JP3691792B2 - 懸濁重合により製造される大孔性クロマトグラフィー用ビーズ - Google Patents

Description

【０００１】
本発明は、クロマトグラフィー用分離媒質及び懸濁重合に関する。
【０００２】
本発明の背景
流体力学的流れのために十分に大きな孔をもつ連続ポリマー床（ｂｅｄｓ）の形態にあるクロマトグラフィー用分離媒質は、米国特許第５，６４５，７１７号（Hjerten et al., 1997年７月８日付与）及び同第５，６４７，９７９号（Liao et al.,1997年７月１５日付与）、及びヨーロッパ特許出願第ＥＰ ０ ８５２ ３３４ Ａ１号（Bio-Rad Laboratories, Inc., 1998年７月８日公開）中に開示されている。これらの床は「連続性」といわれる。なぜなら、各床が、カラム又はキャピラリーの全断面にわたって、そのカラム又はキャピラリーの管腔を占有する１つの物から成る固体のコアであるからである。このコアは、多孔性であり、その孔は直径約３〜５ミクロンであり、そしてそれ故、その孔が直径約０．１ミクロンであるところの大孔性（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）媒質として従来知られている媒質の直径よりも大きい。上記床は、上記カラム又はキャピラリーの内部の場所に形成され、そして上記孔は上記床の全体にわたり伸びてその孔自体を通っての流体力学的な流れ又は速い拡散を許容するために十分に大きなチャンネルとして役立つ。上記床は、上記「大孔性」サイズの孔を実質的に含まない。大きな孔の存在と大孔の不存在により、上記床を通しての全てではないが大部分の溶質の動きが、流体力学的流れ又は速い拡散として生じ、大孔性媒質のより小さな孔を通して典型的に生じる遅い拡散輸送を本質的に伴わない。この遅い拡散輸送の回避は、バンドの広がりを減少させ、一方、大きな貫通孔（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｏｒｅｓ）の広い表面積は、高い分解能と分離能を提供する。上記貫通孔の大きなサイズも、そのカラムを通しての高処理速度を許容する。
【０００３】
本発明の要約
先に言及した米国特許及びヨーロッパ出願中に記載した大孔媒質は、１つの物から成る（ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ）構造としてそれ自体、上記カラム又はキャピラリー内で形成される。上記媒質の有益な品質がクロマトグラフィー用ビーズ内でも達成されることができるということが今般発見され、上記大きな孔の利点とビーズの多用途性を併せもつこととなる。ビーズは、ユーザーに、使用場所で上記分離カラム又はキャピラリーを充填する能力、及びその幾何、サイズ、及びビーズ直径をユーザーが選択する能力を、ユーザーに与え、各々が、そのクロマトグラフィー分離の程度及び分解能の決定、及び上記カラムを通しての流速の決定におけるさらなる変数として作用する。従って、本発明によれば、クロマトグラフィー・ビーズが先に言及した２つの米国特許及びヨーロッパ特許出願の大孔媒質と同一の孔特徴をもって懸濁重合により製造される。従って上記ビーズは、直径約０．５ミクロン又はこれより大きい、好ましくは約０．５ミクロン〜約２．０ミクロンの直径をもつ貫通孔を含み、上記大孔サイズ又はそれより小さな孔、すなわち、直径０．１ミクロン程度の小さな孔は実質的に含まない。
【０００４】
本発明は、化学組成において広く異なり、そして分離媒質として機能するビーズにも関する。上記ビーズの品質のさらなる説明、それが製造されるところのやり方、及びそれらの使用方法を、本明細書の以下の章において記載する。
【０００５】
本発明の詳細な説明及び特定の態様
本発明のビーズは、固体であり、かつ、水及び多くの有機溶媒中で不溶性である。従って、上記ビーズは、クロマトグラフィー分離媒質としてのそれらの使用の間、固体のままであり、そして充填されたクロマトグラフィー・カラムのための充填材料として役立つ。従って、上記ビーズは、クロマトグラフィー・カラムのための他の固体粒子状充填材と同じやり方で使用される。上記ビーズは、有機相と水相を含む液体懸濁液から形成され、上記有機相は連続相として役立ち、そして上記水相は上記有機相中に分散され（水／油懸濁液）、かつ、上記ビーズを形成する重合性材料（すなわち、モノマー混合物）を含む。従って、上記ビーズそれ自体は、水溶液から形成され、そして上記ビーズの形成のまさにその間に上記孔は水性液で満たされる。連続床の従来技術においては、これは、上記ビーズの孔からの有機溶媒の除去の必要性を回避し；上記ビーズは、非水性液を除去するための長ったらしい洗浄を伴わずに水性分離系内で直ちに使用される。
