1种，上述亲水性聚合物为选自包括多糖类的组中的至少1种，上述亲和配体为选自包括抗体结合性蛋白质及抗体结合性多肽的组中的至少1种，上述亲和层析载体中导入有羧基，上述羧基的导入量以离子交换容量计为15mmol/L-gel～60mmol/L-gel。
＜基材＞
基材为选自包括多糖类、丙烯酸酯类聚合物、甲基丙烯酸酯类聚合物及苯乙烯类聚合物的组中的至少1种，优选为选自多糖类、丙烯酸酯类聚合物及甲基丙烯酸酯类聚合物中的至少1种，更优选为选自多糖类中的至少1种。并且，基材可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
多糖类并没有特别限定，例如可以举出纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、葡甘露聚糖等天然多糖类及向这些天然多糖类中导入交联结构而成的交联多糖类等。交联多糖类例如能够通过使用环氧氯丙烷、(聚)亚烷基二醇二缩水甘油醚、亚烷基二异氰酸酯等交联剂，对天然多糖类所具有的羟基导入交联结构来进行制造。
多糖类优选为选自纤维素、交联纤维素、琼脂糖及交联琼脂糖中的至少1种，更优选为选自琼脂糖及交联琼脂糖中的至少1种。
丙烯酸酯类聚合物并没有特别限定，例如可以举出将丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸羟基乙酯、丙烯酸羟基丙酯、丙烯酸丁酯、丙烯酸硬脂基酯、丙烯酸2-乙基己酯、丙烯酸环己酯、单丙烯酸甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸4,5-环氧基丁酯、丙烯酸9,10-环氧基硬脂基酯等丙烯酸酯中的1种进行聚合而成的聚合物、将2种以上共聚而成的共聚物、将丙烯酸酯中的1种以上与丙烯酸酯以外的含乙烯基化合物中的1种以上进行共聚而成的共聚物等。其中，作为丙烯酸酯以外的含乙烯基化合物，例如可以举出乙烯、丙烯等单乙烯基化合物、二乙烯基苯、三乙烯基苯等芳香族聚乙烯基化合物、丁二烯、亚甲基双丙烯酰胺、异氰脲酸三烯丙酯等聚乙烯基化合物。也可以使用环氧氯丙烷、(聚)亚烷基二醇二缩水甘油醚、亚烷基二异氰酸酯等交联剂，对这些聚合物或共聚物导入交联结构。
甲基丙烯酸酯类聚合物并没有特别限定，例如可以举出将甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、甲基丙烯酸羟基乙酯、甲基丙烯酸羟基丙酯、甲基丙烯酸丁酯、甲基丙烯酸硬脂基酯、甲基丙烯酸2-乙基己酯、甲基丙烯酸环己酯、单甲基丙烯酸甘油酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸4,5-环氧基丁酯、甲基丙烯酸9,10-环氧基硬脂基酯等甲基丙烯酸酯中的1种进行聚合而成的聚合物、将2种以上进行共聚而成的共聚物、将甲基丙烯酸酯中的1种以上与甲基丙烯酸酯以外的含乙烯基化合物中的1种以上进行共聚而成的共聚物等。作为甲基丙烯酸酯以外的含乙烯基化合物，例如可以举出乙烯、丙烯等单乙烯基化合物、二乙烯基苯、三乙烯基苯等芳香族聚乙烯基化合物、丁二烯、亚甲基双丙烯酰胺、异氰脲酸三烯丙酯等聚乙烯基化合物。也可以使用环氧氯丙烷、(聚)亚烷基二醇二缩水甘油醚、亚烷基二异氰酸酯等交联剂，对这些聚合物或共聚物导入交联结构。
苯乙烯类聚合物并没有特别限定，例如可以举出将苯乙烯、甲基苯乙烯、乙基苯乙烯、羟基苯乙烯、氯苯乙烯等苯乙烯类化合物中的1种进行聚合而成的聚合物、将2种以上进行聚合而成的共聚物、将苯乙烯类化合物中的1种以上与苯乙烯类化合物以外的含乙烯基化合物中的1种以上进行共聚而成的共聚物等。作为苯乙烯类化合物以外的含乙烯基化合物，例如可以举出乙烯、丙烯等单乙烯基化合物、二乙烯基苯、三乙烯基苯等芳香族聚乙烯基化合物、丁二烯、亚甲基双丙烯酰胺、异氰脲酸三烯丙酯等聚乙烯基化合物。也可以使用环氧氯丙烷、(聚)亚烷基二醇二缩水甘油醚、亚烷基二异氰酸酯等交联剂，对这些聚合物或共聚物导入交联结构。
基材优选为多孔粒子或多孔膜。通过基材为多孔粒子或多孔膜，表面积变大，能够加大每单位时间的处理容量。
并且，基材为多孔粒子或多孔膜时的细孔容积并没有特别限定，利用压汞仪测定的细孔容积优选为0.2mL/g～10mL/g，更优选在0.2mL/g～5.0mL/g的范围内。若细孔容积在该范围内，则改善抗体吸附容量及纯化纯度。并且，机械强度不会降低。
并且，基材为多孔粒子或多孔膜时的比表面积并没有特别限定，通过BET
(Brunauer、Emmett、Teller：布鲁诺-埃梅特-特勒)法测定的比表面积(BET比表面积)优选为2m2/g～1500m2/g，更优选在5m2/g～1000m2/g的范围内。若比表面积在该范围内，则改善抗体吸附容量及纯化纯度。
并且，基材为多孔粒子时的平均粒径并没有特别限定，优选为0.5μm～1000μm，更优选为1μm～250μm，进一步优选在2μm～150μm的范围内。若平均粒径在该范围内，则填充于柱中并进行通液时的压力损失小，能够提高通液速度而提高处理效率，并且改善抗体吸附容量及纯化纯度。另外，多孔粒子的平均粒径能够利用已知的方法进行测定。例如，通过利用光学显微镜测定100个以上的粒径，并从其分布计算体积中值粒径来得到平均粒径。
作为基材的市售品，例如可以举出作为琼脂糖类载体的SEPHAROSE系列(GEHealthcare公司制造)(“SEPHAROSE”为注册商标)、作为纤维素类交联载体的CELLUFINE系列(JNC Corporation制造)(“CELLUFINE”为注册商标)、作为烯丙基葡聚糖与N,N’-亚甲基双丙烯酰胺的交联聚合物的SEPHACRYL系列(GE Healthcare公司制造)(“SEPHACRYL”为注册商标)、作为丙烯酸酯类载体的TOYOPEARL HW系列(TOSOH CORPORATION制造)(“TOYOPEARL”为注册商标)等，但并不限定于这些。
＜亲水性聚合物＞
亲水性聚合物为选自包括亲水性多糖类的组中的至少1种。并且，亲水聚合物可以单独使用1种，也可以组合使用2种以上。
另外，在本发明中，对于聚合物或多糖类，亲水性是指包含至少1种亲水性基团。所谓亲水性基团，可以优选举出羧基、羧基的碱金属盐、次硫酸基、次硫酸基的碱金属盐、羟基、酰胺基、氨甲酰基、磺酰胺基、氨磺酰基、磷酸基、磷酸基的碱金属盐、氧磷酸基(oxyphosphoric group)、氧磷酸基的碱金属盐等官能团。这些亲水性基团可以存在于聚合物中的任何位置，例如可以直接或经由连接基团结合于聚合物侧链，也可以结合于聚合物侧链或接枝侧链。并且，亲水性基团在1个分子中优选存在多个。
亲水性多糖类并没有特别限定，从改善纯化纯度的效果高的角度来看，优选为选自葡聚糖、羧甲基葡聚糖及短梗霉聚糖中的至少1种，更优选为葡聚糖。
通过以亲水性聚合物包覆基材，增加本发明的亲和层析载体表面的亲水性，抑制非特异性吸附物的吸附，因此具有改善纯化纯度的效果。
亲水性聚合物的分子量并没有特别限定，以特性粘度计优选为0.10dL/g以上，更优选为0.10dL/g～0.90dL/g，进一步优选为0.12dL/g～0.90dL/g，进一步优选为0.12dL/g～0.30dL/g，更进一步优选在0.17dL/g～0.25dL/g的范围内。若特性粘度在该范围内，则纯化纯度进一步提高。另外，特性粘度能够通过依照第16版改正日本药典中收录的一般测定法中的粘度测定法、第1法“毛细管粘度计法”求出多个不同浓度的高分子溶液的粘度来测定粘度的浓度依赖性，并将所得到的直线的浓度外插于0而求出。
