CN114466861A

CN114466861A - 蛋白a亲和色谱中单克隆抗体的洗脱

Info

Publication number: CN114466861A
Application number: CN202080067087.8A
Authority: CN
Inventors: C·克尔普斯; S·哈菲兹
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2019-10-04
Filing date: 2020-10-01
Publication date: 2022-05-10
Also published as: EP4038082A1; US20220348640A1; KR20220078634A; WO2021064066A1; JP2022550837A; CA3156648A1

Abstract

本发明提供了从结合了单克隆抗体的蛋白A亲和色谱柱中洗脱单克隆抗体的方法，其包括：a)使亲和色谱柱与包含聚(乙二醇)聚合物的洗脱缓冲液接触；b)收集从步骤(a)获得的一种或多种含有单克隆抗体的级分；c)合并从步骤(b)获得的级分以形成洗脱产物池。

Description

蛋白A亲和色谱中单克隆抗体的洗脱

技术领域

本发明涉及从结合了单克隆抗体(mAb)的蛋白A亲和色谱柱中洗脱单克隆抗体的改进方法。

现有技术

单克隆抗体(mAb)的治疗应用在当今的医疗需求中发挥着越来越重要的作用。蛋白A亲和色谱是一种众所周知且广泛使用的纯化单克隆抗体的工具。由于它与抗体的发生在mAb的Fc区和固定化的蛋白A之间的特异性相互作用，以及它耐受高电导率的能力，蛋白A色谱允许直接加载收获的细胞培养液(HCCF)，并能够去除绝大多数工艺和产品相关的杂质，同时丰富抗体池(Vunnum等人,2009.Protein-A based affinity chromatography.In:Gottschalk U,editor.Process scale purification of antibodies.Hoboken,NJ:JohnWiley BT&Sons,Inc.第79–102页)。

生物技术生产的单克隆抗体的下游工艺通常包括至少两个色谱步骤：第一亲和色谱步骤，使用例如蛋白A从收获的细胞培养液(HCCF)中去除非抗体分子，然后进行一个或多个其他步骤，例如离子交换色谱步骤。从色谱柱中洗脱单克隆抗体是工艺性能的重要步骤，它决定了分离选择性和含有产物的池体积(Angelo,J.M.,Lenhoff,A.M.2016.Determinants of protein elution rates from preparative ion-exchangeadsorbents,J Chromatogr A；1440；94-104)。不仅对于药物制剂，而且对于下游工艺的中间体，为了经济地处理，都需要浓缩溶液以实现低体积。因此，大的池体积和慢的洗脱速率对于基于亲和性的分离(如蛋白A色谱)来说是不期望的。因此，对下游工艺的改进特别是在更高的容量和减少的处理时间方面存在重大兴趣。

发明概述

令人惊讶地发现，在单克隆抗体的蛋白A色谱中向洗脱缓冲液中添加聚(乙二醇)聚合物会导致抗体洗脱增强，从而导致洗脱池体积显著降低，同时与不添加辅料的对照条件或者添加通常用于制剂应用以稳定蛋白质和防止聚集的选定二糖或多元醇的对照条件相比，保持相当的产率。

