JP3100129B2 - 水溶液からインシチューで形成された連続床を有するクロマトグラフィーカラム - Google Patents
水溶液からインシチューで形成された連続床を有するクロマトグラフィーカラムInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、固相分離媒質を用
いるカラムクロマトグラフィーに関する。
いるカラムクロマトグラフィーに関する。
【０００２】
発明の背景 カラムクロマトグラフィーは、特にタンパク質およびペ
プチドに対する分析用分離および分取用分離（ｐｒｅｐ
ａｒａｔｉｖｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）の両者に有用
である。分析用分離では、多くの場合の最も効率的なカ
ラムは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であ
り、この場合、高い背圧（６，０００ｐｓｉまで）がカ
ラムにかけられ、高い分離度と再現精度（ｒｅｐｒｏｄ
ｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）とが求められる。カラムの結合容
量（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）は、通常、ほ
とんど重要ではなく、カラムを通るサンプルの高い流量
が、通常、用いられる。分取用分離は、混合物の組成を
測定するために混合物を単に分離するのではなく混合物
から精製したタンパク質またはペプチドを抽出するため
に行われる。高い分離度と再現精度とが分取用分離でも
必要とされ、かつ、カラムの結合容量および流動性も重
要であり、それも分析用カラムでよりもそのことがいえ
る。従って、分取用分離については、高い分離度が、高
い結合容量と低い背圧（典型的には、１，０００ｐｓｉ
またはそれ以下）で達成されることが重要である。
プチドに対する分析用分離および分取用分離（ｐｒｅｐ
ａｒａｔｉｖｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ）の両者に有用
である。分析用分離では、多くの場合の最も効率的なカ
ラムは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）であ
り、この場合、高い背圧（６，０００ｐｓｉまで）がカ
ラムにかけられ、高い分離度と再現精度（ｒｅｐｒｏｄ
ｕｃｉｂｉｌｉｔｙ）とが求められる。カラムの結合容
量（ｂｉｎｄｉｎｇ ｃａｐａｃｉｔｙ）は、通常、ほ
とんど重要ではなく、カラムを通るサンプルの高い流量
が、通常、用いられる。分取用分離は、混合物の組成を
測定するために混合物を単に分離するのではなく混合物
から精製したタンパク質またはペプチドを抽出するため
に行われる。高い分離度と再現精度とが分取用分離でも
必要とされ、かつ、カラムの結合容量および流動性も重
要であり、それも分析用カラムでよりもそのことがいえ
る。従って、分取用分離については、高い分離度が、高
い結合容量と低い背圧（典型的には、１，０００ｐｓｉ
またはそれ以下）で達成されることが重要である。
【０００３】高い分離度は、選択性の最大化とバンド広
がりの最小化との両者を必要とする。バンドの広がりに
寄与する因子は、移動相と固定相との両者での非平衡物
質移動、長手方向の拡散および渦状拡散である。
がりの最小化との両者を必要とする。バンドの広がりに
寄与する因子は、移動相と固定相との両者での非平衡物
質移動、長手方向の拡散および渦状拡散である。
【０００４】長手方向の拡散は、高分子には重要性はほ
んの僅かである。移動相の非平衡物質移動と渦状拡散と
は、充填床（ｐａｃｋｅｄ ｂｅｄ）でおおいに重要で
あるが、両者は、１−５ミクロンの直径範囲の直径を有
する均一な粒子を充填したカラムを用いることにより減
ぜられている。しかしながら、この種の床は、高い流れ
抵抗を有している。さらに、これらは、それでも固定相
で非平衡物質移動を受けやすい、すなわち、粒子の孔へ
出入りする溶質分子の拡散に影響されやすい。このこと
は、バンドの広がりでの大きな寄与因子であり、そのよ
り低い拡散速度に起因してより大きなタンパク質でいえ
る。
んの僅かである。移動相の非平衡物質移動と渦状拡散と
は、充填床（ｐａｃｋｅｄ ｂｅｄ）でおおいに重要で
あるが、両者は、１−５ミクロンの直径範囲の直径を有
する均一な粒子を充填したカラムを用いることにより減
ぜられている。しかしながら、この種の床は、高い流れ
抵抗を有している。さらに、これらは、それでも固定相
で非平衡物質移動を受けやすい、すなわち、粒子の孔へ
出入りする溶質分子の拡散に影響されやすい。このこと
は、バンドの広がりでの大きな寄与因子であり、そのよ
り低い拡散速度に起因してより大きなタンパク質でいえ
る。
【０００５】拡散物質移動は、非孔質粒子の使用により
除去され得るが、そのような粒子の低表面積は、結合容
量に有害である。表面積は、約１−３ミクロンの範囲の
直径を有する非孔質粒子の使用により増すことができる
が、分離が速く、この寸法の粒子は、高い背圧を必要と
するので、分取用には実用できない。もう１つの選択肢
は、散布用粒子（ｐｅｒｆｕｓｉｖｅ ｐａｒｔｉｃｌ
ｅ）の使用、すなわち、粒子を横断し、十分な大きさを
有して流体力学的な流れを受け入れる貫通孔（６，００
０−８，０００Å）と、貫通孔から枝分かれするより小
さい直径（５００−１，５００Å）の拡散孔との両者を
含む粒子の使用である。しかしながら、貫通孔は、渦状
拡散を起こし、その理由は、１０ミクロンの直径の粒子
の７，０００Åの貫通孔を通る移動相の平均線速度が粒
子間の隙間を通る平均線速度の僅か５％であり、流速の
差が渦状拡散の原因になっているからである。さらに、
粒子内対流が、粒子内溶質輸送に必要な時間を減少さ
せ、他方で、小直径枝孔の溶質の遅い拡散輸送が溶質の
流れをそれでも支配している。このことが、高い流速で
バンドの広がりを起こす。
除去され得るが、そのような粒子の低表面積は、結合容
量に有害である。表面積は、約１−３ミクロンの範囲の
直径を有する非孔質粒子の使用により増すことができる
が、分離が速く、この寸法の粒子は、高い背圧を必要と
