CN117683118A - 一种IgM抗体纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种IgM抗体纯化方法。具体涉及一种从样品中纯化IgM抗体蛋白的方法，其中所述IgM抗体为纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体，所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段，所述样品包含所述IgM抗体蛋白和选自宿主细胞蛋白(HCP)、高分子量聚集体(HMW)和低分子量碎片(LMW)的杂质，所述方法包括：a)将所述样品上样至疏水层析柱，所述样品选自细胞培养收获液和细胞培养收获液经一步或多步纯化的收集液；b)使用洗脱缓冲液对所述疏水层析柱进行洗脱处理，收集含有所述IgM抗体蛋白的洗脱峰，获得纯化产物库；其中所述洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液，所述洗脱缓冲液中含有精氨酸，且所述洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是0.2M至1M。
Description
本申请是2023年3月16日提交的，发明名称为“一种IgM抗体纯化方法”的中国专利申请202310253689.8的分案申请。
技术领域
本发明属于生物技术领域。具体而言，本发明涉及一种IgM抗体纯化方法。
背景技术
IgM抗体是在免疫系统接触免疫原后最早表达的抗体，也是分子量最大的一类免疫球蛋白，主要分布在血清中。经典的分泌型IgM通过J链形成五聚体，但也存在不含J链的六聚体形式。额外的结合位点提供了多价的结合能力，因此与IgG抗体相比，它有更高的亲和能力和更广谱的结合性能，能够引发机体更强的抗原中和作用和免疫调理作用。常规包含轻重链的IgM分子量在900KD左右，巨大的分子量使得IgM分子极不稳定，容易发生聚集，沉降等现象。因为在结构或是糖基化等方面，IgM都较IgG复杂，在纯化方面，IgM不稳定性更高，溶解性范围更窄，抗体聚集风险更高。
蛋白聚集体在单抗类药物开发和生产过程的所有阶段都可以观察到，蛋白结构，温度，溶液条件，储存条件，生产过程等都会影响蛋白聚集体的产生。聚集体会对产品的质量和功效有显著的负面影响，其通常会减弱药物的生物活性，还可能存在潜在增强免疫原性的风险。蛋白聚集体的去除可以通过结构修饰，调整溶液配方或使用额外的色谱法进行去除。结构修饰会存在导致生物功能改变的风险；溶液配方常在抗体药物的制剂生产阶段进行摸索，主要是调整溶液的pH、离子强度以及稳定剂；针对生产过程中原液聚集体的去除，常采用色谱法进行，但势必会导致每一步的产物损失，导致原液中目标蛋白的回收率和总产率降低，需要根据目标蛋白的结构特性开发优化色谱纯化方法。
发明内容
发明人在抗体生产研究中发现，IgM抗体分子在常温条件下十分容易产生聚集体，尤其在生产放大过程中，例如对于纳米抗体结构的IgM抗体分子(完整分子量600KD以上)，经两步层析及室温放置后，抗体纯度仅84％，其中HMW的含量约15％，HCP残留大于100ppm。为保证后续生产，增加工艺的稳健性，蛋白纯化的方法仍需要进一步开发和改进以提高抗体纯度，进一步去除聚集体片段，同时保证较好的收率。发明人发现通过疏水层析方法可以很好的去除纳米抗体结构的IgM抗体纯化产物中的HMW，提高纯度，降低HCP残留，保证较好的收率；此外，发明人意外地发现，在洗脱过程中洗脱缓冲液中添加适当含量的精氨酸，节省物料成本同时实现优异地更低的HMW水平和更高的收率。
一方面，本发明提供一种从样品中纯化IgM抗体蛋白的方法，其中所述样品包含所述IgM抗体蛋白和选自宿主细胞蛋白(HCP)、高分子量聚集体(HMW)和低分子量碎片(LMW)的杂质，所述方法包括：
a)将所述样品上样至疏水层析柱；
b)使用洗脱缓冲液对所述疏水层析柱进行洗脱处理，收集含有所述IgM抗体蛋白的洗脱峰，获得纯化产物库；
其中所述洗脱缓冲液中含有精氨酸。
在一些实施方案中，样品选自细胞培养收获液和细胞培养收获液经一步或多步纯化的收集液。
在一些实施方案中，疏水层析柱的填料选自UniHR Butyl 80L(纳微科技)。
在一些实施方案中，洗脱处理的洗脱模式选自线性洗脱和等度洗脱。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液选自磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液中的一种或多种。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是约0.2M至约1M。