【０００６】
上記モノマー混合物は、水溶性重合性化合物と水溶性架橋剤を含む。好ましくは、上記成分は、上記化合物の約１０重量％以上を含む水溶液が形成されることができるよう十分に可溶性である。上記重合性化合物は、一般に、上記ビーズの重合性マトリックスを形成するように重合する１官能性のモノマーである。この化合物は、以下に説明するように、アニオン交換、カチオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、バイオアフィニティー・クロマトグラフィー、及び染料−リガンド・バイオアフィニティー・クロマトグラフィーを含む、いずれかのタイプの分離のために好適な官能基を含むよう誘導体化されることができる。
【０００７】
上記ビーズの大きな孔の特徴は、その中に、上記モノマー混合物が、上記水相の約２重量％〜約５０重量％を、好ましくは約２０重量％〜約４０重量％を占め、そして上記モノマー混合物に対して約０．１〜約０．７、そして好ましくは約０．３〜約０．４のモル分率で存在する架橋剤を含む、水相を使用して達成される。
【０００８】
上記ポリマーの鎖の形成において使用される重合性化合物の好ましい基は、ビニル、アリル、アクリル及びメタクリル化合物である。上記グループ内の化合物の例は、酢酸ビニル、ビニル・プロピルアミン、アクリル酸、メタクリレート、ブチル・アクリレート、アクリルアミド、及びメタクリルアミドである。官能基の含入により誘導体化されるポリマーを形成することが望ましい場合、上記重合性化合物は、上記例の置換された誘導体であることができる。上記の置換された誘導体の例は、反応性ヒドロキシ基、エポキシ基、カルボン酸基、アミノ基、又は上記基の組合せにより置換された化合物である。官能基の分布及び密度は、選択された比で誘導体化化合物と非誘導体化化合物の組合せを使用することにより選択され、そして変えられることができる。
【０００９】
イオン交換媒質のためには、上記官能基は、上記モノマーに共有結合された電荷をもつ基であるであろうし、そして特定の電荷密度をもつポリマーを形成する慣用手段は、特定の比率の電荷をもつモノマーと電荷をもたないモノマーの混合物を使用することである。ほとんどの場合、上記混合物中の電荷をもつモノマー対電荷をもたないモノマーの比率は、比較的小さいものであるであろう。上記モノマーに電荷を与える官能基は、イオン交換媒質中で使用されるいずれかの慣用基であることができる。アニオン交換媒質のためには、適当な官能基の例は、その窒素原子上に２，３又は４つのアルキル置換基をもつ第４アンモニウム基であり、上記アルキル基は主にメチル又はエチルである。第４アンモニウム基を担持するモノマーの１例は、ジメチル・ジアリル・アンモニウム・クロリドである。ある場合には、上記アルキル基は、それ自体、例えば、ヒドロキシル基で置換されることができる。第４アンモニウム基及びアニオン効果のための正電荷をもつ基の他のクラスの他の例は、当業者に自明であろう。カチオン交換媒質のためには、適当な官能基の例は、スルホン酸基、硫酸基、及びカルボン酸基である。スルホン酸基を担持するモノマーの１例は、アリルオキシ・ヒドロキシプロパンスルホン酸である。他の例は、ビニルスルホン酸による反応により置換されたヒドロキシプロピル・メタクリレートである。アニオン交換媒質とカチオン交換媒質の両者において、上記イオン交換基の強さは、官能基の選定又は官能基の組合せの使用により決定され、一方、イオン交換基の能力は、官能基の密度、すなわち、ビーズの容量又は重量当りの基の数により決定される。
【００１０】
疎水性相互作用クロマトグラフィー媒質のためには、上記モノマー混合物は、１以上の疎水性アルキル又はフェニル基を含む水溶性モノマーを含むであろう。上記モノマーの好ましい基は、疎水性アルキル・メタクリレートと疎水性アルキル・アクリルアミドである。上記モノマーのための好ましいアルキル基は、３又は４の炭素原子をもつものであり、そしてこれらの中で、より好ましいものは、直鎖状に配置された炭素原子をもつ飽和アルキルである。疎水性相互作用クロマトグラフィーのために特に有用な例は、ｎ−プロピル・アクリルアミドとイソプロピル・アクリルアミドである。