高分子的特性粘度η与分子量M之间，下述马克-霍温克-樱田方程式(Mark-Houwink-Sakurada equation)成立，因此若利用直接测定方法求出若干个试样的分子量，并根据分子量和各自的特性粘度值预先确定K和α，则对于相同种类的高分子，可通过测定特性粘度η而求出分子量M，通过测定分子量M而求出特性粘度η。
η＝KMα
其中，K及α为根据高分子的种类、溶剂的种类及温度来确定的常数。
例如，已知葡聚糖的特性粘度(ηDextran)与重均分子量(MwDextran)满足下述关系式。
ηDextran[dL/g]＝9×10-4×MwDextran 0.5[dL/g]
亲水性聚合物的包覆量(以下，有时简称为“亲水性聚合物包覆量”。)并没有特别限定，优选为3mg/g-dry gel～500mg/g-dry gel，更优选为3mg/g-dry gel～350mg/g-drygel，进一步优选为10mg/g-dry gel～300mg/g-dry gel，进一步优选为20mg/g-dry gel～240mg/g-dry gel。若亲水性聚合物包覆量在该范围内，则能够适当增加本发明的亲和层析载体表面的亲水性而抑制非特异性吸附物的吸附，并且抗体扩散渗透到基材中的机会多而抗体吸附容量变大，因此可进一步改善纯化纯度。另外，亲水性聚合物无需覆盖基材的整个表面，只要覆盖基材的至少一部分即可。
另外，亲水性聚合物包覆量[单位：mg/g-dry gel]为将包覆的亲水性聚合物的干燥重量(WP)[单位：mg]除以包覆前基材的干燥重量(W0)[单位：g-dry gel]而得到的值。并且，亲水性聚合物的干燥重量(WP)为载体总量的干燥重量(W1)与包覆前基材的干燥重量(W0)之差(W1-W0)[单位：mg]。
因此，亲水性聚合物包覆量能够通过以下式求出。
亲水性聚合物包覆量(mg/g-dry gel)＝WP/W0＝(W1-W0)/W0
上述包覆前基材的干燥重量(W0)能够以如下方式进行计算。
W0＝W0，xg×w0/x
其中，
W0，xg：包覆前基材的湿凝胶xg的干燥重量
w0：亲水性聚合物包覆反应中所使用的包覆前基材的湿凝胶总重量
x：干燥中所使用的包覆前基材的湿凝胶重量(xg)
上述载体总量的干燥重量(W1)也能够以相同的方式进行计算。
＜亲和配体＞
亲和配体为选自包括抗体结合性蛋白质及抗体结合性多肽的组中的至少1种，优选为选自抗体结合性蛋白质中的至少1种。
在本发明中，多肽是含有包含2个残基～50个残基的氨基酸残基的肽链的分子，是指分子量大致小于5000的分子。并且，在本发明中，蛋白质是含有包含51个残基以上的氨基酸残基的肽链的分子，是指分子量大致为5000以上的分子。
抗体结合性蛋白质只要是通过抗原抗体反应与抗体结合的蛋白质，则并没有特别限定，例如可以举出蛋白A、蛋白G、蛋白L、蛋白D、蛋白A变体等。作为抗体结合性蛋白质，优选蛋白A或其变体。作为蛋白A变体，优选耐碱性型蛋白A。
抗体结合性多肽只要是通过抗原抗体反应与抗体结合的多肽，则并没有特别限定，例如可以举出具有与蛋白A的抗体结合域的氨基酸序列的一部分相同的氨基酸序列的多肽及其变体等。作为抗体结合性多肽变体，优选耐碱性型变体。
本发明的亲和层析载体的亲和配体的导入量(以下，有时简称为“亲和配体导入量”。)并没有特别限定，优选为0.01mmol/L-gel～100mmol/L-gel，更优选为0.05mmol/L-gel～50mmol/L-gel，进一步优选为0.10mmol/L-gel～10mmol/L-gel，进一步优选为0.10mmol/L-gel～2.0mmol/L-gel，更进一步优选为0.10mmol/L-gel～1.0mmol/L-gel，更进一步优选为0.10mmol/L-gel～0.50mmol/L-gel。
＜羧基＞
本发明的亲和层析载体的羧基的导入量(以下，有时简称为“羧基导入量”。)以离子交换容量计为15mmol/L-gel～60mmol/L-gel，优选为15mmol/L-gel～55mmol/L-gel，更优选为15mmol/L-gel～40mmol/L-gel。若羧基导入量在该范围内，则能够将亲和配体导入量设在适当的范围内，改善抗体吸附容量。并且，能够抑制非特异性吸附物的吸附。
[亲和层析载体的制造方法]
本发明的亲和层析载体能够通过以亲水性聚合物包覆基材，并导入羧基，进一步导入亲和配体来进行制造。
基材、亲水性聚合物及亲和配体如已在“亲和层析载体”中所记载的那样。
＜基于亲水性聚合物的包覆＞
以亲水性聚合物包覆基材。
以亲水性聚合物包覆基材的方法只要能够将亲水性聚合物通过共价键而结合于基材，则并没有特别限定，例如可以举出使氯甲基环氧乙烷(环氧氯丙烷)与基材进行反应而导入环氧基，并与亲水性聚合物进行反应的方法；在溶剂中，在碱的存在下使基材与如氯甲基环氧乙烷(环氧氯丙烷)之类的交联剂进行反应，并使所得到的反应产物与亲水性聚合物进行反应的方法；使用卤化剂将氯基等卤素基导入到基材中，使用威廉姆孙醚合成法将亲水性聚合物固定化的方法等。
在以亲水性聚合物包覆基材时，亲水性聚合物包覆量优选为3mg/g-dry gel～500mg/g-dry gel，更优选为3mg/g-dry gel～350mg/g-dry gel，进一步优选为10mg/g-drygel～300mg/g-dry gel，进一步优选为20mg/g-dry gel～240mg/g-dry gel。
另外，在本说明书中，有时将即将以包覆亲水性聚合物之前的基材称为“包覆前基材”，将对该包覆前基材包覆了亲水性聚合物的称为“载体”。
＜羧基的导入＞
向载体中导入羧基。
向载体中导入羧基的方法只要能够将具有羧基的化合物通过共价键结合于载体，则并没有特别限定，例如可以举出在碱条件下使氯乙酸与载体进行反应而向载体表面的羟基的一部分中导入羧基甲基的方法；向载体中导入醛基，利用还原氨基化法，经由氨基酸等具有羧基及氨基的化合物的氨基向醛基中导入羧基的方法等。
在向载体中导入羧基时，羧基导入量以离子交换容量计为15mmol/L-gel～60mmol/L-gel，优选为15mmol/L-gel～55mmol/L-gel，更优选为15mmol/L-gel～40mmol/L-gel。
另外，在本说明书中，有时将向载体中导入了羧基的载体称为“羧基化载体”。
＜亲和配体的导入＞
向羧基化载体中导入(固定化)亲和配体。
向羧基化载体中导入(固定化)亲和配体的方法只要能够将亲和配体通过共价键结合于羧基化载体，则并没有特别限定，例如可以举出将羧基的一部分进行EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide；N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺)/NHS(N-hydroxysuccinimide；N-羟基琥珀酰亚胺)化，使其与蛋白A等亲和配体进行反应，反应后再生未反应的EDC/NHS化的羧基的方法；在蛋白A等具有氨基的亲和配体的情况下，保护羧基而导入醛基，利用还原氨基化法，经由氨基向醛基中导入亲和配体的方法等。
