KR20130128020A - 약한 분배성 크로마토그래피법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체로부터 생성물을 정제하기 위해 약한 분배성 크로마토그래피를 이용하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상을 결합시키도록 하거나, 대안적으로는, 0.1 이상의 분배 계수로 한정되는 작동 조건에 의해 명시되는 약한 분배성 크로마토그래피법에 관한 것이다.

Description

약한 분배성 크로마토그래피법 {A METHOD OF WEAK PARTITIONING CHROMATOGRAPHY}
본 발명은 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체 (load fluid) 로부터 정제 생성물을 회수하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 당해 방법은, 매질이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상을 결합시키도록 하는 작동 조건에서 로드 유체를 매질에 통과시키는 단계, 및 로드 순환 (load cycle) 중의 컬럼 용리액 및 본질적으로 등용매조성 (isocratic) 인 임의의 세정액 내 정제 생성물을 회수하는 단계를 포함한다. 본 발명의 다른 구현예에서, 당해 방법은, 0.1 이상의 분배 계수로 한정되는 작동 조건에서 로드를 매질에 통과시키는 단계를 포함한다.
생명공학 산업에서, 상업적 규모의 단백질 정제는 치료 및 진단 목적용 재조합 단백질의 개발을 위한 중요 도전 과제이다. 제조 부문에서는 수율, 순도 및 처리량에 관련한 문제가 계속적으로 빚어져 왔다. 재조합 단백질 기술의 시대가 도래함에 따라, 원하는 단백질을, 그 단백질을 인코딩하는 유전자를 발현시키기 위해 엔지니어링된 배양된 진핵 또는 원핵 숙주 세포주를 이용하여 생산할 수 있다. 그러나, 숙주 세포 배양 공정으로부터 얻어지는 것은, 단백질 변형체와 같은 단백질 그 자체로부터 또는 숙주 세포 단백질과 같은 숙주 세포로부터 유래된 불순물과 원하는 단백질과의 혼합물이다. 원하는 재조합 단백질의 약학적 적용에서의 이용은, 이들 불순물로부터 적정 수준의 단백질을 신뢰성 있게 회수할 수 있는지의 여부에 달려 있다.
통상적 단백질 정제 방법은, 크기, 전하, 용해도 및 소수성 정도의 차이를 근거로 하여 불순물로부터 원하는 단백질을 분리하도록 고안된다. 이러한 방법에는 크로마토그래피법, 예컨대 친화성 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 및 히드록시아파타이트 크로마토그래피가 포함된다. 이들 방법에서는 흔히 분리 매질이 이용되는데, 이는 원하는 단백질 또는 불순물을 선택적으로 부착시키도록 고안될 수 있다. 결합-용리성 (bind-elute) 방식에서는, 원하는 단백질이 분리 매질에 선택적으로 결합되고, 상이한 용매에 의해 매질로부터 차별적으로 용리된다. 통과-흐름성 (flow-through) 방식에서는, 불순물이 분리 매질에 특이적으로 결합되는 반면, 원하는 단백질은 그렇지 않기 때문에, 원하는 단백질이 "통과-흐름" 내로 회수된다.
항체와 같은 단백질을 정제하는 현행 방법은 둘 이상의 크로마토그래피 단계를 포함한다. 예를 들어, 단백질 정제 프로토콜에서의 제 1 단계는 원하는 단백질 및 고정화 포획제 사이의 특이적 상호작용을 이용하는 친화성 크로마토그래피 단계를 종종 이용한다. 단백질 A 흡착제는, Fc 영역을 포함하고 있는 항체와 같은 단백질의 친화성 포획에서 특히 유용하다. 그러나, 단백질 정제를 위해 단백질 A 크로마토그래피를 이용하면 단백질 A 포획 작용제가 누출된다는 단점이 있으며, 이는 용리된 단백질 생성물의 오염을 야기한다. 또한, 친화성 포획은 원하는 단백질을 단백질 변형체, 예컨대 단백질의 응집된 형태로부터 분리시키지 못한다.
연구원들은, 정제 공정 자체 내에서 있을 수 있는 선행 단계 및 배양 공정의 둘 다로부터 나오는 불순물을 갖지 않는 단백질을 회수하기 위한 노력으로 결합-용리성 방법, 통과-흐름성 방법 및 치환 방법을 이용해 왔다.
친화성 포획 단계 이후 단백질 정제를 위한 전형적 제 2 단계로서 결합-용리성 단계를 이용하는 그룹의 예에 하기가 포함된다: US 특허 4,983,722 (혼합물로부터 단백질 A 를 감소시키는 결합-용리성 이온 교환 방법이 기술됨); US 특허 5,429,746 (단백질 A 불순물을 포함하는 혼합물로부터 IgG 항체를 정제하기 위한 결합-용리성 소수성 상호작용 크로마토그래피 방법이 기술됨); 및 US 특허 5,644,036 (단백질 A 단계, 결합-용리성 이온 교환 단계, 및 크기 배제 단계를 포함하는, 정제 IgG 항체 제제의 수득을 위한 3-단계 공정이 기술됨). 다른 그룹에서는 친화성 크로마토그래피 단계 이후 통과-흐름성 단계를 이용해왔다. 예를 들어, PCT 공개 WO 04/076485 는, 단백질 A 크로마토그래피 단계 및 이후 통과-흐름성 이온 교환 단계에 의해 정제된 항체로부터 누출된 단백질 A 를 제거하는 방법을 기술하고 있다. PCT 공개 WO 03/059935 는, 샘플을 통과-흐름성 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계 및 이후 친화성 크로마토그래피 단계에 적용하는 것을 포함하는, 샘플 내 단백질의 정제 방법을 기술하고 있다.
기타 그룹에서는, 기존의 정제 단계와 연관되었던 문제점들을 피하기 위해 단일 폴리싱 (polishing)-단계 정제 계획안을 이용했다. 예를 들어, US 특허 6,177,548 은 생물학적 샘플로부터 응집체를 제거하는 단일-단계 통과-흐름성 이온 교환 방법을 기술하고 있는데, 여기서는 샘플의 pH 가 생물학적 샘플의 등전점 미만인 0.2 log 로 조정된다. US 특허 5,451,662 는 단일-단계 결합-용리성 이온 교환 방법을 기술하고 있는데, 여기서는 미정제 단백질 혼합물의 pH 가, 분리할 단백질 분획의 등전점 범위 사이의 값으로 조정된다. PCT 공개 WO 05/044856 은 히드록시아파타이트 크로마토그래피를 이용하여 항체 제제로부터 고분자량 응집체를 제거하는 단일-단계 치환 방법을 기술하고 있다.
그러나, 선행 기술의 통상적 결합-용리성 또는 통과-흐름성 방법 중 어느 것도 처리량, 수율 및 생성물 순도의 모든 요건 면에서 생명 공학산업의 요구를 충족시킬 수 없었다. 결합-용리성 방법 및 치환 방법은, 기타 요인 중, 원하는 단백질에 대한 분리 매질의 용량 한계에 의해 제한된다. 반면, 통과-흐름성 방법은 결합-용리성 방법보다 더 높은 로드 챌린지 (load challenges) 를 허용하지만, 불순물에 대한 분리 매질의 용량에 의해 제한된다. 통과-흐름성 방법에서는, 생성물이 컬럼에 결합되는 일이 실질적으로 발생하지 않는데; 임의의 실질적인 생성물 결합은 생성물 회수율에 부정적인 영향을 주는 것으로 볼 수 있다. 치료 및 진단 용도에서 요구하는 순도 및 수율에 대한 요건을 충족시키는, 대량 처리 (high throughput) 로 정제 단백질을 회수하는 방법에 대한 요구가 여전히 존재한다. 더욱이, 상업적 제조 공정은 신뢰성 있고, 확고하며, 비용 효율적인 정제 계획안에 대한 요구를 더하고 있다.
[도면의 간단한 설명]
도 1A 및 1B 는 (A) 분배 계수 및 생성물 흡착 등온선 사이의 관계; 및 (B) 세 가지 작업 방식: 결합-용리성 방식, 약한 분배성 방식 및 통과-흐름성 방식에서 수지에 결합되는 생성물에 대한 흡착 등온선을 보여주고 있다.
도 2A 및 2B 는 (A) 이온 교환 크로마토그래피에서의 세 가지 작업 방식: 결합-용리성 방식, 약한 분배성 방식 및 통과-흐름성 방식에서의 분배 영역; 및 (B) 히드록시아파타이트에서의 세 가지 작업 방식에서의 분배 영역을 보여주고 있다.
도 3 은 세 가지 작업 방식: 결합-용리성 방식, 약한 분배성 방식 및 통과-흐름성 방식에서의 도식적 크로마토그램을 보여주고 있다.
도 4 는 약한 분배성 및 통과-흐름성 크로마토그램을 비교하고 있다.
도 5A 및 5B 는 (A) Kp 의 함수로서의 전형적 오염원 제거율 프로필; 및 (B) 로드 챌린지 및 Kp 의 함수로서의 회수율을 보여주고 있다.
도 6 은 하기 단계를 포함하는, 약한 분배성 크로마토그래피 단계 개발의 전형적 진행을 보여주고 있다: 1) Kp 측정을 위한 대량 처리 스크린, 2) 낮은 로드 챌린지의 시행, 3) 높은 챌린지 용량 시행, 및 4) 최적의 약한 분배성 크로마토그래피 시행.
도 7 은 실험 1.1 에 기술된 바와 같이 저농도 데이터세트로부터의 총 클로라이드 농도 및 Kp 대 pH 의 등고선 플롯을 보여주고 있다.
도 8 은 실험 1.1 에 기술된 바와 같이 분배 계수, Kp 의 함수로서의 단백질 A 제거율을 보여주고 있다. log 제거값은 Kp 에 따라 증가한다. 통과-흐름성 방식은 "FT" 가 적힌 점선 박스로 표시했고, 약한 분배성 방식은 "WP" 가 적힌 점선 박스로 표시했다.
도 9 는 실험 2.1. 에 기술된 바와 같이 총 클로라이드 농도 및 Kp 대 pH 의 등고선 플롯을 보여주고 있다.
도 10A 및 10B 는 (A) Mab-AAB 에 대한, 이온 교환 크로마토그래피에서 Kp 의 함수로서의 숙주 세포 단백질 파과 (breakthrough) 프로필; 및 (B) Mab-AAB 의 경우, 이온 교환 크로마토그래피에서 Kp 의 함수로서의 단백질 A 의 파과를 보여주고 있다.
도 11 은 Mab-MYA 의 경우, 히드록시아파타이트에서의 약한 분배성 크로마토그래피에 대한 최적 작동 윈도우을 보여주고 있다. 이 실시예에서의 최적 Kp 는 1.5 내지 20 이다.
도 12 는 Mab-A5T4 의 경우, 히드록시아파타이트에서의 약한 분배성 크로마토그래피에 대한 최적 작동 윈도우을 보여주고 있다. 이 실시예에서의 최적 Kp 는 2 내지 20 이다.
도 13 은 Mab-MYO 의 경우, 히드록시아파타이트에서의 약한 분배성 크로마토그래피에 대한 최적 작동 윈도우을 보여주고 있다. 이 실시예에서의 최적 Kp 는 5 내지 20 이다.
본 발명의 요약
본 발명은, 매질이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상을 결합시키도록 하는 작동 조건에서 로드 유체를 매질에 통과시키는 것과, 로드 순환 중의 컬럼 용리액 및 본질적으로 등용매조성인 임의의 세정액 내 정제 생성물을 회수하는 것에 의해, 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체로부터 정제 생성물을 회수하는 방법에 관한 것이다. 다른 구현예에서, 작동 조건은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 5 mg 이상을 결합시키도록 한다. 또다른 구현예에서, 작동 조건은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 10 mg 이상을 결합시키도록 한다. 다른 구현예에서, 작동 조건은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 20, 30, 40, 50 또는 60 mg 이상을 결합시키도록 한다.
본 발명은 또한, 0.1 이상의 분배 계수로 한정되는 작동 조건에서 로드 유체를 매질에 통과시키는 것과, 로드 순환 중의 컬럼 용리액 및 본질적으로 등용매조성인 임의의 세정액 내 정제 생성물을 회수하는 것에 의해, 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체로부터 정제 생성물을 회수하는 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서는, 분배 계수가 약 0.2 내지 약 20.0 의 범위이다. 또다른 구현예에서는, 분배 계수가 약 0.2 내지 약 10.0 의 범위이다. 또다른 구현예에서는, 분배 계수가 약 1.0 내지 약 5.0 의 범위이다. 또다른 구현예에서는, 분배 계수가 약 0.5 내지 약 5.0 의 범위이다. 추가적 구현예에서는, 분배 계수가 약 0.5 내지 약 1.5 의 범위이다.
본 발명은 또한, 매질이 매질 1 mL 당 생성물을 적어도 1 내지 약 70 mg 결합시키도록 하고 0.3 내지 20 의 분배 계수로 한정되는 작동 조건에서 로드 유체를 매질에 통과시키는 것과, 로드 순환 중의 컬럼 용리액 및 본질적으로 등용매조성인 임의의 세정액 내 정제 생성물을 회수하는 것에 의해, 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체로부터 정제 생성물을 회수하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 매질이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상을 결합시키도록 하거나 대안적으로는 0.1 이상의 분배 계수로 한정되는 작동 조건을, 스크리닝 단계에서, 확인하는 것을 제공한다. 스크리닝 단계는 배치 결합 (batch binding) 연구 또는 컬럼 결합 (column binding) 연구, 예컨대 구배 용리 (gradient elution) 연구 또는 등용매조성 용리 연구를 적용할 수 있다.
작동 조건에는 pH 수준, 이온 강도, 염 농도, 부형제 농도 (예컨대, 포스페이트 농도, 칼슘 농도, 아르기닌 농도, 글리신 농도 및 HEPES 농도) 및 반대 리간드 (counterligand) 수준 (예컨대, 이미다졸 농도) 이 포함되는데, 이는 매질의 선택에 의존한다.