するので、分取用には実用できない。もう１つの選択肢
は、散布用粒子（ｐｅｒｆｕｓｉｖｅ ｐａｒｔｉｃｌ
ｅ）の使用、すなわち、粒子を横断し、十分な大きさを
有して流体力学的な流れを受け入れる貫通孔（６，００
０−８，０００Å）と、貫通孔から枝分かれするより小
さい直径（５００−１，５００Å）の拡散孔との両者を
含む粒子の使用である。しかしながら、貫通孔は、渦状
拡散を起こし、その理由は、１０ミクロンの直径の粒子
の７，０００Åの貫通孔を通る移動相の平均線速度が粒
子間の隙間を通る平均線速度の僅か５％であり、流速の
差が渦状拡散の原因になっているからである。さらに、
粒子内対流が、粒子内溶質輸送に必要な時間を減少さ
せ、他方で、小直径枝孔の溶質の遅い拡散輸送が溶質の
流れをそれでも支配している。このことが、高い流速で
バンドの広がりを起こす。
【０００６】粒子は、カラムの横断面にまたがる粗孔固
体プラグの導入により完全に避けることができた〔１９
６９年、９月１７日に公衆閲覧に供したオランダ国特許
出願第６，８０３，７３９号（チェコスロバキア科学ア
カデミー、プラハ（Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａｎ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｒａｇ
ｕｅ））〕。粗孔プラグは、粒子を準備しそれらをカラ
ムに充填する必要を排除し、その代わり、プラグが、カ
ラム自体の中での重合によりつくられた。しかしなが
ら、ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）として有機溶媒を用い
ることにより、得られるプラグは、粗孔であり、すなわ
ち、およそ０．１ミクロン以下の直径を有する孔を持っ
ていた。この大きさの孔は、上記の拡散輸送を起こさ
せ、これが流体力学的な流れを妨害し、バンドの広がり
をもたらす。さらには、有機溶媒の使用は、重合が、無
水の条件下で行われることと、水性移動相を用いた分離
を行うに先立ってプラグを徹底的に洗うこととを必要と
する。さらに別の欠点は、得られる床が、疎水性であっ
たことであり、このことは、多くの場合にその有用性を
減じた。
体プラグの導入により完全に避けることができた〔１９
６９年、９月１７日に公衆閲覧に供したオランダ国特許
出願第６，８０３，７３９号（チェコスロバキア科学ア
カデミー、プラハ（Ｃｚｅｃｈｏｓｌｏｖａｋｉａｎ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｐｒａｇ
ｕｅ））〕。粗孔プラグは、粒子を準備しそれらをカラ
ムに充填する必要を排除し、その代わり、プラグが、カ
ラム自体の中での重合によりつくられた。しかしなが
ら、ポロゲン（ｐｏｒｏｇｅｎ）として有機溶媒を用い
ることにより、得られるプラグは、粗孔であり、すなわ
ち、およそ０．１ミクロン以下の直径を有する孔を持っ
ていた。この大きさの孔は、上記の拡散輸送を起こさ
せ、これが流体力学的な流れを妨害し、バンドの広がり
をもたらす。さらには、有機溶媒の使用は、重合が、無
水の条件下で行われることと、水性移動相を用いた分離
を行うに先立ってプラグを徹底的に洗うこととを必要と
する。さらに別の欠点は、得られる床が、疎水性であっ
たことであり、このことは、多くの場合にその有用性を
減じた。
【０００７】
発明の要約 本発明は、ポロゲン（ここでは、この用語は、重合され
るモノマーを除く任意の非水性の溶剤または補助溶剤を
意味するものとして使用している）を使用せずに、水溶
液からカラム内で形成される連続床にある。床は、１種
またはそれ以上の、たとえば、ビニル化合物、アリル化
合物およびメタクリル化合物のような水溶性の重合可能
な化合物、架橋剤（重合可能な化合物と架橋剤とは、こ
こではまとめて「モノマー」と呼ぶ）および硫酸アンモ
ニウムを次に示す量で含む重合反応混合物から形成され
る： （ａ）水性重合反応混合物に対するモノマーの重量％の
合計は、約１０％−約２０％の範囲内であり； （ｂ）重合反応混合物中に存在する全てのモノマーに対
する架橋剤のモル分率は、約０．３−約０．４の範囲内
であり；そして （ｃ）重合反応混合物中の硫酸アンモニウムの量の濃度
は、約０．４−約０．８Ｍの範囲内である。（ａ）およ
び（ｂ）で、初めに形成されるが、反応しなかった重合
反応混合物中に存在しなかったモノマーは、これらの合
計およびモル分率の計算に含まれない。
るモノマーを除く任意の非水性の溶剤または補助溶剤を
意味するものとして使用している）を使用せずに、水溶
液からカラム内で形成される連続床にある。床は、１種
またはそれ以上の、たとえば、ビニル化合物、アリル化
合物およびメタクリル化合物のような水溶性の重合可能
な化合物、架橋剤（重合可能な化合物と架橋剤とは、こ
こではまとめて「モノマー」と呼ぶ）および硫酸アンモ
ニウムを次に示す量で含む重合反応混合物から形成され
る： （ａ）水性重合反応混合物に対するモノマーの重量％の
合計は、約１０％−約２０％の範囲内であり； （ｂ）重合反応混合物中に存在する全てのモノマーに対
する架橋剤のモル分率は、約０．３−約０．４の範囲内
であり；そして （ｃ）重合反応混合物中の硫酸アンモニウムの量の濃度
は、約０．４−約０．８Ｍの範囲内である。（ａ）およ
び（ｂ）で、初めに形成されるが、反応しなかった重合
反応混合物中に存在しなかったモノマーは、これらの合
計およびモル分率の計算に含まれない。
【０００８】本発明の連続床は、クロマトグラフィーカ
ラムの横断面にまたがる固体の非粒状分離媒質である。
床は、流体力学的な流れを可能とするのに十分な大きさ
の貫通孔またはチャンネル（すなわち、通常約１ミクロ
ン以上の直径を有する）を有し、粗孔範囲（約０．１ミ
クロン以下）の孔を実質的に有さない。したがって、床
を通る溶質の輸送のほとんどは、小さな直径の枝の孔を
通る拡散流れよりはむしろチャンネルを通る流体力学的
な流れの結果である。チャンネル壁自体は、粗い表面
（これは、床の活性な表面積に寄与する）を有するが実
質的に非孔質である。カラム自体は、ＨＰＬＣや毛管ク
ロマトグラフィーで用いられるもののような管状のクロ
マトグラフィーのカラムであり、連続床は、カラム内に
