JP2815700B2 - クロマトグラフィカラム及びこれを用いた分離方法 - Google Patents
クロマトグラフィカラム及びこれを用いた分離方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、分子の大きさ、電荷、疎水性及びバイオ親
和性のような普通のクラマトグラフィの性質に基づくク
ロマトグラフィ分離、そしてまたこのような分離に有用
なクロマトグラフィ分離に関する。
和性のような普通のクラマトグラフィの性質に基づくク
ロマトグラフィ分離、そしてまたこのような分離に有用
なクロマトグラフィ分離に関する。
発明の背景及び概要 従来のクロマトグラフィは、ビーズの床（bed）を通
るサンプルの通過を含む。しかし、完全に充填した床を
達成することは、不可能であった。充填した床の不均一
性、ゾーンの広がりを生じ、それは妨げるファクターと
なる。充填した床の他の不利な点は、ビーズの調製に必
要な、時間のかかるしかも高価な工程、所望の大きさを
選ぶためのビーズの篩分け、及びビーズによるカラムの
充填である。
るサンプルの通過を含む。しかし、完全に充填した床を
達成することは、不可能であった。充填した床の不均一
性、ゾーンの広がりを生じ、それは妨げるファクターと
なる。充填した床の他の不利な点は、ビーズの調製に必
要な、時間のかかるしかも高価な工程、所望の大きさを
選ぶためのビーズの篩分け、及びビーズによるカラムの
充填である。
これらの不利益は、単量体から形成された連続したし
かも凝集性のゲル・プラグ（gel plug）の形のクロマト
グラフィ分離媒体の使用により避けられることが分か
り、該単量体は、重合すると溶離液の通過を許すのに十
分なチャンネル（channels）を有し、しかも分子篩、イ
オン交換、疎水性相互作用、アフィニティ、ボロネート
及びダイ・リガンドのクロマトグラフィのような分離技
術にそれを有用にする性質を有する構造を形成する。こ
のようなチャンネルは、例えば単量体が水中の制限され
た溶解性を有するものを含むとき形成できる。これらの
単量体が十分な量又は割合で用いられるとき、得られた
重合体は、それらを溶液の外に沈殿させるのに十分な疎
水性を有する。この沈殿の結果、重合体鎖は、束（bund
les）で互いに付着しがちになり、前記の空所（voids）
又はチャンネルは束の間に形成される。この記述に合致
する単量体の一つの例は、N,N′−メチレンビスアクリ
ルアミドであり、本発明における好ましい重合体は、ポ
リ尿素類、特にポリアクリルアミド類である。
かも凝集性のゲル・プラグ（gel plug）の形のクロマト
グラフィ分離媒体の使用により避けられることが分か
り、該単量体は、重合すると溶離液の通過を許すのに十
分なチャンネル（channels）を有し、しかも分子篩、イ
オン交換、疎水性相互作用、アフィニティ、ボロネート
及びダイ・リガンドのクロマトグラフィのような分離技
術にそれを有用にする性質を有する構造を形成する。こ
のようなチャンネルは、例えば単量体が水中の制限され
た溶解性を有するものを含むとき形成できる。これらの
単量体が十分な量又は割合で用いられるとき、得られた
重合体は、それらを溶液の外に沈殿させるのに十分な疎
水性を有する。この沈殿の結果、重合体鎖は、束（bund
les）で互いに付着しがちになり、前記の空所（voids）
又はチャンネルは束の間に形成される。この記述に合致
する単量体の一つの例は、N,N′−メチレンビスアクリ
ルアミドであり、本発明における好ましい重合体は、ポ
リ尿素類、特にポリアクリルアミド類である。
ゲル・プラグの均一制の高い構造は、溶離液を非常に
狭いゾーンに分離し、プラグは、単に単量体溶液を囲い
（enclosure）に満たすだけで、クロマトグラフィ分離
が生ずべき毛管、カラム又は他の囲いで直接、容易にし
かも再生可能に調製される。
狭いゾーンに分離し、プラグは、単に単量体溶液を囲い
（enclosure）に満たすだけで、クロマトグラフィ分離
が生ずべき毛管、カラム又は他の囲いで直接、容易にし
かも再生可能に調製される。
本発明でいう水不溶性プラグとは、カラム断面領域に
及び、上記のように、単量体から形成された連続したし
かも凝集性のゲル・プラグの形のクラマトグラフィー分
離媒体であって、カラムに導入した重合体粒子の集合体
のようなものを包含するものではない。
及び、上記のように、単量体から形成された連続したし
かも凝集性のゲル・プラグの形のクラマトグラフィー分
離媒体であって、カラムに導入した重合体粒子の集合体
のようなものを包含するものではない。
発明のその他の特長及び利点は、下記の記述から明ら
かになるだろう。
かになるだろう。
発明の詳細な説明及び好ましい態様 ここで記載される連続したしかもチャンネル浸透の構
造は、その他の方法では透明なポリアクリルアミド・ゲ