매질은 하전 이온 교환 매질, 예컨대 음이온 교환 매질 또는 양이온 교환 매질, 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지, 히드록시아파타이트 수지, 또는 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 수지를 포함하는 임의 유형의 크로마토그래피 수지 또는 분리 매질일 수 있다.
본 발명을 이용하여 회수할 수 있는 정제 생성물에는 융합 단백질, Fc-포함 단백질, 면역접합체, 사이토킨, 인터루킨, 호르몬 및 치료 효소가 포함된다.
본 발명을 이용하여 제거할 수 있는 불순물에는 숙주 세포 단백질, 핵산, 생성물 변형체, 내독소, 단백질 A 및 바이러스가 포함된다.
한 구현예에서, 매질은 숙주 세포 단백질, 핵산, 생성물 변형체, 내독소 및 단백질 A 를 포함하는 로드 유체 내에서 불순물의 99.9 % 이상을 제거한다.
또다른 구현예에서는, 정제 생성물 내 생성물 변형체의 농도가 약 2 % 를 초과하지 않는다.
추가적 구현예에서는, 매질로의 로딩이 매질 1 mL 당 생성물 500 mg 이상 또는 1000 mg 이상의 로드 챌린지로 이루어질 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 정제 생성물은, 매질이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상을 결합시키도록 하는 pH 수준 및 이온 강도를 포함하는 작동 조건에서, 또는 대안적으로는 0.1 이상의 분배 계수로 한정되는 작동 조건에서, 로드 유체를 하전 이온 교환 매질에 통과시키는 것에 의해 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체로부터 회수한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 정제 생성물은, 매질이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상을 결합시키도록 하는 pH 수준, 이온 강도 및 염 농도를 포함하는 작동 조건에서, 또는 대안적으로는 0.1 이상의 분배 계수로 한정되는 작동 조건에서, 로드 유체를 소수성 상호작용 크로마토그래피 수지에 통과시키는 것에 의해 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체로부터 회수한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 정제 생성물은, 매질이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상을 결합시키도록 하는 pH 수준, 이온 강도, 포스페이트 농도, 칼슘 농도, 아르기닌 농도, 글리신 농도, HEPES 농도 및 이미다졸 농도를 포함하는 작동 조건에서, 또는 대안적으로는 0.1 이상의 분배 계수로 한정되는 작동 조건에서, 로드 유체를 히드록시아파타이트 크로마토그래피 수지에 통과시키는 것에 의해 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체로부터 회수한다.
본 발명의 또다른 양태에서, 정제 생성물은, 매질이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상을 결합시키도록 하는 반대 리간드 수준 및 pH 수준을 포함하는 작동 조건에서, 또는 대안적으로는 0.1 이상의 분배 계수로 한정되는 작동 조건에서, 로드 유체를 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 수지에 통과시키는 것에 의해 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체로부터 회수한다.
본 발명의 방법은 하나 이상의 정제 단계와 임의적으로 조합할 수 있다. 임의적 단계(들) 를 본 발명의 방법의 실행 이전 또는 이후에 수행할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 단백질 A 크로마토그래피 단계를 초기 단계로서 임의적으로 조합할 수 있다.
본 발명의 한 구현예에서는, 생성물-포함 유체를 낮은 이온 강도의 용리 완충액을 이용하여 단백질 A 컬럼으로부터 용리시키고; 생성물-포함 유체의 전도도 및 pH 를 중화 완충액을 이용해 조정하여 생성물-포함 유체의 이온 강도가 20 mM 을 초과하지 않도록 하여, 로드 유체를 생성시키고; 상기 로드 유체를 본 발명의 작동 조건 하에서 음이온 교환 매질에 통과시킨다.
일부 구현예에서, 용리 완충액은 pKa 6.5 ~ 10 인 양이온기로 하전된 분자를 포함한다. 다른 구현예에서, 용리 완충액은 pKa 2 ~ 5 인 음이온기로 하전된 분자를 추가로 포함한다. 특정 구현예에서, 용리 완충액은 pH 7 내지 9 에서 쯔비터이온인 분자를 포함한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 방법에 의해 제조된, 정제 단백질 및 항체를 포함하는 정제 생성물을 제공한다.
본 발명의 추가적 목적 및 장점은 이어지는 상세한 설명에 일부 기재되며, 일부는 상세한 설명으로부터 자명하거나 또는 본 발명의 실시를 통해 알 수 있다. 본 발명의 목적 및 장점은 첨부된 청구의 범위에 특별히 지적된 요소 및 조합을 통해 실현 및 획득될 것이다.
상기한 일반적 설명 및 이어지는 상세한 설명은 모두 본 발명을 예시 및 설명하기 위한 것이지 본 발명을 한정하기 위한 것으로 이해되서는 안된다.
본 명세서에 포함되며, 본 명세서의 일부를 구성하는 첨부된 도면은 상세한 설명과 함께 본 발명의 원리를 설명해준다.
발명의 상세한 설명
A. 정의
본 발명을 더욱 쉽게 이해할 수 있도록 하기 위해서, 특정 용어를 먼저 정의한다. 추가적 정의는 상세한 설명 전체에 걸쳐서 기재된다.
용어 "통과-흐름성 방식" 이란 생성물 제제 분리 기술을 나타내는 것으로서, 여기서 제제 내에 포함된 하나 이상의 생성물은 통과-흐름성 크로마토그래피 수지 또는 매질을 통과하여 흐르게 되고, 동시에 하나 이상의 잠재적 오염원 또는 불순물은 크로마토그래피 수지 또는 매질에 결합되도록 고안된다. 일반적으로, 통과-흐름성 방식을 위한 생성물 분배 계수는 0.1 미만이고, 결합 생성물 농도는 1 mg/mL 미만이다. "통과-흐름성 방식" 은 등용매조성 작업이다.
용어 "결합-용리성 방식" 이란 생성물 제제 분리 기술을 나타내는 것으로서, 여기서 제제 내에 포함된 하나 이상의 생성물은 크로마토그래피 수지 또는 매질에 결합된다. 일반적으로, 결합-용리성 방식을 위한 생성물 분배 계수는 20 을 초과하고, 결합 생성물 농도는 1 ~ 20 mg/mL 이다. 이 방식에서 결합 생성물은 용리상 동안 용리된다.
용어 "약한 분배성 방식" 이란 생성물 제제 분리 기술을 나타내는 것으로서, 여기서 제제 내에 포함된 하나 이상의 생성물 및 하나 이상의 오염원 또는 불순물 모두는 크로마토그래피 수지 또는 매질에 결합된다. 약한 분배성 방식에서의 생성물은 크로마토그래피 수지 또는 매질의 1 mL 당 생성물 1 mg 이상으로 결합된다. 일반적으로, 약한 분배성 방식을 위한 생성물 분배 계수 0.1 이상이다. "약한 분배성 방식" 는 등용매조성 작업이다.
용어 "분배 계수" (Kp) 란, pH 및 용액 조성의 구체화된 조건 하에서, 용액 내 생성물의 농도 (c) 에 대한 수지에 흡착된 생성물의 농도 (Q) 의 평형비를 나타낸다. 분배 계수 Kp 는 또한 도 1 에 도시된 바와 같이 생성물 흡착 등온선과 관련된다. 분배 계수 Kp 는 매우 낮은 용액 농도에서의 생성물 흡착 등온선의 기울기에 대응된다. 이는 하기 식에서와 같이 최대 용량에 관련된다:
Figure pat00001
식 중, Q최대 는 생성물에 대한 수지의 최대 용량이며, kd 는 "수지-생성물" 상호작용에 대한 해리 상수이다. 분배 계수는 전형적으로는 배치 결합 기술로 측정하지만, 다른 기술, 예컨대 등용매조성 크로마토그래피를 이용할 수도 있다.
용어 "결합 생성물" (Q) 이란, 공급스트림으로 평형화된 경우 수지에 결합되는 생성물의 양을 나타낸다.
용어 "항체" 란 임의의 면역글로불린 또는 이의 단편을 나타내고, 항원-결합 부위를 포함하는 임의의 폴리펩티드를 포함한다. 상기 용어는 다클론, 단클론, 단특이성, 다특이성, 비특이성, 인간화, 인간, 단일-사슬, 키메라, 합성, 재조합, 하이브리드, 돌연변이, 이식 및 시험관내 생성 항체를 포함하지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 용어 "항체" 는 또한 항체 단편, 예컨대 Fab, F(ab')2, Fv, scFv, Fd, dAb, 및 항원-결합 기능을 보유하는 기타 항체 단편을 포함한다. 전형적으로, 이러한 단편은 항원-결합 도메인을 포함할 것이다.
본 발명의 특정 구현예에서, 항체는 CH2/CH3 영역을 포함하는 것이므로, 단백질 A 크로마토그래피에 의해 정제된다. 용어 "CH2/CH3 영역" 이란 단백질 A 와 상호작용하는 면역글로불린 분자의 Fc 영역 내 아미노산 잔기를 나타낸다. 일부 구현예에서, CH2/CH3 영역은 무손상 CH2 영역 및 이어지는 무손상 CH3 영역을 포함하고, 다른 구현예에서는, 면역글로불린의 Fc 영역을 포함한다. CH2/CH 영역-포함 단백질의 예에는 CH2/CH3 영역에 융합되거나 또는 접합되는 원하는 단백질을 포함하는 융합 단백질, 항체 및 면역흡착 (immunoadhesion) 이 포함된다.
용어 "로드 (load)" 란 정화된 세포 배양 또는 발효 조건화 매질 유래의 생성물, 또는 크로마토그래피 단계 유래의 부분적 정제 중간물을 포함하는 임의의 로드 물질을 나타낸다. 용어 "로드 유체" 란 로드 물질을 포함하는 액체를 나타내는 것으로서, 본 발명의 작동 조건 하에서 매질에 통과된다.
용어 "불순물" 이란, 정제할 원하는 단백질의 샘플 내에, 정제할 원하는 단백질 이외에 또한 존재하는 생물학적 거대분자, 예컨대 DNA, RNA 또는 단백질을 포함하는 임의의 이물 또는 원치않는 분자를 나타낸다. 불순물에는, 예를 들어, 단백질 변형체, 예컨대 응집된 단백질, 고분자량 종 (species), 저분자량 종 및 단편, 및 탈아미드 종; 정제할 단백질을 분비하는 숙주 세포로부터의 다른 단백질 (숙주 세포 단백질); 선행 정제 단계 동안 샘플로 침출될 수 있는, 친화성 크로마토그래피에 이용되는 흡수체의 일부인 단백질, 예컨대 단백질 A; 내독소; 및 바이러스가 포함된다.
용어 "본질적으로 등용매조성인 세정" 이란 pH 또는 조성 면에서 로드 유체와 오직 약간만 다른 용액을 나타낸다.
용어 "컬럼 용리액" 이란 로드 순환 중의, 또는 로드가 적용되는 기간에 매질 또는 컬럼에서 배출되는 액체를 나타낸다.
용어 "로드 챌린지" 란, 배치 결합에서 수지에 적용되거나, 크로마토그래피 단계의 로드 순환에 컬럼 상에 로딩되는 생성물의 총 질량을 나타내는 것으로서, 수지의 단위 부피당 생성물의 단위 질량으로 측정된다.
용어 "log 제거값" (LRV) 이란 생성물 풀 (pool) 내 불순물의 질량에 대한 정제 단계의 로드 내 불순물의 질량비의 log(및 10) 를 나타낸다.
용어 "등용매조성 크로마토그래피" 란 원하는 기간 중의 농도 (strength) 가 변하지 않는 용매를 이용하는 크로마토그래피 컬럼 작업을 나타낸다.
B. 방법의 설명
본 발명은 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체로부터 정제 생성물을 회수하는 방법을 제공한다. 본 발명은 치료 및 진단 목적용 단백질의 대규모 제조에 효용을 갖는다.
1. 약한 분배성 방식
출원인은 놀랍게도, 통상의 결합-용리성 및 통과-흐름성 크로마토그래피 방식 사이의 영역 (region) 에 속하는 크로마토그래피 방식에서의 작업에 의해, 불순물이 고도로 감소될 뿐 아니라, 생성물 로드 챌린지 및 생성물 회수율이 높아질 수 있다는 것을 알아내었다. 출원인은 이러한 중간물 생성물 결합 방식을 "약한 분배성 방식" 이라 명명했다.
약한 분배성 방식에서는, 원하는 생성물 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 로드 유체를 크로마토그래피 매질에 통과시키는데, 이때 생성물 및 불순물이 둘 다 매질에 결합된다. 그러나, 불순물이 생성물보다 더욱 단단히 매질에 결합되고, 로딩이 계속됨에 따라, 결합되지 않은 생성물은 매질을 통과하게 되고, 컬럼 용리액으로부터 회수된다. 이후, 임의로는 매질을 등용매조성 조건 하에서 세정하여, 약하게 결합된 추가의 생성물을 매질로부터 회수하고, 본질적으로 등용매조성인 임의의 세정으로부터의 정제 생성물을, 로드 순환 중의 컬럼 용리액으로부터의 정제 생성물과 혼주 (pool) 시킨다.
본 발명에 따르면, 약한 분배성 방식은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상을 결합시키도록 하는 작동 조건에 의해 한정된다. 한 구현예에서, 작동 조건은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 5 mg 이상을 결합시키도록 한다. 또다른 구현예에서, 작동 조건은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 10 mg 이상을 결합시키도록 한다. 또다른 구현예에서, 작동 조건은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 20 mg 이상을 결합시키도록 한다.
본 발명의 특정 구현예에서는, 매질에 결합된 총 생성물 질량이 매질에 로딩된 총 생성물 질량의 10 % 이상이다. 일부 구현예에서는, 매질에 결합된 총 생성물 질량이 매질에 로딩된 총 생성물 질량의 20 % 이상이다. 다른 구현예에서, 매질에 결합된 총 생성물 질량이 매질에 로딩된 총 생성물 질량의 30 % 이상이다.