【００１１】
官能基は、官能化されたモノマーと官能化されていないモノマーの共重合により上記ポリマーの構造中に取り込まれることができる。あるいは、上記ビーズの表面及び上記孔の内部は、重合が完結した後に、化学的に修飾されることができる。これは、そのポリマー構造を形成するモノマー上又は上記構造中に取り込まれた第２ポリマー上の活性基を使用して、上記ポリマー表面の慣用の結合を通じた官能基の共有結合により達成されることができる。さらなる別法は、共有結合により疎水性種で上記ポリマー表面をコートして、非特異的相互作用を低下させ、そしてその後、上記ポリマーを誘導体化又は官能化して、特異的な相互作用のタイプを達成することである。上記ポリマー表面にコーティングを適用することも、誘導体化のための追加のカップリング部位を提供するための手段として役立つことができる。
【００１２】
本発明についてのさらなるバリエーションにおいては、上記ビーズの特性は、重合前に上記モノマー混合物に疎水性ポリマーを付加することにより修飾されることができる。上記疎水性ポリマーは、重合反応に参加するであろう重合性基、例えば、アリル基を含むものであるであろう。上記ポリマーは、上記ビーズ表面に親水性の特徴を付与し、そのビーズ表面における疎水性の特徴を減少させ、そしてそれにより上記ビーズ表面において生じるかもしれない非特異的なタンパク質相互作用を低下させる。これは、上記媒質からのタンパク質の回収を高め、そして上記媒質により上記タンパク質の変性のリスクを低下させる。上記目的のために使用されることができる疎水性ポリマーの例は、デキストラン、デンプン、及びメチルセルロースのアリル誘導体である。上記ポリマーのさらなる利点は、それらが、リガンドの付着のための高い部位密度（ｓｉｔｅ ｄｅｎｓｉｔｙ）（例えば、反応性ヒドロキシル基）、又はビーズを形成する懸濁重合の前に、リガンドが上記部位に結合している場合には高いリガンド密度をもつということである。リガンドが付着するとき、上記の高いリガンド密度そしてまた上記の付着されたポリマー鎖のフレキシビリティーに因り、上記疎水性ポリマーは上記媒質の能力を増大させる。
【００１３】
本発明における使用のために好適な架橋剤は、架橋のやり方において先に記載した重合性化合物と反応することができるいずれかの２官能性の種を含む。ポリアクリルアミド、及びアクリル酸の他の形態のポリマーのためには、好適な架橋剤の例は、ビスアクリルアミド、ジアクリレート、及び広いレンジの末端ジエンである。特定の例は、ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド、ジアリル酒石酸ジアミド、トリアリル・クエン酸トリアミド、エチレン・ジアクリレート、ビスアクリルイルシスタミン、Ｎ，Ｎ′−メチレンビスアクリルアミド、及びピペラジン・ジアクリルアミドである。
【００１４】
重合及び架橋の結果として形成される孔（すなわち、ビーズの内部にあるチャンネル）の直径は、上記モノマー構造上の疎水性基の存在、並びにそれらの量及び疎水性度、並びに上記水溶液中の上記成分の一般的極性のようなパラメーターに依存する。得られたポリマーが低い程度の疎水性の特徴を有する場合、その孔の直径は、より高い疎水性の特徴をもつポリマーにより達成されるものよりも小さいものである傾向をもつであろう。
【００１５】
上記孔のサイズのさらなるコントロールは、上記水溶液中に極性調節剤を含入することにより得られることができる。得られたモノマーの疎水性の特徴が、望ましいものよりも小さい（これは、望ましいものよりも小さい孔サイズをもたらすであろう）場合、上記モノマー混合物の極性を高めるために、無機塩が、適当な極性調節剤として役立つことができる。この目的のために有用な塩の例は、硫酸塩、例えば、硫酸アンモニウム、硫酸リチウム及び硫酸ナトリウムである。上記塩の量は決定的なものではなく、そして最適量は、上記塩の選択、上記モノマー、及び上記架橋剤に依存して、変動しうる。例えば、上記塩として硫酸アンモニウムが使用される場合、典型的な量は、約０．４Ｍ（０．８Ｎ）〜約０．８Ｍ（１．６Ｎ）、そして好ましくは約０．５Ｍ（１．０Ｎ）〜約０．７Ｍ（１．４Ｎ）の範囲内にある。
【００１６】