在一些实施方案中，纯化产物库经尺寸排阻色谱法(SEC)检测的高分子量聚集体(HMW)水平小于或等于约8.5％，且所述纯化产物库中所述IgM抗体蛋白的收率大于或等于约60％。
在一些实施方案中，IgM抗体为纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体，所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段。
在一些实施方案中，方法还包括在上样前利用平衡缓冲液进行柱平衡的步骤。
在一些实施方案中，方法还包括在将所述样品上样至疏水层析柱时，利用再平衡缓冲液进行再平衡的步骤。
在一些实施方案中，洗脱处理的洗脱体积大于或等于约3、4或5个柱体积。
一方面，本发明提供一种从样品中纯化IgM抗体蛋白的方法，其中所述IgM抗体为纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体，所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段，所述样品包含所述IgM抗体蛋白和选自宿主细胞蛋白(HCP)、高分子量聚集体(HMW)和低分子量碎片(LMW)的杂质，所述方法包括：
a)将所述样品上样至疏水层析柱，所述样品选自细胞培养收获液和细胞培养收获液经一步或多步纯化的收集液；
b)使用洗脱缓冲液对所述疏水层析柱进行洗脱处理，收集含有所述IgM抗体蛋白的洗脱峰，获得纯化产物库；
其中所述洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液，所述洗脱缓冲液中含有精氨酸，且所述洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是约0.2M至约1M。
附图说明
图1为纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体的结构示意图。
具体实施方式
下面对本发明的实施方式进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
另外，为了更好的说明本发明，在下文的具体实施方式中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的原料、元件、方法、手段等未作详细描述，以便于凸显本发明的主旨。
以下，对本发明进行详述。
纳米抗体是指重链单域抗体，也称为VHH抗体，该类抗体只包含一个重链可变区，是最小的功能性抗原结合片段。
J链是指一富含半胱氨酸的多肽链，由浆细胞合成，主要功能是连接单体Ig分子使其成为多聚体。IgA的二聚体和IgM的五聚体均含J链，作用是使Ig分子分泌到黏膜表面，行使黏膜免疫作用。
Fc片段是指抗体的可结晶片段，是抗体分子与效应分子或者细胞相互作用的部位，IgG抗体的Fc段指重链恒定区CH2和CH3区域，IgM抗体的Fc段包含重链恒定区CH2、CH3及CH4区域。
细胞培养收获液是指表达目的蛋白的细胞经培养后，培养液经过离心或深层过滤去除细胞成分后得到的适于下游纯化的收获液。
尺寸排阻色谱法(size exclusion chromatography，SEC)，是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术，又称为凝胶色谱法、分子排阻色谱法、排阻色谱法等，是液相色谱的一种。
本申请中收率又称回收率或蛋白收率，指纯化后得到的蛋白量与上样液中的蛋白量的比值。
一方面，本发明提供一种从样品中纯化IgM抗体蛋白的方法，其中所述样品包含所述IgM抗体蛋白和选自宿主细胞蛋白(HCP)、高分子量聚集体(HMW)和低分子量碎片(LMW)的杂质，所述方法包括：
a)将所述样品上样至疏水层析柱；
b)使用洗脱缓冲液对所述疏水层析柱进行洗脱处理，收集含有所述IgM抗体蛋白的洗脱峰，获得纯化产物库(纯化收集液)；
其中所述洗脱缓冲液中含有精氨酸。
在一些实施方案中，样品选自细胞培养收获液和细胞培养收获液经一步或多步纯化的收集液。
在优选的实施方案中，细胞选自哺乳动物细胞，更优选地，哺乳动物细胞选自CHO细胞、HEK293细胞和Vero细胞。
在优选的实施方案中，细胞培养收获液经一步或多步纯化的收集液选自细胞培养收获液经亲和层析纯化的收集液、经阴离子复合层析纯化的收集液以及经亲和层析和阴离子复合层析两步纯化的收集液。在优选的实施方案中，亲和层析的层析柱的填料选自NMabPro(纳微科技)。在优选的实施方案中，阴离子复合层析的层析柱的填料选自Capto adhere(Cytiva)。
在一些实施方案中，疏水层析柱的填料选自UniHR Butyl 80L(纳微科技)。
在一些实施方案中，洗脱处理的洗脱模式选自线性洗脱和等度洗脱。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液选自磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液中的一种或多种。