特别地，本发明提供了从结合了单克隆抗体的蛋白A亲和色谱柱中洗脱单克隆抗体的方法，其包括

a)使亲和色谱柱与包含聚(乙二醇)聚合物的洗脱缓冲液接触；

b)收集一种或多种从步骤(a)获得的含有单克隆抗体的级分；

c)可以合并从步骤(b)获得的级分以形成洗脱产物池。

有利地，在这些条件下的分离可以使用低得多的量的洗脱液进行。

同时，可以以更高产率得到具有改进的纯度的产品。下面给出的实例非常清楚地表明了这一点。

已发现，优选地，洗脱缓冲液的聚(乙二醇)聚合物浓度为2重量％至15重量％，更优选5重量％至10重量％。

在本发明的一个优选实施方案中，聚(乙二醇)聚合物的平均分子量为1,000g/mol至10,000g/mol，更优选3,000g/mol至5,000g/mol。

在本发明的另一个优选实施方案中，洗脱缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。

根据本发明的有利的方面，洗脱步骤(a)包括使用pH 5.5至pH2.75的洗脱缓冲液梯度使亲和色谱柱与洗脱缓冲液接触。

在本发明的进一步优选的实施方案中，洗脱产物池的pH为约3.9至约4.2。

发明详述

在单克隆抗体的下游工艺中，需要基于亲和性的色谱工艺，例如蛋白A色谱，以获得具有低洗脱液池体积的浓缩溶液。本发明现在提供从蛋白A亲和色谱柱洗脱单克隆抗体的方法，其包括使用包含聚(乙二醇)聚合物的洗脱缓冲液。发现向洗脱缓冲液中加入聚(乙二醇)可使洗脱液移至较低的pH值，同时显示出尖锐的洗脱峰。这允许从柱出口收集高度浓缩的洗脱液级分并减少总洗脱液池体积。此外，洗脱后的低pH值有利于病毒灭活。对于单克隆抗体的下游工艺，这种改进导致更高的容量和减少的处理时间。

如本文所用，术语“抗体”是指表现出所需生物活性的任何形式的抗体或其片段。因此，它以最广泛的意义使用，并且具体涵盖单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需的生物活性。“分离的抗体”是指结合化合物的纯化状态，在这种情况下是指分子基本上不含其他生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、碳水化合物或其他材料，例如细胞碎片和生长培养基。通常，术语“分离的”并非意指完全不存在此类物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以实质上干扰如本文所述的结合化合物的实验或治疗用途的量存在。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体(即，构成该群体的个体抗体是相同的，除了可能以少量存在的天然发生的突变之外)中获得的抗体。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相反，常规(多克隆)抗体制剂通常包括大量针对(或特异于)不同表位的抗体。修饰语“单克隆”表示抗体的特征是从基本上同质的抗体群体中获得，并且不应解释为需要通过任何特定方法生产抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可以通过Kohler等,(1975)Nature 256:495首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以通过重组DNA方法制备(参见，例如，美国专利No.4,816,567)。“单克隆抗体”也可以使用例如Clackson等,(1991)Nature 352:624-628和Marks等,(1991)J.Mol.Biol.222:581-597中描述的技术从噬菌体抗体库中分离出来。

本文中的单克隆抗体具体包括“嵌合”抗体(免疫球蛋白)，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而一个或多个链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体以及此类抗体的片段中的相应序列相同或同源，只要它们表现出所需的生物活性(美国专利No.4,816,567；和Morrison等,(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855)。

术语“蛋白A亲和色谱”应指使用蛋白A分离或纯化物质和/或颗粒，其中蛋白A通常固定在固相上。蛋白A是一种40-60kD的细胞壁蛋白，最初在金黄色葡萄球菌中发现。抗体与蛋白A树脂的结合是高度特异性的。用于本文的蛋白A亲和色谱的蛋白A亲和色谱柱包括但不限于固定在聚乙烯醚固相上的蛋白A，例如

柱(Merck,Darmstadt,Germany)、固定在多孔玻璃基质上的蛋白A，

柱(Merck,Darmstadt,Germany)、固定在琼脂糖固相上的蛋白A，例如MABSELECT^TM SuRe^TM柱(GE Healthcare,Uppsala,Sweden)。

如本文所用，术语“缓冲液”应指通过其酸碱缀合物组分的作用抵抗pH变化的缓冲溶液。“洗脱缓冲液”是用于从色谱柱中洗脱蛋白质的缓冲液。本发明的用于蛋白A亲和色谱的洗脱缓冲液的pH在约2.75至5.5的范围内。将pH控制在该范围内的缓冲液的实例包括磷酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐或铵的缓冲液，或多于一种。优选的这种缓冲液是柠檬酸盐。

术语“聚(乙二醇)”或“PEG”应指由氧化乙烯单元组成的长链、线性合成聚合物。氧化乙烯单元可以变化，从而可以获得分子量范围为约200g/mol至100,000g/mol的PEG化合物。这样的聚(乙二醇)可以包含一种或多种其他化学基团，它们是结合反应所必需的，其由分子的化学合成产生，或者是用于优化分子部分的距离的间隔基。这些其他化学基团不用于计算聚(乙二醇)的分子量。此外，这样的聚(乙二醇)可以包含一个或多个连接在一起的聚(乙二醇)-链。具有多于一个聚(乙二醇)链的聚(乙二醇)称为多臂或支化聚(乙二醇)。