在向羧基化载体中导入亲和配体时，亲和配体的导入量优选为0.01mmol/L-gel～100mmol/L-gel，更优选为0.05mmol/L-gel～50mmol/L-gel，进一步优选为0.10mmol/L-gel～10mmol/L-gel，进一步优选为0.10mmol/L-gel～2.0mmol/L-gel，更进一步优选为0.10mmol/L-gel～1.0mmol/L-gel，更进一步优选为0.10mmol/L-gel～0.50mmol/L-gel。
另外，将亲和配体结合于羧基化载体的羧基的一部分时的亲和层析载体的羧基导入量以“羧基化载体的羧基导入量-亲和层析载体的亲和配体导入量”来表示。
[生物物质的纯化方法、通过该纯化方法纯化的生物物质]
＜生物物质＞
利用本发明的亲和层析载体进行纯化的生物物质并没有特别限定，但优选为抗体或抗体衍生物，更优选为免疫球蛋白G或其衍生物。
抗体是指免疫球蛋白或其类似物、片段或融合体。其中，类似物是指免疫球蛋白的结构或功能至少局部得到保持的天然或人工制作的蛋白质或蛋白质缀合物。并且，片段是指通过酶处理或基因工程设计而制作的具有免疫球蛋白的部分结构的蛋白质。并且，融合体包括将作为免疫球蛋白分子的恒定区的Fc(Fragment crystallizable，可结晶片段)区和其他功能性蛋白质或肽融合而成的Fc融合蛋白质(含Fc分子)。另外，在本发明中，免疫球蛋白可以为IgG(Immunoglobulin G；免疫球蛋白G)、IgM(Immunoglobulin M；免疫球蛋白M)、IgA(Immunoglobulin A；免疫球蛋白A)、IgD(Immunoglobulin D；免疫球蛋白D)及IgE(Immunoglobulin E；免疫球蛋白E)这5种类别(同种型)中的任意一种，优选IgG或IgM，更优选IgG。
并且，抗体衍生物是指人免疫球蛋白的Fc区与非人类哺乳动物免疫球蛋白的Fab区融合的嵌合抗体、人免疫球蛋白的若干个Fc区与非人类哺乳动物免疫球蛋白的若干个Fv区融合的嵌合抗体、除去人免疫球蛋白的CDR(Complementarity Determining Region；互补决定区)部分的剩余部分与非人类哺乳动物免疫球蛋白CDR部分融合的人源化抗体、非人类哺乳动物免疫球蛋白的Fc区与人免疫球蛋白的Fab(Fragment，antigen binding；抗原结合片段)区融合的嵌合抗体、非人类哺乳动物免疫球蛋白的若干个Fc区与人免疫球蛋白的若干个Fv区融合的嵌合抗体、除去人免疫球蛋白的CDR部分的剩余部分与非人类哺乳动物免疫球蛋白的CDR部分融合的非人类哺乳动物化抗体、非人类哺乳动物免疫球蛋白的Fc区与非人类哺乳动物免疫球蛋白的Fab区融合的嵌合抗体、非人类哺乳动物免疫球蛋白的若干个Fc区与非人类哺乳动物免疫球蛋白的若干个Fv区融合的嵌合抗体、除去非人类哺乳动物免疫球蛋白的CDR(Complementarity Determining Region；互补决定区)部分的剩余部分与非人类哺乳动物免疫球蛋白CDR部分融合的非人类哺乳动物型抗体、以及施加了它们的化学修饰的保持Fc区的蛋白质。
它们用作抗体医药品的原料。
＜纯化方法＞
以下，对于生物物质为免疫球蛋白G的情况，例示出使用了本发明的亲和层析载体的纯化方法的详细说明，但本发明并不限定于此。
使用了亲和层析载体的生物物质(尤其是抗体)的纯化大体由吸附工序、清洗工序、离子强度调节工序、洗脱工序这4个工序构成，此外还可以包括其后的再生工序和/或CIP(cleaning-in-place；定置清洗)工序、再平衡化工序等用于再利用的工序。
在吸附工序中，能够使用一般的亲和层析纯化方法。即，在其一例中，调整包含免疫球蛋白G的蛋白质溶液的pH成为中性附近之后，使该溶液通过填充有本发明的亲和层析载体的柱中，经由亲和配体使免疫球蛋白G特异性吸附于亲和层析载体。例如，在将蛋白A作为亲和配体时，其载样pH即生物物质的添加时pH优选为5.0～9.0，更优选为5.3～9.0，进一步优选为5.5～9.0，进一步优选为6.0～8.5。在利用哺乳类培养细胞生产的免疫球蛋白G的纯化中，无需特意进行离子强度的调节，而且还能够预先提高离子强度而抑制非特异吸附。
在清洗工序中，使亲和配体发挥作用的条件范围的缓冲液适量通过以清洗柱内部。即，pH的优选范围可以在与所述载样时相同的范围内，例如优选为pH5.0～9.0。在该时点，免疫球蛋白G已吸附于本发明的亲和层析载体。此时，在中性附近的pH下通过离子强度或组合物的最优化，有时能够有效地去除杂质。在清洗时，优选为羧基不发挥作用的条件，即，优选设为中性附近的pH并且利用一定以上的离子强度的清洗液，在该过程中能够清洗经由亲和层析载体和/或免疫球蛋白G非特异性地残留于柱中的杂质。离子强度例如优选为0.2M以上，更优选为0.5M以上。
在离子强度调节工序中，用中性附近且离子强度低的缓冲液置换柱，为在洗脱时基于羧基的离子强度依赖的洗脱功能的显现而做准备。
在洗脱工序中，通过酸性pH、离子强度的组合，在从亲和配体洗脱时，使阳离子交换分离模式发挥功能，在两种配体的协同作用下，能够将单体含量高的级分回收于低离子强度洗脱级分中。洗脱液的pH能够适用免疫球蛋白G从亲和配体洗脱时的pH。该pH由于以根据亲和层析载体和免疫球蛋白G的种类而确定的分离条件为中心来确定，因此不需要特别的条件设定。
在亲和配体中使用蛋白A的情况下，洗脱时pH优选设定为2.0～5.0。但是，出于避免生物物质的酸变性的目的，更优选为pH2.8以上，进一步优选为pH3.0以上，进一步优选为pH3.2以上。pH优选为5.0以下，更优选为4.8以下。
在亲和配体中使用碱耐性型蛋白A的情况下，一般而言，洗脱时pH优选设定为3.5～4.0，但并不限定于此。并且，洗脱离子强度依赖于亲和配体与羧基的导入比率，而且还依赖于每单位体积的免疫球蛋白G的载样量，能够通过梯度实验或逐步洗脱实验容易设定最优化点。
从通过本发明制备的亲和层析载体的抗体洗脱无论是盐浓度梯度洗脱还是逐步洗脱均能够适用，但在以减少洗脱液量为目的的情况下，优选基于离子强度的逐步洗脱。另外，为了简化操作，优选设定能够实现基于一步洗脱的抗体回收和高纯化纯度的条件。
另外，在即使进行清洗工序的离子强度与酸性pH的组合，凝聚体也残留于柱而不会混入到洗脱级分中的情况下，可以省略离子强度调节工序。
＜纯化的生物物质＞
通过本发明的纯化方法纯化的生物物质、尤其是抗体或抗体衍生物在纯化前后其本身的结构、特性没有变化，但纯化纯度提高。但是，提高哪种程度则依赖于纯化前的溶液等，因此不可以一概而论。
使用通过本发明制备的亲和层析载体而纯化的免疫球蛋白G显出比基于单一分离模式的亲和层析载体更高的单体选择性，其洗脱液中的单体含量高。
在使用基于单一分离模式的亲和层析载体的情况下，也能够通过洗脱时pH及离子强度等的最优化来稍微提高单体含量，但其效果低，其效果的显现伴随更大的回收率的降低。通过使用本发明的亲和层析载体，能够在维持高回收率的状态下，通过单一层析操作高效地实现特异性高的亲和纯化和可主要通过阳离子交换层析而实现的单体含量的提高，因此，能够减少后段工艺的载样，能够有助于整个工艺的收率的提高和单体含量的提高。即，通过使用本发明的新型亲和层析载体，能够有助于抗体医药品的制造工艺的生产率的提高和高纯度化。
实施例
以下，举出实施例对本发明进一步进行详细说明，但本发明并不受它们的任何限制。
[测定方法及评价方法]
1.亲水性聚合物包覆量的测定方法