無機塩を用いて達成されるものと類似の効果が親水性ポリマーの使用により達成される。例は、ポリエチレン・グリコール、デキストラン、メチル・セルロース、及び酸化ポリエチレンである。ポリマーの量は、変動することができ、そしていずれかの特定の場合における最適量は、他の系パラメーターの存在及び程度に依存するであろう。親水性ポリマーが上記目的のために含まれるときは、ほとんどの場合、その効果は、約５％〜約２０％（重量）の範囲内の親水性ポリマー濃度を用いて見られるであろう。
【００１７】
上記の疎水性の特徴が望ましいものよりも高い場合（これは、望ましいものよりも大きな孔サイズをもたらすであろう）、適当な極性調節剤は、より親水性の高い水溶性添加物、例えば、エチレン・グリコール又はグリセロールであるであろう。
【００１８】
極性調節剤が使用されるとき、その量は決定的なものではなく、そしてその最適量は、使用される特定の剤、並びに使用される特定のモノマー及び架橋剤とともに変化しうる。各場合における適当な量は、当業者にとって自明であろうし又は日常的な実験により決定されることができるであろう。例えば、エチレン・グリコールが使用されるとき、典型的な量は、上記水相の約１０％〜約４０％（重量）の範囲内にある。
【００１９】
上記懸濁重合における連続相として役立つ有機相は、水と少なくとも部分的に非混和性であり、そしてそれ故分離相を形成するであろうし、そして上記水相中のモノマー混合物に対して化学的に不活性である有機液体から成ることができる。この説明に適合する多種多様の有機液体のいずれかが使用されうる。このような液体は、脂肪族の液体、芳香族の液体、その他の化学クラスを含む。パラフィン及びイソパラフィン液は特に有用である。Exxon Chemical Company, Houston, Texas, USA から得られうる、名称ＩＳＯＰＡＲ（商標）を担持する高純度イソパラフィン液体が例である。
【００２０】
上記懸濁液を安定化させるために、懸濁又は乳化剤が上記有機相中に含まれうる。上記有機相内で可溶性であるいずれの非イオン懸濁又は乳化剤が使用されうる。例は、ICI Surfactants, Wilmington, Delaware, USAから得られうる、名称ＡＴＬＯＸ、特にＡＴＬＯＸ８０，ＡＴＬＯＸ７７５，ＡＴＬＯＸ８４７，ＡＴＬＯＸ８４８，ＡＴＬＯＸ８４９，ＡＴＬＯＸ１０４５Ａ，ＡＴＬＯＸ４９１２、及びＡＴＬＯＸ８９１６を担持する、ソルビタン誘導体、エトキシル化アルキルフェノール、及びポリエトキシル化エステルである。ポリマーは、しばしば、好ましくは、乳化剤として低分子量化合物である。
【００２１】
重合は、上記モノマーが上記分散された水相中に存在するところの懸濁重合のために慣用手順に従って行われる。重合開始剤又は触媒が、上記水相中に含まれることができる。重合開始剤の例は、２，２′−アゾビスイソブチロニトリル、４，４′−アゾビス−（４−シアノペンタノン酸）、フェニルアゾトリフェニレン・メタン、ｔ−ブチル・ペルオキシド、クミル・ペルオキシド、アセチル・ペルオキシド、ベンゾイル・ペルオキシド、ラウロイル・ペルオキシド、ｔ−ブチル・ヒドロペルオキシド、及びｔ−ブチル・パーベンゾエートである。上記有機相と水相は別々に調製され、次に併合され、そして懸濁液が安定化するまで撹拌される。その滴サイズは上記撹拌の方法及び程度、並びに乳化剤の量によりコントロールされることができる。滴サイズは本発明にとって決定的なものではなく、そして変動しうる。ほとんどの用途においては、典型的な滴は、約５０ミクロン〜約２００ミクロンのサイズ範囲内にあるであろう。一旦、懸濁液が形成されると、その温度は高められ、そしてその系は、重合が完結するまで窒素をパージされる。
【００２２】
以下の実施例は、説明を目的としたものであり、いかなる方法によっても本発明を限定し又は定めることを意図するものではない。
【００２３】
実施例１
アニオン交換媒質としての使用のためのクロマトグラフィー用ビーズを以下のようにして調製した。
【００２４】
水溶液を以下の成分を併合することにより調製した。
【００２５】
水 １０mL
ジメチル・ジアリル・アンモニウム
塩（６５重量％、４５％重合） １０mL
（１０．３ｇ合計、６．７ｇモノマー、３．０ｇ重合）
メチレン・ビスアクリルアミド ３．０ｇ
ヒドロキシプロピル・メタクリレート
（９７重量％） １．６mL（１．７ｇ）
