CN116715756A - 一种抗体纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抗体纯化方法，其中方法包括如下步骤：针对目标样本，确定所述目标样本的蛋白等电点，在阴离子复合层析柱上，经pH线性洗脱表现得到表征纯度的拐点，获得拐点对应的pH值pH1；依据拐点对应的pH1和蛋白等电点配制适用于目标样本的平衡缓冲液，并对阴离子复合层析柱进行平衡操作，满足平衡缓冲液的pH不高于蛋白等电点；目标样品上样，以所述平衡缓冲液进行后平衡，再以含有1M‑2M精氨酸盐酸的洗脱液进行线性洗脱，并收集样品、再生、消毒保存。本发明实现了抗体的一体化高效纯化，利用疏水作用和离子排斥作用相结合，并使用盐酸精氨酸作为洗脱组分可以提高分离度，有效实现了样本的高质量提纯。
Description
技术领域
本发明是关于生物技术，特别是关于一种抗体纯化方法。
背景技术
生物制药市场在过去十年中增长迅速，预计未来将继续快速扩张。单克隆抗体、重组生长因子、重组蛋白、重组激素、疫苗、重组酶、细胞和基因治疗、合成免疫调节剂和其他产品类型都包括在生物制药市场中。其中最吸引人的是单克隆抗体药物市场的爆发，如Humira、Keytruda等。近年来，由于针对两种疾病抗原的抗体联合应用所带来的良好协同效应，有望通过双特异性抗体的独特机制带来“1+1>2”的效应，引起了人们对双抗的研究热情。双特异性抗体由两个不同的结合结构域组成，这两个结构域用来识别两个不同表位或抗原的分子。由于其特异性和双重功能，双抗药物扩大了治疗肿瘤和自身免疫性疾病的应用范围，成为抗体工程领域的研究热点。
由于双特异性抗体是人工设计合成的蛋白质，因此在开发和生产过程中存在许多问题，例如大量与产物相关的杂质(聚合物、片段和同源二聚体)、强疏水性和极端的等电点。在过去的几十年里，许多研究人员制定了各种类型的策略来避免或解决这个问题。这些策略引入不同设计特征或功能属性解决了一些开发难点，如Knob-into-hole。T.Yada等人报道了通过蛋白A亲和层析去除产品相关杂质。使用线性pH洗脱来除去同源二聚体，这种策略对于在蛋白A结合位点被修饰的蛋白(Fc*)具有更好的性能，然而，它对其他构型的蛋白几乎没有作用。YanWan等人在通过在MMCImpRes复合模式色谱上采用pH-盐双梯度洗脱纯化双特异性抗体。但传统和复合模式填料对许多其他蛋白质混合物的分离效果不明显。
公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗体纯化方法实现了抗体的一体化高效纯化，利用疏水作用和离子排斥作用相结合，并使用盐酸精氨酸作为洗脱组分可以提高分离度，有效实现了样本的高质量提纯。
为实现上述目的，本发明的实施例提供了抗体纯化方法，包括如下步骤：针对目标样本，确定目标样本的蛋白等电点，在阴离子复合层析柱上，经pH线性洗脱(指以线性ph梯度缓冲液进行连续性洗脱实验)表现得到表征纯度的拐点，获得拐点对应的pH值pH1；依据拐点对应的pH1和蛋白等电点配制适用于目标样本的平衡缓冲液，并对阴离子复合层析柱进行平衡操作，满足平衡缓冲液的pH不高于蛋白等电点，范围为pH1±0.5；目标样品上样，以平衡缓冲液进行后平衡，再以含有盐酸1M-2M精氨酸的洗脱液进行线性洗脱，并收集样品、再生、消毒保存。
在本发明的一个或多个实施方式中，pH线性洗脱所采用的洗脱液的pH范围为3.5-9。优选的，pH线性洗脱所采用的洗脱液的pH范围为3.5-8.5。