본 발명에 따르면, 약한 분배성 방식이 또한 0.1 이상의 분배 계수에 의해 한정된다. 일부 구현예에서, 약한 분배성 방식에서의 작동은 약 0.2 내지 약 20.0 의 범위의 분배 계수에 의해 한정되는 조건 하에서의 작동을 포함한다. 특정 구현예에서, 약한 분배성 방식에서의 작동은 약 0.2 내지 약 10.0 의 범위의 분배 계수에 의해 한정되는 조건 하에서의 작동을 포함한다. 다른 구현예에서, 약한 분배성 방식에서의 작동은 약 1.0 내지 약 5.0 의 범위의 분배 계수에 의해 한정되는 조건 하에서의 작동을 포함한다. 다른 구현예에서는, 약한 분배성 방식에서의 작동이 약 0.5 내지 약 5.0 범위의 분배 계수에 의해 한정되는 조건 하에서의 작동을 포함한다. 또 다른 구현예에서는, 약한 분배성 방식에서의 작동이 약 0.5 내지 약 1.5 의 범위의 분배 계수에 의해 한정되는 조건 하에서의 작동을 포함한다.
본 발명의 하나 이상의 구현예는, 매질이 매질 1 mL 당 생성물을 적어도 1 내지 약 70 mg 결합시키도록 하고 0.3 내지 20 의 분배 계수에 의해 한정되는 약한 분배성 방식 작동 조건을 제공한다.
도 1 은, 결합-용리성, 통과-흐름성, 및 약한 분배성 방식에서의 생성물 흡착 등온선을 보여주고 있는데, 여기서 약한 분배성 방식에서의 생성물 결합은 결합-용리성 및 통과-흐름성 방식과 비교하여 명백히 중간적이다. 생성물 분배 계수 (Kp) 의 값은 용액 내 생성물의 농도에 대한 흡착된 생성몰의 농도의 비율이므로, 약한 분배성 방식에서의 Kp 값 또한 결합-용리성 및 통과-흐름성 방식에서의 값의 중간이다.
도 2A 는 결합-용리성, 약한 분배, 및 통과-흐름성 방식에서의 분배 영역을 이온 강도의 함수로서 도시하고 있는데, 통과-흐름성 방식보다 약한 분배성 방식에서 K불순물 이 더 큼을 보여준다. 약한 분배성 방식의 더욱 엄격한 결합 조건 하에서는, 통과-흐름성 방식보다 더 높은 생성물 용량을 달성할 수 있는데, 이는 통과-흐름성 방식 보다 더 높으며 (불순물이 더 강하게 결합되기 때문임), 결합-용리성 방식보다 더 높은 것이다 (생성물이 불순물과 비교할 때 매우 약하게 결합되고, 수지 용량의 대부분을 차지하지 않기 때문임). 불순물 분배 계수 (K불순물) 는 더욱 엄격한 결합 조건에서 더욱 높아지며, 이는 통과-흐름성 방식의 생성물 풀과 비교할 때 약한 분배성 방식의 생성물 풀 내의 잔여 불순물의 농도를 더 낮추어 준다. 히드록시아파타이트에서의 통과-흐름성, 약한 분배, 및 결합-용리성 영역이 포스페이트 및 NaCl 농도의 함수로서 도 2B 에 도시된다.
표 A 에는 세 가지 결합 방식: 결합-용리성 (B-E), 약한 분배성 (WP), 및 통과-흐름성 (FT) 사이의 특징 차이가 요약된다.
[표 A]
Figure pat00002
약한 분배성 방식은 또한, 도 3 에 도시된 바와 같이, 결합-용리성 및 통과-흐름성 방식의 크로마토그램에서 이들과 구별될 수 있다. 우선, 통과-흐름성 및 약한 분배성 방식에서의 크로마토그램은 꽤 유사하게 보일 수 있다 - 등용매조성 조건 하 세정액 분획 및 컬럼 용리액에서의 생성물의 회수. 그러나, 도 4 에 도시된 바와 같이, 미묘하지만 의미있는 차별점이 크로마토그램에 존재하는데, 이는 이들 방식을 구별하는데 이용될 수 있다. 통과-흐름성 방식과 비교할 때 약한 분배성 방식에서는 초기 파과 프로필에 지연이 나타난다 (> 0.1 컬럼 부피 또는 CV). 약한 분배성 방식에서는 세척 프로필이 더 느리다. 생성물을 포함하는 작은 스트립 피크가 존재할 수 있는데 (이는 세정 단계 후에도 로딩 생성물 농도의 10 ~ 50 % 가 여전히 수지에 결합되어 있음을 의미함), 이는 로드 순환 중의 컬럼 용리액의 회수에 후속하는 등용매조성 조건 하에서의 로드 후 1 ~ 5 CV 세정을 적용함으로써 수지로부터 회수할 수 있다.
도 5A 는 다양한 수준의 생성물 분배 계수의 값에 대한 오염원 LRV 의 일반적 경향을 보여주고 있다. 오염원 LRV 는 통과-흐름성 작동에 해당하는 Kp 조건에서 비교적 낮다. 증가하는 Kp 의 조건 하에서의 작동은 오염원 파과 이전의 컬럼 용리액 분획 내 LRV 를 상당히 증가시킨다. 실시예에 나타낸 바와 같이, 높은 Kp 값에서의 작동은 표준 통과-흐름성 조건에 해당하는 것보다 2 log 정도 오염원 LRV 를 향상시킨다.
증가하는 Kp 는 전형적으로는 생성물 및 오염원의 둘 모두의 수지로의 결합을 증가시킨다. 더 높은 Kp 에서의 오염원의 더 강한 결합은 오염원 파과 이전의 컬럼 용리액 분획에서의 LRV 를 증가시킨다. 그러나, 오염원 파과 순간의 로드 챌린지는 Kp 증가에 따라 감소하는데, 이는 도 5A 에 높은 Kp 곡선으로 도식적으로 나타낸 바와 같이, 생성물이 수지 상의 결합 부위에 대해 오염원과 경쟁을 시작하기 때문이다. 그러므로, 약한 분배성 영역은, 주어진 분리에 대한 컬럼 용량 요건 및 오염원 LRV 의 개선 사이에서 균형이 있는 작동 윈도우에 해당한다.
약한 분배성 크로마토그래피에서의 Kp 상한은 또한 도 5B 에 도시된 바와 같이 컬럼 로드 챌린지에 의존한다. 분배 계수는, 통과-흐름성 조건의 경계값에서의 생성물 회수율에 영향을 주지 않는다. 생성물 회수율은 높은 Kp 값에서 떨어지기 시작하는데, 여기서, 등용매조성의 세정 조건은, 결합 생성물을 적당한 수의 세정액 부피로 세정하여 컬럼으로부터 제거하는데 효과적이지 못하다. 비효과적 세척에 기인하는 생성물 손실의 양은 로드 챌린지, 및 로드 내 오염원의 성질 및 비율에 민감하다. 따라서, WP 영역의 하한은 오염원 제거의 요건에 의해 한정되며, 동시에, 주어진 로드 챌린지에 대한 상한은 생성물 회수율 또는 용량의 제약에 의해 한정된다.
본 발명의 하나 이상의 구현예에서, 최적의 약한 분배성 조건은, 도 6 에 도시된 바와 같은, 하기의 실험 순서를 이용하여 확인할 수 있다:
(i) HTS 스크린 (또는 표준 배치 결합 실험) 을 수행하여, 생성물 분배 계수 Kp 를 작동 조건의 함수로서 측정한다. 이들 실험으로부터 약한 분배성 영역 (0.1 < Kp < 20) 에 해당하는 작동 윈도우을 확인한다.
(ii) 바람직하게는, 약한 분배성 영역을 확인한 후, 표준 통과-흐름성 작동에 이용되는 것과 유사한 로드 챌린지 (대략 50 mg/mL) 로 소규모 컬럼상에 스카우팅 시행을 수행할 수 있다. 이들 실험으로부터의 오염원 제거율 및 생성물 회수율 값에 근거하여 약한 분배성 작동 윈도우을 추가로 미세 조정할 수 있다.
(iii) 이후, 더욱 바람직하게는, 약한 분배성 영역 내 몇몇 Kp 조건에 대하여 오염원 파과 데이터를 생성할 수 있다. 이러한 결과를 근거로 하여, 허용가능한 로드 챌린지에서 오염원의 최고 제거율을 제공하는 약한 분배성 영역 내 최적 분배 계수를 선별한다.
(iv) 이후, 가장 바람직하게는 최적의 Kp 조건 하에서 약한 분배성 크로마토그래피 시행을 수행하고, 로드 챌린지를 추가로 미세 조정하고, 최적의 회수율 및 오염원 제거를 위해 필요에 따라 부피를 세정할 수 있다.
당업자는 상기 지침 또는 이의 변형을 이용하여, 표준 통과-흐름성 또는 결합-용리성 방식의 컬럼 작업에서와 유사하거나 그보다 더 높은 로드 챌린지에서 증강된 오염원 제거율을 제공하는 약한 분배성 크로마토그래피 단계를 쉽게 명시할 수 있다. 앞서 논의한 대표적 구성안 (약간의 조정이 있을 수 있음) 은 이온 교환, 소수성 상호작용, 히드록시아파타이트, 또는 이들 상호작용의 모든 또는 임의의 요소를 결합된 다중-방식 시스템으로 정제 단계를 개발하는데 적용할 수 있다.
2. 분리 기술
불순물로부터 생성물을 분리시키기 위해 약한 분배성 방식을 임의의 크로마토그래피 수지 또는 매질과 연계하여 이용할 수 있다. 한 구현예에서, 매질은 하전 이온 교환 매질이다. 이온 교환은 알짜 전하에 따라 분리하는 크로마토그래피의 형태이다. 이온 교환 매질 상의 반대로 하전된 리간드기에 대한, 하전된 원하는 생성물과 반대이온 사이의 경쟁의 결과, 분자들의 분리가 일어난다. 생성물 및 이온 교환 매질 사이의 결합 상호 작용은 생성물의 알짜 전하에 의존한다. 알짜 전하는 매질의 pH 및 이온 강도에 의존하며, 이는 원하는 생성물 분자(들) 의 노출 표면 상의 아미노산 및 기타 성분의 상이한 전하 특징에 영향을 준다.
본 발명에 이용될 수 있는 이온 교환 수지에는 음이온 교환 수지 및 양이온 교환 수지가 포함된다. 음이온 교환 수지는 디에틸아미노에틸 (DEAE), 트리메틸아미노에틸 (TMAE), 4차 아미노에틸 (QAE) 및 4차 아민 (Q) 기와 같은 치환체를 이용할 수 있다. 양이온 교환은 카르복시메틸 (CM), 술포에틸 (SE), 술포프로필 (SP), 포스페이트 (P) 및 술포네이트 (들) 와 같은 치환체를 이용할 수 있다.
셀룰로오스 이온 교환 수지, 예컨대 DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 및 CM-52 는 Whatman Ltd. 사 (Maidstone, Kent, U.K) 로부터 구입할 수 있다. 세파덱스-계 및 가교 이온 교환기가 또한 알려져 있다. 예를 들어, DEAE-, QAE-, CM-, 및 SP-Sephadex, 및 DEAE-, Q-, CM- 및 S-SEPHAROSE, 및 SEPHAROSE 모두는 Amersham Biosciences 사 (Piscataway, NJ.) 로부터 구입할 수 있다. 또한, 에틸렌 글리콜-메타크릴레이트 공중합체 유래의 CM 및 DEAE 둘 다, 예컨대 TOYOPEARL™ DEAE-650S 또는 M 및 TOYOPEARL™ CM-650S 또는 M 을 Toso Haas Co. 사 (Philadelphia, PA) 로부터 구입할 수 있다.
본 발명의 특정 구현예에서는, 생성물 정제를 위해 약한 분배성 방식을 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC) 수지와 함께 이용한다. HIC 는 소수성에 근거한 분자 분리 기술이다. 일반적으로, 고(高) 염 완충액 내 샘플 분자가 HIC 수지 상에 로딩된다. 완충액 내 염은 물 분자와 상호작용하여, 용액 내 분자의 용매화를 감소시킴으로써, 샘플 분자 내 소수성 영역을 노출시키고, 이는 결과적으로 HIC 매질에 흡수된다. 분자의 소수성이 클수록, 결합 촉진에 염이 덜 필요하다. 이와 같이, 생성물 분자 및 HIC 매질 사이의 결합 상호 작용은 매질의 염 농도, pH 및 이온 강도와 같은 조건에 의존한다.
본 발명에 사용될 수 있는 다양한 시판 HIC 수지에는 염기 매트릭스를 포함하는 수지 (예, 가교 아가로오스 또는 합성 공중합체 물질) 가 포함되는데, 여기에 소수성 리간드 (예, 알킬 또는 아릴기) 가 커플링된다. 예로서, Phenyl SEPHAROSE™ 6 FAST FLOW™ (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Phenyl SEPHAROSE™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Octyl SEPHAROSE™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Sweden); Fractogel™ EMD Propyl 또는 FRACTOGEL™ EMD Phenyl (E. Merck, Germany); MACRO-PREP™ Methyl 또는 MACRO-PREP™ t-Butyl Supports (Bio-Rad, CA); WP HI- Propyl (C3)™ (J. T. Baker, NJ); 및 TOYOPEARL™ 에테르, 페닐 또는 부틸 (TosoHaas, PA) 이 포함된다.