直接形成されている。
ラムの横断面にまたがる固体の非粒状分離媒質である。
床は、流体力学的な流れを可能とするのに十分な大きさ
の貫通孔またはチャンネル（すなわち、通常約１ミクロ
ン以上の直径を有する）を有し、粗孔範囲（約０．１ミ
クロン以下）の孔を実質的に有さない。したがって、床
を通る溶質の輸送のほとんどは、小さな直径の枝の孔を
通る拡散流れよりはむしろチャンネルを通る流体力学的
な流れの結果である。チャンネル壁自体は、粗い表面
（これは、床の活性な表面積に寄与する）を有するが実
質的に非孔質である。カラム自体は、ＨＰＬＣや毛管ク
ロマトグラフィーで用いられるもののような管状のクロ
マトグラフィーのカラムであり、連続床は、カラム内に
直接形成されている。
【０００９】本発明の連続床を形成するために使用され
るモノマーは、イオン交換樹脂として床を形成する荷電
したモノマー（ｃｈａｒｇｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ）を含
んでいてもよい。荷電したモノマーは、通常、大きな割
合の未荷電のモノマーと混合される。本発明の範囲内の
もう１つの変形例は、床密度を増加させる重合に続く連
続床の圧縮であり、それによる溶質の分解である。分析
用カラムとして用いるために準備するカラムについて、
圧縮の程度は、分取用カラムとして準備したカラムより
も高いであろう。本発明のこれらの特徴と利点および他
の特徴と利点を以下に詳細に記載し説明する。
るモノマーは、イオン交換樹脂として床を形成する荷電
したモノマー（ｃｈａｒｇｅｄ ｍｏｎｏｍｅｒ）を含
んでいてもよい。荷電したモノマーは、通常、大きな割
合の未荷電のモノマーと混合される。本発明の範囲内の
もう１つの変形例は、床密度を増加させる重合に続く連
続床の圧縮であり、それによる溶質の分解である。分析
用カラムとして用いるために準備するカラムについて、
圧縮の程度は、分取用カラムとして準備したカラムより
も高いであろう。本発明のこれらの特徴と利点および他
の特徴と利点を以下に詳細に記載し説明する。
【００１０】
発明の詳細な説明と好ましい実施例の詳細な説明 本発明の連続床をつくるのに用いられるモノマーには、
一官能価モノマーおよび多官能価モノマーがあり、後者
は、架橋剤として働く。モノマーと架橋剤とは、荷電し
ていても未荷電であってもよい。水へのこれらの種の溶
解度は、好ましくは、少なくとも約１０％である。例に
は、ビニルモノマー、アリルモノマー、アクリルモノマ
ーおよびメタクリルモノマーがある。好ましい例は、酢
酸ビニル、ビニルプロピルアミン、アクリル酸、アクリ
ル酸ブチル、アクリルアミド、メタクリルアミド、メタ
クリル酸グリシジル、アクリル酸グリシジル、メチレン
−ビス−アクリルアミドおよびピペラジンジアクリルア
ミドである。
一官能価モノマーおよび多官能価モノマーがあり、後者
は、架橋剤として働く。モノマーと架橋剤とは、荷電し
ていても未荷電であってもよい。水へのこれらの種の溶
解度は、好ましくは、少なくとも約１０％である。例に
は、ビニルモノマー、アリルモノマー、アクリルモノマ
ーおよびメタクリルモノマーがある。好ましい例は、酢
酸ビニル、ビニルプロピルアミン、アクリル酸、アクリ
ル酸ブチル、アクリルアミド、メタクリルアミド、メタ
クリル酸グリシジル、アクリル酸グリシジル、メチレン
−ビス−アクリルアミドおよびピペラジンジアクリルア
ミドである。
【００１１】官能基の結合によりポリマーを誘導するこ
とが所望されるなら、ポリマーが形成されるモノマー
も、共有結合が容易に達成される反応性の基、たとえ
ば、エポキシド基またはヒドロキシル基を含むであろ
う。そのような基を含むモノマーも従って本発明の範囲
にある。これらのモノマーは、単独でまたは組み合わせ
て用いて、得られるポリマーの性質または品質（存在す
る官能基の分布と密度を調節することを含む）を変えて
もよい。
とが所望されるなら、ポリマーが形成されるモノマー
も、共有結合が容易に達成される反応性の基、たとえ
ば、エポキシド基またはヒドロキシル基を含むであろ
う。そのような基を含むモノマーも従って本発明の範囲
にある。これらのモノマーは、単独でまたは組み合わせ
て用いて、得られるポリマーの性質または品質（存在す
る官能基の分布と密度を調節することを含む）を変えて
もよい。
【００１２】イオン交換カラムについては、未荷電モノ
マーと共に比較的少量の荷電したモノマーを含むことが
好ましい。慣用の官能基を有する荷電したモノマーは、
正に荷電していてもあるいは負に荷電していても、使用
できる。陰イオン交換体のための官能基の例は、窒素原
子に３つまたは４つのアルキル置換を有する第四アンモ
ニウム基であり、このアルキル基は、主にメチルまたは
エチルであり、ある場合には、それら自体たとえばヒド
ロキシル基により置換されている。陽イオン交換体のた
めの官能基の例は、樹脂に直接結合したまたは連鎖式
（ｌｉｎｋａｇｅ）を介して結合したスルホン酸基およ
びカルボン酸基である。それぞれの場合で、イオン交換
体の強度は、官能基上の置換基によりまたは異なる官能
基の組合せにより調節され、交換体の容量は、連続床の
単位体積当たりの官能基の数（すなわち、その濃度）に
より調節される。
マーと共に比較的少量の荷電したモノマーを含むことが
好ましい。慣用の官能基を有する荷電したモノマーは、
正に荷電していてもあるいは負に荷電していても、使用
できる。陰イオン交換体のための官能基の例は、窒素原
子に３つまたは４つのアルキル置換を有する第四アンモ
ニウム基であり、このアルキル基は、主にメチルまたは
エチルであり、ある場合には、それら自体たとえばヒド
ロキシル基により置換されている。陽イオン交換体のた
めの官能基の例は、樹脂に直接結合したまたは連鎖式
（ｌｉｎｋａｇｅ）を介して結合したスルホン酸基およ
びカルボン酸基である。それぞれの場合で、イオン交換
体の強度は、官能基上の置換基によりまたは異なる官能
基の組合せにより調節され、交換体の容量は、連続床の
単位体積当たりの官能基の数（すなわち、その濃度）に
より調節される。
【００１３】上記したように、ある種の一官能価のモノ
マー、特に荷電したモノマーは、重合反応の間完全には
反応せず、連続床が形成された後、モノマーの形式でそ