将包覆前基材的湿凝胶5g在50℃下减压干燥直至无重量变化并测定重量，根据其与亲水性聚合物包覆反应中所使用的包覆前基材的湿凝胶重量的乘积，设为包覆前基材的干燥重量。接着，将在包覆前基材上包覆亲水性聚合物而得到的载体的湿凝胶5g在50℃下减压干燥直至无重量变化并测定重量，根据其与在亲水性聚合物包覆反应后所得到的载体的湿凝胶重量的乘积，设为载体的干燥重量。将载体的干燥重量与包覆前基材的干燥重量之差设为包覆着包覆前基材的亲水性聚合物的干燥重量。将亲水性聚合物包覆量作为包覆前基材的每单位干燥重量的亲水性聚合物的干燥重量进行计算。
2.羧基导入量的测定方法
将羧基化载体1g悬浮于3mL的纯水中，并注入到内径15mm的一次性柱中，通过抽滤去除了溶剂。用0.2mol/L的盐酸3mL清洗4次，然后用纯水4mL重复清洗。清洗后，通过测定头部(堆积在柱上的载体部分)高度来计算出羧基化载体的体积。取出羧基化载体，移到100mL容量的烧杯中，悬浮于40mL的0.1mol/L的食盐水中，使用自动滴定装置“COM-1600”(HIRANUMA SANGYO Co.,Ltd.制造)用0.1mol/L的氢氧化钠水溶液进行了滴定。根据终点为止的滴定液量计算出羧基化载体每1L的离子交换容量(meq/L-gel)。另外，将单位换算成“mmol/L-gel”(1meq/L-gel＝1mmol/L-gel)。羧基导入量以离子交换容量来表示。
3.亲和配体导入量(蛋白A固定化量)的测定方法
对蛋白A固定化反应后的蛋白A液、反应液及清洗液分别实施凝胶过滤层析(下述)，根据在280nm下的吸光度的峰面积值计算出各溶液中所包含的蛋白A量。
根据与蛋白A固定化反应前的蛋白A液、反应液及清洗液中所包含的蛋白A量之差计算出蛋白A固定化量。
(凝胶过滤层析的条件)
层析系统：AKTA avant 25(GE Healthcare公司制造)(“AKTAAVANT”为注册商标)
柱：脱盐柱“HiTrap Desalting”(GE Healthcare公司制造)(“HITRAP”为注册商标)
缓冲液：20mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4
流速：3mL/min
4.抗体吸附容量的评价方法
(1)抗体吸附容量的测定
将实施例中制造出的亲和层析载体、比较例中制造出的层析载体或市售的层析载体1mL填充于玻璃柱“Tricorn 10/20column”(GE Healthcare公司制造)(“TRICORN”为注册商标)中，并连接于层析系统“AKTA avant 25”(GE Healthcare公司制造)(“AKTAAVANT”为注册商标)，进行了抗体吸附容量的测定。
用平衡液(20mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4)使柱平衡化之后，以流速0.42mL/min添加了用标准缓冲液(20mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4)将人IgG抗体(Immunoglobulin G：免疫球蛋白G)调整为5mg/mL的溶液15mL。然后，将载样后清洗液(20mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4)以相同的流速流放5mL进行清洗之后，将洗脱前清洗液(20mM磷酸缓冲液，1M NaCl，pH7.4)以相同的流速流放了5mL。然后，将洗脱液(100mM柠檬酸缓冲液，150mM NaCl，pH3.2)以相同的流速流放了5mL。另外，接着将定置清洗(CIP；cleaning in place)液(0.1M氢氧化钠水溶液)以相同的流速流放5mL，然后将再平衡液(20mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4)以相同的流速流放了5mL。此时，根据监测280nm的吸光度而得到的IgG洗脱峰，计算出各级分中的洗脱液的抗体洗脱量。从洗脱前清洗液洗脱至CIP液中的抗体量作为抗体吸附容量进行了计算。
(2)抗体吸附容量的评价
抗体吸附容量的评价是按照以下的评价基准，以仅导入了羧基和蛋白A时的抗体吸附容量为基准来进行的。即，关于实施例1～7、比较例1～6、比较例8及参考例1(基材为多糖类的实施例、比较例及参考例)，以比较例4为基准评价了抗体吸附容量，关于实施例8及比较例7(基材为甲基丙烯酸酯类聚合物的实施例及比较例)，以比较例7为基准评价了抗体吸附容量。
抗体吸附容量为基准的40％以上···抗体吸附容量的评价“A”
抗体吸附容量小于基准的40％···抗体吸附容量的评价“C”
5.纯化纯度的评价方法
(1)纯化纯度的计算
将实施例或比较例中制造出的亲和层析载体或市售的层析载体1mL填充于玻璃柱“Tricorn 10/20column”(GE Healthcare公司制造)(“TRICORN”为注册商标)中，并连接于层析系统“AKTA avant 25”(GE Healthcare公司制造)(“AKTAAVANT”为注册商标)，进行了在各级分中洗脱的HCP(host cell protein；宿主细胞蛋白)量及IgG(Immunoglobulin G；免疫球蛋白G)量的测定。
用平衡液(20mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4)使柱平衡化之后，将以源自IgG、CHO-S(中国仓鼠卵巢(Chinese Hamster Ovary)S)细胞的HCP分别成为1.6mg/mL、0.32mg/mL的方式使用标准缓冲液(20mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4)制备出的IgG/HCP混合液以流速0.21mL/min添加了载样上述(1)中得到的抗体吸附容量的80％的抗体量的溶液量。然后，将载样后清洗液(20mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4)以0.42mL/min流放5mL进行清洗之后，将洗脱前清洗液(20mM磷酸缓冲液，1M NaCl，pH7.4)以相同的流速流放了5mL。然后，将洗脱液(100mM柠檬酸缓冲液，150mM NaCl，pH3.2)以相同的流速流放了5mL。另外，接着将CIP液(0.1M氢氧化钠水溶液)以相同的流速流放5mL，然后，将再平衡液(20mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4)以相同的流速流放了5mL。此时，根据监测280nm的吸光度而得到的IgG洗脱峰，计算出各级分中的洗脱液的IgG洗脱量。并且，回收各级分的洗脱液，通过使用宿主细胞蛋白检测试剂盒“CHO HCP 3rd Generation ELISA kit”(Cygnus Technologies,Inc.制造)的ELISA法，计算出各级分中的洗脱液的HCP量。
使用计算出的洗脱液的IgG量及HCP量，纯化纯度通过以下式作为洗脱液中的HCP混入量、即洗脱液中的每单位IgG量中的HCP量而进行了计算。
纯化纯度(ppm)＝HCP混入量(ppm)＝洗脱液的HCP量/洗脱液的IgG量
(2)纯化纯度的评价
纯化纯度的评价是按照以下的评价基准，以仅导入了羧基和蛋白A时的HCP混入量(ppm)为基准来进行的。即，关于实施例1～7、比较例1～6、比较例8及参考例1(基材为多糖类的实施例、比较例及参考例)，以比较例4为基准评价了HCP混入量，关于实施例8及比较例7(基材为甲基丙烯酸酯类聚合物的实施例及比较例)，以比较例7为基准评价了HCP混入量。