在优选的实施方案中，洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液，更优选地，洗脱缓冲液中磷酸盐的浓度是约5-25mM，最优选地，洗脱缓冲液中磷酸盐的浓度是约22mM。
在优选的实施方案中，洗脱缓冲液的pH为约6.0-7.5，更优选地，洗脱缓冲液的pH为约6.6-7.0，最优选地，洗脱缓冲液的pH为约7.0。
在一些实施方案中，洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是约0.2M至约1M；优选地，洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是约0.2M至约0.5M或约0.5M至约1M；更优选地，洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是约0.5M。
在一些实施方案中，纯化产物库经尺寸排阻色谱法(SEC)检测的高分子量聚集体(HMW)水平小于或等于约8.5％、小于或等于约8％、小于或等于约7.5％、小于或等于约7％、小于或等于约6.5％、小于或等于约6％、小于或等于约5.5％、小于或等于约5％、小于或等于约4.5％、小于或等于约4％、小于或等于约3.5％、小于或等于约3％。在一些实施方案中，纯化产物库中IgM抗体蛋白的收率大于或等于约60％、大于或等于约62％、大于或等于约65％、大于或等于约68％或者大于或等于约69％。
在一些实施方案中，纯化产物库经尺寸排阻色谱法(SEC)检测的高分子量聚集体(HMW)水平小于或等于约8.5％，且纯化产物库中IgM抗体蛋白的收率大于或等于约60％。在一些实施方案中，纯化产物库经尺寸排阻色谱法(SEC)检测的高分子量聚集体(HMW)水平小于或等于约7.5％，且纯化产物库中IgM抗体蛋白的收率大于或等于约65％。在优选的实施方案中，纯化产物库经尺寸排阻色谱法(SEC)检测的高分子量聚集体(HMW)水平小于或等于约4％，且纯化产物库中IgM抗体蛋白的收率大于或等于约65％。在优选的实施方案中，纯化产物库经尺寸排阻色谱法(SEC)检测的高分子量聚集体(HMW)水平小于或等于约3％，且纯化产物库中IgM抗体蛋白的收率大于或等于约65％。在优选的实施方案中，纯化产物库经尺寸排阻色谱法(SEC)检测的高分子量聚集体(HMW)水平小于或等于约4％，且纯化产物库中IgM抗体蛋白的收率大于或等于约68％。在优选的实施方案中，纯化产物库经尺寸排阻色谱法(SEC)检测的高分子量聚集体(HMW)水平小于或等于约3％，且纯化产物库中IgM抗体蛋白的收率大于或等于约68％。
在一些实施方案中，IgM抗体为纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体(例如，纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM五聚体)。纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段，例如，纳米抗体融合蛋白是指通过基因工程手段将纳米抗体与Fc片段进行融合后形成的重组蛋白。
在优选的实施方案中，Fc片段是人源IgM的Fc片段。在优选的实施方案中，纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。在优选的实施方案中，Fc片段的氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示。在更优选的实施方案中，纳米抗体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。在优选的实施方案中，J链蛋白是人源IgM的J链蛋白；更优选地，J链蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
在一些实施方案中，所述方法还包括在上样前利用平衡缓冲液进行柱平衡的步骤。在优选的实施方案中，平衡缓冲液选自磷酸盐缓冲液、乙酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、碳酸盐缓冲液、Tris缓冲液中的一种或多种；更优选地，平衡缓冲液是磷酸盐缓冲液，平衡缓冲液中磷酸盐的浓度是约9mM，平衡缓冲液的pH为约7.0。在更优选的实施方案中，平衡缓冲液中还包含0.5M的硫酸胺。
在一些实施方案中，所述方法还包括在将样品上样至疏水层析柱时，利用再平衡缓冲液进行再平衡的步骤。在优选的实施方案中，再平衡缓冲液与平衡缓冲液组成相同。