の物質の多くを残す。未反応の物質は、床を水でまたは
緩衝溶液で洗うことにより連続床生成物から容易に除去
される。これらの場合、モノマーの比較的高い割合が、
重合反応混合物中に含まれ、得られるポリマー中でのそ
の低い度合いの混在を補償する。初めに仕込んだモノマ
ーの全部またはほんの一部が反応するかどうかに関係な
く、未荷電一官能価モノマーに対する荷電一官能価モノ
マーのモル比は、臨界的でなく、本発明の範囲内で変化
してよい。最良の結果は、荷電一官能価モノマー対未荷
電一官能価モノマーのモル比が、約０．０１−約０．２
０、好ましくは、約０．０５−約０．１５であるとき得
られる。陰イオンカラムについては、正に荷電した一官
能価モノマー対未荷電一官能価モノマーの好ましい比
は、約０．０５−約０．０１の範囲内である。陽イオン
交換カラムについては、負に荷電した一官能価モノマー
対未荷電一官能価モノマーの好ましい比は、約０．１０
−約０．１５の範囲である。
マー、特に荷電したモノマーは、重合反応の間完全には
反応せず、連続床が形成された後、モノマーの形式でそ
の物質の多くを残す。未反応の物質は、床を水でまたは
緩衝溶液で洗うことにより連続床生成物から容易に除去
される。これらの場合、モノマーの比較的高い割合が、
重合反応混合物中に含まれ、得られるポリマー中でのそ
の低い度合いの混在を補償する。初めに仕込んだモノマ
ーの全部またはほんの一部が反応するかどうかに関係な
く、未荷電一官能価モノマーに対する荷電一官能価モノ
マーのモル比は、臨界的でなく、本発明の範囲内で変化
してよい。最良の結果は、荷電一官能価モノマー対未荷
電一官能価モノマーのモル比が、約０．０１−約０．２
０、好ましくは、約０．０５−約０．１５であるとき得
られる。陰イオンカラムについては、正に荷電した一官
能価モノマー対未荷電一官能価モノマーの好ましい比
は、約０．０５−約０．０１の範囲内である。陽イオン
交換カラムについては、負に荷電した一官能価モノマー
対未荷電一官能価モノマーの好ましい比は、約０．１０
−約０．１５の範囲である。
【００１４】本発明で用いるのに適当な架橋剤には、架
橋するようにモノマーと反応しうる二官能価種がある。
アクリル酸の他の形のポリマーおよびポリアクリルアミ
ドについては、適当な架橋剤の例は、ビスアクリルアミ
ド、ジアクリレートおよび広範囲の末端ジエンである。
特定の例は、ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミ
ド、ジアリル酒石酸ジアミド、トリアリルくえん酸トリ
アミド、ジアクリル酸エチレン、ビスアクリルシスタミ
ン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドおよびピペ
ラジンジアクリルアミドである。後者の２つが、好まし
く、ピペラジンジアクリルアミドが、特に好ましい。
橋するようにモノマーと反応しうる二官能価種がある。
アクリル酸の他の形のポリマーおよびポリアクリルアミ
ドについては、適当な架橋剤の例は、ビスアクリルアミ
ド、ジアクリレートおよび広範囲の末端ジエンである。
特定の例は、ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミ
ド、ジアリル酒石酸ジアミド、トリアリルくえん酸トリ
アミド、ジアクリル酸エチレン、ビスアクリルシスタミ
ン、Ｎ，Ｎ’−メチレンビスアクリルアミドおよびピペ
ラジンジアクリルアミドである。後者の２つが、好まし
く、ピペラジンジアクリルアミドが、特に好ましい。
【００１５】モノマーの量と架橋剤の割合は、２つのパ
ラメーターにより都合よくは特徴づけられ、一方は、重
合溶液（未反応のままであり、後で固体の連続床から洗
浄により除去されるモノマーを除く）中の全モノマー濃
度（一官能価および二官能価の両方）を表し、他方は、
全モノマーに対する架橋剤の割合を表す。一番目のもの
は、０．１を掛けた溶液のミリリッター当たりの架橋剤
＋モノマーのミリグラムとして定義される重量／容量％
（これは、数値的には重量％に非常に近い）または重量
％として都合よく表され、記号「Ｔ」によりここでは示
される。二番目のものは、架橋剤＋モノマーのミリグラ
ムで割り１００を掛けた架橋剤のミリグラム数として定
義される重量／重量％ととして都合よく表され、ここで
は記号「Ｃ」により示される。一般的に表されるモノマ
ーと架橋剤について、重量／容量％「Ｃ」は、モノマー
＋架橋剤の全量に対する架橋剤のモル分率により置き換
えられる。
ラメーターにより都合よくは特徴づけられ、一方は、重
合溶液（未反応のままであり、後で固体の連続床から洗
浄により除去されるモノマーを除く）中の全モノマー濃
度（一官能価および二官能価の両方）を表し、他方は、
全モノマーに対する架橋剤の割合を表す。一番目のもの
は、０．１を掛けた溶液のミリリッター当たりの架橋剤
＋モノマーのミリグラムとして定義される重量／容量％
（これは、数値的には重量％に非常に近い）または重量
％として都合よく表され、記号「Ｔ」によりここでは示
される。二番目のものは、架橋剤＋モノマーのミリグラ
ムで割り１００を掛けた架橋剤のミリグラム数として定
義される重量／重量％ととして都合よく表され、ここで
は記号「Ｃ」により示される。一般的に表されるモノマ
ーと架橋剤について、重量／容量％「Ｃ」は、モノマー
＋架橋剤の全量に対する架橋剤のモル分率により置き換
えられる。
【００１６】本発明に従えば、Ｔの値は、約１０％−約
２０％、好ましくは、約１２．５％−約１７％の範囲で
ある。同様に、Ｃの値は、約０．３−約０．４、好まし
くは、約０．３２−約０．３６の範囲である。
２０％、好ましくは、約１２．５％−約１７％の範囲で
ある。同様に、Ｃの値は、約０．３−約０．４、好まし
くは、約０．３２−約０．３６の範囲である。
【００１７】ポリマーの質に有意的に寄与する重合反応
混合物の成分の１つは、硫酸アンモニウムである。本発
明について硫酸アンモニウム濃度の適当な範囲は、約
０．４Ｍ（０．８Ｎ）−約０．８Ｍ（１．６Ｎ）（全溶
液のリッター当たりの硫酸アンモニウムのモルまたは括
弧中で当量）である。好ましい範囲は、約０．５Ｍ
（１．０Ｎ）−約０．７Ｍ（１．４Ｎ）である。
混合物の成分の１つは、硫酸アンモニウムである。本発