HCP混入量(ppm)减少20％以上·····纯化纯度的评价“A”
HCP混入量(ppm)减少超过0％且小于20％···纯化纯度的评价“B”
HCP混入量(ppm)未减少··········纯化纯度的评价“C”
[实施例1]
1.亲和层析载体的制造
(1)湿凝胶的制备
通过在玻璃滤纸(glass filter)上使用纯水对交联琼脂糖类基材“Sepharose6Fast Flow”(GE Healthcare公司制造)(“SEPHAROSE”为注册商标)重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了基材浆液。通过抽滤从该基材浆液中去除纯水而得到了湿凝胶。
另外，在表1的“基材”栏中，“Sepharose6FF”是指“Sepharose 6Fast Flow”。
(2)包覆前基材的制备-环氧基的导入
将所得到的湿凝胶100g、纯水152mL及氯甲基环氧乙烷50g装入500mL容量的三口烧瓶中，并在45℃的温浴中开始进行烧瓶内容物的搅拌。进行搅拌直至烧瓶内的温度成为45℃。在45℃的温浴中，一边将烧瓶内的温度维持为约45℃一边将50％(w/w)氢氧化钠水溶液41g历经2小时滴加到烧瓶内。在滴加氢氧化钠水溶液的总量之后，进一步反应1小时，通过在玻璃滤纸上使用纯水重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了包覆前基材的湿凝胶。
(3)载体的制备-基于亲水性聚合物的包覆
将葡聚糖70(特性粘度0.23dL/g；重均分子量约70,000)13g及纯水154mL装入500mL容量的三口烧瓶中，并在室温下开始进行烧瓶内容物的搅拌。进行搅拌直至葡聚糖70完全溶解。溶解后，将包覆前基材的湿凝胶90g加入到该三口烧瓶中，并在室温下进一步搅拌。在三口烧瓶内的混合液变均匀之后，加入了50％(w/w)氢氧化钠水溶液4.2g。在加入氢氧化钠水溶液之后，在室温下反应16小时，通过在玻璃滤纸上使用纯水重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了载体的湿凝胶。
并且，按照上述“亲水性聚合物包覆量的测定方法”测定了所得到的载体的葡聚糖包覆量。将所得到的亲水性聚合物包覆量示于表1的“亲水性聚合物包覆量”栏。
(4)羧基化载体的制备-羧基的导入
将所得到的载体的湿凝胶12g、氯乙酸钠6.2g及纯水24mL装入100mL容量的三口烧瓶中，并在50℃的温浴中开始进行烧瓶内容物的搅拌。进行搅拌直至氯乙酸钠完全溶解。溶解后，在50℃的温浴中，一边将烧瓶内温度维持为约50℃一边将50％(w/w)氢氧化钠水溶液8.8g历经1小时进行了滴加。在滴加氢氧化钠水溶液的总量之后，进一步反应3小时，通过在玻璃滤纸上使用纯水重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了羧基化载体的湿凝胶。
并且，按照上述“羧基导入量的测定方法”测定了所得到的羧基化载体的羧基导入量。将所得到的羧基导入量示于表1的羧基导入量栏。
另外，亲和层析载体的羧基导入量以“羧基化载体的羧基导入量-亲和配体导入量”来表示。
(5)蛋白A固定羧基化载体的制备-亲和配体的导入
将以湿润体积计为2.5mL量的所得到的羧基化载体装入一次性柱中，通过使用纯水重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了载体浆液。通过抽滤从该载体浆液中去除纯水而得到了湿凝胶。
将所得到的湿凝胶2.0g称取到反应容器中，并加入EDC(N-(3-dimethylaminopropyl)-N'-ethylcarbodiimide；N-(3-二甲基氨基丙基)-N’-乙基碳二亚胺)溶液2mL，在室温下翻转搅拌了10分钟。然后，向反应容器中加入NHS(N-hydroxysuccinimide；N-羟基琥珀酰亚胺)溶液2mL，并在室温下翻转搅拌了30分钟。在此，EDC溶液是在DMSO(dimethyl sulfoxide；二甲基亚砜)2mL中溶解EDC 0.2g而制备的，NHS溶液是在DMSO 2mL中溶解NHS 0.2g而制备的。
将反应凝胶溶液移到一次性柱中，并用冰冷的1mM盐酸6mL进行清洗，得到了EDC/NHS活化的羧基化载体。
将所得到的EDC/NHS活化羧基化载体1.5g装入反应容器中，接下来，将10mg/mL蛋白A溶液1.5mL加入到反应容器中，并在25℃下振荡了2小时。上述10mg/mL蛋白A容液是将基因重组天然型蛋白A“rSPA”(Repligen公司制造)溶解于20mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid；2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲液(pH4.5)而制备的。
将溶剂置换为1M氯化钠水溶液及0.5M乙醇胺水溶液并进行清洗，得到了蛋白A固定羧基化载体。
并且，按照上述“亲和配体导入量(蛋白A固定化量)的测定方法”测定了所得到的蛋白A固定羧基化载体的蛋白A固定化量(亲和配体导入量)。将所得到的蛋白A固定化量示于表1的“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[实施例2]
1.亲和层析载体的制造
将羧基化载体的制备(羧基的导入)时的氯乙酸钠的使用量由6.2g变更为3.6g，除了这点以外，以与实施例1相同的方式制造出蛋白A固定羧基化载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了亲水性聚合物包覆量、羧基导入量、亲和配体导入量。将测定结果分别示于表1的“亲水性聚合物包覆量”、“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[实施例3]
1.亲和层析载体的制造
将羧基化载体的制备(羧基的导入)时的氯乙酸钠的使用量由6.2g变更为11.7g，除了这点以外，以与实施例1相同的方式制造出蛋白A固定羧基化载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了亲水性聚合物包覆量、羧基导入量、亲和配体导入量。将测定结果分别示于表1的“亲水性聚合物包覆量”、“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[实施例4]
1.亲和层析载体的制造
将载体的制备(基于亲水性聚合物的包覆)时的葡聚糖70(特性粘度0.23dL/g、重均分子量约70,000)的使用量由13g变更为66g及将羧基化载体的制备(羧基的导入)时的氯乙酸钠的使用量由6.2g变更为2.0g，除了这点以外，以与实施例1相同的方式制造出蛋白A固定羧基化载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了亲水性聚合物包覆量、羧基导入量、亲和配体导入量。将测定结果分别示于表1的“亲水性聚合物包覆量”、“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[实施例5]
1.亲和层析载体的制造
