KR20220078634A - 단백질 a 친화성 크로마토그래피에서 모노클로날 항체의 용리 - Google Patents

Abstract

본 발명은 모노클로날 항체가 결합되어 있는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 모노클로날 항체를 용리하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다
a) 친화성 크로마토그래피 칼럼을 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체를 포함하는 용리 완충제와 접촉시키는 단계;
b) 단계 (a) 에서 수득된 모노클로날 항체를 함유하는 하나 이상의 분획을 수집하는 단계;
c) 단계 (b) 에서 수득된 분획을 조합하여 용리 산물 풀을 형성하는 단계.

Description

단백질 A 친화성 크로마토그래피에서 모노클로날 항체의 용리

본 발명은 모노클로날 항체가 결합되어 있는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 모노클로날 항체 (mAb) 를 용리하기 위한 개선된 방법에 관한 것이다.

모노클로날 항체 (mAb) 에 관한 치료적 응용은 오늘날의 의학적 필요에서 증가하는 역할을 수행한다. 단백질 A 친화성 크로마토그래피는 모노클로날 항체를 정제하기 위한 공지된 널리 사용되는 도구이다. mAb 의 Fc 영역과 고정화된 단백질 A 사이에서 존재하는 항체와의 특이적 상호작용 및 높은 전도성을 용인하는 능력으로 인해, 단백질-A 크로마토그래피는 수확된 세포 배양 유체 (HCCF) 의 직접 로딩을 허용하고, 대부분의 프로세스 및 산물 관련 불순물을 제거하면서 항체 풀을 농축시키는 것을 가능하게 한다 (Vunnum et al., 2009. Protein-A based affinity chromatography. In: Gottschalk U, editor. Process scale purification of antibodies. Hoboken, NJ: John Wiley BT & Sons, Inc. p 79-102).

생명공학적으로 생산된 모노클로날 항체의 다운스트림 프로세싱은 전형적으로 적어도 둘의 크로마토그래피 단계를 포함한다: 수확된 세포 배양 유체 (HCCF) 로부터 비-항체 분자를 제거하기 위한, 예를 들어 단백질 A 를 사용하는 첫번째 친화성 크로마토그래피 단계, 그에 뒤이은 이온 교환 크로마토그래피 단계와 같은 하나 이상의 추가의 단계. 크로마토그래피 칼럼으로부터의 모노클로날 항체의 용리는 프로세스 수행에서 필수 단계이며, 분리 선택성 및 산물을 함유하는 풀 부피를 결정한다 (Angelo, J.M., Lenhoff, A.M. 2016. Determinants of protein elution rates from preparative ion-exchange adsorbents, J Chromatogr A; 1440; 94-104). 약제학적 제형에 관해서 뿐만 아니라 다운스트림 프로세싱에서의 중간체에 관해서, 경제적인 취급을 위한 작은 부피를 달성하기 위해 농축된 용액이 요구된다. 그러므로, 큰 풀 부피 및 느린 용리 속도는 단백질 A 크로마토그래피와 같은 친화성-기반 분리에 바람직하지 않다. 따라서, 특히 더 높은 용량 및 감소된 프로세싱 시간에 관하여 다운스트림 프로세스에서의 개선에 상당한 관심이 있다.

발명의 요약

놀랍게도, 모노클로날 항체의 단백질 A 크로마토그래피에서의 용리 완충제에 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체를 첨가하면 항체 용리가 향상되어 유의하게 더 낮은 용리 풀 부피를 초래하는 한편 부형제를 첨가하지 않은 대조군 조건 또는 단백질을 안정화시키고 응집을 방지하기 위해 제형 적용에 통상적으로 사용되는 선택된 이당류 또는 폴리올을 첨가한 대조군 조건과 비교할 때 비슷한 수율을 유지하는 것으로 밝혀졌다.

특히, 본 발명은 모노클로날 항체가 결합되어 있는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 모노클로날 항체를 용리하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다

a) 친화성 크로마토그래피 칼럼을 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체를 포함하는 용리 완충제와 접촉시키는 단계;

b) 단계 (a) 에서 수득된 모노클로날 항체를 함유하는 하나 이상의 분획을 수집하는 단계;

c) 잠재적으로 단계 (b) 에서 수득된 분획을 조합하여 용리 산물 풀을 형성하는 단계.

유리하게는, 이들 조건 하에서의 분리는 훨씬 더 적은 양의 용리제를 사용하여 수행될 수 있다.

동시에, 더 높은 수율 및 개선된 순도로 산물이 수득될 수 있다. 아래 제공된 실시예는 이것을 매우 명확하게 보여준다.

바람직하게는, 용리 완충제는 2 중량% 내지 15 중량%, 더욱 바람직하게는 5 중량% 내지 10 중량% 의 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체의 농도를 갖는다는 것이 밝혀졌다.

본 발명의 바람직한 실시양태에서, 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체는 1,000 g/mol 내지 10,000 g/mol, 더욱 바람직하게는 3,000 g/mol 내지 5,000 g/mol 범위의 평균 분자량을 갖는다.

본 발명의 또다른 바람직한 실시양태에서 용리 완충제는 시트레이트 완충제이다.

본 발명의 유리한 양태에 따르면 용리 단계 (a) 는 pH 5.5 내지 pH 2.75 의 용리 완충제 구배를 사용하여 친화성 크로마토그래피 칼럼을 용리 완충제와 접촉시키는 것을 포함한다.