明について硫酸アンモニウム濃度の適当な範囲は、約
０．４Ｍ（０．８Ｎ）−約０．８Ｍ（１．６Ｎ）（全溶
液のリッター当たりの硫酸アンモニウムのモルまたは括
弧中で当量）である。好ましい範囲は、約０．５Ｍ
（１．０Ｎ）−約０．７Ｍ（１．４Ｎ）である。
【００１８】クロマトグラフィーに使用されることにな
るカラム中で直接ポリマーを形成させるのには、当業者
に周知の慣用の重合法を用いてよい。モノマー水溶液
は、通常、１種またはそれ以上の重合触媒と他の慣用の
添加剤をも含み、重合は、媒質が用いられるであろうカ
ラム管またはケーシング中で直接進行させられる。内径
が約２ｍｍまたはそれ以下のマイクロカラムについてい
は、媒質をカラムの内壁に共有結合させることが有利で
あろう。このことは、従来の技術に従い、たとえば、ビ
ニルプロピルトリクロロシランのような結合剤により達
成されてよい。
るカラム中で直接ポリマーを形成させるのには、当業者
に周知の慣用の重合法を用いてよい。モノマー水溶液
は、通常、１種またはそれ以上の重合触媒と他の慣用の
添加剤をも含み、重合は、媒質が用いられるであろうカ
ラム管またはケーシング中で直接進行させられる。内径
が約２ｍｍまたはそれ以下のマイクロカラムについてい
は、媒質をカラムの内壁に共有結合させることが有利で
あろう。このことは、従来の技術に従い、たとえば、ビ
ニルプロピルトリクロロシランのような結合剤により達
成されてよい。
【００１９】クロマトグラフィー分離媒質のようなポリ
マーの性能は、その形成に続く床の強制的圧縮により多
くの場合高められる。圧縮されるべき床は、好ましく
は、カラム管の壁に共有結合されない。この改良につい
ての可能な理由は、隣接ポリマー粒子またはチャンネル
壁の間の流路の短縮であり、よって、分離されるサンプ
ルが床を通るときの、溶質とポリマー表面との間の相互
作用の増加である。圧縮は、上記の水透過性保持部材に
対向する端でカラムに挿入したプランジャーによるよう
にして、または高い流量でのカラムを通る水の通過によ
り、または当業者に容易にうかぶであろう各種の他の手
段のいづれかにより力を単に加えることにより達成され
得る。圧縮は、通常、ポリマーの初めの容積の約７５％
よりも少なく、好ましくは、初めのポリマー容量の約２
５％−約７０％までにされるであろう。多くの用途で
は、少なくとも５倍（すなわち、非圧縮容積の約１／５
まで）、さらには、約１０−約１５倍の圧縮が望まし
い。分取クロマトグラフィーカラムについては、圧縮
は、約１０％−約３０％の範囲内に好ましくは限定され
（すなわち、この範囲内の％の床容積の減少）、分析用
クロマトグラフィーカラムについては、より大きな度合
いの圧縮が好ましく、たとえば、約３０％−約７０％の
範囲内の量である。
マーの性能は、その形成に続く床の強制的圧縮により多
くの場合高められる。圧縮されるべき床は、好ましく
は、カラム管の壁に共有結合されない。この改良につい
ての可能な理由は、隣接ポリマー粒子またはチャンネル
壁の間の流路の短縮であり、よって、分離されるサンプ
ルが床を通るときの、溶質とポリマー表面との間の相互
作用の増加である。圧縮は、上記の水透過性保持部材に
対向する端でカラムに挿入したプランジャーによるよう
にして、または高い流量でのカラムを通る水の通過によ
り、または当業者に容易にうかぶであろう各種の他の手
段のいづれかにより力を単に加えることにより達成され
得る。圧縮は、通常、ポリマーの初めの容積の約７５％
よりも少なく、好ましくは、初めのポリマー容量の約２
５％−約７０％までにされるであろう。多くの用途で
は、少なくとも５倍（すなわち、非圧縮容積の約１／５
まで）、さらには、約１０−約１５倍の圧縮が望まし
い。分取クロマトグラフィーカラムについては、圧縮
は、約１０％−約３０％の範囲内に好ましくは限定され
（すなわち、この範囲内の％の床容積の減少）、分析用
クロマトグラフィーカラムについては、より大きな度合
いの圧縮が好ましく、たとえば、約３０％−約７０％の
範囲内の量である。
【００２０】連続床ポリマーは、化学的に改質（ｍｏｄ
ｉｆｉｅｄ）されて、特定の種類の分離に適当なような
選択したクロマトグラフィー特性を与えるようにしてよ
い。官能基が先ず構造中に共重合されてよいか、または
一度形成されたポリマーの表面が化学的に改質されても
よい。たとえば、非極性リガンドが、ポリマーに共有結
合され、逆相クロマトグラフィーのための媒質としてそ
の有効性を向上されてもよい。非極性リガンドの例は、
長い鎖の飽和脂肪族基たとえば６個またはそれ以上の炭
素原子を有する直鎖である。８−１８個の炭素原子のリ
ガンドは、この点に関して特に有用である。共有結合
は、ポリマー主鎖を形成するモノマー上の官能基または
上記のようにして主鎖に組み入れた第２のモノマー上の
官能基を用いて、ポリマー表面で慣用の結合により達成
されてよい。ポリマーは、ポリマー主鎖への適当に荷電
した官能基の共有結合により、荷電部分への主鎖上に既
にある基の変換により、または上記したように荷電した
官能基を含むモノマーによる共重合により、陽イオンま
たは陰イオン交換クロマトグラフィーに同様にして適当
とされ得る。ポリマーのさらなる処理は、非特定の相互
作用を減じるため共有結合により親水性種によるポリマ
ーの塗布である。次に、塗布したポリマーが、所望によ
り、誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）されて特定の種類の
相互作用を達成してもよい。クロマトグラフィー分離に
使用すると、得られるポリマーは、より大きな分離度を
与える。親水性種によるポリマーの塗布は、カップリン
グに利用できる官能基の高い密度を有する塗膜を選択す
ることにより誘導に対するより多くのカップリング部位
を与える手段として、あるいは非特定の疎水性相互作用
を避ける手段としてさらに使用されてもよい。
ｉｆｉｅｄ）されて、特定の種類の分離に適当なような
選択したクロマトグラフィー特性を与えるようにしてよ
い。官能基が先ず構造中に共重合されてよいか、または
一度形成されたポリマーの表面が化学的に改質されても
よい。たとえば、非極性リガンドが、ポリマーに共有結
合され、逆相クロマトグラフィーのための媒質としてそ