尽管聚(乙二醇)的分子量变化很大，但分子量范围为约400g/mol至约30,000g/mol的聚合物通常是合适的。在本发明的实施例中，选择平均分子量为4,000g/mol的聚乙二醇(PEG4000)。在本发明的优选实施方案中，合适地选择平均分子量在1,000g/mol至10,000g/mol、更优选3,000g/mol至5,000g/mol的范围内的聚乙二醇。

因此，下面描述的实例提供了通过使用减少的体积的洗脱液从结合了单克隆抗体的蛋白A亲和色谱柱中分离单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：

a)使加载的亲和色谱柱与包含聚(乙二醇)聚合物的洗脱缓冲液接触并诱导尖锐、窄的洗脱峰，

b)收集一种或多种从步骤(a)获得的含有单克隆抗体的洗脱级分，

c)任选地合并从步骤(b)获得的级分以形成洗脱产物池，

其中

d)实现了所需单克隆抗体的改进的纯度，分离出约9％且更多的HCP，实现了大于4％的产率提高。

有利地，通过实施该方法，对洗脱液的需求减少了至少约11体积％。

以下实施例表明，通过添加的优化辅料的量和选择，仍可以减少所需的洗脱液量，从而也可以改进可达到的纯度。

附图简要说明：

图1显示了澄清收获物mAbA在

A上使用添加和不添加辅料的pH梯度洗脱的洗脱曲线(实施例2)

图2显示了澄清收获物mAbA在

Ultra Plus上使用添加和不添加辅料的pH梯度洗脱的洗脱曲线(实施例3)。

图3显示了澄清收获物mAbA在MabSelect^TM Sure^TM上使用添加和不添加辅料的pH梯度洗脱的洗脱曲线(实施例4)。

图4显示了澄清收获物mAbB在

A上使用添加和不添加辅料的pH梯度洗脱的洗脱曲线(实施例5)。

图5显示了澄清收获物mAbB在

Ultra Plus上使用添加和不添加辅料的pH梯度洗脱的洗脱曲线(实施例6)。

图6显示了澄清收获物mAbB在MabSelect^TM SuRe^TM上使用添加和不添加辅料的pH梯度洗脱的洗脱曲线(实施例7)。

图7显示了mAbB在

A上在不同条件下(有或没有添加剂)在pH梯度洗脱过程中的宿主细胞蛋白(HCP)曲线(实施例5)。

图8显示了在

A上的pH梯度洗脱过程中的洗脱池的纯度，基于合并级分的HCP含量与总HCP含量的比较(实施例5)。

图9显示了mAbB在

Ultra Plus上在不同条件下(有或没有添加剂)在pH梯度洗脱过程中的宿主细胞蛋白(HCP)曲线(实施例6)。

图10显示了在

Ultra Plus上的pH梯度洗脱过程中的洗脱池的纯度，基于合并级分的HCP含量与总HCP含量的比较(实施例6)。

图11显示了mAbB在MabSelect^TM SuRe^TM上在不同条件下(有或没有添加剂)在pH梯度洗脱过程中的宿主细胞蛋白(HCP)曲线(实施例7)。

图12显示了在MabSelect^TM SuRe^TM上的pH梯度洗脱过程中的洗脱池的纯度，基于合并级分的HCP含量与总HCP含量的比较(实施例7)。

本说明书使本领域技术人员能够全面地应用本发明。即使没有进一步的评论，假定本领域技术人员将能够在最广泛的范围内利用以上描述。

从业者将能够通过常规实验室工作，使用本文的教导，在新方法中有效地分离如上定义的蛋白质。

如果还有任何不清楚之处，可以参考所引用的出版物和专利文献。因此，这些文件被视为本说明书的公开内容的一部分。

为了更好地理解和说明本发明，下面给出在本发明的保护范围内的实施例。这些实施例还用于说明可能的变体。然而，由于所描述的本发明原理的普遍有效性，这些实施例并不适合将本申请的保护范围仅缩小到这些实施例。

此外，对于本领域技术人员来说不言而喻的是，在给出的实施例和说明书的其余部分中，存在于组合物中的组分的量总和仅达到100重量％、体积％或mol％，基于整个组合物，不能超过这个值，即使在所示百分比范围内可能会出现更高的值。除非另有说明，％数据是重量％、体积％或mol％，但在体积数据中显示的比例除外，例如，在混合物中使用某些体积比的溶剂用于制备洗脱液。