본 발명의 추가의 바람직한 실시양태에서 용리 산물 풀은 약 3.9 내지 약 4.2 의 pH 를 갖는다.

발명의 상세한 설명

모노클로날 항체의 다운스트림 프로세싱에서, 단백질 A 크로마토그래피와 같은 친화성-기반 크로마토그래피 프로세스가 용출액 풀 부피가 작은 농축된 용액을 얻는 것이 바람직하다. 본 발명은 이제 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체를 포함하는 용리 완충제의 사용을 포함하는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 모노클로날 항체를 용리하는 방법을 제공한다. 용리 완충제에 폴리 (에틸렌 글리콜)을 첨가하면 용리가 더 낮은 pH 값으로 이동하는 한편 날카로운 용리 피크가 보이는 것으로 밝혀졌다. 이는 칼럼 출구로부터 고도로 농축된 용출액 분획을 수집하는 것을 허용하고 감소된 전체 용출액 풀 부피를 가능하게 한다. 게다가, 용리 후 낮은 pH 는 바이러스 불활성화에 유리하다. 모노클로날 항체의 다운스트림 프로세싱에서, 이러한 개선은 더 높은 용량 및 감소된 프로세싱 시간을 초래한다.

본원에서 사용되는, 용어 "항체" 는 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 임의의 형태의 항체 또는 이의 단편을 의미한다. 따라서, 항체는 가장 넓은 의미로 사용되고, 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 구체적으로 모노클로날 항체 (전장 모노클로날 항체를 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이성 항체 (예를 들어, 이중특이성 항체), 및 항체 단편을 포괄한다. "단리된 항체" 는 결합 화합물의 정제 상태를 지칭하고, 그러한 맥락에서 분자에 핵산, 단백질, 지질, 탄수화물과 같은 다른 생물학적 분자, 또는 세포 파편 및 성장 배지와 같은 다른 물질이 실질적으로 없음을 의미한다. 일반적으로, 용어 "단리된" 은, 본원에 기재된 바와 같은 결합 화합물의 실험적 또는 치료적 사용을 실질적으로 방해하는 양으로 존재하지 않는 한, 이러한 물질의 완전한 부재 또는 물, 완충제 또는 염의 부재를 지칭하는 것으로 의도되지 않는다.

본원에서 사용되는, 용어 "모노클로날 항체" 는 실질적으로 동종인 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하며, 즉 집단을 구성하는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생적 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 고도로 특이적이며, 단일 항원성 에피토프를 향한다. 대조적으로, 종래의 (폴리클로날) 항체 제제는 전형적으로 상이한 에피토프를 향하는 (또는 상이한 에피토프에 특이적인) 다수의 항체를 포함한다. 수식어 "모노클로날" 은 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 얻어진 항체의 특징을 나타내며, 임의의 특별한 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 여겨져서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 Kohler et al., (1975) Nature 256: 495 에 의해 최초로 기재된 하이브리도마 방법에 의해 제조될 수 있거나, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제 4,816,567 호 참고) 에 의해 제조될 수 있다. "모노클로날 항체" 는 또한, 예를 들어, Clackson et al., (1991) Nature 352: 624-628 및 Marks et al., (1991) J. Mol. Biol. 222: 581-597 에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리될 수 있다.

본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종에서 유래하거나 특정 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내 대응 서열과 동일하거나 상동성인 한편, 사슬(들)의 나머지는 또다른 종에서 유래하거나 또다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내 대응 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (면역글로불린), 뿐만 아니라, 요망되는 생물학적 활성을 나타내는 한 그러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제 4,816,567 호; 및 Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855).

용어 "단백질 A 친화성 크로마토그래피" 는 단백질 A 를 사용하여 물질 및/또는 입자를 분리 또는 정제하는 것을 의미하며, 단백질 A 는 일반적으로 고체상에 고정화되어 있다. 단백질 A 는 원래 스타필로코쿠스 아우레우스에서 발견된 40-60 kD 세포 벽 단백질이다. 단백질 A 수지에 대한 항체의 결합은 고도로 특이적이다. 본원에서 단백질 A 친화성 크로마토그래피에서 사용하기 위한 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼은 폴리비닐에테르 고체 상에 고정화된 단백질 A, 예를 들어 Eshmuno® 칼럼 (Merck, Darmstadt, Germany), 공극 유리 매트릭스에 고정화된 단백질 A, 예를 들어 ProSep® 칼럼 (Merck, Darmstadt, Germany), 아가로스 고체 상에 고정화된 단백질 A, 예를 들어 MABSELECT™ SuRe™ 칼럼 (GE Healthcare, Uppsala, Sweden) 을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 용어 "완충제" 는 그것의 산-염기 컨쥬게이트 성분의 작용에 의해 pH 변화에 저항하는 완충되는 용액을 지칭한다. "용리 완충제" 는 크로마토그래피 칼럼으로부터 단백질을 용리하는데 사용되는 완충제다. 본 발명의 단백질 A 친화성 크로마토그래피를 위한 용리 완충제는 약 2.75 내지 5.5 범위의 pH 를 갖는다. pH 를 이 범위 내에서 제어할 완충제의 예는 포스페이트, 아세테이트, 시트레이트 또는 암모늄 완충제, 또는 하나 초과를 포함한다. 바람직한 이러한 완충제는 시트레이트이다.