ルを不透明（opalescent）にし、即ちそれをより水に溶
け難くするのに十分な程度の橋かけ結合から生ずるもの
である。この橋かけ結合の程度は又、水及びサンプル成
分の分子の通過を行わせるのに十分なほど大きい割れ目
（cracks）又はチャンネルを重合体の組織に形成するの
に十分なように重合体の鎖を互いに密に引き寄せるもの
であろう。割れ目に隣接する連続的構造は、多孔性でも
又は非多孔性でもよい。
造は、その他の方法では透明なポリアクリルアミド・ゲ
ルを不透明（opalescent）にし、即ちそれをより水に溶
け難くするのに十分な程度の橋かけ結合から生ずるもの
である。この橋かけ結合の程度は又、水及びサンプル成
分の分子の通過を行わせるのに十分なほど大きい割れ目
（cracks）又はチャンネルを重合体の組織に形成するの
に十分なように重合体の鎖を互いに密に引き寄せるもの
であろう。割れ目に隣接する連続的構造は、多孔性でも
又は非多孔性でもよい。
一般に、これらのチャンネルの形成は、少なくとも約
0.45、好ましくは少なくとも約0.55、そして最も好まし
くは少なくとも約0.70の橋かけ剤対線状形成単量体のモ
ル比を用いることにより達成されるだろう。
0.45、好ましくは少なくとも約0.55、そして最も好まし
くは少なくとも約0.70の橋かけ剤対線状形成単量体のモ
ル比を用いることにより達成されるだろう。
重合体を形成するのに用いられる単量体は、プラグが
用いられようとするクロマトグラフィのタイプに応じて
選ばれよう。クロマトグラフィの任意の特別なタイプに
適切な単量体の分子構造及び単量体の官能基の選択は、
当業者に容易に明らかであろう。従って、人々は、例え
ば本発明内で分子篩クロマトグラフィ、イオン交換クロ
マトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフ
ィニティクロマトグラフィ、ボロネートクロマトグラフ
ィ及びダイ・リガンドクロマトグラフィに適したプラグ
をデザインできる。
用いられようとするクロマトグラフィのタイプに応じて
選ばれよう。クロマトグラフィの任意の特別なタイプに
適切な単量体の分子構造及び単量体の官能基の選択は、
当業者に容易に明らかであろう。従って、人々は、例え
ば本発明内で分子篩クロマトグラフィ、イオン交換クロ
マトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフ
ィニティクロマトグラフィ、ボロネートクロマトグラフ
ィ及びダイ・リガンドクロマトグラフィに適したプラグ
をデザインできる。
好ましい線状形成単量体は、アクリルアミド類及びア
クリル酸の他の誘導体である。アクリルアミドそれ自体
は、特に好ましい線状形成単量体であり、それは、単独
で又は他の構造的に関連のあるもの例えばアクリル酸の
メチルエステルとの組み合わせで用いることができる。
好ましい橋かけ剤は、前述の通り、N,N′−メチレンビ
スアクリルアミドであり、そして線状形成単量体がアク
リルアミドである系では、前記のモル比は、50％又はそ
れ以上、55％又はそれ以上、そして60％又はそれ以上の
Ｃ値（橋かけ剤及び線状形成単量体の合計に対する橋か
け剤の重量％）に相当する。
クリル酸の他の誘導体である。アクリルアミドそれ自体
は、特に好ましい線状形成単量体であり、それは、単独
で又は他の構造的に関連のあるもの例えばアクリル酸の
メチルエステルとの組み合わせで用いることができる。
好ましい橋かけ剤は、前述の通り、N,N′−メチレンビ
スアクリルアミドであり、そして線状形成単量体がアク
リルアミドである系では、前記のモル比は、50％又はそ
れ以上、55％又はそれ以上、そして60％又はそれ以上の
Ｃ値（橋かけ剤及び線状形成単量体の合計に対する橋か
け剤の重量％）に相当する。
重合体がポリアクリルアミドである発明の好ましい態
様では、アクリルアミド単量体とともに用いられる当業
者に周知の任意の広範囲の橋かけ剤が、用いられる。こ
のような剤な中に、ビスアクリルアミド類、ジアクリレ
ート類並びに広範囲の末端ジエン類が含まれる。特定の
例は、ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド、ジア
リルタルタルジアミド、トリアリルシトリックトリアミ
ド、エチレンジアクリレート、ビスアクリリルシスタミ
ン及びN,N′−メチレンビスアクリルアミドである。
様では、アクリルアミド単量体とともに用いられる当業
者に周知の任意の広範囲の橋かけ剤が、用いられる。こ
のような剤な中に、ビスアクリルアミド類、ジアクリレ
ート類並びに広範囲の末端ジエン類が含まれる。特定の
例は、ジヒドロキシエチレンビスアクリルアミド、ジア
リルタルタルジアミド、トリアリルシトリックトリアミ
ド、エチレンジアクリレート、ビスアクリリルシスタミ
ン及びN,N′−メチレンビスアクリルアミドである。