实施例和说明书以及权利要求书中给出的温度始终以℃为单位。

实施例

实施例1：缓冲液和辅料溶液的制备

使用0.45μm HAWP混合纤维素酯过滤器(Merck，Darmstadt，Germany)过滤所有缓冲液和辅料，并在使用前在超声波浴中脱气20分钟。对于所有蛋白质A色谱运行，制备和使用以下缓冲液：

表1：用于蛋白A色谱的缓冲液A1，pH 5.50

表2：用于蛋白A色谱的缓冲液A2，pH 7.00

表3：用于蛋白A色谱的缓冲液B，pH 2.75

根据其保护抗体免于聚集的能力选择以下辅料：

表4：应用的辅料的应用浓度、制造商和质量标准

实施例1.1：在柠檬酸盐缓冲液pH 5.5中0.5M蔗糖的制备

将171.1g蔗糖(M＝342.29g/mol)称重到合适的烧瓶中。加入约800ml的0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.5，搅拌溶液直至物质完全溶解。使用1M HCl将pH调节至5.5+/-0.05。然后，将溶液转移到1000.0ml容量瓶中，用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.5填充至刻度并充分混合。

实施例1.2：在柠檬酸盐缓冲液pH 2.75中0.5M蔗糖的制备

将171.1g蔗糖(M＝342.29g/mol)称重到合适的烧瓶中。加入约800ml的0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.75，搅拌溶液直至物质完全溶解。使用1M HCl将pH调节至2.75+/-0.05。然后，将溶液转移到1000.0ml容量瓶中，用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.75填充至刻度并充分混合。

实施例1.3：在柠檬酸盐缓冲液pH 5.5中0.5M海藻糖的制备

将171.1g海藻糖(M＝342.29g/mol)称重到合适的烧瓶中。加入约800ml的0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.5，搅拌溶液直至物质完全溶解。使用1M HCl将pH调节至5.5+/-0.05。然后，将溶液转移到1000.0ml容量瓶中，用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.5填充至刻度并充分混合。

实施例1.4：在柠檬酸盐缓冲液pH 2.75中0.5M海藻糖的制备

将171.1g海藻糖(M＝342.29g/mol)称重到合适的烧瓶中。加入约800ml的0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.75，搅拌溶液直至物质完全溶解。使用1M HCl将pH调节至2.75+/-0.05。然后，将溶液转移到1000.0ml容量瓶中，用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.75填充至刻度并充分混合。

实施例1.5：在柠檬酸盐缓冲液pH 5.5中0.5M甘露醇的制备

将91.09g甘露醇(M＝182.17g/mol)称重到合适的烧瓶中。加入约800ml的0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.5，搅拌溶液直至物质完全溶解。使用1M HCl将pH调节至5.5+/-0.05。然后，将溶液转移到1000.0ml容量瓶中，用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.5填充至刻度并充分混合。

实施例1.6：在柠檬酸盐缓冲液pH 2.75中0.5M甘露醇的制备

将91.09g甘露醇(M＝182.17g/mol)称重到合适的烧瓶中。加入约800ml的0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.75，搅拌溶液直至物质完全溶解。使用1M HCl将pH调节至2.75+/-0.05。然后，将溶液转移到1000.0ml容量瓶中，用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.75填充至刻度并充分混合。

实施例1.7：在柠檬酸盐缓冲液pH 5.5中0.5M山梨糖醇的制备

将91.09g山梨糖醇(M＝182.17g/mol)称重到合适的烧瓶中。加入约800ml的0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.5，搅拌溶液直至物质完全溶解。使用1M HCl将pH调节至5.5+/-0.05。然后，将溶液转移到1000.0ml容量瓶中，用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.5填充至刻度并充分混合。

实施例1.8：在柠檬酸盐缓冲液pH 2.75中0.5M山梨糖醇的制备

将91.09g山梨糖醇(M＝182.17g/mol)称重到合适的烧瓶中。加入约800ml的0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.75，搅拌溶液直至物质完全溶解。使用1M HCl将pH调节至2.75+/-0.05。然后，将溶液转移到1000.0ml容量瓶中，用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.75填充至刻度并充分混合。

实施例1.9：在柠檬酸盐缓冲液pH 5.5中5％(w/v)PEG4000的制备

将50g PEG4000(M＝3500-4500g/mol)称重到合适的烧瓶中。加入约800ml的0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.5，搅拌溶液直至物质完全溶解。使用1M HCl将pH调节至5.5+/-0.05。然后，将溶液转移到1000.0ml容量瓶中，用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 5.5填充至刻度并充分混合。