용어 "폴리 (에틸렌 글리콜)" 또는 "PEG" 는 에틸렌 옥사이드 단위체로 구성된 장쇄 선형 합성 중합체를 지칭한다. 에틸렌 옥사이드 단위체는 다양할 수 있으며, 대략 200 g/mol 내지 100,000 g/mol 범위의 분자량을 갖는 PEG 이 얻어질 수 있다. 이러한 폴리 (에틸렌 글리콜)은 분자의 부분들의 최적의 거리를 위한 스페이서이거나, 분자의 화학적 합성으로부터 생성되는, 결합 반응에 필요한 하나 이상의 추가의 화학적 기(들)를 함유할 수 있다. 이들 추가의 화학적 기는 폴리 (에틸렌 글리콜)의 분자량 계산에 사용되지 않는다. 또한, 이러한 폴리 (에틸렌 글리콜) 은 함께 연결된 하나 이상의 폴리 (에틸렌 글리콜)-사슬을 포함할 수 있다. 하나 초과의 폴리 (에틸렌 글리콜)-사슬을 갖는 폴리 (에틸렌 글리콜)은 멀티암 (multiarmed) 또는 분지형 폴리 (에틸렌 글리콜)로 호칭된다.

폴리 (에틸렌 글리콜)은 실질적으로 분자량이 다양하지만, 약 400 g/mol 내지 약 30,000 g/mol 범위의 분자량을 갖는 중합체가 일반적으로 적합하다. 본 발명의 실시예에서, 평균 분자량 4,000 g/mol 의 폴리에틸렌 글리콜 (PEG4000) 이 선택된다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 1,000 g/mol 내지 10,000 g/mol, 더욱 바람직하게는 3,000 g/mol 내지 5,000 g/mol 범위의 평균 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜이 적합하게 선택된다.

하기 예는 그러므로 감소된 부피의 용리제를 사용하여 모노클로날 항체가 결합되어 있는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 모노클로날 항체를 분리하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법을 제공한다:

a) 로딩된 친화성 크로마토그래피 칼럼을 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체를 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 날카로운, 좁은 용리 피크를 유도하는 단계,

b) 단계 (a) 에서 수득된 모노클로날 항체를 함유하는 용리된 분획 중 하나 이상을 수집하는 단계,

c) 잠재적으로 단계 (b) 에서 수득된 분획을 조합하여 용리 산물 풀을 형성하는 단계,

그에 의해

d) 요망되는 모노클로날 항체의 개선된 순도가 달성되고 약 9% 이상의 HCP 가 분리되고 4% 초과 만큼의 수율 증가가 달성된다.

유리하게는 이 방법을 수행함으로써 용리제에 대한 요구량이 대략 적어도 11 부피% 만큼 감소된다.

하기 실시예는 첨가되는 부형제의 양 및 선택을 최적화함으로써, 용리제의 필요한 양이 여전히 감소될 수 있고, 이에 의해 달성가능한 순도가 또한 개선될 수 있음을 보여준다.

도 1 은 부형제를 첨가한 및 첨가하지 않은 pH 구배 용리를 사용하는 Eshmuno® A 상에서의 정화된 수확물 mAbA 용리 프로파일을 보여준다 (실시예 2).
도 2 는 부형제를 첨가한 및 첨가하지 않은 pH 구배 용리를 사용하는 ProSep® Ultra Plus 상에서의 정화된 수확물 mAbA 용리 프로파일을 보여준다 (실시예 3).
도 3 은 부형제를 첨가한 및 첨가하지 않은 pH 구배 용리를 사용하는 MabSelect™ Sure™ 상에서의 정화된 수확물 mAbA 용리 프로파일을 보여준다 (실시예 4).
도 4 는 부형제를 첨가한 및 첨가하지 않은 pH 구배 용리를 사용하는 Eshmuno® A 상에서의 정화된 수확물 mAbB 용리 프로파일을 보여준다 (실시예 5).
도 5 는 부형제를 첨가한 및 첨가하지 않은 pH 구배 용리를 사용하는 ProSep® Ultra Plus 상에서의 정화된 수확물 mAbB 용리 프로파일을 보여준다 (실시예 6).
도 6 은 부형제를 첨가한 및 첨가하지 않은 pH 구배 용리를 사용하는 MabSelect™ SuRe™ 상에서의 정화된 수확물 mAbB 용리 프로파일을 보여준다 (실시예 7).
도 7 은 상이한 조건에서의 (첨가제의 존재 또는 부재 하의) pH 구배 용리 동안 Eshmuno® A 상에서의 mAbB 의 숙주 세포 단백질 (HCP) 프로파일을 보여준다 (실시예 5).
도 8 은 Eshmuno® A 상에서의 pH 구배 용리 동안 풀링된 분획의 HCP 함량과 총 HCP 함량의 비교에 기초하는 용리 풀의 순도를 보여준다 (실시예 5).
도 9 는 상이한 조건에서의 (첨가제의 존재 또는 부재 하의) pH 구배 용리 동안 ProSep® Ultra Plus 상에서의 mAbB 의 숙주 세포 단백질 (HCP) 프로파일을 보여준다 (실시예 6).
도 10 은 ProSep® Ultra Plus 상에서의 pH 구배 용리 동안 풀링된 분획의 HCP 함량과 총 HCP 함량의 비교에 기초하는 용리 풀의 순도를 보여준다 (실시예 6).
도 11 은 상이한 조건에서의 (첨가제의 존재 또는 부재 하의) pH 구배 용리 동안 MabSelect™ SuRe™ 상에서의 mAbB 의 숙주 세포 단백질 (HCP) 프로파일을 보여준다 (실시예 7).
도 12 는 MabSelect™ SuRe™ 상에서의 pH 구배 용리 동안 풀링된 분획의 HCP 함량과 총 HCP 함량의 비교에 기초하는 용리 풀의 순도를 보여준다 (실시예 7).