본 발명의 다른 구현예에서는, 생성물 정제를 위해 약한 분배성 방식을 히드록시아파타이트 크로마토그래피와 함께 이용한다. 히드록시아파타이트 크로마토그래피는 화학식 [Ca10)(PO4)6(OH)2] 의 불용성 히드록실화 칼슘 포스페이트를 매트릭스 및 리간드의 둘 다로서 이용하는 기술이다. 관능기는 양으로 하전된 칼슘 이온 (C-부위) 및 음으로 하전된 포스페이트기의 클러스터 (P-부위) 의 쌍으로 이루어진다. 생성물 및 히드록시아파타이트 매질 사이의 결합 상호 작용은 매질의 부형제 농도, 예컨대 포스페이트 농도, 칼슘 농도, 아르기닌 농도, 글리신 농도 및 HEPES 농도, pH 및 이온 강도와 같은 조건에 의존한다. 다양한 히드록시아파타이트 크로마토그래피 수지기 시판되고 있으며, 본 발명에 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 구현예에서는, 생성물 정제를 위해 약한 분배성 방식을 고정화 금속 친화성 크로마토그래피 (IMAC) 수지와 함께 이용한다. IMAC 는, 수지 상에 고정화된 킬레이팅된 전이 금속 이온 및 태깅된 원하는 생성물 상의 히스티딘 잔기의 이미다졸 곁사슬 사이의 상호작용에 근거한다. MAC 수지 상의 금속기에 대한, 태깅된 원하는 생성물 및 반대 리간드 사이의 경쟁의 결과, 분자의 분리가 일어난다. 생성물 및 금속-충전된 IMAC 매질 사이의 결합 상호작용은 매질의 이온 강도 및 반대 리간드 수준, 예컨대 이미다졸 농도와 같은 조건에 의존한다. 다양한 IMAC 수지가 시판되고 있으며, 본 발명에 사용될 수 있다.
3. 정제를 위한 생성물
본 발명은 자연 발생 단백질, 융합 단백질, Fc-포함 단백질, 면역접합체, 사이토킨, 인터루킨, 호르몬 및 치료 효소를 포함하는 다양한 원하는 생성물의 상업적 규모의 정제를 위해 이용될 수 있다. 한 구현예에서, 정제되는 단백질은 하나 이상의 불변 항체 면역글로불린 도메인(들) 을 포함할 수있다. 한 구현예에서, 단백질은 또한 단독 또는 다중 가변 항체 면역글로불린 도메인(들) 을 포함할 수 있다. 또다른 구현예에서는, Fc-포함 단백질이 항체를 포함할 수 있다. 단백질은 배양된 재조합 원핵 또는 진핵 숙주 세포주를 포함하는 다양한 공급원으로부터 유래될 수 있다.
본 발명의 항체 제제는 면역화된 동물의 혈청, 복수, 하이브리도마 또는 골수종 상청액, 항체 분자를 발현시키는 재조합 세포주의 배양으로부터 유래되는 조건 배지 (conditioned media) 및 항체-생성 세포의 모든 세포 추출물로부터의 조건 배지를 포함하는, 그러나 이에 한정되지는 않는, 다수의 공급원으로부터 분리될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서는, 각종 항체 생성 재조합 세포주의 조건화 세포 배양 배지로부터의 항체가 정제된다. 본원에 기술된 바에 근거하여, 세포주로부터 세포주로의 일부 변형 및 각종 항체 생성물 중에서의 일부 변형을 기대할 수 있지만, 본 발명을 항체 단백질과 항체 생성용 세포주의 특정 조합에 맞게 변화시키는 것은 당업자의 권한 내에 있다.
단지 설명의 목적을 위해, 본 발명을 IgG 동형의 수 개의 항체의 정제에 적용했다. 더욱 상세하게는, 본 발명을 인간화, 항-A 베타 단클론 항체, 항-GDF8 항체, 및 인간화, 항-IL-13 단클론 항체의 정제에 적용했다.
4. 로딩 조건 및 용량
생성물 및 불순물을 포함하는 유체를 매질 상에 로딩하기 전에, 매질이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상을 결합시키도록 하는 작동 조건을 찾음으로써 약한 분배의 영역을 확인하는 것이 필요할 수 있다. 한 구현예에서, 알아낸 작동 조건은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 5 mg 이상을 결합시키도록 한다. 또다른 구현예에서, 알아낸 작동 조건은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 10 mg 이상을 결합시키도록 한다. 다른 구현예에서, 알아낸 작동 조건은 매질이 매질 1 mL 당 생성물 20 mg 이상을 결합시키도록 한다. 대안적으로는, 0.1 이상의 분배 계수로 한정되는 작동 조건을 찾음으로써 약한 분배의 영역을 확인한다. 특정 구현예에서, 알아낸 작동 조건은 약 0.2 내지 약 20.0 의 범위의 분배 계수로 한정된다. 다른 구현예에서, 알아낸 작동 조건은 약 0.2 내지 약 10.0 의 범위의 분배 계수로 한정된다. 또한 기타 구현예에서, 알아낸 작동 조건은 약 1.0 내지 약 5.0 의 범위, 약 0.5 내지 약 5.0 의 범위, 또는 약 0.5 내지 약 1.5 의 범위의 분배 계수로 한정된다. 추가적 구현예에서는, 매질이 매질 1 mL 당 생성물을 적어도 1 내지 약 70 mg 결합시키도록 하고 0.3 내지 20 의 분배 계수로 한정되는 작동 조건을 찾음으로써 약한 분배의 영역을 확인한다.
당업자는 적절한 작동 조건이 생성물의 정제를 위해 선별되는 매질의 선택에 의존함을 인식할 것이다. 특정 구현예에서는, 작동 조건에 pH 수준 및 이온 강도가 포함된다. 다른 구현예에서는, 작동 조건에 염 농도가 추가로 포함된다. 또 다른 구현예에서는, 작동 조건에 부형제 수준, 예컨대 포스페이트 농도 및 칼슘 농도가 추가로 포함된다. 일부 구현예에서는, 작동 조건에 반대 리간드 수준, 예컨대 이미다졸 농도, 및 pH 수준이 포함된다.
스크리닝 단계를 이용하여, 약한 분배성 방식을 위한 작동 조건을 확인할 수 있다. 이러한 스크리닝 단계는 배치 결합 연구 또는 컬럼 결합 연구를 포함할 수 있다. 컬럼 결합 연구는 구배 용리 연구 또는 등용매조성 용리 연구를 포함할 수 있다. 예를 들어, 당업자는, 정제할 특정 단백질 및 확인할 작동 조건에 대하여 어떠한 완충액 또는 염이 적절한지를 결정할 수 있다. 이후, 예를 들어, 선택된 완충액 또는 염을, 로드 유체 (정제할 생성물 및 불순물을 포함함) 가 부가된 컬럼을 통해 구배 용리시킴으로써 선택된 완충액 또는 염의 최적의 농도를측정할 수 있다. 컬럼의 용리액의 분획을 수집 및 분석하여, 생성물 결합이 매질 1 mL 당 생성물 1 mg 이상이거나, 대안적으로는, 생성물에 대한 분배 계수가 0.1 이상이 되는 완충액 또는 염의 농도를 측정할 수 있다. 본 발명의 특정 구현예에서는, 배치 결합 실험에서 상 비율 (수지의 부피에 대한 액체의 부피) 이 3 대 6 일 때, 분배 계수가 1 내지 10 mg/mL 로드 챌린지로 측정된다.
일단 작동 조건이 결정되면, 이에 따라 로드 유체 및/또는 매질의 조건을 조정할 수 있다. 예를 들어, 매질을 용액 (이는 매질을 약한 분배성 방식의 필요한 작동 조건에 맞게함) 으로 세정함으로써 평형화할 수 있다. 로드 유체는 또한 약한 분배성 방식에 대한 준비에서 적절한 완충액 또는 로딩 완충액으로 완충 교환될 수 있다. 로딩 완충액은 평형화 완충액과 동일하거나 상이한 완충액일 수 있다.
한 구현예에서, 로드 유체의 이온 강도는 100 mM 을 초과하지 않는다. 또다른 구현예에서는, 로드 유체의 이온 강도가 50 mM 을 초과하지 않는다. 또다른 구현예에서는, 로드 유체의 이온 강도가 25 mM 을 초과하지 않는다. 또다른 구현예에서는, 로드 유체의 이온 강도가 10 mM 을 초과하지 않는다.
베드 컬럼에 패킹된 분리 매질, 고체상 매트릭스를 포함하는 유동화/팽창 베드 컬럼에 패킹된 분리 매질, 및/또는 고체상 매트릭스가 특정 시간 동안 로드 유체와 혼합되는 배치 포멧에서의 분리 매질에 로드 유체를 통과시킬 수 있다. 로드 유체를 매질에 통과시킨 후, 매질을 상당량의 본질적으로 등용매조성의 세정으로 임의의 세정한다. 정제 생성물을 본질적으로 등용매조성인 임의의 세정으로부터 수득하여, 로드 순환 중의 컬럼 용리액으로부터의 정제 생성물과 혼주시킬 수 있다. 임의적 세정 단계 후, 매질을 임의로 스트리핑 및 재생성할 수 있다. 이러한 절차는 전형적으로는, 고체상의 표면상에 불순물이 축적되는 것을 최소화하고/하거나, 생성물이 미생물로 오염되는 것을 피하기 위하여 매질을 멸균하기 위해 정기적으로 수행한다.
약한 분배성 방식에서는 높은 로드 농도 및 로드 부피가 가능하다. 한 구현예에서, 로드 유체 내 생성물의 농도는 로드 유체 1 mL 당 생성물 1 mg 이상이고, 또다른 구현예에서는, 로드 유체 내 생성물의 농도가 로드 유체 1 mL 당 생성물 5 mg 이상이고, 또다른 구현예에서는, 로드 유체 1 mL 당 생성물 50 mg 이상이고, 또다른 구현예에서는, 로드 유체 1 mL 당 생성물 100 mg 이상이다. 정제 생성물은 매질을 통과한 50 CV 이하의 로드 유체로부터 회수할 수 있다.
약한 분배성 방식에서는 높은 로드 챌린지가 또한 가능하다. 한 구현예에서, 매질로의 로드는 매질 1 mL 당 생성물 10 mg 이상의 로드 챌린지로 이루어질 수 있다. 다른 구현예에서, 매질로의 생성물의 로딩은 매질 1 mL 당 생성물 50 mg 이다. 특정 구현예에서, 매질로의 생성물의 로딩은 매질 1 mL 당 생성물 100 mg 이다. 다른 구현예에서, 매질로의 로드는 매질 1 mL 당 생성물 500 mg 이상의 로드 챌린지로 이루어질 수 있다. 또한 다른 구현예에서는, 매질로의 로드가 매질 1 mL 당 생성물 1000 mg 이상의 로드 챌린지로 이루어질 수 있다.
5. 불순물의 제거율
약한 분배성 방식은 응집된 생성물 및 고분자량 종을 포함하는 생성물 변형체, 헥산, 숙주 세포 단백질, 선행 정제 단계로부터의 단백질 A 오염원, 내독소 및 바이러스를 포함하는 생성물 제제로부터의 모든 유형의 불순물의 제거에 유용한 것으로 나타났다.
본 발명의 한 구현예에서, 정제 생성물 내 존재하는 숙주 세포 단백질의 농도는 생성물 1 mg 당 숙주 세포 단백질이 약 500 ng 을 초과하지 않는다. 다른 구현예에서, 숙주 세포 단백질의 농도는 생성물 1 mg 당 250 ng 을 초과하지 않도록 감소될 수 있고, 다른 구현예에서는, 생성물 1 mg 당 100 ng 을 초과하지 않도록 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 숙주 세포 단백질의 log 제거값은 1.0 이상이고, 다른 구현예에서, 숙주 세포 단백질의 log 제거값은 2.0 이상이고, 다른 구현예에서는, 숙주 세포 단백질의 log 제거값이 3.0 이상이다.
본 발명의 한 구현예에서, 정제 생성물 내 존재하는 단백질 A 의 농도는 생성물 1 mg 당 단백질 A 가 약 100 ng 을 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 단백질 A 의 농도는 생성물 1 mg 당 50 ng 을 초과하지 않도록 감소될 수 있고, 다른 구현예에서는, 생성물 1 mg 당 10 ng 을 초과하지 않도록 감소될 수 있다. 특정 구현예에서, 단백질 A 의 log 제거값은 1.0 이상이고, 다른 구현예에서, 단백질 A 의 log 제거값은 2.0 이상이고, 다른 구현예에서는, 단백질 A 의 log 제거값이 3.0 이상이다.
본 발명의 또다른 구현예에서는, 정제 생성물로부터 바이러스성 불순물이 제거된다. 특정 구현예에서, 바이러스의 log 제거값은 1.0 을 초과하고, 다른 구현예에서는, 2.0 을 초과하고, 다른 구현예에서는, 3.0 을 초과한다.
본 발명의 일부 구현예에서는, 정제 생성물로부터 핵산 불순물이 제거된다. 특정 구현예에서, 정제 생성물 내 존재하는 핵산의 양은 생성물 1 mg 당 핵산이 1 ng 을 초과하지 않도록 감소될 수 있다.
추가적 구현예에서, 정제 생성물 내 단백질 변형체의 농도는 약 10 % 를 초과하지 않는다. 일부 구현예에서, 단백질 변형체의 농도는 약 5 % 를 초과하지 않도록 감소될 수 있고, 일부 구현예에서는, 2 % 를 초과하지 않도록 감소될 수 있고, 일부 구현예에서는, 0.5 % 를 초과하지 않도록 감소될 수 있다.
약한 분배성 방식의 엄격한 결합 조건 하에서, 분리 매질은 숙주 세포 단백질, 핵산, 단백질 변형체, 내독소 및 단백질 A 불순물의 90 % 이상을 제거한다. 일부 구현예에서는, 매질이 불순물의 99 % 이상을 제거하고, 다른 구현예에서는, 매질이 불순물의 99.9 % 이상을 제거한다.
6. 추가적 임의적 단계
본 발명의 정제 방법은 기타 단백질 정제 단계와 조합으로 이용될 수 있다. 본 발명의 한 구현예에서, 약한 분배성 단계에 선행하는 하나 이상의 단계는 로드 챌린지의 감소를 위해 요망될 수 있다. 본 발명의 또다른 구현예에서는, 약한 분배성 단계에 후속되는 하나 이상의 정제 단계가 추가적 오염원 또는 불순물의 제거를 위해 요망될 수 있다.
기술되어 있는 약한 분배성 정제 과정은 단백질 A 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 고정화 금속 친화성 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피, 투석 여과, 한외 여과, 바이러스 제거 여과 및/또는 이온 교환 크로마토그래피를 포함하는, 그러나 이에 제한되지는 않는 기타 정제 단계와 임의적으로 조합될 수 있다. 약한 분배성 단계에 선행 및/또는 후속되는 임의적 정제 단계는 또한 약한 분배성 방식, 또는 기타 방식, 예컨대 결합-용리성 방식 또는 통과-흐름성 방식으로 작업될 수 있다.