在一些实施方案中，洗脱处理的洗脱体积大于或等于约3、4或5个柱体积。在优选的实施方案中，洗脱处理的洗脱体积大于或等于约5个柱体积。
另一方面，本发明提供一种从样品中纯化IgM抗体蛋白的方法，其中IgM抗体为纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体，纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段，样品包含IgM抗体蛋白和选自宿主细胞蛋白(HCP)、高分子量聚集体(HMW)和低分子量碎片(LMW)的杂质，所述方法包括：
a)将样品上样至疏水层析柱，样品选自细胞培养收获液和细胞培养收获液经一步或多步纯化的收集液；
b)使用洗脱缓冲液对疏水层析柱进行洗脱处理，收集含有所述IgM抗体蛋白的洗脱峰，获得纯化产物库；
其中洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液中含有精氨酸，且洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是约0.2M至约1M。
再一方面，本发明提供一种从样品中纯化IgM抗体蛋白的方法，其中IgM抗体为纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体，纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段，样品包含IgM抗体蛋白和选自宿主细胞蛋白(HCP)、高分子量聚集体(HMW)和低分子量碎片(LMW)的杂质，所述方法包括：
a)将样品上样至疏水层析柱，样品选自细胞培养收获液和细胞培养收获液经一步或多步纯化的收集液；
b)使用洗脱缓冲液对疏水层析柱进行洗脱处理，收集含有所述IgM抗体蛋白的洗脱峰，获得纯化产物库；
其中洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液中含有精氨酸，且洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是约0.2M至约0.5M。
又一方面，本发明提供一种从样品中纯化IgM抗体蛋白的方法，其中IgM抗体为纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体，纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段，样品包含IgM抗体蛋白和选自宿主细胞蛋白(HCP)、高分子量聚集体(HMW)和低分子量碎片(LMW)的杂质，所述方法包括：
a)将样品上样至疏水层析柱，样品选自细胞培养收获液和细胞培养收获液经一步或多步纯化的收集液；
b)使用洗脱缓冲液对疏水层析柱进行洗脱处理，收集含有所述IgM抗体蛋白的洗脱峰，获得纯化产物库；
其中洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液，洗脱缓冲液中含有精氨酸，且洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是约0.5M。
缩略词描述
实施例1洗脱缓冲液中精氨酸对IgM抗体蛋白聚集的影响
本实施例所使用的层析系统均为AKTAPure150 ER563(Cytiva)。
层析柱为疏水层析柱UniHR Butyl 80L(纳微科技)，柱高范围是18～20cm。
上样液为表达IgM抗体MR14(由纳米抗体融合蛋白R14-Fc(氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示)与J链(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)形成的五聚体形式的IgM，结构如图1所示)的CHO K1细胞(CHO K1购自美国Merck公司)培养收获液经亲和层析(NMabPro(纳微科技))及阴离子复合层析(Capto adhere(Cytiva))纯化后的过滤收集液，包含82.5％的IgM抗体蛋白，15.1％的高分子量聚集体(HMW)，2.4％的低分子量碎片(LMW)，HCP含量为858ppm。
用于柱平衡的溶液为pH 7.0PB+0.5M(NH4)2SO4。
为考察洗脱缓冲液中精氨酸(盐酸精氨酸)添加量对纯化效果的影响，本实施例采用等度洗脱方式，设置不同的洗脱条件，如下：
条件1的洗脱溶液为pH 6.6PB+1M Arg；
条件2的洗脱溶液为pH 7.0PB+0.5M Arg；
条件3的洗脱溶液为pH 7.0PB+0.05M Arg；
条件4的洗脱溶液为pH 7.0PB+0.1M Arg；
条件5的洗脱溶液为pH7.0 PB+0.2M Arg；
层析步骤如下表1所示，包括柱平衡、上样、再平衡及样品洗脱，洗脱方式为等度洗脱。步骤如下：