实施例1.10：在柠檬酸盐缓冲液pH 2.75中5％(w/v)PEG4000的制备

将50g PEG4000(M＝3500-4500g/mol)称重到合适的烧瓶中。加入约800ml的0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.75，搅拌溶液直至物质完全溶解。使用1M HCl将pH调节至2.75+/-0.05。然后，将溶液转移到1000.0ml容量瓶中，用0.1M柠檬酸钠缓冲液pH 2.75填充至刻度并充分混合。

实施例2：澄清收获物mAbA在Eshmuno A上的洗脱性能

蛋白A色谱树脂：

基材是一种基于聚乙烯醚的刚性亲水聚合物。固定在其上的是五聚体形式的金黄色葡萄球菌蛋白A的C结构域，它是在大肠杆菌中重组产生的。

A来自Merck(Darmstadt,Germany)，柱由Repligen GmbH(Ravensburg,Germany)填充。

表5：应用的

A树脂的色谱柱参数

抗体样品的制备：

模型抗体mAbA是单克隆抗体(约152kDa)，pI～7.01-8.58。它用作澄清的细胞培养收获物，使用具有0.8/0.2μm

膜(Pall Corporation，NY，USA)的

90PF过滤单元过滤。溶液的浓度为0.943mg/mL，pH为7.0，电导率为12mS/cm。

蛋白A色谱方法：

使用以下方法参数进行蛋白A色谱：

表6：蛋白A色谱的方法参数

使用根据实施例1的五种含有辅料的洗脱缓冲液中的每一种以及使用不含辅料的洗脱缓冲液作为参考进行六次洗脱运行。通过应用从pH 5.5至pH 2.75的30CV线性梯度，以规定的梯度斜率进行洗脱。从不同的色谱运行中收集UV280 nm(2mm路径长度)处30mAU起始峰信号和30mAU结束峰信号之间的洗脱峰级分，并分析pH、体积、产率^*和HCP含量^*(*仅应用于mAbB)。

获得了以下结果，并以图形方式表示为图1中的洗脱曲线：

表7：澄清收获物mAbA在Eshmuno A上的洗脱性能

图1显示添加5％PEG4000导致显著移向较低的pH值的更尖锐的洗脱峰，而不使用辅料或使用二糖和多元醇的洗脱显示更宽的洗脱峰。根据表7，与使用二糖和多元醇相比，洗脱产物池的体积减少，并且洗脱产物池的pH值最低。

实施例3：澄清收获物mAbA在

Ultra Plus上的洗脱性能

蛋白A色谱树脂：

Ultra Plus树脂具有可控孔玻璃基质和作为配体与其结合的重组天然蛋白A。

Ultra Plus来自Merck(Darmstadt Germany)，柱由Repligen GmbH(Ravensburg,Germany)填充。

表8：应用的

Ultra Plus树脂的柱参数

柱长度	2cm
		柱内径	0.8cm
柱体积	1mL
		平均粒径	60μm
基材	可控孔玻璃
		官能团	重组天然蛋白A
Lot#	A4SA045AQ
		系列#	00227

样品制备和蛋白A色谱方法如实施例2所述。

获得了以下结果，并以图形方式表示为图2中的洗脱曲线：

表9：澄清收获物mAbA在

Ultra Plus上的洗脱性能

图2显示添加5％PEG4000导致在

Ultra Plus上的更尖锐的洗脱峰，而不使用辅料或使用二糖和多元醇的洗脱显示更宽的洗脱峰。根据表9，与使用二糖、多元醇或不使用辅料的样品相比，洗脱产物池的体积最低，并且洗脱产物池的pH值最低。

实施例4：澄清收获物mAbA在MabSelect^TM SuRe^TM上的洗脱性能

蛋白A色谱树脂：

MabSelect^TM SuRe^TM树脂具有琼脂糖基质。通过硫醚固定在其上的是重组产生的(大肠杆菌)带有C末端半胱氨酸的工程化蛋白A结构域的四聚体。该树脂由GE Healthcare(Uppsala，Sweden)生产，柱由Repligen GmbH(Ravensburg，Germany)填充。