在本发明的一个或多个实施方式中，平衡缓冲液的pH与蛋白等电点相比：低于蛋白等电点2-4。优选的，平衡缓冲液的pH与蛋白等电点相比：低于蛋白等电点2-3，优选的平衡缓冲液的pH范围为pH1±0.2。
在本发明的一个或多个实施方式中，阴离子复合层析柱的填料选自：Captoadhere，NM90AgaroseHAM等阴离子复合模式填料。优选的，阴离子复合层析柱的填料为Captoadhere。
在本发明的一个或多个实施方式中，洗脱液其组成还至少包括如下任一：50mm醋酸钠-醋酸、50mm柠檬酸钠-柠檬酸酸、50mmMES、50mm磷酸盐。此时不同缓冲体系均包含1-2M盐酸精氨酸。优选的洗脱液组成为：50mm醋酸钠-醋酸，1.5M盐酸精氨酸，pH与平衡缓冲液pH相同。
在本发明的一个或多个实施方式中，平衡缓冲液其组成包括：50mm醋酸钠-醋酸，或50mm柠檬酸钠-柠檬酸酸，或50mmMES，或50mm磷酸盐。优选的平衡缓冲液组成：50mm醋酸钠-醋酸。
在本发明的一个或多个实施方式中，处理目标样品可以为如下任一：多特异性抗体或单克隆抗体或抗体片段等。
与现有技术相比，根据本发明实施方式的抗体纯化方法，精纯步骤通常利用离子交换进行纯度的提升，去除杂质，通常上样pH低于蛋白等电点，目的蛋白带正电，与阳离子交换填料发生结合，再用洗脱液进行洗脱，分离目的蛋白和杂质，达到提升纯度的作用。
本发明实现了一种从抗体混合物中去除聚集体和片段的新方法。由于蛋白质的强疏水性，洗脱极其困难。采用复合模式填料进行纯度的提升大概率会发生结合过强的情况，本发明采用疏水作用和离子排斥作用相结合，并使用盐酸精氨酸作为洗脱组分可以提高分离度。采用阴离子复合模式层析，结合洗脱模式去除杂质，目标样品的纯度为98.1％，同时保持高回收率(86.58％)。
附图说明
图1是根据本发明实施例1的四组实验对照图；
图2是根据本发明实施例2的实验图；
图3是根据本发明实施例3的实验图。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。
除非另有其它明确表示，否则在整个说明书和权利要求书中，术语“包括”或其变换如“包含”或“包括有”等等将被理解为包括所陈述的元件或组成部分，而并未排除其它元件或其它组成部分。
复合阴离子层析通常采用高于目标蛋白等电点的ph进行上样操作，蛋白通过离子交换吸附在填料上，然后通过洗脱液的离子强度，进行阶段或梯度洗脱，收集不同组分，达到提升纯度的目的。
本发明采用缓冲液pH低于蛋白等电点的缓冲液，目标蛋白的等电点在7.0-8.5之间，优选的目标蛋白等电点为7.5-8.5，首先通过pH线性洗脱(9.0-3.5)，优选的缓冲液pH范围为8.5-3.5，确定蛋白在阴离子复合填料上的分离表现，找到纯度或者曲线的拐点，确定相应的拐点pH值，通常低于蛋白等电点2-4，优选的缓冲液pH是低于等电点2-3，然后采用此时pH进行上样操作，优选的pH为3.5-6.5，例如pH6.0的缓冲体系平衡层析柱，样品的pH保持在平衡缓冲液pH±0.5，优选的样品pH调节到平衡液pH的±0.2，然后进行上样，上样之后，用平衡缓冲液进行后平衡，之后采用含有1M-2M精氨酸盐酸的洗脱液进行线性洗脱，优选的盐酸精氨酸浓度为1.0-1.5M。线性洗脱方式为0-100％洗脱液线性洗脱10-40倍柱体积，优选的洗脱体积为10-20倍柱体积。洗脱过程中监测UV信号，进行样品的收集，洗脱后步骤为再生与消毒保存。
实施例1