将湿凝胶的制备时的交联琼脂糖类基材变更为“Sepharose 4Fast Flow”(GEHealthcare公司制造)(“SEPHAROSE”为注册商标)及将羧基化载体的制备(羧基的导入)时的氯乙酸钠的使用量由2.0g变更为3.9g，除了这点以外，以与实施例4相同的方式制造出蛋白A固定羧基化载体。
另外，在表1的“基材”栏中，“Sepharose4FF”表示“Sepharose 4Fast Flow”。
另外，以与实施例1相同的方式测定了亲水性聚合物包覆量、羧基导入量、亲和配体导入量。将测定结果分别示于表1的“亲水性聚合物包覆量”、“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[实施例6]
1.亲和层析载体的制造
使用葡聚糖40(特性粘度0.17dL/g、重均分子量约40,000)来代替载体的制备(基于亲水性聚合物的包覆)时的葡聚糖70(特性粘度0.23dL/g、重均分子量约70,000)及将羧基化载体的制备(羧基的导入)时的氯乙酸钠的使用量由3.9g变更为4.5g，除了这点以外，以与实施例5相同的方式制造出蛋白A固定羧基化载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了亲水性聚合物包覆量、羧基导入量、亲和配体导入量。将测定结果分别示于表1的“亲水性聚合物包覆量”、“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[实施例7]
1.亲和层析载体的制造
使用葡聚糖19(特性粘度0.12dL/g、重均分子量约19,000)来代替载体的制备(基于亲水性聚合物的包覆)时的葡聚糖70(特性粘度0.23dL/g、重均分子量约70,000)及将羧基化载体的制备(羧基的导入)时的氯乙酸钠的使用量由3.9g变更为5.7g，除了这点以外，以与实施例5相同的方式制造出蛋白A固定羧基化载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了亲水性聚合物包覆量、羧基导入量、亲和配体导入量。将测定结果分别示于表1的“亲水性聚合物包覆量”、“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[实施例8]
1.亲和层析载体的制造
(1)湿凝胶的制备
通过在玻璃滤纸上使用纯水将甲基丙烯酸酯类多孔系基材“TOYOPEARL HW-65F”(TOSOH CORPORATION制造)(“TOYOPEARL”为注册商标)重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了基材浆液。通过抽滤从该基材浆液中去除纯水而得到了湿凝胶。
(2)包覆前基材的制备-环氧基的导入
将所得到的湿凝胶100g、纯水152mL及氯甲基环氧乙烷50g装入500mL容量的三口烧瓶中，并在45℃的温浴中开始进行烧瓶内容物的搅拌。进行搅拌直至烧瓶内的温度成为45℃。在45℃的温浴中，一边将烧瓶内的温度维持为约45℃一边将50％(w/w)氢氧化钠水溶液41g历经2小时滴加到烧瓶内。在滴加氢氧化钠水溶液的总量之后，进一步反应1小时，通过在玻璃滤纸上使用纯水重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了湿凝胶。通过重复3次该反应而得到了包覆前基材的湿凝胶。
(3)载体的制备-基于亲水性聚合物的包覆
使用葡聚糖40(特性粘度0.17dL/g、重均分子量约40,000)126g来代替葡聚糖70(特性粘度0.23dL/g；重均分子量约70,000)13g，除了这点以外，以与实施例1相同的方式得到了载体的湿凝胶。
并且，与实施例1同样按照上述“亲水性聚合物包覆量的测定方法”测定了所得到的载体的葡聚糖包覆量。将所得到的亲水性聚合物包覆量示于表1的“亲水性聚合物包覆量”栏。
(4)羧基化载体的制备-羧基的导入
将氯乙酸钠的使用量由6.2g变更为3.4g，除了这点以外，以与实施例1相同的方式得到了羧基化载体的湿凝胶。
并且，与实施例1同样按照上述“羧基导入量的测定方法”测定了所得到的羧基化载体的羧基导入量。将所得到的羧基导入量示于表1的“羧基导入量”栏。
(5)蛋白A固定羧基化载体的制备-亲和配体的导入
以与实施例1相同的方式得到了蛋白A固定羧基化载体。
并且，与实施例1同样按照上述“亲和配体导入量(蛋白A固定化量)的测定方法”测定了所得到的蛋白A固定羧基化载体的蛋白A固定化量。将所得到的蛋白A固定化量示于表1的“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[比较例1]
1.亲和层析载体的制造
将羧基化载体的制备(羧基的导入)时的氯乙酸钠的使用量由6.2g变更为1.8g，除了这点以外，以与实施例1相同的方式制造出蛋白A固定羧基化载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了亲水性聚合物包覆量、羧基导入量、亲和配体导入量。将测定结果分别示于表1的“亲水性聚合物包覆量”、“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[比较例2]
1.亲和层析载体的制造
将羧基化载体的制备(羧基的导入)时的氯乙酸钠的使用量由6.2g变更为22.7g，除了这点以外，以与实施例1相同的方式制造出蛋白A固定羧基化载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了亲水性聚合物包覆量、羧基导入量、亲和配体导入量。将测定结果分别示于表1的“亲水性聚合物包覆量”、“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[比较例3]
1.亲和层析载体的制造
(1)载体的制备-基于亲水性聚合物的包覆
以与实施例1相同的方式得到了载体的湿凝胶。并且，与实施例1同样按照上述“亲水性聚合物包覆量的测定方法”测定了所得到的载体的葡聚糖包覆量。将所得到的亲水性聚合物包覆量示于表1的“亲水性聚合物包覆量”栏。
(2)蛋白A固定化载体的制备-亲和配体的导入
将以湿润体积计为4mL量的所得到的载体装入一次性柱中，通过使用纯水重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了载体浆液。通过抽滤从该载体浆液中去除纯水而得到了湿凝胶。
将所得到的湿凝胶称取到反应容器中，利用纯水使浆液体积成为5mL之后，加入了250mM柠檬酸钠缓冲液(pH3.5)1mL。另外，在加入160mM高碘酸钠水溶液2mL之后，在室温下翻转搅拌0.5小时，通过在滤纸上使用纯水及磷酸缓冲液重复进行悬浮及过滤来进行清洗，并通过抽滤去除纯水或磷酸缓冲液而得到了醛基导入载体的湿凝胶。
将所得到的醛基导入载体的湿凝胶1.5g称取到反应容器中，并将20mg/mL蛋白A溶液3mL加入到反应容器中，在室温下翻转搅拌了2小时。上述20mg/mL蛋白A溶液是将基因重组天然型蛋白A“rSPA”(Repligen公司制造)溶解于200mM MES(2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid；2-(N-吗啉基)乙磺酸)缓冲液(pH7.4)而制备的。