表10：应用的Mab

SuRe^TM树脂的柱参数

抗体样品制备和蛋白A色谱方法如实施例2所述。

获得了以下结果，并以图形方式表示为图3中的洗脱曲线：

表11：澄清收获物mAbA在MabSelect^TM SuRe^TM上的洗脱性能

图3显示添加5％PEG4000导致MabSelect^TM SuRe^TM上的洗脱峰更尖锐，并显著移向较低的pH值，而不使用辅料或使用二糖和多元醇的洗脱显示出更宽的洗脱峰。根据表11，与使用二糖、多元醇或无辅料的样品相比，洗脱产物池的体积最低，并且洗脱产物池的pH值最低。

实施例5：澄清收获物mAbB在

A上的洗脱性能

抗体样品制备：

第二模型抗体mAbB是由Merck(Darmstadt,Germany)生产的单克隆抗体(约145kDa)，pI～7.6-8.3。它用作使用具有0.8/0.2μm

膜(Pall Corporation，NY，USA)的

90PF过滤单元过滤的澄清细胞培养收获物。溶液的浓度为1.45mg/mL，pH值为7.0，电导率为12.87mS/cm。

蛋白A色谱树脂是如实施例2中所述的

A，并且蛋白A色谱方法也如实施例2中所述。

获得了以下结果，并以图形方式表示为图4、图7和图8中的洗脱曲线：

表12：澄清收获物mAbB在

A上的洗脱性能

图4显示添加5％PEG4000导致在

A上的显著更锐利的洗脱峰，而不使用辅料或使用二糖和多元醇的洗脱显示出宽的洗脱峰。根据表12，与使用二糖、多元醇或不使用辅料的样品相比，洗脱产物池的体积最低，并且洗脱产物池的pH值最低。

图7显示了HCP在pH梯度上的分布。含有500mM山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖或蔗糖的添加剂条件的HCP曲线与没有添加剂的对照条件相当。相比之下，在PEG4000存在下HCP的洗脱行为与对照和其他选定的添加剂条件下显著不同。在此，更多的HCP在梯度的后部以大峰洗脱，这意味着HCP洗脱在略向低的pH偏移。这不仅导致洗脱池的纯度更高(梯度中仅总HCP的59％HCP残留，而在不添加辅料的对照条件下为68.2％)而且产率也更高(产率79.8％，而不添加辅料的对照条件为75.5％)。

图7中的紫色实线代表不含辅料的mAbB的UV洗脱曲线，仅用于说明抗体在梯度中相对于HCP洗脱的洗脱时间。在山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖或蔗糖存在下的抗体洗脱曲线是相似的。在5％PEG4000存在下的UV洗脱曲线略微移向更高梯度条件(更低pH条件)。

分析和比较每次色谱运行的pH梯度期间收集的级分的HCP含量。图8显示了基于来自基于>30mAU的UV280收集标准收集的级分的洗脱池的HCP含量与pH梯度洗脱期间的总HCP含量的比较的洗脱池纯度。在使用添加5％PEG4000的

A的色谱运行期间，实现了最低HCP含量高达梯度中总HCP的59％的洗脱池。

实施例6：澄清收获物mAbB在

Ultra Plus上的洗脱性能

如实施例2中所述进行蛋白A色谱，除了使用实施例3中描述的

UltraPlus树脂作为蛋白A色谱树脂和使用实施例5中描述的mAbB作为抗体。

获得了以下结果，并以图形方式表示为图5、图9和图10中的洗脱曲线：

表13：澄清收获物mAbB在

Ultra Plus上的洗脱性能

图5显示添加5％PEG4000导致在

Ultra Plus上的显著移向更低pH的显著更锐利的洗脱峰，而不使用辅料或使用二糖和多元醇的洗脱显示出宽的洗脱峰。根据表13，与使用二糖、多元醇或不使用辅料的样品相比，洗脱产物池的体积最低。

图9显示了HCP在pH梯度上的分布。含有500mM山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖或蔗糖的添加剂条件的HCP曲线与没有添加剂的对照条件相当。相比之下，在PEG4000存在下HCP的洗脱行为与对照和其他选定的添加剂条件下显著不同。在此，更多的HCP在梯度的后部以大峰洗脱，这意味着HCP洗脱在略向低的pH偏移。这不仅导致洗脱池的纯度更高(梯度中仅总HCP的52.6％的残留HCP，而在不添加辅料的对照条件下为66.4％的残留HCP)而且产率也更高(产率86.3％，而不添加辅料的对照条件为83％)。