の有効性を向上されてもよい。非極性リガンドの例は、
長い鎖の飽和脂肪族基たとえば６個またはそれ以上の炭
素原子を有する直鎖である。８−１８個の炭素原子のリ
ガンドは、この点に関して特に有用である。共有結合
は、ポリマー主鎖を形成するモノマー上の官能基または
上記のようにして主鎖に組み入れた第２のモノマー上の
官能基を用いて、ポリマー表面で慣用の結合により達成
されてよい。ポリマーは、ポリマー主鎖への適当に荷電
した官能基の共有結合により、荷電部分への主鎖上に既
にある基の変換により、または上記したように荷電した
官能基を含むモノマーによる共重合により、陽イオンま
たは陰イオン交換クロマトグラフィーに同様にして適当
とされ得る。ポリマーのさらなる処理は、非特定の相互
作用を減じるため共有結合により親水性種によるポリマ
ーの塗布である。次に、塗布したポリマーが、所望によ
り、誘導（ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅ）されて特定の種類の
相互作用を達成してもよい。クロマトグラフィー分離に
使用すると、得られるポリマーは、より大きな分離度を
与える。親水性種によるポリマーの塗布は、カップリン
グに利用できる官能基の高い密度を有する塗膜を選択す
ることにより誘導に対するより多くのカップリング部位
を与える手段として、あるいは非特定の疎水性相互作用
を避ける手段としてさらに使用されてもよい。
【００２１】上記の手法により一旦得られると、本発明
の分離媒質は、ペプチド、タンパク質および生物学的お
よびその他のサンプル中の他の種類の混合物を含めた広
範囲の種類の分離に用いてもよい。移動相は、水性相で
あり、好ましくは、ｐＨ約１．０−約１３．０の緩衝液
であり、流れは、ポンプ送りによりまたは重力流れ（ｇ
ｒａｖｉｔｙ ｆｌｏｗ）により達成される。陽イオン
交換カラムについては、移動相ｐＨに対する好ましい範
囲は、約６．０−約７．０である。陰イオン交換カラム
については、移動相ｐＨに対する好ましい範囲は、約
７．５−約９．０である。逆相カラムについては、移動
相ｐＨに対する好ましい範囲は、約２．０−約５．０で
あり、ｐＨ２の移動相が通常用いられる。溶離溶質の検
出は、必要に応じて染色法（ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔ
ｈｏｄ）を用いてカラム自体の中でまたは下流端でカラ
ムの外で慣用の手段により容易に達成し得る。この種の
分離の媒質は、分子量約１００−約１，０００，００
０、最も顕著には約１，０００−約１，０００，０００
の範囲の種の分離に特に効果的である。
の分離媒質は、ペプチド、タンパク質および生物学的お
よびその他のサンプル中の他の種類の混合物を含めた広
範囲の種類の分離に用いてもよい。移動相は、水性相で
あり、好ましくは、ｐＨ約１．０−約１３．０の緩衝液
であり、流れは、ポンプ送りによりまたは重力流れ（ｇ
ｒａｖｉｔｙ ｆｌｏｗ）により達成される。陽イオン
交換カラムについては、移動相ｐＨに対する好ましい範
囲は、約６．０−約７．０である。陰イオン交換カラム
については、移動相ｐＨに対する好ましい範囲は、約
７．５−約９．０である。逆相カラムについては、移動
相ｐＨに対する好ましい範囲は、約２．０−約５．０で
あり、ｐＨ２の移動相が通常用いられる。溶離溶質の検
出は、必要に応じて染色法（ｓｔａｉｎｉｎｇ ｍｅｔ
ｈｏｄ）を用いてカラム自体の中でまたは下流端でカラ
ムの外で慣用の手段により容易に達成し得る。この種の
分離の媒質は、分子量約１００−約１，０００，００
０、最も顕著には約１，０００−約１，０００，０００
の範囲の種の分離に特に効果的である。
【００２２】
【実施例】以下の例は、説明の目的で記載するものであ
り、なんら本発明を限定するものでも定義することを意
図するものではない。
り、なんら本発明を限定するものでも定義することを意
図するものではない。
【００２３】例 以下は、示したように様々な用途向けに設計した本発明
に従う連続床に対する重合反応混合物の例である。表Ｉ
は、生体分子を精製する分取用クロマトグラフィーに使
用される陰イオン交換カラムシステムの形成に用いられ
る成分を挙げてある。カラムシステムは、ＰＥＥＫ（ポ
リエーテルケトン）ポリッシャーカラムが後続する一次
ガラスカラムからなる。
に従う連続床に対する重合反応混合物の例である。表Ｉ
は、生体分子を精製する分取用クロマトグラフィーに使
用される陰イオン交換カラムシステムの形成に用いられ
る成分を挙げてある。カラムシステムは、ＰＥＥＫ（ポ
リエーテルケトン）ポリッシャーカラムが後続する一次
ガラスカラムからなる。
【００２４】
【表１】
【００２５】表ＩＩは、表Ｉと同じカラムシステムを用
い、生体分子を精製する分取用クロマトグラフィーに使
用される陽イオン交換カラムシステムの形成に用いられ
る成分を挙げてある。
い、生体分子を精製する分取用クロマトグラフィーに使
用される陽イオン交換カラムシステムの形成に用いられ
る成分を挙げてある。
【００２６】
【表２】
【００２７】表ＩおよびＩＩに挙げた混合物も、床容積
１０ｍＬ−１００ｍＬ以上を形成するように拡大（ある
いは縮小）でき、流量１００ｍＬ／分まで、背圧１，５
００ｐｓｉまでで運転できる。表ＩおよびＩＩに挙げた
混合物から形成された連続床は、使用前に好ましくは圧
縮される。床容量約６０％の圧縮は、中圧力分取クロマ
トグラフィーに特に有用なカラムをもたらし、床容量約
１０％−３０％（好ましくは約２０％）の圧縮は、低圧
力分取用クロマトグラフィーに特に有用なカラムをもた
らす。
１０ｍＬ−１００ｍＬ以上を形成するように拡大（ある
いは縮小）でき、流量１００ｍＬ／分まで、背圧１，５
００ｐｓｉまでで運転できる。表ＩおよびＩＩに挙げた
混合物から形成された連続床は、使用前に好ましくは圧
縮される。床容量約６０％の圧縮は、中圧力分取クロマ
トグラフィーに特に有用なカラムをもたらし、床容量約
１０％−３０％（好ましくは約２０％）の圧縮は、低圧
力分取用クロマトグラフィーに特に有用なカラムをもた
らす。
【００２８】表ＩＩＩおよびＩＶは、背圧３，０００ｐ
ｓｉまでの高圧力分析用クロマトグラフィー用に設計し
たそれぞれ陰イオンおよび陽イオン交換カラムに使用で