본 명세서는 당업자가 발명을 충분히 적용할 수 있게 해준다. 추가 언급이 없어도, 당업자는 상기 설명을 가장 넓은 범위로 이용할 수 있다고 가정한다.

실행자들은, 본 명세서의 교시들을 사용하여, 일상적인 실험실 작업으로, 새로운 프로세스로 효율적으로 상기 정의된 바와 같이 단백질을 분리할 수 있을 것이다.

여전히 불명료한 점이 있는 경우, 인용된 간행물과 특허문헌을 참고해야 하는 것으로 이해된다. 따라서, 이들 문헌은 본 명세서의 공개 내용의 일부로 간주된다.

더 나은 이해를 위해 그리고 본 발명을 예시하기 위해, 실시예가 아래에 제공되며, 실시예는 본 발명의 범위 내에 있다. 이들 실시예는 또한 가능한 변형예를 예시하는 역할을 한다. 그러나, 기술된 본 발명의 원리의 일반적 타당성으로 인해, 실시예는 이들 단독으로 본 출원의 보호 범위를 감소시키기에 적합하지 않다.

게다가, 제공된 실시예 및 또한 명세서의 나머지 모두에서, 조성물에 존재하는 성분의 양의 합계는 조성물 전체에 대해 항상 100 중량%, 부피% 또는 mol-% 이고, 표시된 백분율 범위로부터 더 큰 값이 발생할 수 있더라도 이를 초과할 수 없다는 것은 당업자에게 말할 나위 없다. 예를 들어, 제조에 특정 부피비의 용매가 혼합물로 사용되는 용리제와 같은 부피 데이터로 나타내는 비를 제외하고는, 달리 지시되지 않는 한, % 데이터는 중량%, 부피% 또는 mol-% 이다.

실시예 및 상세한 설명 뿐만 아니라 청구항에 제시된 온도는 항상 ℃ 이다.

실시예:

실시예 1 : 완충제 및 부형제 용액의 제조

모든 완충제 및 부형제를 0.45 μm HAWP 혼합 셀룰로스 에스테르 필터 (Merck, Darmstadt, Germany) 를 사용하여 여과하고, 사용 전에 초음파 바쓰에서 20 분 동안 탈기시켰다. 모든 단백질 A 크로마토그래피 실행을 위해 하기 완충제를 제조하고 사용했다:

표 1: 단백질 A 크로마토그래피 pH 5.50 를 위한 완충제 A1

표 2: 단백질 A 크로마토그래피 pH 7.00 를 위한 완충제 A2

표 3: 단백질 A 크로마토그래피 pH 2.75 를 위한 완충제 B

하기 부형제를 응집으로부터 항체를 보호하는 능력에 기초하여 선택했다:

표 4: 적용된 부형제와 적용된 농도, 제조사 및 품질 표준

실시예 1.1 : 시트레이트 완충제 pH 5.5 중 0.5M 수크로스의 제조

171.1 g 수크로스 (M = 342.29 g/mol) 를 적당한 플라스크에 칭량해 넣었다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 첨가하고, 물질이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반했다. 1M HCl 을 사용하여 pH 를 5.5 +/- 0.05 로 조정했다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피측정 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 마크까지 채우고, 철저히 혼합했다.

실시예 1.2: 시트레이트 완충제 pH 2.75 중 0.5M 수크로스의 제조

171.1 g 수크로스 (M = 342.29 g/mol) 를 적당한 플라스크에 칭량해 넣었다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 첨가하고, 물질이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반했다. 1M HCl 을 사용하여 pH 를 2.75 +/- 0.05 로 조정했다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피측정 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 마크까지 채우고, 철저히 혼합했다.

실시예 1.3: 시트레이트 완충제 pH 5.5 중 0.5M 트레할로스의 제조

171.1 g 트레할로스 (M = 342.29 g/mol) 를 적당한 플라스크에 칭량해 넣었다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 첨가하고, 물질이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반했다. 1M HCl 을 사용하여 pH 를 5.5 +/- 0.05 로 조정했다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피측정 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 마크까지 채우고, 철저히 혼합했다.

실시예 1.4: 시트레이트 완충제 pH 2.75 중 0.5M 트레할로스의 제조

171.1 g 트레할로스 (M = 342.29 g/mol) 를 적당한 플라스크에 칭량해 넣었다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 첨가하고, 물질이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반했다. 1M HCl 을 사용하여 pH 를 2.75 +/- 0.05 로 조정했다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피측정 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 마크까지 채우고, 철저히 혼합했다.

실시예 1.5: 시트레이트 완충제 pH 5.5 중 0.5M 만니톨의 제조

91.09 g 만니톨 (M = 182,17 g/mol) 을 적당한 플라스크에 칭량해 넣었다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 첨가하고, 물질이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반했다. 1M HCl 을 사용하여 pH 를 5.5 +/- 0.05 로 조정했다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피측정 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 마크까지 채우고, 철저히 혼합했다.