한 구현예에서, 약한 분배성 정제 단계 이전에, 임의적으로는 수집 배지 (harvest media) 가 단백질 A 크로마토그래피 단계에 의해 먼저 정제될 수 있다. 예를 들어, 기공 조절 유리 (controlled pore glass) 에 공유결합된 단백질 A 로 이루어지는 PROSEP-A™ (Millipore, U.K.) 를 이용할 수 있다. 기타 유용한 단백질 제형에 Protein A Sepharose FAST FLOW™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), TOYOPEARL™ 650M Protein A (TosoHaas Co., Philadelphia, PA) 및 MABSELECT™ 컬럼 (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ) 이 포함된다.
7. 단백질 A 크로마토그래피 및 이온 교환 크로마토그래피와 연계로 이용되는 쯔비터이온 완충액
특정 구현예에서는, 생성물-포함 유체를 낮은 이온 강도의 용리 완충액을 이용하여 단백질 A 컬럼으로부터 용리시킨다. 이후, 생성물-포함 유체의 전도도 및 pH 를 중화 완충액을 이용해 조정하여, 생성물-포함 유체의 이온 강도가 20 mM 을 초과하지 않도록 만든다. 생성된 로드 유체를, 이후, 약한 분배성 방식의 조건 하에서 작업되는 음이온 교환 매질 또는 히드록시아파타이트 매질에 통과시킨다. 특정 구현예에서는, 로드 유체를 투석 여과할 필요 없이 음이온 교환 매질에 통과시킨다. 일부 구현예에서는, 생성물-포함 유체의 전도도 및 pH 를 중화 완충액을 이용해 조정하여, 생성물-포함 유체의 이온 강도가 40 mM 을 초과하지 않도록 만든다. 다른 구현예에서는, 생성물-포함 유체의 전도도 및 pH 를 중화 완충액을 이용해 조정하여, 생성물-포함 유체의 이온 강도가 60 mM 을 초과하지 않도록 만든다. 또 다른 구현예에서는, 생성물-포함 유체의 전도도 및 pH 를 중화 완충액을 이용해 조정하여, 생성물-포함 유체의 이온 강도가 80 mM 을 초과하지 않도록 만든다.
단백질 A 컬럼으로부터의 용리에 이용할 수 있는 완충액은 pKa 2 ~ 5 인 음이온기로 하전된 분자를 포함하는 완충액을 포함한다. 이러한 용리 완충액은 pKa 6.5 ~ 10 인 양이온기로 하전된 분자를 추가로 포함할 수 있다. 한 구현예에서, 용리 완충액은 pH 4 내지 9 에서 쯔비터이온인 분자, 예컨대 글리신; 1,4-피페라진비스-(에탄술폰산); 글리실글리신; 시클로펜탄테트라-1,2,3,4-카르복실산; N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄술폰산; 2-(N-모르폴리노)프로판-술폰산; N-트리스(히드록실메틸)메틸-2-아미노에탄 술폰산; N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산; 4-(2-히드록시에틸)-I-피페라진프로판 술폰산; N-트리스(히드록시메틸)메틸글리신; 글리신아미드; N,N-비스(2-히드록시에틸)글리신; N-트리스(히드록시메틸)메틸-2-아미노프로판 술폰산; 또는 N-글리실-글리신을 포함한다.
쯔비터이온 완충액을 이용한 단백질 A 컬럼의 용리는 어느 정도의 중화에 대하여 낮은 이온 강도의 장점을 제공한다. 완충액의 낮은 이온 강도는, 히드록시아파타이트 컬럼을 포함하는 후속 이온 교환 컬럼의 작업에 역효과를 주지 않는다. 높은 수준의 이온 강도는 불순물이 이온 교환 컬럼에 결합되는 것을 감소시킬 것이고, 이는 정제의 전체적 효율을 감소시킬 것이다. 이온 교환 컬럼상으로의 로드를 위해서는 더 낮은 이온 강도의 용액이 바람직한데, 이는 농축염 용액이 첨가됨에 따라 이온 강도가 쉽게 상승될 수 있지만; 용액 이온 강도의 감소는 손쉽게 이루어지지 않기 때문이다. 놀랍게도, 단백질 A 용리 단계에 유용한 낮은 pH 수준에서 이용할 수 있는 낮은 pKa 를 가지며, 또한 이온 교환 크로마토그래피에 유용한 높은 pH 수준에서 이용할 수 있는 두번째 pKa 를 갖는 완충액이 존재하며; 이들 완충액은, 적당한 두번째 pH 에서 이용되는 경우, 단백질 A 단계에 후속하는 이온 교환 단계의 작업 중에 유효 전하를 거의 갖지 않는다.
단백질 A 에 대하여 바람직한 용리 pH (pH 2 내지 5, 바람직하게는 2.5 내지 4.0) 의 pKa 에 근접한 pKa 를 갖는 쯔비터이온 완충액은, 완충액의 pI 에 근접한 pH 를 유지시키고 컬럼을 용리시키기 위해 이용되도록 한다. 후속 이온 교환 컬럼 (pH 5.5 내지 11) 의 작업의 pKa 에 근접한 pKa 를 또한 갖는 쯔비터이온 완충액은, 상기 완충액이 pH 를 상기 pH 범위 및 단백질 A 용리 pH 범위 내로 조절하도록 해준다. 이온 교환 크로마토그래피에 유용한 높은 pH 를 유지시키고 낮은 pH 에서 단백질 A 컬럼을 용리시키는 것 둘 다를 위해 단일 화합물을 이용하는 것은 두 단계 모두의 작업을 단순화시키며, 또한 중화 후 생성물 풀의 조성을 단순화시킨다.
본 발명의 또다른 구현예에서, pKal 및 pKa2 의 쯔비터이온 완충액은 pKal 의 1 pH 단위 내 pH 수준에서 단백질 A 컬럼을 용리시킬 수 있다. 또한, 쯔비터이온 완충액의 염기 용액을 이용해 단백질 A 풀을 pKa2 의 1 pH 단위 내 두번째 pH 로 중화시키면, 쯔비터이온 완충액이 용액의 pH 를 유지시킬 수 있다. 두번째 pH 가 pKa2 의 것 미만이면, 완충액은 쯔비터이온으로 남고, 용액의 전체적 이온 강도에 거의 기여하지 않는다. 예를 들어, pKa2 와 동일한 pH 에서 농도 χ 의 쯔비터이온 완충액은 전체 이온 강도에 오직 χ/2 기여할 것이다. 완충액의 pKa2 미만의 1 pH 단위에서 농도 χ 의 쯔비터이온 완충액은 χ 의 1/10 의 이온 강도를 가질 것이다. 이온 강도에서의 이러한 감소는 이온 교환 크로마토그래피의 작업에서 상당히 유용하다.
단백질 A 컬럼의 용리에 유용한 pKal 및 이온 교환 크로마토그래피의 작업에 유용한 pKa2 를 갖는 완충액이 존재하는 지의 여부는, 이들 완충액의 pKal 이 통상보고되지 않았다는 점에서 분명하지 않다. 완충액은 일반적으로 pKa2 의 pH 에 근접한 pH 수준에서 이용되지만, 단백질 A 컬럼으로부터의 용리에 유용한 크로마토그래피는 당업자에게 알려지지 않았다. 더욱이, 단백질 A 크로마토그래피 컬럼으로부터의 용리를 위한 이들 완충액의 용도가 일반적으로 분명히 파악되지 않는한, 단백질 A 컬럼에 후속되는 이온 교환 컬럼을 위한 완충액으로서의 추가적 용도를 가질런지 또한 분명치 않은데, 이는 이들 쯔비터이온 완충액이, 중화된 단백질 A 풀에 대하여 이온 강도에 덜 기여하기 때문이다.
[실시예]
C. 실시예
하기 실시예는 오로지 예시의 목적으로 제공된다.
실시예는 3 가지의 서로 다른 단클론 항체를 이용하여, 3 가지 방식의 크로마토그래피 (음이온 교환, 소수성 상호작용 및 히드록시아파타이트) 에 대해 제공된다. 4 개의 개별적인 시리즈의 실험이 기재되며, 각각은 크로마토그래피 방식 및 정제될 단클론 항체의 서로 다른 페어링 (pairing) 을 나타낸다. 초기 스크리닝 연구를 먼저 나타내었는데, 이는 다양한 용액 조건 하에서 수지에 결합 생성물의 농도 및/또는 분배 계수를 측정함에 따라, 약한 분배성 (WP) 및 통과-흐름성 (FT) 방식의 작동 영역을 한정했다. 이후, 몇몇의 컬럼 연구를, 생성물 회수율 및 불순물 제거율에 대한 자료로 요약하였다. 생성물 회수율은 WP 컬럼 시행에 대해 우수했으며, 불순물 수준은 상응하는 FT 연구보다 낮았다. WP 시행은 FT 연구보다 수지로의 로드 챌린지를 높게 수행하였다.
시험 샘플에서 단백질 A 잔여의 수준은 단백질 A 효소-연결 면역검사법 (ELISA) 을 이용하여 측정하였다. 고분자량 응집체의 양은 분석용 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 검정을 이용하여 측정하였다. 숙주 세포 단백질 (HCP) 의 수준은 HCP ELISA 를 이용하여 측정하였다. 모든 스크리닝 및 컬럼 연구는 실온에서 수행하였다.
시리즈 1 - TMAE - HiCap (M) 및 Mab - AAB 를 이용한 음이온 교환
실험 1.1 - WP 및 FT 조건을 확립하기 위한 대량 처리 스크린
대량 처리 스크린 (HTS) 을 수행하여 TMAE-HiCap (M) 매질과 Mab-AAB 에 관한 약한 분배성 및 통과-흐름성 조건을 확인하였다. 상기 스크린은 염화나트륨의 농도 및 pH 를 변화시켜, TMAE 매질로의 MAB-AAB 및 공정 관련 불순물 (단백질 A 및 HCP) 의 결합 정도에 대한 그의 효과를 측정하였다.
50 μL 의 TMAE HiCap 매질을, 96 웰 필터 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 각 웰은 50 mM 글리신 및 가변성 양의 Tris 완충액 (표 1.1.1 에 명시된 pH 로의 중화에 필요한 양에 따름) 및 염화나트륨 (표 1.1.2 에 명시됨) 으로 만들어진 용액에서 평형화시켰다. pH 는 7.6 내지 9.0 의 범위였으며 염화나트륨은 0 mM 내지 80 mM 의 범위였다.
각 줄 (row) 에서 이용된 완충 용액은 자동화 피펫팅 시스템 (automated pipetting system; Tecan 100 RST) 상에서 희석하였다. 완충액을 위한 저장 용액은 HCl 에 의해 pH 3.0 으로 산성화된 500 mM 글리신으로 만들었으며, 이후 표 1.1.1 에 제시된 pH 수준으로, 2M Tris 염기로 중화시켰다. 상기 적정은 완충액의 pH 에 의존성인 Tris 의 수준을 초래하였다. 완충액 pH 는 저장 완충액 농도의 1 내지 10 희석에서 측정하였고, 이는 자동화 피펫팅 시스템에 의한 희석에 상응하였다. pH 3.0 으로의 글리신 산성화의 결과로서, 완충액은 약 10 mM 의 이온 강도를 최종 용액에 기여한다. 수지에 2 가지의 로드 챌린지를 수행하였다: 분배 계수 K 를 측정하기 위한 5 mg/mL, 및 컬럼 로드 농도와 대략 동일한 농도에서 단백질 용액과 평형의, 불순물 및 결합 생성물의 제거를 위한 수지의 용량을 측정하기 위한 122 mg/mL.
[표 1.1.1]: 각 웰의 완충액 유형 및 목표 pH
Figure pat00003
[표 1.1.2]: 각 웰의 NaCl 수준 (mM) 및 단백질 챌린지 (mg/mL)
Figure pat00004
HTS 실험의 제 1 단계에서, 각 웰을 6 : 1 (30O μL 용액 : 5O μL 수지) 의 상 부피비로, 표 1.1.1 및 1.1.2 에 기술된 바와 같은 NaCl 및 pH 의 조건에서 평형화시켰다. 플레이트를 20 분 동안 진탕하여 평형에 도달하게 하였다. 이후, 필터 플레이트를 원심분리하여 용액을 제거하였다. 이러한 평형화 주기를 3 회 반복하였다.
제 2 단계에서, 적절한 NaCl 농도 및 pH 에서 6 : 1 (30O μL 용액 : 5O μL 수지) 의 부피비로, 농축 Mab-AAB 용액을 5 mg/(수지)mL 로 각 웰의 수지에 챌린지하였다. 300 ppm 의 단백질 A 로 스파이크 (spike) 된 1 mM HEPES, 10 mM NaCl, pH 7.0 중 Mab-AAB 의 36 mg/mL 용액을 저장 용액으로 이용하였다. 로딩된 플레이트를 20 분 동안 진탕하여, 수지 및 용액이 평형화되도록 하였다. 상청액을 원심분리에 의해 필터 플레이트로부터 제거하고 수집 플레이트로 수집하였다. 각 웰의 상청액 내의 단백질 농도는 A280 nm 에서의 흡광도에 의해 측정하였다.
제 3 단계에서, 표 1.1.2 에 열거된, 특정된 NaCl 및 pH 조건의 용액을 첨가하여 수지를 세정하였다. 20 분 동안 진탕 후, 상청액을 제거하였다. 제 4 단계에서, 2 M NaCl 을 첨가하여 수지에 결합된 잔여 단백질을 제거하였다. 제 3 및 4 단계로부터 용리된 질량 및 제 2 단계로부터의 생성물 농도를 이용하여 각 웰에 대해 분배 계수를 계산하고, 표 1.1.3 에 나타내었다. pH 및 클로라이드의 함수로서 분배 계수의 log 의 등고선 플롯을 도 7 에 나타내었다.