プラグは、当業者に周知の従来の技術による重合によ
り形成される。プラグは、例えば、プラグが用いられよ
うとするケーシング又はカラム管中で直接、単量体及び
橋かけ剤及び重合触媒及び他の従来の添加物の水溶液か
ら形成できる。このような場合、プラグをカラムの内壁
に共有的に結合させることが有利であろう。これは、従
来の技術に従って、結合剤例えばバインド・シラン（Bi
nd Silane）により達成できよう。重合体成分が溶液の
約１重量％〜約20重量％を構成する水溶液が好ましい。
この範囲内で、約２％〜約10％の濃度がさらに好まし
く、そして約2.5％〜約５％の濃度が最も好ましい。
り形成される。プラグは、例えば、プラグが用いられよ
うとするケーシング又はカラム管中で直接、単量体及び
橋かけ剤及び重合触媒及び他の従来の添加物の水溶液か
ら形成できる。このような場合、プラグをカラムの内壁
に共有的に結合させることが有利であろう。これは、従
来の技術に従って、結合剤例えばバインド・シラン（Bi
nd Silane）により達成できよう。重合体成分が溶液の
約１重量％〜約20重量％を構成する水溶液が好ましい。
この範囲内で、約２％〜約10％の濃度がさらに好まし
く、そして約2.5％〜約５％の濃度が最も好ましい。
サンプルのその成分への分離は、従来の技術に従って
同様に達成される。水又は好ましくは約7.0〜約8.5のpH
の緩衝溶液が、プラグを通るサンプルのための担体とし
て好適に働き、そして流れはポンプ処理又は重力流によ
り達成できる。次に、分離したサンプル成分の検出は、
もし必要ならば染色法（staining methods）を用いるカ
ラムそれ自体で、又はカラムからの個々の成分の溶離液
としてのプラグの下流部分又はカラムの外側で、従来の
手段により達成される。このタイプの分離媒体は、約10
00〜約1,000,000に及ぶ分子量を有するものの分離に特
に有効である。
同様に達成される。水又は好ましくは約7.0〜約8.5のpH
の緩衝溶液が、プラグを通るサンプルのための担体とし
て好適に働き、そして流れはポンプ処理又は重力流によ
り達成できる。次に、分離したサンプル成分の検出は、
もし必要ならば染色法（staining methods）を用いるカ
ラムそれ自体で、又はカラムからの個々の成分の溶離液
としてのプラグの下流部分又はカラムの外側で、従来の
手段により達成される。このタイプの分離媒体は、約10
00〜約1,000,000に及ぶ分子量を有するものの分離に特
に有効である。
下記の実施例は、説明の目的のみに提供され、そして
決して発明を制限したり又は規定することを目的とする
ものではない。
決して発明を制限したり又は規定することを目的とする
ものではない。
実施例 ガラスウールのプラグを、ピペットの収縮した部分の
頂部でパスツールピペットに置いた。ホースクランプを
備えたある長さのプラスチック管をピペットの先端に取
り付けた。
頂部でパスツールピペットに置いた。ホースクランプを
備えたある長さのプラスチック管をピペットの先端に取
り付けた。
0.01Mトリス−HCl及び10％（重量／容量）シュクロー
スを含むpH7.5の緩衝溶液を、ピペットに注いだ。次
に、ホースクランプを開いた。緩衝液のレベル（buffer
level）がガラスウールに達したとき、ホースクランプ
を閉じて緩衝液の流れを停止させた。
スを含むpH7.5の緩衝溶液を、ピペットに注いだ。次
に、ホースクランプを開いた。緩衝液のレベル（buffer
level）がガラスウールに達したとき、ホースクランプ
を閉じて緩衝液の流れを停止させた。
次に、脱気した混合物をピペットに注ぎそして重合さ
せた。上記混合物は、1mlのアクリルアミド及びN,N′−
メチレンビスアクリルアミドの水溶液（下記の濃度及び
割合）、６μのペルオクソ二硫酸アンモニウムの10％
（重量／容量）溶液及び１μのテトラメチルエチレン
ジアミンよりなかった。
せた。上記混合物は、1mlのアクリルアミド及びN,N′−
メチレンビスアクリルアミドの水溶液（下記の濃度及び
割合）、６μのペルオクソ二硫酸アンモニウムの10％
（重量／容量）溶液及び１μのテトラメチルエチレン
ジアミンよりなかった。
一度溶液が重合すると、それは、ガラスウール上のピ
ペットの幅に及ぶ水不溶性の連続した構造を形成した。
次に、下記の成分よりなるサンプルを、重合体構造の頂
部に適用した。
ペットの幅に及ぶ水不溶性の連続した構造を形成した。
次に、下記の成分よりなるサンプルを、重合体構造の頂
部に適用した。
フィコエリトリン ……分子量290,000 フィコシアニン ……分子量135,000 チトクローム ……分子量 13,000 ブロムフェノールブルー ……分子量 1,000 0.01Mトリス−HClよりなるpH7.5の緩衝溶液をサンプ
ルの上に重ね、そしてサンプル及び緩衝溶液を重力流に