실시예 1.6: 시트레이트 완충제 pH 2.75 중 0.5M 만니톨의 제조

91.09 g 만니톨 (M = 182,17 g/mol) 을 적당한 플라스크에 칭량해 넣었다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 첨가하고, 물질이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반했다. 1M HCl 을 사용하여 pH 를 2.75 +/- 0.05 로 조정했다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피측정 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 마크까지 채우고, 철저히 혼합했다.

실시예 1.7: 시트레이트 완충제 pH 5.5 중 0.5M 소르비톨의 제조

91.09 g 소르비톨 (M = 182,17 g/mol) 을 적당한 플라스크에 칭량해 넣었다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 첨가하고, 물질이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반했다. 1M HCl 을 사용하여 pH 를 5.5 +/- 0.05 로 조정했다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피측정 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 마크까지 채우고, 철저히 혼합했다.

실시예 1.8: 시트레이트 완충제 pH 2.75 중 0.5M 소르비톨의 제조

91.09 g 소르비톨 (M = 182,17 g/mol) 을 적당한 플라스크에 칭량해 넣었다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 첨가하고, 물질이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반했다. 1M HCl 을 사용하여 pH 를 2.75 +/- 0.05 로 조정했다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피측정 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 마크까지 채우고, 철저히 혼합했다.

실시예 1.9 : 시트레이트 완충제 pH 5.5 중 5% (w/v) PEG4000 의 제조

50 g PEG4000 (M = 3500 - 4500 g/mol) 을 적당한 플라스크에 칭량해 넣었다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 첨가하고, 물질이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반했다. 1M HCl 을 사용하여 pH 를 5.5 +/- 0.05 로 조정했다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피측정 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 5.5 를 마크까지 채우고, 철저히 혼합했다.

실시예 1.10: 시트레이트 완충제 pH 2.75 중 5% (w/v) PEG4000 의 제조

50 g PEG4000 (M = 3500 - 4500 g/mol) 을 적당한 플라스크에 칭량해 넣었다. 대략 800 ml 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 첨가하고, 물질이 완전히 용해될 때까지 용액을 교반했다. 1M HCl 을 사용하여 pH 를 2.75 +/- 0.05 로 조정했다. 그 후, 용액을 1000.0 ml 부피측정 눈금 플라스크로 옮기고, 0.1M Na-시트레이트 완충제 pH 2.75 를 마크까지 채우고, 철저히 혼합했다.

실시예 2: Eshmuno A 상에서의 정화된 수확물 mAbA 의 용리 성능

단백질 A 크로마토그래피 수지:

Eshmuno® 베이스 물질은 폴리비닐에테르에 기초하는 강성 및 친수성 중합체이다. 대장균에서 재조합적으로 생산되는 오합체 형태의 스타필로코쿠스 아우레우스 단백질 A 의 C 도메인이 그 위에 고정화되어 있다. Eshmuno® A 는 Merck (Darmstadt, Germany) 로부터 입수했고, 칼럼은 Repligen GmbH (Ravensburg, Germany) 에 의해 패킹되었다.

표 5: 적용된 Eshmuno® A 수지에 관한 칼럼 파라미터

항체 샘플 제조:

모델 항체 mAbA 는 pI ~ 7.01-8.58 의 모노클로날 항체 (대략 152 kDa) 이다. 그것을 정화된 세포 배양 수확물로서 사용했고, VacuCap® 90 PF Filter Unit 과 0.8/0.2 μm Supor® 멤브레인 (Pall Corporation, NY, USA) 을 사용하여 여과했다. 용액은 농도 0.943 mg/mL, pH 7.0 및 전도도 12 mS/cm 를 갖는다.

단백질 A 크로마토그래피 방법:

단백질 A 크로마토그래피를 하기 방법 파라미터를 사용하여 수행했다:

표 6: 단백질 A 크로마토그래피를 위한 방법 파라미터

실시예 1 에 따른 5 가지 부형제를 함유하는 용리 완충제 각각 및 레퍼런스로서 부형제를 함유하지 않는 용리 완충제를 사용하여 6 회의 용리 실행을 수행했다. pH 5.5 내지 pH 2.75 의 30CV 의 선형 구배를 적용하여 정의된 구배 경사에서 용리를 수행했다. 상이한 크로마토그래피 실행으로부터 UV 280 nm (2 mm 경로 길이) 에서 30 mAU 의 시작 피크 신호와 30 mAU 의 종료 피크 신호 사이에서 용리 피크의 분획을 수집하고 pH, 부피, 수율^* 및 HCP 함량^* (^*mAbB 에만 적용됨) 에 대해 분석했다.

하기 결과가 수득되었고, 도 1 에 용리 프로파일로서 그래프로 나타나 있다:

표 7: Eshmuno A 상에서의 정화된 수확물 mAbA 의 용리 성능

도 1 은 5% PEG4000 의 첨가가 더 날카로운 용리 피크와 더 낮은 pH 로의 유의한 이동을 야기하며, 한편 부형제를 사용하지 않은 또는 이당류 및 폴리올을 사용한 용리는 더 넓은 용리 피크를 나타냄을 보여준다. 표 7 에 따르면, 용리 산물 풀의 부피는 이당류 및 폴리올의 사용에 비해 감소되고, 용리 산물 풀은 가장 낮은 pH 를 나타낸다.