[표 1.1.3]: MAB-AAB 에 대한 96 웰 HTS 스크린에 대한 분배 계수 (K)
Figure pat00005
표 1.1.3 에 나타난 바와 같이, Kp 값은 MAB-AAB 가 TMAE 매질에 서로 다른 강도로 결합되는 영역을 기술하기 위해 이용될 수 있다. 이들 영역은 도 7 에서 더욱 명확하게 가시화된다. TMAE 매질에 대한 MAB-AAB 결합의 강도는, 클로라이드의 농도 및 pH 의 조건을 통과-흐름성 (K≤0.1), 약한 분배성 (0.1<K<20) 및 결합 구역 (K≥20) 으로 변화시켜, 조정할 수 있다.
각 구역으로부터의 모든 웰의 로드 단계로부터 상청액을 샘플링하고 단백질 A 분석을 수행하였다. 상기 샘플의 검정 결과는 표 1.1.4 에 요약하였다. TMAE 크로마토그래피 단계가 매우 상당량의 단백질 A 는 제거하면서 수지에 대한 단백질 손실에 대하여는 제한적이 되는 pH 및 전도도의 영역이 있다. 상기 영역은 임의의 특정 pH 또는 클로라이드 농도가 아닌, 분배 계수 값 Kp 와 밀접한 연관이 있는 것으로 밝혀졌다 (도 8 참조).
[표 1.1.4]: HTS 스크린으로부터의 MAB-AAB 결합 데이터에 대한 단백질 A log 제거값 (LRV)
Figure pat00006
실험 1.2 - 통과-흐름성 조건 하에서의 컬럼 시행
하기 실험은 Mab-AAB 가 컬럼과 매우 약하게만 상호작용하는 통과-흐름성 (FT) 방식으로 수행하였다. 110 mg/(수지)ml 및 200 mg/(수지)mL 의 로드 챌린지로, 2 회의 시행을 하였다.
시리즈 1 실험에서 기술된 전체 TMAE (HiCapM) 음이온 교환 크로마토그래피 시행에 대해, 하기 조건을 이용하였다 (예외 사항은 개별적인 실험 설명에 기재됨).
작동 유속 - 150 ~ 300 cm/시간
평형화 1 - 50 mM Tris, 2.0 M NaCl, pH 7.5 (5 컬럼 부피)
평형화 2 - 명시된 바와 같이, 로드 pH 및 클로라이드 함량과 대략 동등함
후(post) 로드 세정액 - 명시된 바와 같이, 로드 pH 및 클로라이드 함량과 대략 동등함
스트립 완충액 (strip buffer) - 50 mM Tris, 2.0 M NaCl, pH 7.5 (5 컬럼 부피)
Mabselect 단백질 A 크로마토그래피
Millipore K-prime 400 크로마토그래피 시스템에 연결된 MabSelect 컬럼 (2,389 mL) 을 이용하여 파일럿 (Pilot) 규모에서 단클론 항체를 포함하는 배양물을 정제하였다. Mabselect 단백질 A 컬럼은 300 cm/시간 의 유속에서 50 mM Tris/150 mM NaCl, pH 7.5 의 5 컬럼 부피로 평형화시켰다. 이후, 컬럼을 약 40 (생성물)mg/(수지)mL 의 로드로 로딩하였다. 이후, 1 M NaCl, 5O mM Tris, pH 7.5 중의 5 CV 세정액 및 10 mM Tris, 75 mM NaCl, pH 7.5 세정액을 포함하는 5 CV 세정액으로 세정하였다. 이후, 컬럼을 50 mM 글리신, 75 mM NaCl, pH 3.0 을 이용하여 용리하였다. 생성물 풀은 2M Tris pH 8.5 를 이용하여 pH 7.6 으로 중화시켰다. 중화된 피크는 약 90 mM 의 클로라이드 농도를 가졌다.
TMAE HiCap (M) 크로마토그래피
중화된 단백질 A 풀은 50 mM Tris 및 75 mM 염화나트륨으로, pH 7.5 에서 평형화, 로드 및 세정 용액으로 TMAE 단계 상에서 추가로 정제하였다. 5 컬럼 부피의 세정액을 이용하였다. 이들 두 실험에 대한 컬럼 치수 및 로드 챌린지는 하기와 같았다: 시행 1: 7.0 cm 지름 x 20.6 cm 층 높이 (부피 - 793 mL) 와 로드 농도 11.9 mg/mL, 및 시행 2: 7.0 cm 지름 x 13 cm 층 높이 (부피 - 500 mL) 와 로드 농도 17.6 mg/mL.
상기 로드 조건은 통과-흐름성 (FT) 영역 내에 있었다 (표 1.2.1). 배치 결합 연구를 이용하여 분배 계수 (Kp) 를 측정하고, UV 흡수를 이용하여 컬럼 스트립에서의 단백질에 의해, 결합 생성물을 측정하였다. 이러한 결합 생성물 측정 방법은 통상적으로, 세정하는 동안 생성물의 등용매조성 용리때문에 로딩 중의 결합 생성물의 양을 적게 추정했다. 로드 및 생성물 풀 내의 단백질 A, HCP 및 HMW 를 측정하고, 제거율의 정도를 계산하였다. 결과는 표 1.2.1 에 나타나 있다. 단백질 A 및 HMW 의 빈약한 제거, 및 HCP 수준에서 다소의 감소가 있다.
[표 1.2.1]: 통과-흐름성 조건 하에서 HCP, 단백질 A 및 HMW 의 제거율
Figure pat00007
실험 1.3 - 약한 분배성 조건 하에서의 컬럼 시행 (높은 생성물 챌린지 )
TMAE ( HiCap M) 음이온 교환 크로마토그래피
몇몇의 Mabselect 단백질 A 시행을 본질적으로 실험 1.2 에 기술된 바와 같이 수행하여 이들 시행에 대하여 로드 물질을 생성하였다. 단백질 A 단계로부터 부분적 정제 항체 풀을 TMAE 컬럼 상에서 추가로 정제하였다. TMAE 컬럼으로의 로드는 50 mM Tris, pH 8.2 중에 있었다. 컬럼 지름은 0.5 cm 였고, 층 높이는 10 cm 층 높이 (부피 - 2.0 mL) 이었다. 컬럼은 27.7 mg/mL 로드 농도에서의 500 mg/(수지)mL 의 로드로 챌린지하였다.
컬럼을 50 mM Tris, 2 M NaCl pH 7.5 을 포함하는 5 컬럼 부피의 용액으로 평형화시킨 후, 50 mM Tris, pH 8.2 용액을 포함하는 또 하나의 평형화 단계를 수행하였다. 이후, 이전 단계로부터 중화된 단백질 A 피크를 500 (생성물)mg/(수지)ml 로 컬럼에 로딩하고, 생성물은 로드 순환 중의 컬럼 용리액 및 세정액 분획의 일부 컬럼 부피에서 회수하였다.
상기 로드 조건은 약한 분배성 영역에 있다. 배치 결합 실험을 이용하여 높은 단백질 농도에서 생성물 결합, 및 분배 계수 (Kp) 를 측정하였다. pH 8.2 및 12 mM 의 대략적인 클로라이드 함량에서, 분배 계수 Kp 는 (HTS 스크린으로부터의 데이터세트의 내삽법으로부터) 1.9 로 추정하였다.
HCP 및 단백질 A 의 수준은 약 250, 375 및 500 mg/(수지)mL 의 로드 챌린지를 나타내는 로딩 단계 동안 3 개의 분획에서 측정하였다. 실험 1.3 으로부터의 결과는 표 1.3.1 에 나타내었다. 이러한 결과는 매우 높은 생성물 챌린지가 불순물의 파과 없이, 약한 분배성 방식에서 달성될 수 있다는 것을 나타낸다. HMW 함량의 50 % 감소와 함께, HCP 및 단백질 A 모두에서 우수한 감소가 달성되었다. 표 1.2.1 에서 통과-흐름성 방식에서의 작동에 대한 결과와 비교하여, 약한 분배성 방식에서의 불순물 제거율이 훨씬 더 양호했다.
[표 1.3.1]: 500 mg/mL(TMAE) 로드 챌린지에 대한 HCP, 단백질 A 및 HMW 의 제거율
Figure pat00008
실험 1.4 - 약한 분배성 조건 하에서의 컬럼 시행 ( 확고성 ( robustness ) 연구
약한 분배성의 영역에서 TMAE 컬럼의 성능을 추가로 확인하기 위해, 로드 내의 pH 및 NaCl 농도를 변화시켜, 몇몇의 시행을 설계하여 공정 확고성을 시험하였다. 모든 시행은 250 mg/(수지)mL 의 로드 챌린지에서 수행하였다. 몇몇의 Mabselect 단백질 A 시행을 본질적으로 실험 1.2 에 기술된 바와 같이 수행하여 이들 시행에 대하여 로드 물질을 생성하였다. 상기 시행에서 변화시킨 유일한 인자은 단백질 A 용리에서의 염화나트륨 농도였으며, 이는 특정 실험을 위해 TMAE 로드 내의 NaCl 농도에 맞추기 위해 변화되었다. 컬럼은 Equil 2 완충액으로 평형화시켰으며, 세정 완충액으로 세정하였고, 이는 로드의 pH 및 염화나트륨 함량과 대략 동일하였다.
상기 로드 조건은 약한 분배성 영역 내에 있다. 배치 결합 연구를 이용하여 분배 계수 (Kp) 를 측정하였다. 시행은 표 1.4.1 에 열거된 분배 계수로 순위를 매겼다. 결합 생성물은 UV 흡수를 이용하여 컬럼 스트립 내의 단백질을 측정하여 결정하였으며, 7.8 ~ 25.3 mg/mL 의 범위였다. 상기 실험으로부터 단백질 A, HCP 및 HMW 의 결과는 표 1.4.1 에 나타내었다. 모든 불순물의 제거율은 13.5 ~ 38.8 mM 총 클로라이드 및 pH 7.8 ~ 8.4 를 포함하는 작동 범위에서 확고한 것으로 밝혀졌다.
[표 1.4.1]: 약한 분배성 방식에서의 HCP, 단백질 A 및 HMW 의 제거율에 대한 공정 확고성 연구
Figure pat00009
요약
상기 실험으로부터, 단백질 A 제거율 (LRV) 이 Kp 에 따라 강하게 변화하는 한편, HCP LRV 은 0.26 이상의 모든 Kp 값에서 우수하지만, Kp = 0.17 (통과-흐름성 조건 하) 에서 크게 감소하는 것을 볼 수 있다. 숙주 세포 단백질 제거율은 감소된 로드 챌린지에 대해서도, 약한 분배성 조건에 비해 통과-흐름성 조건에서 1 log 낮다. 결합 생성물은 수지 및 단클론 항체의 상기 조합 상에서 상기 약한 분배성 조건에 대해 7.8 ~ 25 mg/mL 의 범위이다. 분배 계수는 0.41<Kp<5.4 사이에서 최적으로 보인다. 상기는 실험 1.2 의 조건인 Kp=O.17 및 결합 생성물 1.4 ~ 3.3 mg/mL 에서 최적으로 보이지 않는다.
시리즈 2 - TMAE - HiCapM 및 Mab - IMA 를 이용한 음이온 교환
실험 2.1 - WP 및 FT 조건을 확립하기 위한 대량 처리 스크린
대량 처리 스크링 (HTS) 를 수행하여 TMAE-HiCap (M) 매질과 Mab-IMA 에 관한 약한 분배성 및 통과-흐름성 조건을 확인하였다. 상기 스크린은 염화나트륨 및 pH 의 농도를 변화시켜, TMAE 매질로의 MAB-IMA 및 공정 관련 불순물 (단백질 A 및 HCP) 의 결합 정도에 대한 그의 효과를 측정하였다. 1OO μL 의 TMAE HiCap 매질을 96 웰 필터 플레이트의 각 웰에 첨가하였다. 각 웰은 완충액 pKa (표 2.1.1) 로부터 1 pH 단위를 초과하지 않도록 떨어진 25 mM 완충액 및 적절한 수준의 염화나트륨 (표 2.1.2) 으로 만들어진 용액 중에 평형화시켰다. pH 는 7.00 내지 8.75 의 범위였으며 염화나트륨 농도는 1 mM 내지 190 mM 의 범위였다.
12 M HCl 을 이용하여 모든 완충액을 목표 pH 로 적정하였다. 서로 다른 완충 종 (species) 가 서로 다른 수준의 적정제를 필요로한 결과, 클로라이드 농도는 웰마다 변화하였으며, 이는 그 웰에 어느 완충액이 이용되었는지에 의존하였다. 완충액을 목표 pH 로 적정하기 위해 필요한 Cl- 의 양을 Henderson-Hasselbech 식을 이용하여 계산하고, NaCl 및 로드 물질 내의 양 모두로부터 기여한 총 Cl- 에 추가하였다. 실험에서 각 웰에 대해 계산된 Cl- 수준은 표 2.1.3 에 열거하였다.
[표 2.1.1]: 각 웰의 완충액 유형 및 pH 목표
Figure pat00010
[표 2.1.2]: 각 웰의 NaCl 수준 (mM)
Figure pat00011
[표 2.1.3]: 각 웰의 Cl- 수준 (mM)
Figure pat00012
HTS 실험의 제 1 단계에서, 각 웰은 3 : 1 (30O μL 용액: lOO μL 수지) 의 상 부피비로, 표 2.1.1 및 2.1.2 에 기술된 바와 같은 NaCl 및 pH 의 조건 하에서 평형화시켰다. 플레이트를 20 분 동안 진탕하여 평형에 도달하도록 하였다. 이후, 용액을 필터 플레이트 원심분리에 의해 제거하였다. 상기 평형화 주기를 3 회 반복하였다.