よりピペットを通して流れさせた。種々のポリアクリル
アミド組成及び緩衝溶液の流速を、下記の表に示したよ
うに用いた。この表では、記号Ｔは、形成する溶液中で
組み合わされたアクリルアミド及びN,N′−メチレンビ
スアクリルアミドの濃度（重量％）を示し、記号Ｃは、
アクリルアミド及びN,N′−メチレンビスアクリルアミ
ドの組合せに対するＮ、Ｎ′−メチレンビスアクリルア
ミドの重量％で表された割合を示し、最後の欄は、各Ｃ
値に対する互いに相対的な値の流速を表す。Ｔ＝４、Ｃ
＝60について与えられた流速は、全溶離に関し約４〜５
時間に等しい。直接の比較は、単一のＴ値により種々の
Ｃ値の流速の中で行うことができる。
ルの上に重ね、そしてサンプル及び緩衝溶液を重力流に
よりピペットを通して流れさせた。種々のポリアクリル
アミド組成及び緩衝溶液の流速を、下記の表に示したよ
うに用いた。この表では、記号Ｔは、形成する溶液中で
組み合わされたアクリルアミド及びN,N′−メチレンビ
スアクリルアミドの濃度（重量％）を示し、記号Ｃは、
アクリルアミド及びN,N′−メチレンビスアクリルアミ
ドの組合せに対するＮ、Ｎ′−メチレンビスアクリルア
ミドの重量％で表された割合を示し、最後の欄は、各Ｃ
値に対する互いに相対的な値の流速を表す。Ｔ＝４、Ｃ
＝60について与えられた流速は、全溶離に関し約４〜５
時間に等しい。直接の比較は、単一のＴ値により種々の
Ｃ値の流速の中で行うことができる。
正の重力流が検出可能な例では、前記の４種の成分が
増大する分子量の順序で別々のバンドに分離でき、最大
の分子量の成分（フィコエリトリン）は、カラムを通る
最大の移動度を示した。
増大する分子量の順序で別々のバンドに分離でき、最大
の分子量の成分（フィコエリトリン）は、カラムを通る
最大の移動度を示した。
前述は、主として説明の目的で提供されている。系の
材料、方法及び他のパラメータの点の変更及び置換は、
発明の趣旨及び範囲から外れることなく導入できること
は、当業者により容易に明らかであろう。
材料、方法及び他のパラメータの点の変更及び置換は、
発明の趣旨及び範囲から外れることなく導入できること
は、当業者により容易に明らかであろう。
Claims (10)
- 【請求項１】クロマトグラフィカラムの断面領域に及ぶ
水不溶性単一分子よりなる分離媒体を含み、該プラグ
が、高分子溶離物（macromolecular eluents）を浸透し
うるチャンネルを形成するのに、十分の程度の橋かけを
有し且つ十分に疎水性である橋かけした重合体よりな
る、クロマトグラフィカラム。 - 【請求項２】前記の橋かけした重合体が、線状形成単量
体及び橋かけ剤の混合物から形成され、線状形成単量体
及び橋かけ剤の合計に対する橋かけ剤のモル比が、少な
くとも約0.45である請求項１記載のクロマトグラフィカ
ラム。 - 【請求項３】前記の橋かけした重合体が、アクリルアミ
ドを含む線状形成単量体及びビスアクリルアミドである
橋かけ剤の混合物から形成される請求項１記載のクロマ
トグラフィカラム。 - 【請求項４】前記の橋かけした重合体が、アクリルアミ
ドを含む線状形成単量体及びN,N′−メチレンビスアク
リルアミドである橋かけ剤の混合物から形成され、該N,
N′−メチレンビスアクリルアミドが、該アクリルアミ
ド及び該N,N′−メチレンビスアクリルアミドの合計の
少なくとも約50重量％を構成する請求項１記載のクロマ
トグラフィカラム。 - 【請求項５】液体サンプル中の高分子物の混合物を分子
の大きさに基づいて成分に分離する方法において、クロ
マトグラフィカラムの断面領域に及ぶ水不溶性プラグよ
りなる分離媒体を含むクロマトグラフィカラムに該サン
プルを通して、該成分を該プラグ内で実質的に別々のバ
ンドに分離させ、該プラグが、高分子溶離物を浸透しう
るチャンネルを形成するのに、十分な程度の橋かけを有
し且つ十分に疎水性である橋かけした重合体よりなる方
法。 - 【請求項６】前記の橋かけした重合体が、線状形成単量
体及び橋かけ剤の混合物から形成され、線状形成単量体
及び橋かけ剤の合計に対する橋かけ剤のモル比が、少な
くとも約0.45であり、そして前記のプラグが、水により
飽和されたとき、該プラグ及び該水を合わせた重量の約
１％〜約20％を構成する請求項５記載の方法。 - 【請求項７】前記の橋かけした重合体が、アクリルアミ
ドを含む線状形成単量体及びN,N′−メチレンビスアク
リルアミドである橋かけ剤の混合物から形成される請求
項５記載の方法。 - 【請求項８】前記のプラグが、約7.0〜約8.5のpHで緩衝
溶液により飽和され、そして該プラグが、該プラグ及び
該水を合わせた重量の約2.5％〜約５％を構成する請求
項５記載の方法。 - 【請求項９】前記のプラグを通るサンプルの前記の通過
が、重力流により達成される請求項５記載の方法。 - 【請求項１０】液体サンプル中の高分子物の混合物を分