실시예 3 : ProSep® Ultra Plus 상에서의 정화된 수확물 mAbA 의 용리 성능

단백질 A 크로마토그래피 수지:

ProSep® Ultra Plus 수지는 조절된 공극 유리 매트릭스 및 그것에 결합된 리간드로서 재조합 천연 단백질 A 를 갖는다. ProSep® Ultra Plus 는 Merck (Darmstadt, Germany) 로부터 입수했고, 칼럼은 Repligen GmbH (Ravensburg, Germany) 에 의해 패킹되었다.

표 8: 적용된 ProSep® Ultra Plus 수지에 관한 칼럼 파라미터

샘플 제조 및 단백질 A 크로마토그래피 방법은 실시예 2 에 기재된 바와 같았다.

하기 결과가 수득되었고, 도 2 에 용리 프로파일로서 그래프로 나타나 있다:

표 9: ProSep® Ultra Plus 상에서의 정화된 수확물 mAbA 의 용리 성능

도 2 는 5% PEG4000 의 첨가가 ProSep® Ultra Plus 상에서의 더 날카로운 용리 피크를 야기하며, 한편 부형제를 사용하지 않은 또는 이당류 및 폴리올을 사용한 용리는 더 넓은 용리 피크를 나타냄을 보여준다. 표 9 에 따르면, 이당류, 폴리올을 사용한 또는 부형제를 사용하지 않은 샘플과 비교할 때 용리 산물 풀의 부피가 가장 작고, 용리 산물 풀이 가장 낮은 pH 를 나타낸다.

실시예 4: MabSelect™ SuRe™ 상에서의 정화된 수확물 mAbA 의 용리 성능

단백질 A 크로마토그래피 수지:

MabSelect™ SuRe™ 수지는 아가로스 매트릭스를 갖는다. 재조합 생산된 (대장균) C-말단 시스테인을 갖는 조작된 단백질 A 도메인의 사합체가 티오-에테르를 통해 그 위에 고정화되어 있다. 이 수지는 GE Healthcare (Uppsala, Sweden) 에 의해 생산되었고, 칼럼은 Repligen GmbH (Ravensburg, Germany) 에 의해 패킹되었다.

표 10: 적용된 Mab Select® SuRe™ 수지에 관한 칼럼 파라미터

항체 샘플 제조 및 단백질 A 크로마토그래피 방법은 실시예 2 에 기재된 바와 같았다.

하기 결과가 수득되었고, 도 3 에 용리 프로파일로서 그래프로 나타나 있다:

표 11: MabSelect™ SuRe™ 상에서의 정화된 수확물 mAbA 의 용리 성능

도 3 은 5% PEG4000 의 첨가가 MabSelect™ SuRe™ 상에서의 더 날카로운 용리 피크와 더 낮은 pH 로의 현저한 이동을 야기하며, 한편 부형제를 사용하지 않은 또는 이당류 및 폴리올을 사용한 용리는 더 넓은 용리 피크를 나타냄을 보여준다. 표 11 에 따르면, 이당류, 폴리올을 사용한 또는 부형제를 사용하지 않은 샘플과 비교할 때 용리 산물 풀의 부피가 가장 작고, 용리 산물 풀이 가장 낮은 pH 를 나타낸다.

실시예 5: Eshmuno® A 상에서의 정화된 수확물 mAbB 의 용리 성능

항체 샘플 제조:

두번째 모델 항체 mAbB 는 Merck (Darmstadt, Germany) 가 생산한, pI ~ 7.6-8.3 의 모노클로날 항체 (대략 145 kDa) 이다. 그것을 정화된 세포 배양 수확물로서 사용했고, VacuCap® 90 PF Filter Unit 과 0.8/0.2 μm Supor® 멤브레인 (Pall Corporation, NY, USA) 을 사용하여 여과했다. 용액은 농도 1.45 mg/mL, pH 7.0 및 전도도 12.87 mS/cm 를 갖는다.

단백질 A 크로마토그래피 수지는 실시예 2 에 기재된 바와 같은 Eshmuno® A 였고, 단백질 A 크로마토그래피 방법은 또한 실시예 2 에 기재된 바와 같았다.

하기 결과가 수득되었고, 도 4, 도 7 및 도 8 에 용리 프로파일로서 그래프로 나타나 있다:

표 12: Eshmuno® A 상에서의 정화된 수확물 mAbB 의 용리 성능

도 4 는 5% PEG4000 의 첨가가 Eshmuno® A 상에서의 유의하게 더 날카로운 용리 피크를 야기하며, 한편 부형제를 사용하지 않은 또는 이당류 및 폴리올을 사용한 용리는 넓은 용리 피크를 나타냄을 보여준다. 표 12 에 따르면, 이당류, 폴리올을 사용한 또는 부형제를 사용하지 않은 샘플과 비교할 때 용리 산물 풀의 부피가 가장 작고, 용리 산물 풀이 가장 낮은 pH 를 나타낸다.