硫酸アンモニウム １．７ｇ
４，４′−アゾビス（４−シアノペンタノン酸）
（残りの成分を７０℃まで加熱した後に添加） ２０mg
全体としての上記溶液に対するジメチル・ジアリル・アンモニウム・クロリド、メチレン・ビスアクリルアミド、及びヒドロキシプロピル・メタクリレートの合計の重量パーセントは４５％であり、そしてモノマー合計に対する架橋剤のモル分率は０．３％であった。この溶液を、１５０mLのＩＳＯＰＡＲ Ｈと５ｇのＡＴＬＯＸ４９１２から成る有機溶液と混合した。撹拌を、７０℃で１５分間、その後、８５℃で２０分間、２２０rpm で続けた。その温度を８５℃に保ちながら、窒素パージを開始した。重合は２４分目に観察された。凝集物が（８７℃）において２５分目に現れはじめ、そして達成された最高温度は２７分目に９０℃であった。この窒素パージを６０分後に中断し、そして上記窒素パージの開始から合計して１時間の時間期間にわたり８５℃で同一速度で続けた。次に得られたビーズを回収し、そして調べた。これは、そのビーズの直径が１５０ミクロンを上廻ることを示した。
【００２６】
上記の調製を、同じやり方であるが、２２０rpm よりも２８０rpm における撹拌を用いて調製された水溶液及び有機溶液を用いて、繰り返した。重合プロトコールは以下のようなものであった：窒素パージしながらの２０分と３０秒間にわたる８５℃、２８０rpm における撹拌、その後の窒素パージを伴わない５分間の同一速度及び同一温度における連続撹拌、その後の再び窒素パージを伴わない２時間にわたる同一温度における１５０rpm での撹拌。重合までの時間は２３分と３０秒間であり、凝集は２４分と５０秒目に現れはじめ、そして到達最高温度は９１℃であり、２６分と３０秒目に生じた。得られたビーズを回収し、そして検査し、その間、それらの直径が７０ミクロン〜９０ミクロンの範囲内にあったことが観察された。次に、ビーズを５分間８，０００rpm においてブレンダー内でホモジェナイズし、そしてそのビーズの中のいくつかを、さらに、９，０００rpm で３分間、ホモジェナイズした。５分間のホモジェナイゼーションにのみかけられたビーズがなめらかな外表面をもち、一方、追加の３分間のホモジェナイゼーションにかけられたビーズは、粗い外表面をもっていた。
【００２７】
上記ビーズが、大孔ビーズよりも高いレベルのタンパク質捕獲を有することを示すために上記ビーズに対してタンパク質捕獲試験を行った。なぜなら、本発明のビーズのより大きな孔は、大孔ビーズ内でよりもより速く、かつ、より容易に、タンパク質がビーズ内に拡散することを許容するからである。直径７mm、かつ、長さ５５mmのカラムに、上記ビーズを充填し、そして２０mM Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、pH８．２から成るバッファーＡ中５mg／mLの濃度におけるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、５０分間２mL／分の流速及び４psi の背圧で上記カラムに適用した。次に、このＢＳＡを、１０分間同一流速で（ＢＳＡを含有しない）バッファーＢ単独で置き替えた。次にバッファーＡを１０分間バッファーＢで置き替えた。このバッファーＢはバッファーＡと同一の組成をもっていたが１．０Ｍ ＮａＣｌをも含有していた。上記カラム溶離液のタンパク質含量を、ＵＶモニターで連続的にモニターした。
【００２８】
５分間のみ８，０００rpm でブレンダー内でホモジェナイズされていたビーズに関して、その結果を図１に示す。図中、３つの曲線は以下のものを表す：
曲線Ｉ：バッファーＢのパーセントに換算して示される上記カラムを通って流れるバッファー、０％（すなわち、１００％バッファーＡ）から出発し、そして１ステップで１時間目に１００％まで増加される。
【００２９】
曲線II：上記カラムを去る上記塩濃度の尺度としての、上記カラム溶離液の伝導率、０％から出発し、そしてバッファーＡがバッファーＢにより置換された直後に増加される。
【００３０】
曲線III ：上記ディテクターにより検出されるとき上記カラム溶離液のタンパク質含量、上記タンパク質が上記ビーズにより捕獲されているところの０から出発し、その後、上記ビーズが飽和されるようにより、そしてタンパク質が上記床を通過するときに徐々に増加され、上記タンパク質溶液が５０分目にバッファーＡにより置換されるとき０に戻され、次に、バッファーＡが１時間目にバッファーＢにより置換された直後に急激に増加される。