きる材料を挙げてある。
ｓｉまでの高圧力分析用クロマトグラフィー用に設計し
たそれぞれ陰イオンおよび陽イオン交換カラムに使用で
きる材料を挙げてある。
【００２９】
【表３】
【００３０】
【表４】
【００３１】以上は、説明を目的に主に記載したもので
ある。当業者には材料についての変更および置き換えは
容易に明瞭であろうし、またシステムの手順および他の
パラメーターが本発明の精神と範囲を逸脱することなく
導入できるであろう。
ある。当業者には材料についての変更および置き換えは
容易に明瞭であろうし、またシステムの手順および他の
パラメーターが本発明の精神と範囲を逸脱することなく
導入できるであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 30/48 B01D 15/08 C08F 2/10 C08F 18/08 C08F 20/06 C08F 20/10 C08F 20/56 C08F 20/58 G01N 33/50 G01N 33/68 ZNA
Claims (10)
- 【請求項１】 連続固体非粒状分離媒質が広がりわたる
内部横断面を有するクロマトグラフィーカラムにおい
て、モノマー混合物の重合により形成された該分離媒質
が、 （ａ）ビニル化合物、アリル化合物、アクリル化合物お
よびメタクリル化合物からなる群から選択される水溶性
の重合可能な化合物および （ｂ）架橋剤を含むモノマー混合物がさらに （ｃ）硫酸アンモニウムを含有する水溶液の重合により
形成され、 よって、該水溶液について該モノマー混合物中のモノマ
ーの重量％の合計が１０％−２０％であり、該モノマー
混合物中のモノマーの合計に対し該架橋剤のモル分率が
０．３−０．４であり、該水溶液中の硫酸アンモニウム
の濃度が０．４−０．８モル／ｌである、 ことを特徴とするクロマトグラフィーカラム。 - 【請求項２】 （ａ）が、 （ｉ）酢酸ビニル、アクリル酸、アクリル酸ブチル、ア
クリルアミド、メタクリルアミドおよびグリシジルアク
リルアミドからなる群から選択されるメンバーおよび （ｉｉ）荷電した基が共有結合したビニルモノマー、ア
クリルモノマーおよびメタクリルモノマーからなる群か
ら選択されるメンバーを含んでなる混合物である請求項
１記載のクロマトグラフィーカラム。 - 【請求項３】 （ｉｉ）が、正に荷電した基が共有結合
したビニルモノマー、アリルモノマー、アクリルモノマ
ーおよびメタクリルモノマーからなる群から選択される
メンバーであり、上記水溶液中の硫酸アンモニウムの濃
度が、０．５−０．７モル／ｌである請求項２記載のク
ロマトグラフィーカラム。 - 【請求項４】 （ｂ）が、Ｎ，Ｎ’−メチレン−ビス−
アクリルアミドおよびピペラジンジアクリルアミドから
なる群から選択されるメンバーである請求項１記載のク
ロマトグラフィーカラム。 - 【請求項５】 （ｉ）が、メタクリルアミドであり、
（ｂ）が、ピペラジンジアクリルアミドである請求項２
記載のクロマトグラフィーカラム。 - 【請求項６】 （ｉｉ）対（ｉ）のモル比が、０．０１
−０．２０である請求項２記載のクロマトグラフィーカ
ラム。 - 【請求項７】 （ｉ）が、メタクリルアミドであり、
（ｉｉ）が、ジアリルジメチルアンモニウムクロリドで
あり、（ｉｉ）対（ｉ）のモル比が、０．０５−０．１
０である請求項２記載のクロマトグラフィーカラム。 - 【請求項８】 （ｉ）が、メタクリルアミドであり、
（ｉｉ）が、２−アクリルアミド−２−メチル−１−プ
ロパンスルホン酸であり、（ｉｉ）対（ｉ）のモル比
が、０．１０−０．１５である請求項２記載のクロマト
グラフィーカラム。 - 【請求項９】 上記水溶液に関し上記モノマー混合物中
のモノマーの重量％の合計が、１２．５％−１７％であ
る請求項１記載のクロマトグラフィーカラム。 - 【請求項１０】 上記モノマー混合物中のモノマーの合
計に対し上記架橋剤のモル分率が、０．３２−０．３６
である請求項１記載のクロマトグラフィーカラム。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US77847297A | 1997-01-03 | 1997-01-03 | |
| US08/964,768 US5935429A (en) | 1997-01-03 | 1997-11-05 | Chromatography columns with continuous beds formed in situ from aqueous solutions |
| US08/778472 | 1997-11-06 | ||
| US08/964768 | 1997-11-06 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH116822A JPH116822A (ja) | 1999-01-12 |
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Family
ID=27119457
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP09360311A Expired - Fee Related JP3100129B2 (ja) | 1997-01-03 | 1997-12-26 | 水溶液からインシチューで形成された連続床を有するクロマトグラフィーカラム |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5935429A (ja) |
| EP (1) | EP0852334A1 (ja) |
| JP (1) | JP3100129B2 (ja) |
| CA (1) | CA2225703C (ja) |
Families Citing this family (39)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE9504205D0 (sv) * | 1995-11-24 | 1995-11-24 | Pharmacia Biotech Ab | A chromatographic separation method and device |