제 2 단계에서, 적절한 NaCl 농도 및 pH 에서 3 : 1 (300 μL 용액 : 1OO μL 수지) 의 부피비로, 농축 MAb-IMA 용액을 3 mg/(수지)mL 로 각 웰의 수지에 첼린지하였다. 300 ppm 의 단백질 A 와 함께 1 mM Mes, 15 mM NaCl, pH 6.5 에서 Mab-IMA 의 30 mg/mL 용액을 저장 용액으로서 이용하였다. 로딩된 플레이트를 20 분 동안 진탕하여, 수지 및 용액을 평형화시켰다. 상청액을 필터 플레이트로부터 원심분리로 제거하고 수집 플레이트에 수집하였다. 각 웰 내의 상청액의 단백질 농도를 A280 nm 에서의 흡광도로 측정하였다. 단백질 A 및/또는 HCP 수준에서의 임의의 감소는 정제 수행성 조건을 나타낸다.
제 3 단계에서, 표 2.1.2 에 나열된 특정된 NaCl 및 pH 조건의 용액을 첨가하여 수지를 세정하였다. 20 분 동안 진탕 후 상청액을 제거하였다. 제 4 단계에서, 2 M NaCl 을 첨가하여 수지에 결합되는 잔여 단백질을 제거하였다. 단계 3 및 4 로부터 용리된 질량 및 단계 2 로부터의 생성물 농도를 이용하여 각 웰에 대해 분배 계수를 계산하고, 표 2.1.4 에 나타내었다. pH 및 클로라이드의 함수로서 분배 계수의 log 의 등고선 플롯을 도 9 에 나타내었다.
[표 2.1.4]: MAB-IMA 에 대한 96 웰 HTS 스크린에 대한 분배 계수 (Kp)
Figure pat00013
표 2.1.4 에 나타낸 바와 같이, Kp 값은 MAB-IMA 가 TMAE 매질에 서로 다른 강도로 결합되는 영역을 기술하기 위해 이용될 수 있다. 상기 구역은 도 9 에서 더욱 명확하게 가시화된다. TMAE 매질에 대한 MAb-IMA 결합의 강도는, 클로라이드의 농도 및 pH 의 조건을 통과-흐름성 (Kp≤O.1), 약한 분배성 (0.1<Kp<20), 및 결합 구역 (Kp≥20) 으로 변화시켜, 조정할 수 있다.
각 구역으로부터 수개의 웰의 로드 단계로부터 상청액을 샘플링하고 단백질 A 분석용으로 제출하였다. 로드는 단백질 A 300 ppm 이었다. 상기 샘플의 분석 결과를 표 2.1.5 에 요약한다. TMAE 크로마토그래피 단계가 매우 상당량의 단백질 A 는 제거하면서 수지에 대한 단백질 손실에 대하여는 제한적이 되는 pH 및 전도도의 영역이 있다. 상기 영역은 임의의 특정 pH 또는 클로라이드 농도가 아닌, 분배 계수 값 Kp 와 밀접한 연관이 있는 것으로 밝혀졌다.
[표 2.1.5]: HTS 스크린으로부터의 MAB-IMA 결합 데이터 및 단백질 A 잔여 수준
Figure pat00014
실험 2.2 - TMAE - HiCapM 및 Mab - IMA 를 이용한 FT 조건 하 컬럼 시행
하기 실험은 Mab-IMA 가 가 컬럼과 매우 약하게만 상호작용하는 통과-흐름성 (FT) 방식으로 수행하였다. 109 ~ 275 mg/(수지)mL 의 로드 챌린지로 4 회의 시행을 했다.
TMAE ( HiCap M) 음이온 교환 크로마토그래피
실험 2 시리즈에 기재된 전체 TMAE (HiCapM) 음이온 교환 크로마토그래피 단계에 대해, 하기 조건을 이용하였다 (예외 사항은 개별적인 실험 설명에 기재됨).
작동 유속 - 150 ~ 300 cm/시간
평형화 1 - 50 mM Tris, 2.0 M NaCl, pH 7.5 또는 8.0 (5 컬럼 부피)
평형화 2 - 75 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.5 (시행 3 및 4 는 50 mM 글리신 함유)
후 로딩 세정액 - 75 mM NaCl, 50 mM Tris, pH 7.5 (시행 3 및 4 는 50 mM 글리신 함유)
스트립 완충액 - 50 mM Tris, 2.0 M NaCl, pH 7.5 또는 8.0 (5 컬럼 부피)
수 개의 Mabselect 단백질 A 시행을 본질적으로 실험 1.2 에 기재된 바와 같이 수행하여 상기 시행용 로딩 재료를 생성하였다. 앞서 기술한 단백질 A 단계로부터 부분적 정제 항체 풀을 통과-흐름성 (FT) 방식에서 음이온 교환 단계에 걸쳐 추가로 정제하였다. 컬럼 직경은 1.0 ~ 3.2 cm 범위이고 컬럼 높이는 7.2 ~ 8.5 cm 이었다.
50 mM Tris, 2 M NaCl pH 7.5 를 함유하는 용액의 5 컬럼 부피로 컬럼을 평형화하고 그 다음 50 mM Tris, pH 7.5 용액을 포함하는 또다른 평형화 단계를 수행하였다. 그 다음 부분적 정제 단백질 A 피크를 109 mg/mL 내지 275 mg/mL 로 컬럼에 로딩시키고 로드 순환 중의 컬럼 용리액 및 세정액 분획의 일부 컬럼 부피에서 생성물을 회수하였다.
상기 로딩 조건은 통과-흐름성 (FT) 영역이었다. 실험 2.1 에 기재된 대량 처리 스크린은 pH 및 클로라이드 농도의 상기 조건 하 분배 계수 (Kp) 의 값에 대한 추정치를 제공했다. 시행은 표 2.2.1 에 나열된 분배 계수로 순위를 매겼다. UV 흡광도를 이용하여 컬럼 스트립 내 단백질을 측정함으로써 결합 생성물을 결정하였다. 이러한 결합 생성물 측정 방법은 통상적으로, 세정하는 동안 생성물의 등용매 조성 용리로 인해, 결합 생성물의 총량을 적게 추정한다. 상기 실험으로부터 단백질 A, HCP, HMW 및 LMW 제거 결과를 표 2.2.1 에 또한 나타낸다. HCP 의 제거는 상대적으로 불량하고 가변적이며, 단백질 A 및 생성물 변형체 (HMW 및 LMW 종) 의 제거는 없다.
[표 2.2.1]: FT 방식에서 HCP, 단백질 A 및 HMW 및 LMW 의 제거율
Figure pat00015
실험 2.3 - Mab-IMA 에 대한 약한 분배성 조건 하의 컬럼 시행
HTS 스크리닝 (실험 2.1) 에 의해 확인된 조건 하 약한 분배성 조건에서 하기 컬럼 실험을 수행하였다. 부분적 정제 단백질 A 풀로부터 TMAE 컬럼에 걸쳐 7회 시행을 수행하였다.
TMAE HiCap (M) 크로마토그래피
미리 기재된 바와 본질적으로 동일한 단백질 A 단계 시행으로부터 부분적 정제 항체를 하기 기재된 바와 같이 pH 및 클로라이드 함량의 약한 분배성 (WP) 조건 하 TMAE 단계에 걸쳐 추가로 정제하였다. 컬럼 직경은 0.5 내지 3.2 cm 범위이고 컬럼 높이는 9.4 내지 9.5 cm 이었다.
50 mM Tris, 2 M NaCl pH 7.5 또는 8.0 을 포함하는 용액의 5 컬럼 부피로 컬럼을 평형화하고 그 다음 5O mM 글리신, 50 mM Tris, pH 7.5 또는 8.0 용액을 포함하는 또다른 평형화 단계를 수행하였다. 그 다음 부분적 정제 단백질 A 피크를 124 mg/mL 내지 303 mg/mL 로 컬럼에 로딩시키고 로드 순환 중의 컬럼 용리액 및 세정액 분획의 일부 컬럼 부피에서 생성물을 회수하였다. 상기 실험으로부터의 결과를 표 2.3.1 에 나타낸다.
상기 로딩 조건은 약한 분배성 (WP) 영역이다. 실험 2.1 에 기재된 대량 처리 스크린은 분배 계수 (Kp) 의 값에 대한 추정치를 제공한다. 시행은 표 2.3.1 에 나열된 분배 계수로 순위를 매겼다. UV 흡광도를 이용하여 컬럼 스트립 내 단백질을 측가함으로써 결합 생성물을 결정하였다. 결합 생성물의 양을 측정하는 상기 방법은 통상적으로, 세정에서의 생성물의 등용매조성 용리으로 인해, 결합 생성물의 총량을 적게 추정한다. 상기 실험으로부터 단백질 A, HCP, HMW 및 LMW 결과를 표 2.2.1 에 또한 나타낸다. HCP 의 제거율은 일관되고 높으며, 단백질 A 의 제거율은 우수하고, 생성물 변형체 (HMW 및 LMW 종) 는 상당히 감소된다.
표 2.2.1 및 2.3.1 에 나타낸 데이터의 비교는 통과-흐름성 방식 (Kp 값 ≤0.3) 의 조건 하에서의 HCP, 단백질 A, HMW 및 LMW 의 제거율은 약한 분배성 조건 (Kp 값 >0.3) 하에서 달성될 수 있는 것보다, 심지어 로드 첼린지가 300 mg/mL 를 초과하는 경우에서조차 훨씬 낮다는 것을 확인해준다.
[표 2.3.1]: 약한 분배성 조건 하 HCP, 단백질 A, HMW 및 LMW 의 제거율
Figure pat00016
실험 2.4: 파일럿 및 임상 제조 규모에서 약한 분배성 컬럼 시행의 성능
약한 분배성 영역에서 작동되는 Mab-IMA 의 정제용 TMAE 공정 단계를 파일럿 플랜트 및 임상 제조의 규모로 확대하였다. 파일럿 내의 3 L 또는 5 L MabSelect 컬럼 및 임상 제조 동안의 28 L MabSelect 컬럼을 이용하여 단클론 항체를 포함하는 배양액을 먼저 정제시켰다. MabSelect 컬럼을 실험 1.2 에 기재된 바와 같이 필수적으로 작동시켰다. 상기 시행으로부터의 중화된 단백질 A 피크 풀을 파일럿 내의 1.5 L TMAE 컬럼 및 임상 제조 설비 내의 7 L TMAE 컬럼 상에서 추가로 정제시켰다. 3 회 파일럿 시행 및 9 회 임상 제조 시행의 결과를 표 2.4.1 및 2.4.2 에 개별적으로 요약하였다. 단계 성능은 시행 내내 일관되었고, HCP, 단백질 A 의 감소가 우수하며, HMW 및 LMW 종에 관련된 생성물의 제거율은 양호하였다. 생성물 회수율은 전체 시행에서 >87 % 이었다. 파일럿 시행 동안 수지에 결합 생성물의 추정치를 컬럼 스트립 내 생성물로부터 수득하였고, 이는 6 내지 14 mg/(수지)mL 범위이었다.
[표 2.4.1]: 약한 분배성 조건 하 파일럿 규모 시행의 성능
Figure pat00017
[표 2.4.2]: 약한 분배성 조건 하 제조 규모 시행의 성능
Figure pat00018
요약
HTS 는 WP 및 FT 작동용 조건을 확인해 주었다. FT 방식는 HCP 및 LMW 종에서 단지 적당한 감소를 제공하였고, 단백질 A 잔여물 또는 HMW 종에서 감소는 없었다. WP 방식에서의 작동은 생성물 수율의 희생없이 전체 불순물의 제거율을 향상시켰다. 공정 단계는, HCP 및 단백질 A 에 대해 매우 높은 LRV, 및 HMW 및 LMW 종에서의 양호한 감소와 함께, 3 회 시행에 대해 일관되게 작동되었고 파일럿 플랜트로 규모가 확대되었다.
시리즈 3 - TMAE - HiCapM 및 Mab - AAB 를 이용하는 음이온 교환
실험 3.1 - WP 및 FT 조건을 확립하기 위한 대량 처리 스크린
실험 1.1 에 기재된 바와 같은 절차를 이용하여 실험 3.1 을 수행하였다.
실험 3.2 - 가변 분배 계수에 대응하는 조건 하에서의 컬럼 용량 시행
HTS 스크린 (실험 3.1) 에 의해 확인되는 분배 계수의 범위에 해당하는 조건 하 에서 크로마토그래피 실험을 5 회 수행하였다. TMAE 컬럼을 매우 높은 로드 첼린지 (>1000 g/L) 로 로딩시켜 약한 분배성 조건 하에서 AEX 단계의 우수한 성능을 구체적으로 강조하였다.
하기 조건을 시리즈 3 에서 수행된 AEX 시행에 대해 이용하였다 (예외 사항은 개별적인 실험 설명에 기재됨).
작동 유속 - 150 ~ 300 cm/시간
평형화 1 - 50 mM Tris, 2.0 M NaCl, pH 7.5 (5 컬럼 부피)
평형화 2 - 특정된 바대로, 로드 pH 및 클로라이드 함량에 대략 동등함
후 로딩 세정액 - 특정된 바대로, 로드 pH 및 클로라이드 함량에 대략 동등함
스트립 완충액 - 50 mM Tris, 2.0 M NaCl, pH 7.5 (5 컬럼 부피)
평형화 완충액 1 의 5 컬럼 부피 및 이후 평형화 2 단계의 5 컬럼 부피로 컬럼을 평형화하였다. 그 다음 적당한 평형화 2 완충액으로 조정되는 단백질 A 피크 풀 (시리즈 1, 실험 1.1 로 참조) 을 940 내지 2144 (생성물)mg/(수지)mL 로 컬럼에 로딩시켰다.
컬럼 용리액 분획을 수집하고 계속해서 HCP 및 잔여 단백질 A 수준에 대해 검정하였다. 상기 실험에서 이용된 로드 조건은 통과-흐름성 및 약한 분배성 (WP) 영역을 확장시키는 분배 계수의 혁신적 증가에 해당한다. 실험 3.1 에 기재된 대량 처리 스크린은 분배 계수 (Kp) 의 값에 대한 추정치를 제공하였다. 상기 실시예에서, 결합 생성물 값은 스트립에서 용리된 생성물을 근거로 계산되었다. 상기 실험으로부터의 결과를 표 3.2.1 및 도 10A 및 10B 에 나타낸다.