【００３１】
５分間８，０００rpm において最初に、そしてその後に３分間９，０００rpm においてホモジェナイズされていたビーズに関して、その結果を図２に示す。図中、３つの曲線は、図１中のものと同じパラメーターを表す。
【００３２】
図１と図２の両者が、大容量のタンパク質が上記ビーズにより捕獲され、その後にバッファーＢにより放出されたことを示している。
【００３３】
実施例２
カチオン交換媒質としての使用のためのクロマトグラフィー用ビーズを、以下のように調製した。
【００３４】
水溶液を、以下の成分を併合することにより調製した：
水 １３mL
アリルオキシ・ヒドロキシプロパンスルホン酸、
ナトリウム塩（４０重量％、２８％重合） ７．０mL
（８．２ｇ合計、３．３ｇモノマー、０．９２ｇ重合）
メチレン・ビスアクリルアミド ３．０ｇ
ヒドロキシプロピル・メタクリレート
（９７重量％） １．５mL（１．６ｇ）
ビニル・スルオン酸、ナトリウム塩
（５７％重合） １．５ｇ
モノメチル・エーテル・ヒドロキノン（モノマーの
溶解の間の重合を回避するための重合阻害剤） ５mg
４，４′−アザビス−（４−シアノペンタノン酸）
（残りの成分を７５℃まで加熱した後に添加） ２０mg
全体としての上記溶液に対する、アリルオキシ・ヒドロキシプロパンスルホン酸、メチレン・ビスアクリルアミド、ヒドロキシプロピル・メタクリレート、及びビニル・スルホン酸の合計の重量パーセントは３８％であり、そしてモノマー合計に対する架橋剤のモル分率は０．３であった。この溶液を、１５０mLのＩＳＯＰＡＲ Ｈと５ｇのＡＴＬＯＸ４９１２から成る有機溶液と混合して懸濁液を形成した。撹拌を、７０℃で１５分間、その後２０分間８５℃で、２２０rpm において続けた。上記温度を８５℃に保ちながら、窒素パージを開始した。重合は２６分目に観察され、凝集は（８７℃において）２６分と４０秒目に現れはじめ、そして到達最高温度は２８分と３０秒目に９８．５℃であった。窒素パージを６０分目に中断し、そして窒素パージの開始から合計６０分間の時間期間にわたり８５℃で同一速度で続けた。得られたビーズを回収し、そして検査した。これは、そのビーズの直径が５０ミクロン〜７０ミクロンの範囲内にあったことを示した。
【００３５】
実施例１に記載する条件と同様の条件を用いて、タンパク質捕獲試験を行った。但し、そのタンパク質は免疫グロブリンＧであり、バッファーＡはpH５．０における２０mM酢酸ナトリウムであり、バッファーＢは、バッファーＡにpH８．３における１．０Ｍ ＮａＣｌを加えたものであり、そして免疫グロブリンＧ溶液の流れを、２０分間だけ続け、その後バッファーＡとバッファーＢの各々で１０分間行った。その結果のプロットを図３に示す。図中、曲線Ｉ，II、及びIII は、実施例１におけるものと同じパラメーターを表す。図１と図２中に示されるものと同様に、その結果大容量のタンパク質が１４分間以内に上記ビーズにより捕獲され、その後、バッファーＢにより本質的に１度に解放されたことを示している。
【００３６】
実施例３
疎水性相互作用媒質としての使用のためのクロマトグラフィー用ビーズを以下のように調製した。
【００３７】
水溶液を以下の成分を併合することにより調製した：
水 １．３mL
ｎ−プロピル・アクリルアミド ３００μＬ（０．３ｇ）
メチレン・ビスアクリルアミド ０．３ｇ
エチレン・グリコール ０．７mL（０．８ｇ）
上記溶液を、１５mLのＩＳＯＰＡＲ Ｈと０．１５ｇのＡＴＬＯＸ４９１２から成る有機溶液と混合した。撹拌を、７０℃で１５分間、その後２０分間８５℃で、２２０rpm において続けた。その温度を８５℃に保ちながら、窒素パージを開始した。重合は２６分目に観察され；そして到達最高温度は２８分目に９０℃であった。窒素パージを６０分目に中断し、そして撹拌を、窒素パージの開始から合計して６０分間の時間期間にわたり８５℃で同一速度において続けた。得られたビーズを回収し、そして検査した。これは、上記ビーズの直径が８０ミクロン〜９０ミクロンの範囲内であったことを示した。
【００３８】