| US6048457A (en) | 1997-02-26 | 2000-04-11 | Millipore Corporation | Cast membrane structures for sample preparation |
| US6998047B1 (en) | 1997-02-26 | 2006-02-14 | Millipore Corporation | Cast membrane structures for sample preparation |
| US7232520B1 (en) | 1998-06-12 | 2007-06-19 | Waters Investments Limited | Ion exchange porous resins for solid phase extraction and chromatography |
| EP1091981B1 (en) | 1998-06-12 | 2007-08-22 | Waters Investments Limited | Novel ion exchange porous resins for solid phase extraction and chromatography |
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| US6423666B1 (en) * | 1999-10-05 | 2002-07-23 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Large-pore chromatographic beads prepared by suspension polymerization |
| US6267884B1 (en) * | 2000-01-04 | 2001-07-31 | Waters Investments Limited | Capillary columns employing monodispersed particles |
| JP2003520962A (ja) * | 2000-01-18 | 2003-07-08 | アドビオン バイオサイエンシーズ インコーポレーティッド | 分離媒体、複式電気噴霧ノズルシステム、および方法 |
| US7169298B2 (en) * | 2000-01-26 | 2007-01-30 | Transgenomic, Inc. | Method and apparatus for separating polynucleotides using monolithic capillary columns |
| JP2003534905A (ja) * | 2000-06-09 | 2003-11-25 | アドヴィオン バイオサイエンシィズ インコーポレイテッド | 多孔性ポリマーモノリスの表面修飾およびそれから得られた生成物 |
| US20020194901A1 (en) * | 2000-12-19 | 2002-12-26 | Showa Denko K.K. | Porous polymer particle, alkali-resistant anion exchanger, producing method thereof, column for ion chromatography, and method for measuring anions |
| US20030066336A1 (en) * | 2000-12-19 | 2003-04-10 | Showa Denko K.K. | Method for measuring anions |
| JP2004532392A (ja) * | 2001-02-20 | 2004-10-21 | アドヴィオン バイオサイエンシィズ インコーポレイテッド | 親和性吸着剤を有するマイクロチップ電子噴霧装置およびカラムならびにそれらの使用法 |
| EP1382963B1 (en) * | 2001-04-20 | 2008-09-03 | Gl Sciences Incorporated | Method and instrument for extracting trace component in solid phase |
| EP1417366A4 (en) | 2001-08-09 | 2010-10-27 | Waters Technologies Corp | INORGANIC / ORGANIC HYBRID MONOLITHIC MATERIALS FOR CHROMATOGRAPHIC SEPARATIONS AND PROCESS FOR THEIR PREPARATION |
| US6749749B2 (en) * | 2002-06-26 | 2004-06-15 | Isco, Inc. | Separation system, components of a separation system and methods of making and using them |
| US7473367B2 (en) * | 2002-06-26 | 2009-01-06 | Dionex Corporation | Monolithic column |
| US20050061745A1 (en) * | 2002-06-26 | 2005-03-24 | Teledyne Isco, Inc. | Separation system, components of a separation system and methods of making and using them |
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| US6858135B2 (en) * | 2002-11-15 | 2005-02-22 | Advanced Research And Technology Institute, Inc. | Hydrophilic monolithic columns for separation of saccharide mixtures |
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