将构建好的携带目的基因的质粒进行脂质体介导的转染，建立表达目标双抗的CHO细胞。将转染的细胞铺在许多96孔板上。根据蛋白质量进行克隆筛选，获得高表达的细胞系。细胞在36.5℃下在补充有Eden-F600aS和Eden-F600bS的Eden-B600S培养基中生长。当细胞培养至第六天时，温度变为33℃。在第14天，收获培养物。细胞、细胞碎片和大颗粒可以通过深度过滤去除。收获后的上清采用蛋白A亲和层析进行捕获，精纯步骤采用结合-洗脱模式。通过氨基酸序列确定此双抗蛋白等电点8.1，Captoadhere复合模式填料填充在直径为0.5cm，柱高为10cm的柱中。柱体积约为2mL。层析柱的上样载量是10mg/ml(蛋白质/填料)。实验步骤如表1所示。用0.22μm过滤器过滤所有缓冲液和上样样品。A1-A4为四组平衡液，B1-B4为四组为洗脱液，以An/Bn(n顺次选自1-4)为一组实验，共有4组实验对应为实验1(采用A1、B1)-实验4(采用A4、B4)。
表1.复合模式层析程序
Table 1Mixed mode chromatography procedure
实验过程图谱如图1所示。实验结果如下：
表2 Capto adhere汇总数据
Table 2Summary data for Capto Adhere
采用capto adhere利用离子排斥和疏水作用可以很好的提高目标双抗的纯度，且保证较高的回收率，方案简单，便于操作，不需要多步纯化的复杂操作。
实施例2
将构建好的携带目的基因的质粒进行脂质体介导的转染，建立表达目标三抗的CHO细胞。将转染的细胞铺在许多96孔板上。根据蛋白质量进行克隆筛选，获得高表达的细胞系。当细胞培养至第六天时，温度变为35℃。在第14天，收获培养物。细胞、细胞碎片和大颗粒可以通过深度过滤去除。收获后的上清采用蛋白A亲和层析进行捕获，精纯步骤采用结合-洗脱模式。通过氨基酸序列确定此蛋白等电点8.0，经pH线性洗脱确定此蛋白纯度拐点为5.8，Captoadhere复合模式填料填充在直径为2.6cm，柱高为25cm的柱中。柱体积约为135mL。层析柱的上样载量是10mg/ml(蛋白质/填料)。实验步骤如表3所示。用0.22μm过滤器过滤所有缓冲液和上样样品。
表3.复合模式层析程序
Table 3Mixed mode chromatography procedure
实验过程图谱如图2所示。实验结果如下：
实施例3
将构建好的携带双抗目的基因的质粒进行电染，建立表达目标双抗的CHO细胞。将转染的细胞铺在许多96孔板上。根据蛋白质量进行克隆筛选，获得高表达的细胞系。当细胞培养至第六天时，温度变为33℃。在第13天，收获培养物。细胞、细胞碎片和大颗粒可以通过深度过滤去除。收获后的上清采用蛋白A亲和层析进行捕获，精纯步骤采用结合-洗脱模式。通过氨基酸序列确定此双抗蛋白等电点7.8，经pH线性洗脱确定此双抗蛋白纯度拐点为6.1，Capto adhere复合模式填料填充在直径为2.6cm，柱高为25cm的柱中。柱体积约为135mL。层析柱的上样载量是15mg/ml(蛋白质/填料)。实验步骤如表3所示。用0.22μm过滤器过滤所有缓冲液和上样样品。
表3.复合模式层析程序
Table 3Mixed mode chromatography procedure
实验过程图谱如图3所示。实验结果如下：
实施例4
将构建好的携带三抗目的基因的质粒进行电染，建立表达目标三抗的CHO细胞。将转染的细胞铺在许多96孔板上。根据蛋白质量进行克隆筛选，获得高表达的细胞系。当细胞培养至第六天时，温度变为33℃。在第13天，收获培养物。细胞、细胞碎片和大颗粒可以通过深度过滤去除。收获后的上清采用蛋白A亲和层析进行捕获，精纯步骤采用结合-洗脱模式。通过氨基酸序列确定此蛋白等电点8.4，经pH线性洗脱确定此蛋白纯度拐点为6.4，NM90AgaroseHAM复合模式填料填充在直径为2.6cm，柱高为25cm的柱中。柱体积约为135mL。层析柱的上样载量是15mg/ml(蛋白质/填料)。实验步骤如表4所示。用0.22μm过滤器过滤所有缓冲液和上样样品。