実施例１と２のものと同様のプロトコールを用いて、タンパク質捕獲試験を図４と図５に示す。上記試験の各々において、上記タンパク質は、この場合においては２Ｍ硫酸アンモニウムを含むpH７．０における２０mMリン酸ナトリウムから成っていたバッファーＡ中の４mg／mL溶液とし上記カラムに導入されたＢＳＡであった。上記カラムを通る流速は２mL／分であった。上記タンパク質溶液の流れを、２０分間続け、この時点で、上記タンパク質溶液を、（ＢＳＡを含まない）バッファーＡ単独で置き替えた。バッファーＡの流れを、１０分間続け、次にバッファーＢで置き替えた。このバッファーＢは、最後の１０分間の間pH７．０において２０mMのリン酸ナトリウムから成っていた。
【００３９】
上記プロトコールに従って行われた１の試験の結果を図４のプロットに示す。図中、曲線Ｉは、（硫酸アンモニウムを全く含有しない）バッファーＢのパーセントを表し、曲線IIは、溶離液中の伝導率（硫酸アンモニウム濃度の指標）を表し、そして曲線III は、上記カラム溶離液のタンパク質含量を表す。図４の試験の繰り返しを、ＮａＯＨに上記ビーズをまず晒した後に、行って、２４時間上記カラムを通して１Ｍ ＮａＯＨを通過させることにより、ｎ−プロピル・アクリルアミド・モノマー中での上記疎水性リガンドの安定性を評価した。この繰り返し試験の結果を図５に示し、そして図４と図５の間の類似性は、上記リガンドと上記ビーズのポリマー構造との間の共有結合が安定であるということを示している。
【００４０】
次に、上記ビーズを使用して、運転開始後３．５分目から１８分目までの時間期間にわたる線形グラジエントにおいてバッファーＡがバッファーＢにより徐々に置き替えられたグラジエント溶離において、シトクロームＣ、ウマ・ミオグロビン、及びリゾチームから成るタンパク質混合物のクロマトグラフィーによる分離を行った。上記カラムは、実施例１と２において使用したものと同じであり、そして上記カラムを通しての流速は１mL／分であった。得られたクロマトグラムを図６に示す。図中、曲線Ｉは上記バッファー混合物中のバッファーＢのパーセントを表し、曲線IIは、上記カラム溶離液の伝導率（上記カラムからの溶出する硫酸アンモニウムの濃度の指標）を表し、そして曲線III は、（上記ＵＶ検出器を通過する上記タンパク質濃度を示す）クロマトグラムである。最大分解能をもって４つのピークへの上記タンパク質混合物のはっきりした分離が示されている：２つの最も左にあるピークは、シトクロームＣを表し、次のピークは、ウマ・ミオグロビンを表し、そして最も右側のピークは、リゾチームを表す。この試験を、２４時間上記カラムに１Ｍ ＮａＯＨを通過させた後に、繰り返して、上記リガンド結合の安定性をテストした。繰り返された試験の結果を図７に示し、そして図６と図７の間の類似性は、上記リガンドと上記ビーズの上記ポリマー構造との間の共有結合が安定であることを示している。
【００４１】
以上は、主に説明を目的として提出されたものである。本発明の範囲内に未だありながら、上記系、組成物、材料、及び手順のさらなる修正及び変更を行いうる。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、本発明に従って調製されたアニオン交換ビーズのタンパク質捕獲試験のプロットである。
【図２】 図２は、本発明に従って調製されたさらなるアニオン交換ビーズのタンパク質捕獲試験のプロットである。
【図３】 図３は、本発明に従って調製されたカチオン交換ビーズのタンパク質捕獲試験のプロットである。
【図４】 図４は、本発明に従って調製された疎水性相互作用ビーズのタンパク質捕獲試験のプロットである。
【図５】 図５は、本発明に従って調製された疎水性相互作用ビーズの第２のタンパク質捕獲試験のプロットである。
【図６】 図６は、図４のビーズを用いた疎水性相互作用により分離されたタンパク質混合物のクロマトグラムである。
【図７】 図７は、図５のビーズを用いた疎水性相互作用により分離されたタンパク質混合物のクロマトグラムである。

Claims (10)

1. 少なくとも０．５ミクロンの直径をもつ貫通性孔（ｔｈｒｏｕｇｈ−ｐｏｒｅｓ）を有するビーズの形態におけるクロマトグラフィー分離媒質の製造方法であって：
   （ａ）有機連続相中に水性液滴の懸濁液を形成し、この水性液は、水中に溶解されたモノマー混合物を含み、このモノマー混合物は、水溶性重合性化合物と水溶性架橋剤から成り、ここで、上記水性液に対する上記モノマー混合物の重量パーセントは２％〜５０％であり、かつ、上記モノマー混合物に対する上記架橋剤のモル分率は０．１〜０．７であり、そして上記有機連続相は乳化剤をその中に溶解された有機溶媒を含み、上記有機溶媒は少なくとも部分的に水と非混和性であり；