도 7 은 pH 구배에 걸친 HCP 분포를 보여준다. 500 mM 소르비톨, 만니톨, 트레할로스 또는 수크로스 첨가제 조건의 HCP 프로파일은 첨가제를 사용하지 않은 대조군 조건과 비슷하다. 그에 비해, PEG4000 의 존재 하의 HCP 의 용리 거동은 대조군 및 다른 선택된 첨가제 조건과 유의하게 상이하다. 이 경우에 더 많은 HCP 이 구배의 뒷부분에서 큰 피크로 용리되었으며, 이는 HCP 용리가 약간 더 낮은 pH 조건으로 이동했음을 의미한다. 이는 용리 풀의 더 높은 순도 (오직 59% HCP vs. 부형제를 첨가하지 않은 대조군 조건 하의 구배에서 총 HCP 중 68.2% 남은 HCP) 뿐만 아니라 더 높은 수율 (79.8% 수율 vs. 부형제를 첨가하지 않은 대조군 조건의 75.5% 수율) 을 초래한다.

도 7 의 자주색 실선은 부형제를 첨가하지 않은 mAbB 의 UV 용리 프로파일을 나타내고, 오직 HCP 용리에 관하여 구배에서의 항체의 용리 시간을 예시하기 위한 것이다. 소르비톨, 만니톨, 트레할로스 또는 수크로스의 존재 하의 항체 용리 프로파일은 유사하다. 5% PEG4000 의 존재 하의 UV 용리 프로파일은 더 높은 구배 조건 (더 낮은 pH 조건) 으로 약간 이동한다.

각각의 크로마토그래피 실행으로부터 pH 구배 동안 수집된 분획의 HCP 함량을 분석하고 비교했다. 도 8 은 >30 mAU 의 UV280 수집 기준에 기초하는 수집된 분획으로부터의 용리 풀의 HCP 함량과 pH 구배 용리 동안 총 HCP 함량의 비교에 기초하는 용리 풀의 순도를 보여준다. 5% PEG4000 을 첨가한 Eshmuno® A 를 사용하는 크로마토그래피 실행 동안 구배에서 총 HCP 의 59% 까지의 HCP 함량이 가장 낮은 용리 풀이 달성되었다.

실시예 6: ProSep® Ultra Plus 상에서의 정화된 수확물 mAbB 의 용리 성능

실시예 3 에 기재된 바와 같은 ProSep® Ultra Plus 수지를 단백질 A 크로마토그래피 수지로서 사용하고 실시예 5 에 기재된 바와 같은 mAbB 를 항체로서 사용한 점을 제외하고는, 실시예 2 에 기재된 바와 같이 단백질 A 크로마토그래피를 수행했다.

하기 결과가 수득되었고, 도 5, 도 9 및 도 10 에 용리 프로파일로서 그래프로 나타나 있다:

표 13: ProSep® Ultra Plus 상에서의 정화된 수확물 mAbB 의 용리 성능

도 5 는 5% PEG4000 의 첨가가 ProSep® Ultra Plus 상에서의 유의하게 더 날카로운 용리 피크와 더 낮은 pH 로의 현저한 이동을 야기하며, 한편 부형제를 사용하지 않은 또는 이당류 및 폴리올을 사용한 용리는 넓은 용리 피크를 나타냄을 보여준다. 표 13 에 따르면, 이당류, 폴리올을 사용한 또는 부형제를 사용하지 않은 샘플과 비교할 때 용리 산물 풀의 부피가 가장 낮다.

도 9 는 pH 구배에 걸친 HCP 분포를 보여준다. 500 mM 소르비톨, 만니톨, 트레할로스 또는 수크로스 첨가제 조건의 HCP 프로파일은 첨가제를 사용하지 않은 대조군 조건과 비슷하다. 그에 비해, PEG4000 의 존재 하의 HCP 의 용리 거동은 대조군 및 다른 선택된 첨가제 조건과 유의하게 상이하다. 이 경우에 더 많은 HCP 이 구배의 뒷부분에서 큰 피크로 용리되었으며, 이는 HCP 용리가 약간 더 낮은 pH 조건으로 이동했음을 의미한다. 이는 용리 풀의 더 높은 순도 (오직 52.6% 남은 HCP vs. 부형제를 첨가하지 않은 대조군 조건 하의 구배에서 총 HCP 중 66.4% 남은 HCP) 뿐만 아니라 더 높은 수율 (86.3% 수율 vs. 부형제를 첨가하지 않은 대조군 조건의 83% 수율) 을 초래한다.

도 9 의 자주색 실선은 부형제를 첨가하지 않은 mAbB 의 UV 용리 프로파일을 나타내고, 오직 HCP 용리에 관하여 구배에서의 항체의 용리 시간을 예시하기 위한 것이다. 소르비톨, 만니톨, 트레할로스 또는 수크로스의 존재 하의 항체 용리 프로파일은 유사하다. 5% PEG4000 의 존재 하의 UV 용리 프로파일은 더 높은 구배 조건 (더 낮은 pH 조건) 으로 약간 이동한다.

각각의 크로마토그래피 실행으로부터 pH 구배 동안 수집된 분획의 HCP 함량을 분석하고 비교했다. 도 10 은 >30 mAU 의 UV280 수집 기준에 기초하는 수집된 분획으로부터의 용리 풀의 HCP 함량과 pH 구배 용리 동안 총 HCP 함량의 비교에 기초하는 용리 풀의 순도를 보여준다. 5%PEG4000 을 첨가한 ProSep® Ultra Plus 를 사용하는 크로마토그래피 실행 동안 구배에서 총 HCP 의 52.6% 까지의 HCP 함량이 가장 낮은 용리 풀이 달성되었다.