1)使用至少3个柱体积的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡；
2)将样品上样至层析柱；
3)使用至少3个柱体积的平衡缓冲液对疏水层析柱进行再平衡；
4)使用至少5个柱体积的洗脱缓冲液对层析柱进行洗脱处理；
5)当UV280紫外吸收值快速上升至≥50mAU时开始收集来自步骤4)的含有IgM抗体蛋白的一个或多个极分，当UV280紫外吸收值下降至≥50mAU时结束收集，形成纯化产物库；
对纯化收集液取样检测蛋白含量、纯度(SEC-HPLC)及HCP残留，计算蛋白收率，汇总结果如下表2所示。
表1洗脱液中精氨酸浓度等度测试
表2洗脱收集液检测
由表2可知，随着洗脱液中精氨酸浓度的降低，纯化回收率也同步降低，当精氨酸浓度低于0.2M时(条件3和4)，收率＜60％。因此，为保证样品洗脱的收率高于60％，精氨酸添加量应≥0.2M。
当精氨酸浓度低于0.2M时(条件3和4)，SEC纯度结果更优，但由于收率＜60％，不适合作为大规模生产的纯化条件。当精氨酸浓度升高为0.2M时，SEC纯度结果变差，收集液中蛋白主峰占比为91.4％，HMW占比为8.4％；令人意外的是，当精氨酸浓度升高为0.5M时，收集液中蛋白主峰占比升高为93.0％-97.6％，HMW占比降低为2.4％-6.8％；当精氨酸浓度继续升高为1M时，收集液中蛋白主峰占比却又降低为86％-94％，HMW却又升高为5.3％-13.8％。
由此可见，当洗脱缓冲液中精氨酸含量在0.2-1M时，收集液中蛋白收率高，蛋白主峰占比高，HMW聚集体少；精氨酸添加量为0.5M时，主峰占比最高，HMW聚集体最少。
实施例2线性洗脱对纯化效果的影响
本实施例中所使用的层析系统，层析柱类型，层析上样液及柱平衡溶液均与实施例1中一致。
由于精氨酸添加量变化对纯化效果令人意外的结果，发明人进一步考察线性洗脱条件下精氨酸添加量对纯化效果的影响，本实施例设置不同的洗脱条件，如下：
条件6的洗脱溶液为pH 7.0PB+0.5M Arg；
条件7的洗脱溶液为pH7.0 PB+0.2M Arg；
条件8的洗脱溶液为pH7.0 PB+0.1M Arg；
层析步骤如下表3所示，包括柱平衡，上样，再平衡及样品洗脱，洗脱方式为线性洗脱。步骤如下：
1)使用至少3个柱体积的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡；
2)将样品上样至层析柱；
3)使用至少3个柱体积的平衡缓冲液对疏水层析柱进行再平衡；
4)使用两种洗脱缓冲液对层析柱进行洗脱处理，当缓冲液组分达到100％B后继续洗脱直至收集完成，洗脱体积为3个柱体积；
5)当UV280紫外吸收值快速上升至≥50mAU时开始收集来自步骤4)的含有IgM抗体蛋白的一个或多个极分，当UV280紫外吸收值下降至≥50mAU时结束收集，形成纯化产物库。
对纯化收集液取样检测蛋白含量、纯度(SEC-HPLC)及HCP残留，计算蛋白收率，汇总结果如下表4所示。
表3洗脱液中精氨酸浓度线性洗脱测试
表4线性洗脱收集液检测
由表4可知，在线性梯度洗脱条件下，为保证样品洗脱的回收率高于60％，与等度洗脱条件一致，精氨酸添加量应≥0.2M。但相比在相同精氨酸浓度的等度洗脱条件，线性洗脱条件下的抗体纯化回收率更高。
在线性梯度洗脱条件下，当精氨酸浓度为0.5M时，收集液中蛋白主峰占比为95.0％-96.9％，HMW占比为3.1％-3.8％；当精氨酸浓度为0.2M时，收集液中蛋白主峰占比为92.7-95.1％，HMW为4.8-7.1％；当精氨酸浓度为0.1M时，收集液中蛋白主峰占比为97-98.6％，HMW为1.3-2.8％。
可见，与等度洗脱结果一致，当精氨酸浓度低于0.2M时，SEC纯度数据相比精氨酸浓度为0.2M更优，但由于收率＜60％，不适合作为大规模生产的纯化条件，同样令人意外地，当洗脱液中精氨酸添加量升高为0.5M时，主峰及HMW聚集体占比都优于精氨酸添加量为0.2M的情况。
实施例3线性洗脱洗脱体积优化对纯化效果的影响
本实施例中所使用的层析系统，层析柱类型，层析上样液及柱平衡溶液均与实施例1中一致。
发明人进一步考察线性洗脱条件下洗脱体积对纯化效果的影响，本实施例设置的洗脱条件，如下：
条件9的洗脱溶液为pH 7.0 22mM PB+0.5M Arg；
层析步骤如下表5所示，包括柱平衡，上样，再平衡及样品洗脱，洗脱方式为线性洗脱。步骤如下：
1)使用至少3个柱体积的平衡缓冲液对疏水层析柱进行平衡；
2)将样品上样至层析柱；
3)使用至少3个柱体积的平衡缓冲液对疏水层析柱进行再平衡；
4)使用两种洗脱缓冲液对层析柱进行洗脱处理，当缓冲液组分达到100％B后继续洗脱直至收集完成，洗脱体积为5个柱体积；