子の大きさに基づいて成分に分離する方法において、ア
クリルアミド及びN,N′−メチレンビスアクリルアミド
の混合物から形成された橋かけされたポリアクリルアミ
ドの水不溶性の流体浸透性プラグから構成されたクロマ
トグラフィカラムに該サンプルを通し、該N,N′−メチ
レンビスアクリルアミドが、該アクリルアミド及び該N,
N′−メチレンビスアクリルアミドの合計の少なくとも
約55重量％を構成し、さらに該プラグが、水により飽和
されたとき、該プラグ及び該水を合わせた重量の約2.5
％〜約５％を構成する方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US29750189A | 1989-01-13 | 1989-01-13 | |
| US297,501 | 1989-01-13 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03505784A JPH03505784A (ja) | 1991-12-12 |
| JP2815700B2 true JP2815700B2 (ja) | 1998-10-27 |
Family
ID=23146575
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| Country | Link |
|---|---|
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| JP (1) | JP2815700B2 (ja) |
| CA (1) | CA2007723C (ja) |
| DE (1) | DE69020246T2 (ja) |
| WO (1) | WO1990007965A1 (ja) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5645717A (en) * | 1989-01-13 | 1997-07-08 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Hydrophobic polymers from water-soluble monomers and their use as chromatography media |
| EP0609373B1 (en) * | 1991-10-21 | 1996-05-22 | Cornell Research Foundation, Inc. | Column with macroporous polymer media |
| DE69524749D1 (de) * | 1994-06-15 | 2002-01-31 | Purdue Research Foundation West Lafayette | Vorrichtung zum packen von chromatografischen stationären phasen |
| US5728457A (en) * | 1994-09-30 | 1998-03-17 | Cornell Research Foundation, Inc. | Porous polymeric material with gradients |
| US6066258A (en) | 1997-12-05 | 2000-05-23 | Transgenomic, Inc. | Polynucleotide separations on polymeric separation media |
| SE9504205D0 (sv) * | 1995-11-24 | 1995-11-24 | Pharmacia Biotech Ab | A chromatographic separation method and device |
| US5647979A (en) * | 1996-06-14 | 1997-07-15 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | One-step preparation of separation media for reversed-phase chromatography |
| US5935429A (en) * | 1997-01-03 | 1999-08-10 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Chromatography columns with continuous beds formed in situ from aqueous solutions |