接下来，将三乙基氨基硼烷11mg加入到反应容器中，并在25℃下振荡了16小时。将溶剂置换成200mM MES缓冲液(pH7.4)并进行清洗，在去除清洗液之后，将20mM三盐酸缓冲液3mL、三乙基氨基硼烷11mg加入到反应容器中，并在室温下翻转搅拌了2小时。将溶剂置换成纯水、1M氯化钠水溶液并进行清洗，得到了蛋白A固定化载体。
并且，按照上述“亲和配体导入量(蛋白A固定化量)的测定方法”测定了所得到的蛋白A固定化载体的蛋白A固定化量(亲和配体导入量)。将所得到的蛋白A固定化量示于表1的“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[比较例4]
1.亲和层析载体的制造
通过在玻璃滤纸上使用纯水对交联琼脂糖类基材“Sepharose 6Fast Flow”(GEHealthcare公司制造)重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了基材浆液。通过抽滤从该基材浆液中去除纯水而得到了湿凝胶。
将所得到的湿凝胶12g、氯乙酸钠4.7g及纯水24mL装入100mL容量的三口烧瓶中，并在50℃的温浴中开始进行烧瓶内容物的搅拌。进行搅拌直至氯乙酸钠完全溶解。溶解后，在50℃的温浴中，一边将烧瓶内温度维持为约50℃一边将50％(w/w)氢氧化钠水溶液8.8g历经1小时进行了滴加。在滴加氢氧化钠水溶液的总量之后，进一步反应3小时，通过在玻璃滤纸上使用纯水重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了羧基化载体的湿凝胶。
使用所得到的羧基化载体，以与实施例1相同的方式得到了蛋白A固定羧基化载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了羧基化载体的羧基导入量及蛋白A固定羧基化载体的蛋白A导入量。将测定结果分别示于表1的“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[比较例5]
1.亲和层析载体的制造
将湿凝胶的制备时的交联琼脂糖类基材变更为“Sepharose 4Fast Flow”(GEHealthcare公司制造)及将羧基化载体的制备时的氯乙酸钠的使用量由4.7g变更为9.3g，除了这点以外，以与比较例4相同的方式制造出蛋白A固定羧基化载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了羧基化载体的羧基导入量及蛋白A固定羧基化载体的蛋白A导入量。将测定结果分别使示于表1的“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[比较例6]
1.亲和层析载体的准备
作为亲和层析载体，准备了蛋白A导入载体“MabSelect SuRe”(GE Healthcare公司制造)(“MABSELECT”为注册商标)。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用所准备的蛋白A导入载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[比较例7]
1.亲和层析载体的制造
通过在玻璃滤纸上使用纯水对甲基丙烯酸酯类多孔系基材“TOYOPEARL HW-65F”(TOSOH CORPORATION制造)(“TOYOPEARL”为注册商标)重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了基材浆液。通过抽滤从该基材浆液中去除纯水而得到了湿凝胶。
将所得到的湿凝胶12g、氯乙酸钠3.8g及纯水24mL装入100mL容量的三口烧瓶中，并在50℃的温浴中开始进行烧瓶内容物的搅拌。进行搅拌直至氯乙酸钠完全溶解。溶解后，在50℃的温浴中，一边将烧瓶内温度维持为约50℃一边将50％(w/w)氢氧化钠水溶液8.8g历经1小时进行了滴加。在滴加氢氧化钠水溶液的总量之后，进一步反应3小时，通过在玻璃滤纸上使用纯水重复进行悬浮及过滤来进行清洗，得到了羧基化载体的湿凝胶。
使用所得到的羧基化载体，以与实施例1相同的方式得到了蛋白A固定羧基化载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了羧基化载体的羧基导入量及蛋白A固定羧基化载体的蛋白A导入量。将测定结果分别示于表1的“羧基导入量”及“亲和配体导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的蛋白A固定羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[比较例8]
1.亲和层析载体的制造
以与实施例1相同的方式得到了羧基化载体的湿凝胶。
将所得到的湿凝胶用作亲和层析载体。
另外，以与实施例1相同的方式测定了亲水性聚合物包覆量及羧基导入量。将测定结果分别示于表1的“亲水性聚合物包覆量”及“羧基导入量”栏。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用制造出的羧基化载体，与实施例1同样按照上述“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
[参考例1]
1.层析载体的准备
作为层析载体，准备了次硫酸基导入载体“Cellufine MAX S-r”(JNCCorporation制造)(“CELLUFINE”为注册商标)。
2.抗体吸附容量及纯化纯度的评价
使用所准备的次硫酸基导入载体，按照后述的“抗体吸附容量的评价方法”及“纯化纯度的评价方法”进行了抗体吸附容量及纯化纯度的评价。将抗体吸附容量及纯化纯度的评价结果分别示于表1的“抗体吸附容量(评价)”及“纯化纯度(评价)”栏。
3.次硫酸基导入量的测定
并且，依照上述“羧基导入量的测定方法”测定了次硫酸基导入量，其结果，次硫酸基导入量为150mmol/L-gel。
4.抗体吸附容量的评价方法
将市售的层析载体1mL填充于玻璃柱“Tricorn 10/20column”(GE Healthcare公司制造)(“TRICORN”为注册商标)中，并连接于层析系统“AKTA avant 25”(GE Healthcare公司制造)(“AKTAAVANT”为注册商标)，进行了抗体吸附容量的测定。
用平衡液(10mM乙酸缓冲液，pH4.7)使柱平衡化之后，以流速0.42mL/min添加了用标准缓冲液(10mM乙酸缓冲液，pH4.7)将人IgG抗体(Immunoglobulin G：免疫球蛋白G)调整为5mg/mL的溶液30mL。然后，将载样后清洗液(10mM乙酸缓冲液，pH4.7)以相同的流速流放5mL，在进行清洗之后，一边利用洗脱液1(20mM磷酸缓冲液，pH7.4)及洗脱液2(20mM磷酸缓冲液，1M NaCl，pH7.4)阶段性地提高盐浓度一边以相同的流速流放了30mL。然后，将CIP液(0.1M氢氧化钠水溶液)以相同的流速流放5mL，接下来，将平衡液(20mM磷酸缓冲液，150mMNaCl，pH7.4)以相同的流速流放了5mL。此时，根据监测280nm的吸光度而得到的IgG洗脱峰，计算出各级分中的洗脱液的抗体洗脱量。将从洗脱前清洗液中洗脱至CIP液中的抗体量作为抗体吸附容量进行计算。
抗体吸附容量的评价是按照以下的评价基准，以仅导入了羧基和蛋白A时的抗体吸附容量为基准来进行的。即，以比较例4为基准评价了抗体吸附容量。