5)当UV280紫外吸收值快速上升至≥50mAU时开始收集来自步骤4)的含有IgM抗体蛋白的一个或多个极分，当UV280紫外吸收值下降至≥50mAU时结束收集，形成纯化产物库。
对纯化收集液取样检测蛋白含量、纯度(SEC-HPLC)及HCP残留，计算蛋白收率，汇总结果如下表6所示。
表5线性梯度洗脱体积测试
表6疏水层析线性洗脱收集液检测
由表6可知，与实施例2相比，线性洗脱体积从3CV提高到5CV后，SEC主峰占比提高约1～2％，聚集体含量进一步降低。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
所使用的序列
SEQ ID NO:1R14-Fc
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAATPATYYSGRYYYQCPAGGMDYWGQGTQVTVSSVIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
SEQ ID NO:2J链
QEDERIVLVDNKCKCARITSRIIRSSEDPNEDIVERNIRIIVPLNNRENISDPTSPLRTRFVYHLSDLCKKCDPTEVELDNQIVTATQSNICDEDSATETCYTYDRNKCYTAVVPLVYGGETKMVETALTPDACYPD
SEQ ID NO:3R14
QVQLQESGGGLVQPGGSLRLSCAVSGFTLDYYAIGWFRQAPGKEREGVSCISSSDGSTSYADSVKGRFTISRDNAKNTVYLQMNSLKPEDTALYYCAATPATYYSGRYYYQCPAGGMDYWGQGTQVTVSS
SEQ ID NO:4Fc
VIAELPPKVSVFVPPRDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVTSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTKSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNSGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGFSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCVVAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY
Claims (10)
1.一种从样品中纯化IgM抗体蛋白的方法，其中所述IgM抗体为纳米抗体融合蛋白和J链蛋白形成的IgM抗体，所述纳米抗体融合蛋白包含纳米抗体和Fc片段，所述样品包含所述IgM抗体蛋白和选自宿主细胞蛋白(HCP)、高分子量聚集体(HMW)和低分子量碎片(LMW)的杂质，所述方法包括：
a)将所述样品上样至疏水层析柱，所述样品选自细胞培养收获液和细胞培养收获液经一步或多步纯化的收集液；
b)使用洗脱缓冲液对所述疏水层析柱进行洗脱处理，收集含有所述IgM抗体蛋白的洗脱峰，获得纯化产物库；
其中所述洗脱缓冲液是磷酸盐缓冲液，所述洗脱缓冲液中含有精氨酸，且所述洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是0.2M至0.5M。
2.权利要求1所述的方法，其中所述样品选自细胞培养收获液经亲和层析纯化的收集液、经阴离子复合层析纯化的收集液以及经亲和层析和阴离子复合层析两步纯化的收集液，并且所述细胞选自CHO细胞、HEK293细胞和Vero细胞。
3.权利要求1或2所述的方法，所述疏水层析柱的填料选自UniHR Butyl 80L。
4.权利要求1或2所述的方法，所述洗脱处理的洗脱模式选自线性洗脱和等度洗脱。
5.权利要求1或2所述的方法，所述洗脱缓冲液的pH为6.6-7.0。
6.权利要求1或2所述的方法，所述洗脱缓冲液中精氨酸的浓度是约0.5M。
7.权利要求1或2所述的方法，所述纯化产物库经尺寸排阻色谱法(SEC)检测的高分子量聚集体(HMW)水平小于或等于4％，且所述纯化产物库中所述IgM抗体蛋白的收率大于或等于65％。
8.权利要求1或2所述的方法，其中所述纳米抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
9.权利要求1或2所述的方法，其中所述纳米抗体融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
10.权利要求1或2所述的方法，其中所述J链蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
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