表4.复合模式层析程序
Table 3Mixed mode chromatography procedure
实验结果如下：
实施例5
将构建好的携带三抗目的基因的质粒进行电染，建立表达目标三抗的CHO细胞。将转染的细胞铺在许多96孔板上。根据蛋白质量进行克隆筛选，获得高表达的细胞系。当细胞培养至第六天时，温度变为33℃。在第13天，收获培养物。细胞、细胞碎片和大颗粒可以通过深度过滤去除。收获后的上清采用蛋白A亲和层析进行捕获，精纯步骤采用结合-洗脱模式。通过氨基酸序列确定此蛋白等电点8.2，经pH线性洗脱确定此蛋白纯度拐点为6.2，NM90Agarose HAM复合模式填料填充在直径为2.6cm，柱高为25cm的柱中。柱体积约为135mL。层析柱的上样载量是15mg/ml(蛋白质/填料)。实验步骤如表5所示。用0.22μm过滤器过滤所有缓冲液和上样样品。
表5.复合模式层析程序
Table 3Mixed mode chromatography procedure
实验结果如下：
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
Claims (9)
1.一种抗体纯化方法，包括如下步骤：
针对目标样本，确定所述目标样本的蛋白等电点，在阴离子复合层析柱上，经pH线性洗脱表现得到表征纯度的拐点，获得拐点对应的pH值pH1；
依据拐点对应的pH1和蛋白等电点配制适用于目标样本的平衡缓冲液，并对阴离子复合层析柱进行平衡操作，满足平衡缓冲液的pH不高于蛋白等电点，平衡缓冲液的pH范围为pH1±0.5；
目标样品上样，以所述平衡缓冲液进行后平衡，再以含有1M-2M盐酸精氨酸的洗脱液进行线性洗脱，并收集样品、再生、消毒保存。
2.如权利要求1所述的抗体纯化方法，其特征在于，所述pH线性洗脱所采用的洗脱液的pH范围为3.5-9。
3.如权利要求2所述的抗体纯化方法，其特征在于，所述pH线性洗脱所采用的洗脱液的pH范围为3.5-8.5。
4.如权利要求1所述的抗体纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液的pH与蛋白等电点相比：低于蛋白等电点2-4。
5.如权利要求1所述的抗体纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液的pH与蛋白等电点相比：低于蛋白等电点2-3，pH范围为pH1±0.5。
6.如权利要求1所述的抗体纯化方法，其特征在于，所述阴离子复合层析柱的填料选自：Captoadhere、NM90AgaroseHAM。
7.如权利要求1所述的抗体纯化方法，其特征在于，所述洗脱液其组成还至少包括如下任一：50mM醋酸钠-醋酸、50mM柠檬酸钠-柠檬酸酸、50mM MES、50mM磷酸盐。
8.如权利要求1所述的抗体纯化方法，其特征在于，所述平衡缓冲液其组成至少包括如下任一：50mM醋酸钠-醋酸、50mM柠檬酸钠-柠檬酸酸、50mMMES、50mM磷酸盐。
9.如权利要求1所述的抗体纯化方法，其特征在于，所述目的样本的抗体类型，包括：多特异性抗体或单克隆抗体或抗体片段。
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