   （ｂ）上記滴を重合させて、少なくとも０．５ミクロンからの直径をもつ貫通性孔をもつ固体多孔性ビーズを形成し；そして
   （ｃ）上記固体多孔性ビーズを上記有機連続相から回収する、
   を含む前記方法。
2. 前記重合性化合物が、酢酸ビニル、プロピルアミン・ビニル、アクリル酸、メタクリレート、ブチル・アクリレート、アクリルアミド、メタクリルアミド、反応性ヒドロキシ基を担持する上記化合物の置換誘導体、反応性エポキシ基を担持する上記化合物の置換誘導体、反応性カルボキシ基を担持する上記化合物の置換誘導体、及び反応性アミノ基を担持する上記化合物の置換誘導体から成る群から選ばれるメンバーであり、そして前記架橋剤が、Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミド及びピペラジン・ジアクリルアミドから成る群から選ばれるメンバーである、請求項１に記載の方法。
3. 前記分離媒質が、アニオン交換媒質であり、そして前記重合性化合物が、（ｉ）ビニル、アリル、アクリル、及びメタクリル化合物から成る群から選ばれるメンバーと、（ii）ビニル、アリル、アクリル、及びメタクリル化合物から成る群から選ばれるメンバーであって、正電荷をもつ基がそれに共有結合しているものとの混合物であり、そして上記モノマー混合物が、そのモノマー混合物の極性を高める無機塩をさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記クロマトグラフィー用分離媒質が、カチオン交換媒質であり、そして前記重合性化合物が、（ｉ）ビニル、アリル、アクリル、及びメタクリル化合物から成る群から選ばれるメンバーと、（ii）ビニル、アリル、アクリル、及びメタクリル化合物から成る群から選ばれるメンバーであって、負電荷をもつ基がそれに共有結合されているものとの混合物である、請求項１に記載の方法。
5. 前記クロマトグラフィー用分離媒質が、疎水性相互作用媒質であり、そして前記重合性化合物が、疎水性アルキル基を含むモノマーである、請求項１に記載の方法。
6. 以下の：
   （ａ）有機連続相中に水性液滴の懸濁液を形成し、この水性液は、水中に溶解されたモノマー混合物を含み、このモノマー混合物は、水溶性重合性化合物と水溶性架橋剤から成り、ここで、上記水性液に対する上記モノマー混合物の重量パーセントは２％〜５０％であり、かつ、上記モノマー混合物に対する上記架橋剤のモル分率は０．１〜０．７であり、そして上記有機連続相は乳化剤をその中に溶解された有機溶媒を含み、上記有機溶媒は少なくとも部分的に水と非混和性であり；
   （ｂ）上記滴を重合させて、少なくとも０．５ミクロンからの直径をもつ貫通性孔をもつ固体多孔性ビーズを形成し；そして
   （ｃ）上記固体多孔性ビーズを上記有機連続相から回収する、
   を含む懸濁重合方法により製造される固体不溶性ビーズから成るクロマトグラフィー用分離媒質。
7. 前記水性液に対する前記モノマー混合物の重量パーセントが、２０％〜４０％であり、かつ、前記モノマー混合物に対する前記架橋剤のモル分率が０．３〜０．４である、請求項６に記載のクロマトグラフィー用分離媒質。
8. 前記クロマトグラフィー用分離媒質が、イオン交換媒質であり、そして前記重合性化合物が、（ｉ）ビニル、アリル、アクリル、及びメタクリル化合物から成る群から選ばれるメンバーと、（ii）ビニル、アリル、アクリル、及びメタクリル化合物から成る群から選ばれるメンバーであって、電荷をもつ基がそれに共有結合しているものとの混合物である、請求項６に記載のクロマトグラフィー用分離媒質。
9. 前記クロマトグラフィー用分離媒質が、カチオン交換媒質であり、そして（ii）が、ビニル、アリル、アクリル、及びメタクリル化合物であって、負電荷をもつ基がそれに共有結合されているものから成る群から選ばれるメンバーである、請求項８に記載のクロマトグラフィー用分離媒質。
10. 前記クロマトグラフィー用分離媒質が、疎水性相互作用媒質であり、かつ、前記重合性化合物が、疎水性アルキル基を含むモノマーである、請求項６に記載のクロマトグラフィー用分離媒質。

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