图9中的紫色实线代表不含辅料的mAbB的UV洗脱曲线，仅用于说明抗体在梯度中相对于HCP洗脱的洗脱时间。在山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖或蔗糖存在下的抗体洗脱曲线是相似的。在5％PEG4000存在下的UV洗脱曲线略微移向更高梯度条件(更低pH条件)。

分析和比较每次色谱运行的pH梯度期间收集的级分的HCP含量。图10显示了基于来自基于>30mAU的UV280收集标准收集的级分的洗脱池的HCP含量与pH梯度洗脱期间的总HCP含量的比较的洗脱池纯度。在使用添加5％PEG4000的

Ultra Plus的色谱运行期间，实现了最低HCP含量高达梯度中总HCP的52.6％的洗脱池。

实施例7：澄清收获物mAbB在MabSelect^TM SuRe^TM上的洗脱性能

如实施例2中所述进行蛋白A色谱，除了使用实施例4中描述的MabSelect^TM SuRe^TM树脂作为蛋白A色谱树脂并且使用实施例5中描述的mAbB作为抗体。

获得了以下结果，并以图形方式表示为图6、图11和图12中的洗脱曲线：

表14：澄清收获物mAbB在MabSelect^TM SuRe^TM上的洗脱性能

图7显示添加5％PEG4000导致在MabSelect^TM SuRe^TM上的显著移向更低pH的更锐利的洗脱峰，而不使用辅料或使用二糖和多元醇的洗脱显示出宽的洗脱峰。根据表14，与使用二糖、多元醇或不使用辅料的样品相比，洗脱产物池的pH最低。

图11显示了HCP在pH梯度上的分布。含有500mM山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖或蔗糖的添加剂条件的HCP曲线与没有添加剂的对照条件相当。相比之下，在PEG4000存在下HCP的洗脱行为与对照和其他选定的添加剂条件下显著不同。在此，更多的HCP在梯度的后部以大峰洗脱，这意味着HCP洗脱在略向低的pH偏移。这不仅导致洗脱池的纯度更高(梯度中仅总HCP的67.3％HCP残留，而在不添加辅料的对照条件下为79.1％)而且产率也更高(产率77.7％，而不添加辅料的对照条件为76.6％)。

图11中的紫色实线代表不含辅料的mAbB的UV洗脱曲线，仅用于说明抗体在梯度中相对于HCP洗脱的洗脱时间。在山梨糖醇、甘露糖醇、海藻糖或蔗糖存在下的抗体洗脱曲线是相似的。在5％PEG4000存在下的UV洗脱曲线略微移向更高梯度条件(更低pH条件)。

分析和比较每次色谱运行的pH梯度期间收集的级分的HCP含量。图12显示了基于来自基于>30mAU的UV280收集标准收集的级分的洗脱池的HCP含量与pH梯度洗脱期间的总HCP含量的比较的洗脱池纯度。在使用添加5％PEG4000的MabSelect^TM SuRe^TM的色谱运行期间，实现了最低HCP含量高达梯度中总HCP的67.3％的洗脱池。

Claims

1.通过使用减少体积的洗脱液从结合了单克隆抗体的蛋白A亲和色谱柱中分离单克隆抗体的方法，其包括以下步骤：

b)收集从步骤(a)获得的一种或多种含有单克隆抗体的洗脱级分，

c)任选地合并从步骤(b)获得的级分以形成洗脱产物池，

其中

实现了所需单克隆抗体的改进的纯度，分离出约9％且更多的HCP，实现了大于4％的产率提高。

2.根据权利要求1所述的方法，其中洗脱缓冲液的聚(乙二醇)聚合物浓度为约2重量％至15重量％。

3.根据权利要求2所述的方法，其中洗脱缓冲液的聚(乙二醇)聚合物浓度为约5重量％至10重量％。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中聚(乙二醇)聚合物的平均分子量为1,000g/mol至10,000g/mol。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中聚(乙二醇)聚合物的平均分子量为3,000g/mol至6,000g/mol。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中洗脱缓冲液是柠檬酸盐缓冲液。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中洗脱步骤(a)包括使用pH 5.5至pH2.75的洗脱缓冲液梯度使亲和色谱柱与洗脱缓冲液接触。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中洗脱产物池的pH在约3.9至约4.2的范围内。

9.根据前述权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于对洗脱液的需求减少了至少约11％。