실시예 7: MabSelect™ SuRe™ 상에서의 정화된 수확물 mAbB 의 용리 성능

실시예 4 에 기재된 바와 같은 MabSelect™ SuRe™ 수지를 단백질 A 크로마토그래피 수지로서 사용하고 실시예 5 에 기재된 바와 같은 mAbB 를 항체로서 사용한 점을 제외하고는, 실시예 2 에 기재된 바와 같이 단백질 A 크로마토그래피를 수행했다.

하기 결과가 수득되었고, 도 6, 도 11 및 도 12 에 용리 프로파일로서 그래프로 나타나 있다:

표 14: MabSelect™ SuRe™ 상에서의 정화된 수확물 mAbB 의 용리 성능

도 7 은 5% PEG4000 의 첨가가 MabSelect™ SuRe™ 상에서 더 날카로운 용리 피크와 더 낮은 pH 로의 현저한 이동을 야기하며, 한편 부형제를 사용하지 않은 또는 이당류 및 폴리올을 사용한 용리는 더 넓은 용리 피크를 나타냄을 보여준다. 표 14 에 따르면, 이당류, 폴리올을 사용한 또는 부형제를 사용하지 않은 샘플과 비교할 때 용리 산물 풀의 pH 가 가장 낮다.

도 11 은 pH 구배에 걸친 HCP 분포를 보여준다. 500 mM 소르비톨, 만니톨, 트레할로스 또는 수크로스 첨가제 조건의 HCP 프로파일은 첨가제를 사용하지 않은 대조군 조건과 비슷하다. 그에 비해, PEG4000 의 존재 하의 HCP 의 용리 거동은 대조군 및 다른 선택된 첨가제 조건과 유의하게 상이하다. 이 경우에 더 많은 HCP 이 구배의 뒷부분에서 큰 피크로 용리되었으며, 이는 HCP 용리가 약간 더 낮은 pH 조건으로 이동했음을 의미한다. 이는 용리 풀의 더 높은 순도 (오직 67,3% 남은 HCP vs. 부형제를 첨가하지 않은 대조군 조건 하의 구배에서 총 HCP 중 79.1% 남은 HCP) 뿐만 아니라 더 높은 수율 (77.7% 수율 vs. 부형제를 첨가하지 않은 대조군 조건의 76.6% 수율) 을 초래한다.

도 11 의 자주색 실선은 부형제를 첨가하지 않은 mAbB 의 UV 용리 프로파일을 나타내고, 오직 HCP 용리에 관하여 구배에서의 항체의 용리 시간을 예시하기 위한 것이다. 소르비톨, 만니톨, 트레할로스 또는 수크로스의 존재 하의 항체 용리 프로파일은 유사하다. 5% PEG4000 의 존재 하의 UV 용리 프로파일은 더 높은 구배 조건 (더 낮은 pH 조건) 으로 약간 이동한다.

각각의 크로마토그래피 실행으로부터 pH 구배 동안 수집된 분획의 HCP 함량을 분석하고 비교했다. 도 12 는 >30 mAU 의 UV280 수집 기준에 기초하는 수집된 분획으로부터의 용리 풀의 HCP 함량과 pH 구배 용리 동안 총 HCP 함량의 비교에 기초하는 용리 풀의 순도를 보여준다. 5%PEG4000 을 첨가한 MabSelect™ SuRe™ 을 사용하는 크로마토그래피 실행 동안 구배에서 총 HCP 의 67.3% 까지의 HCP 함량이 가장 낮은 용리 풀이 달성되었다.

Claims (9)

1. 감소된 부피의 용리제를 사용하여 모노클로날 항체가 결합되어 있는 단백질 A 친화성 크로마토그래피 칼럼으로부터 모노클로날 항체를 분리하는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는 방법:
   a) 로딩된 친화성 크로마토그래피 칼럼을 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체를 포함하는 용리 완충제와 접촉시켜 날카로운, 좁은 용리 피크를 유도하는 단계,
   b) 단계 (a) 에서 수득된 모노클로날 항체를 함유하는 용리된 분획 중 하나 이상을 수집하는 단계,
   c) 잠재적으로 단계 (b) 에서 수득된 분획을 조합하여 용리 산물 풀을 형성하는 단계,
   그에 의해
   요망되는 모노클로날 항체의 개선된 순도가 달성되고 약 9% 이상의 HCP 가 분리되고 4% 초과 만큼의 수율 증가가 달성된다.
2. 제 1 항에 있어서, 용리 완충제가 약 2 중량% 내지 15 중량% 의 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체의 농도를 갖는 방법.
3. 제 2 항에 있어서, 용리 완충제가 약 5 중량% 내지 10 중량% 의 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체의 농도를 갖는 방법.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체가 1,000 g/mol 내지 10,000 g/mol 의 평균 분자량을 갖는 방법.
5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리 (에틸렌 글리콜) 중합체가 3,000 g/mol 내지 6,000 g/mol 의 평균 분자량을 갖는 방법.
6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 완충제가 시트레이트 완충제인 방법.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 단계 (a) 가 pH 5.5 내지 pH 2.75 의 용리 완충제 구배를 사용하여 친화성 크로마토그래피 칼럼을 용리 완충제와 접촉시키는 것을 포함하는 방법.
8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 용리 산물 풀이 약 3.9 내지 약 4.2 범위의 pH 를 갖는 방법.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 용리제에 대한 요구량이 대략 적어도 11% 만큼 감소되는 방법.

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