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| US6048457A (en) | 1997-02-26 | 2000-04-11 | Millipore Corporation | Cast membrane structures for sample preparation |
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| WO2001068240A2 (en) * | 2000-03-14 | 2001-09-20 | Hammen Corporation | Composite matrices with interstitial polymer networks |
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| US6833238B2 (en) | 2002-01-04 | 2004-12-21 | Applera Corporation | Petal-array support for use with microplates |
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| US6749749B2 (en) | 2002-06-26 | 2004-06-15 | Isco, Inc. | Separation system, components of a separation system and methods of making and using them |
| JP2004264045A (ja) * | 2003-02-03 | 2004-09-24 | Japan Organo Co Ltd | イオンクロマトグラフィー装置用カラム、サプレッサー及びイオンクロマトグラフィー装置 |
| JP4931006B2 (ja) * | 2007-08-03 | 2012-05-16 | オルガノ株式会社 | モノリス状有機多孔質イオン交換体、その使用方法、製造方法及び製造に用いる鋳型 |
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|---|---|---|---|---|
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| NL6803739A (ja) * | 1968-03-15 | 1969-09-17 | ||
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| US3878092A (en) * | 1973-03-12 | 1975-04-15 | Phillips Petroleum Co | Chromatographic colums |
| JPS54137398A (en) * | 1978-04-18 | 1979-10-25 | Sekisui Chemical Co Ltd | Filled material for liquid chromatography |
| JPS5640758A (en) * | 1979-09-12 | 1981-04-17 | Terukazu Suzuki | Filling agent for gel chromatography |
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-
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- 1990-01-08 EP EP90902731A patent/EP0407560B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-08 WO PCT/US1990/000191 patent/WO1990007965A1/en active IP Right Grant
- 1990-01-08 DE DE69020246T patent/DE69020246T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-01-12 CA CA 2007723 patent/CA2007723C/en not_active Expired - Lifetime
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| DE69020246D1 (de) | 1995-07-27 |
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| CA2007723C (en) | 1995-01-31 |
| CA2007723A1 (en) | 1990-07-13 |
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