抗体吸附容量为基准的40％以上···抗体吸附容量的评价“A”
抗体吸附容量小于基准的40％···抗体吸附容量的评价“C”
5.纯化纯度的评价方法
将市售的层析载体1mL填充于玻璃柱“Tricorn 10/20column”(GE Healthcare公司制造)(“TRICORN”为注册商标)中，并连接于层析系统“AKTA avant 25”(GE Healthcare公司制造)(“AKTAAVANT”为注册商标)，进行了在各级分中洗脱的HCP(host cell protein；宿主细胞蛋白)量及IgG(Immunoglobulin G；免疫球蛋白G)量的测定。
用平衡液(10mM乙酸缓冲液，pH4.7)使柱平衡化之后，将以源自IgG、CHO-S(Chinese Hamster Ovary S)细胞的HCP分别成为1.6mg/mL、0.64mg/mL的方式使用标准缓冲液(10mM乙酸缓冲液，pH4.7)制备的IgG/HCP混合液以流速0.21mL/min添加了载样上述(1)中得到的抗体吸附容量的80％的抗体量的溶液量。然后，一边利用洗脱液1(20mM磷酸缓冲液，pH7.4)及洗脱液2(20mM磷酸缓冲液，1M NaCl，pH7.4)阶段性地提高盐浓度一边以流速0.42mL/min流放了30mL。然后，将CIP液(0.1M氢氧化钠水溶液)以相同的流速流放5mL，接下来，将平衡液(20mM磷酸缓冲液，150mM NaCl，pH7.4)以相同的流速流放了5mL。此时，根据监测280nm的吸光度而得到的IgG洗脱峰，计算出各级分中的洗脱液的IgG洗脱量。并且，回收各级分的洗脱液，通过使用宿主细胞蛋白检测试剂盒“CHO HCP 3rd Generation ELISAkit”(Cygnus Technologies,Inc.制造)的ELISA法，计算出各级分中的洗脱液的HCP量。
使用计算出的洗脱液的IgG量及HCP量，纯化纯度通过以下式作为洗脱液中的HCP混入量、即洗脱液中的每单位IgG量中的HCP量而进行了计算。
纯化纯度(ppm)＝HCP混入量(ppm)＝洗脱液的HCP量/洗脱液的IgG量
纯化纯度的评价是按照以下的评价基准，以仅导入了羧基和蛋白A时的HCP混入量(ppm)为基准来进行的。即，以比较例4为基准评价了HCP混入量。
HCP混入量(ppm)减少20％以上·······纯化纯度的评价“A”
HCP混入量(ppm)减少超过0％且小于20％···纯化纯度的评价“B”
HCP混入量(ppm)未减少··········纯化纯度的评价“C”
＜结果的说明＞
实施例1～8的亲和层析载体的抗体吸附容量及纯化纯度均为“B”以上的评价，抗体吸附容量及纯化纯度均优异。
另一方面，比较例1～8的抗体吸附容量及纯化纯度中的至少一个为“C”评价，抗体吸附容量及纯化纯度中的至少一个差。
并且，若对比实施例6和实施例8，则基材为交联琼脂糖类的实施例6的纯化纯度为“A”评价，相对于此，基材为甲基丙烯酸酯类的实施例8的纯化纯度为“B”评价，因此暗示着与甲基丙烯酸酯类基材相比，交联琼脂糖类基材的纯化纯度更优异。另外，在亲水性聚合物包覆量相差很大的实施例1和实施例4中，纯化纯度的评价均为“A”评价，因此认为实施例6与实施例8之间纯化纯度的评价不同的原因在于基材是交联琼脂糖类(实施例6)还是甲基丙烯酸酯类(实施例8)。

Claims (14)

1.一种亲和层析载体，其具有基材、亲水性聚合物及亲和配体，所述亲和层析载体中，
所述基材包含选自包括多糖类、丙烯酸酯类聚合物、甲基丙烯酸酯类聚合物及苯乙烯类聚合物的组中的至少1种，
所述亲水性聚合物为选自包括亲水性多糖类的组中的至少1种，
所述亲和配体为选自包括抗体结合性蛋白质及抗体结合性多肽的组中的至少1种，
所述亲和层析载体中导入有羧基，
所述羧基的导入量以离子交换容量计为15mmol/L-gel～60mmol/L-gel。
2.根据权利要求1所述的亲和层析载体，其中，
所述亲水性聚合物的特性粘度为0.10dL/g以上。
3.根据权利要求1或2所述的亲和层析载体，其中，
所述亲水性聚合物的包覆量为3mg/g-dry gel～500mg/g-dry gel。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的亲和层析载体，其中，
所述基材包含选自包括多糖类、丙烯酸酯类聚合物及甲基丙烯酸酯类聚合物的组中的至少1种。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的亲和层析载体，其中，
所述亲水性聚合物为选自包括葡聚糖、羧甲基葡聚糖及短梗霉聚糖的组中的至少1种。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的亲和层析载体，其中，
所述基材为多孔粒子。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的亲和层析载体，其中，
所述亲和配体与抗体进行抗原抗体反应。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的亲和层析载体，其中，
所述亲和配体为蛋白A或其变体。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的亲和层析载体，其中，
所述基材包含选自包括纤维素、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、葡甘露聚糖及向它们中导入交联结构而成的交联多糖类的组中的至少1种，
所述亲水性聚合物为选自包括葡聚糖、羧甲基葡聚糖及短梗霉聚糖的组中的至少1种亲水性多糖类，
所述亲水性多糖类的特性粘度为0.12dL/g～0.30dL/g，
所述亲水性聚合物的包覆量为10mg/g-dry gel～240mg/g-dry gel，
所述羧基的导入量以离子交换容量计为15mmol/L-gel～55mmol/L-gel，
所述亲和配体为蛋白A或其变体，且
所述亲和配体的导入量为0.10mmol/L-gel～1.0mmol/L-gel。
10.根据权利要求1至8中任一项所述的亲和层析载体，其中，
所述基材包含选自包括丙烯酸酯类聚合物及甲基丙烯酸酯类聚合物的组中的至少1种，
所述亲水性聚合物为选自包括葡聚糖、羧甲基葡聚糖及短梗霉聚糖的组中的至少1种亲水性多糖类，
所述亲水性多糖类的特性粘度为0.12dL/g～0.30dL/g，
所述亲水性聚合物的包覆量为10mg/g-dry gel～240mg/g-dry gel，
所述羧基的导入量以离子交换容量计为15mmol/L-gel～55mmol/L-gel，
所述亲和配体为蛋白A或其变体，且
所述亲和配体的导入量为0.10mmol/L-gel～1.0mmol/L-gel。
11.一种生物物质的纯化方法，所述纯化方法使用了权利要求1至10中任一项所述的亲和层析载体。
12.根据权利要求11所述的纯化方法，其中，
所述生物物质的添加时pH为5.0～9.0。
13.根据权利要求11或12所述的纯化方法，其中，
所述生物物质的洗脱时pH为2.0～5.0。
14.根据权利要求11至13中任一项所述的纯化方法，其中，
所述生物物质为抗体或抗体衍生物。
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