[표 3.2.1]: WP 방식에서 매우 높은 로드 첼린지로부터의 결과 요약
Figure pat00019
전형적인 통과-흐름성 작동에 대해 예상된 바와 같이, 0.1 의 Kp 에 해당하는 시행에 대한 결합 생성물 값은 거의 0 이었다. 약한 분배성 영역에서 수행된 실험에 대한 결합 생성물 값은 모든 경우에서 > 12.0 mg/ml 이었다. 사실, 7 의 Kp 에 해당하는 시행에 대한 결합 생성물 값은 71 mg/ml 만큼 높았다. 그러나, 모든 경우에서 조합된 로드 용리액 및 세정액 분획에서의 생성물 회수율은 > 93 % 이었다.
HCP 및 단백질 A 제거율을 로드 첼린지의 함수로서 도 1OA 및 1OB 에 나타낸다. 상기 논의된 바와 같이, 조건이 통과-흐름성에서 약한 분배성으로 이동함에 따라, HCP 제거율이 상당히 증가한다. 통과-흐름성 조건 하 작동은 대략 1.5 log 의 HCP 배제를 제공하고, HCP log 제거값은 약한 분배성 영역 내 7 의 Kp 에서 작동하는 경우 로드 첼린지 < 450 mg/(수지)mL 에서 3.8 log 만큼 높았다. 약한 분배성 영역 내 0.8 의 Kp 에서, 2.8 log 의 HCP 배제를 1000 mg/(수지)mL 이하의 로드 첼린지에 대해 수득하였고, > 3 log 의 HCP 배제를 약한 분배성 영역 내 2.7 의 Kp 에서 800 mg/(수지)mL 의 로드 첼린지 이하에 대해 수득하였다.
HCP 의 경우에서와 같이, 통과-흐름성 조건에서 약한 분배성 조건으로 이동함에 따라 단백질 A 제거율이 상당히 증가한다. 도 1OA 및 1OB 에 나타낸 결과는 또한, 통과-흐름성으로부터 약한 분배성 영역으로의 작동의 Kp 증가가 오염원의 파과에 앞서 수득된 HCP 및 단백질 A log 배제 값 둘 다뿐 아니라, 파과점에 해당하는 로드 첼린지를 증가시킨다는 사실을 강조한다. Kp 에서의 추가적 증가는 오염원의 파과에 앞서 HCP 및 단백질 A LRV 를 계속 증가시킨다. 그러나, 결합 생성물이 현재 결합 부위에 대해 오염원과 경쟁함에 따라 상대적으로 낮은 로드 첼린지에서 파과점이 발생한다. 그럼에도 불구하고, 본 발명에 나타내는 시행에 대한 컬럼 용량은 높은 Kp 시행에 대해서조차 매우 높았다.
요약
약한 분배성 조건 하에서 그리고 1000 mg/(수지)mL 의 과량의 로드 첼린지에서 AEX 단계를 작동함으로써 단백질 A 및 HCP 제거율을 상당히 개선할 수 있음을 상기 실시예에서 나타내었다. 상기 실시예는 결합 조건 하의 약한 분배성 크로마토그래피와 표준 작동 사이에서 하나의 근본적인 차이점을 강조한다. 약한 분배성 조건은 오염원 배제를 상당히 개선시키는 지점 이하까지만 생성물 결합의 한계를 밀어내지만, 생성물 회수율 및 로드 첼린지는 여전히 높다. 결합 조건에 대응하는 Kp 값은 AEX 에서 > 20 이고; 상기 조건 하에서 생성물과 오염원 사이의 경쟁 효과는 약한 분배성 크로마토그래피와 비교하여 용량을 감소시킬 만큼 매우 강력하다.
시리즈 4 - Phenyl Toyopearl 및 Mab - AAB 를 이용한 소수성 상호작용
실험 4.1 - WP 및 FT 조건을 확립하기 위한 회분식 결합 연구
회분식 결합 연구를 수행하여 Phenyl Toyopearl 매질 (Tosoh Biosciences 사제) 과 Mab-AAB 에 대한 약한 분배성 및 통과-흐름성 조건을 확인하였다. 수지와의 생성물이 상호작용의 강도를 조절하는 염은 Na2SO4 이고, 0.20 내지 0.90 M 에서 가변적이었다. 용액을 완충액화시켜 pH 7.5 에서 조절하였다. 45 μm 필터 플레이트를 이용하여 수지를 액체와 함께 배양하고 원심분리를 통해 상청액을 데칸트시켰다. Na2SO4 를 이용해 상이한 농도 (0.2 M 내지 0.9 M) 에서 8 개의 Tris/Na2SO4 완충액를 만들었다. 단백질 A 크로마토그래피에 의해 부분적 정제 Mab-AAB 를 Tris/ Na2SO4 용액으로 희석시켜 0.87 mg/ml 의 최종 농도로 만들었다. 50 μL 의 수지를 300 μL 의 완충액으로 평형화시키고 그 다음 상청액을 각각의 Tris/Na2SO4 조건에 대해 데칸트시키고; 상기 평형화를 3 회 반복하였다. 평형화 이후, 데칸트된 수지를 생성물과 함께 동일 염 농도 및 pH 에서 혼합하고 부드럽게 진탕하면서 30 분 동안 항온배양하였다. 모든 조건에 대해 로드 첼린지는 5.2 (생성물)mg/(수지)mL 였다. 그 다음 UV 플레이트를 필터 플레이트의 바닥에서 스택 (stack) 하여 원심분리시 상청액을 수집하였다. 계속해서, 300 μL 의 50 mM Tris, pH 7.5 완충액을 수지에 적용시켜 결합 생성물을 스트리핑 제거하였다. 20 분 항온배양 후, 원심분리를 통해 스트립을 별도의 UV 플레이트에 수집하였다. 각 분획에서 생성물의 농도를 UV 흡광도 및 상기 MAb 에 대한 소광 계수로 측정하였다. 실험의 개별 세트를 통해 측정되는 29 μL 의 부피에 걸쳐서 단계 대 단계 운반에 대해 계산을 조정하였다. 실험을 각 염 조건 하에서 4 회 반복하였고 평균 분배 계수를 보고한다.
표 4.2.1 에 상기 실험으로부터의 분배 계수를 요약하였다. 최고 농도의 Na2SO4 는 강한 생성물 결합을 일으켰고, 0.40 ~ 0.55 M 범위의 염 농도는 약한 분배성 조건을 나타내었다.
실시예 4.2 - 약한 분배성 , 통과-흐름성 및 결합성 조건 하에서의 컬럼 시행 (높은 생성물 챌린지 연구)
통과-흐름성, 약한 분배성 및 강한 결합성 조건 하에서 컬럼 시행을 수행하였다. 시리즈 4 실험에 기재된 Phenyl Toyopearl 소수성 상호작용 크로마토그래피 시행 모두에 대해 다음 조건을 이용하였다 (예외 사항은 개별적인 실험 설명에 기재됨).
컬럼 치수: 직경 0.5 cm, 층 높이 9.5 ~ 10.5 cm
평형화 - 로드와 대략적으로 동등한 양의 [Na2SO4]를 갖는 pH 7.5 의 50 mM Tris,
로드 - 하기에 명시된 바와 같은 [Na2SO4]
세정액 - 로드와 동일한 [Na2SO4] (예외 사항은 아래에 기재함)
스트립 - pH 7.5 의 50 mM Tris
2 가지 상이한 로드를 이용하였다: i) 전술한 바와 본질적으로 동일한 단백질 A 단계 시행으로부터의 부분적 정제 항체 풀, 또는 ii) FT 방식 작동으로부터의 더욱 순수한 TMAE Q Sepharose FF 생성물 풀.
실험 4.2.1 - 단백질 A 피크 풀을 로드로서 이용한 컬럼 시행
여기서 논의된 실험은 약한 분배성 조건 하에서 HIC 의 우수한 성능을 강조하기 위해 수행되었다. 통과-흐름성, 약한 분배성 및 강한 결합성 조건에 상응하는 분배 계수 범위를 포함하도록 염 농도를 변화시키면서 컬럼 시행을 수행하였다. 실시예 4.1 에 기재된 배치 결합 스크린 (batch binding screen) 은 분배 계수 값 (Kp) 의 추정치를 제공하였다. 상기 컬럼을 pH 7.5 의 50 mM Tris 및 특정 농도의 적절한 [Na2SO4] 를 함유한 용액 5 컬럼 부피로 평형화하였다. 단백질 A 피크를 먼저 10 배로 농축하고, 이어서, 적절한 염 농도 중 14.77 mg/ml 로 희석하였다. 로드 물질 내 숙주 세포 단백질 (HCP) 및 잔여 단백질 A 수준은 각각 30911 ppm 및 17.1 ppm 이었다. 모든 컬럼 시행을 100 mg/(수지)mL 의 로드 챌린지에서 수행하였다. 로드 순환 분획 중의 컬럼 용리액에서 생성물을 수집하였다. 생성물을 통과-흐름시킨 후, 로드와 동일한 염 농도를 갖는 세정 완충액 10 컬럼 부피를 컬럼에 적용하고, 이어서, pH 7.5 의 5O mM Tris 를 함유한 스트립 완충액 5 컬럼 부피를 적용하였다. 후속하여, 상기 로드 용리액 및 세정액 샘플 중 HCP 및 단백질 A 함량을 ELISA 로 분석하였다. 로드 용리액 및 세정액 분획 둘 다에서 수합된 불순물 수준을 표 4.2.1 에 기록하였다.
상기 시행들은 분배 계수로 순위를 매겼다. UV 흡광도를 이용하여 컬럼 스트립 내의 단백질을 측정함으로써 결합 생성물을 측정하였다. 이러한 결합 생성물 측정 방법은 통상적으로, 세정하는 동안 생성물이 점차적으로 제거되기 때문에, 로딩 중의 결합 생성물의 양을 적게 추정한다.
[표 4.2.1]: 통과-흐름성, 약한 분배성 및 강한 결합성 조건에서의 불순물 제거율
Figure pat00020
표 4.2.1 에 제시된 데이터에서 명백한 바와 같이, 통과-흐름성 조건에서 약한 분배성 조건으로의 이동시 HIC 단계의 성능은, 생성물 회수율은 유사하면서, 오염원 감소율 면에서 현저하게 개선되었다. 작업 염 농도를 추가로 증가시킨 경우, 강한 결합성 조건에 해당하는 분배 계수에 이르게 되었다. 약한 분배성 조건에서 강한 결합성 조건으로의 이동시 HIC 단계 성능이 생성물 회수율 뿐만 아니라 오염원 감소율 면에서 모두 저하됨을 표 4.2.1 에 제시된 데이터로부터 다시 한번 명확히 확인하였다. 따라서, 이러한 분리를 위한 최적의 작동 윈도우는 약한 분배성 크로마토그래피의 윈도우에 해당하였다. 약한 분배성 조건 하에서, 상기 HIC 단계에 의해 1 의 HCP log 감소율 및 3.4 의 단백질 A 배수 감소율이 수득되었다. 본 실시예에서 약한 분배성 조건 하에서의 결합 생성물 수준은 2.8 내지 5 mg/(수지)mL 였다.
실험 4,2.2 - 로드로서 Q- Sepharose 피크 풀을 이용한 컬럼 시행
최적의 약한 분배성 크로마토그래피 조건 하에서의 HIC 단계의 성능을 보다 깨끗한 공급원 (feedstock) 을 이용하여 더욱 개선시킬 수 있다는 사실을 강조하기 위하여, 본 실험 세트에 Q Sepharose FF 피크 풀을 이용하였다. 이 경우에 로드 물질은 2,880 ppm 의 HCP 를 함유하였고, Q-Sepharose FF 컬럼 상에서 단백질 A 피크 풀을 정제하여 생성하였다. 하나는 약한 분배성 조건 하에서 그리고 다른 하나는 통과-흐름성 조건 하에서 시행한 두가지 실험을 수행하여, 불순물 제거율에 관한 컬럼 성능을 비교하였다. Q-Sepharose 피크를 550 mM 의 Na2SO4 에서 3.27 mg/ml 로 희석하고, 약한 분배성 조건 하에서의 작업을 위해 100 mg/(수지)mL 의 로드 챌린지로 컬럼에 로딩하였다. 이어서, 상기 컬럼을 로드와 동일한 염 농도를 함유한 완충액 10 CV 로 세정하고, pH 7.5 의 50 mM Tris 완충액 6 CV 로 스트리핑하였다. 통과-흐름성 조건 하에서 제 2 실험을 수행하였다. 로드를 200 Na2SO4 중 3.03 mg/ml 로 조정하고, 컬럼에 90 mg/(수지)mL 의 로드 챌린지로 로딩하였다. 이어서, 상기 컬럼을 로드와 동일한 염 농도를 함유한 완충액 6 CV 로 세정한 후, pH 7.5 의 50 mM Tris 완충액 6 CV 로 스트리핑하였다. 양 시행 모두에서, 회수율 및 불순물 분석을 위해 통과-흐름성 및 세정액 분획을 수집하였다. 이러한 시행의 결과를 표 4.2.2 에 기록하였다.
[표 4.2.2]: HIC 의 약한 분배성 결과와 통과-흐름성 결과의 비교
Figure pat00021
약한 분배성 조건 하에서의 생성물 회수율 값은 통과-흐름성 작동에서와 유사하였고, 이들 실험에 이용된 공급원에도 무관하였다. HCP 제거율에 관한 상기 단계의 성능은 통과-흐름성 작동과 비교시 약한 분배성 조건 하에서 현저하게 더 높았다.
어느 쪽의 공급원을 이용하던지, HIC 단계 전체에 걸친 HCP LRV 는 통과-흐름성 조건 하에서 유사하였다 (약 0.4 ~ 0.5 LRV). 그러나, 약한 분배성 조건 하에서 수행된 실험에 대한 HCP LRV 값은 단백질 A 로드 물질 이용시의 1 LRV 로부터 증가하여, 단백질 A 및 Q Sepharose FF 컬럼을 통해 정제된 로드 물질 이용시의 2 LRV 를 초과하는 값으로 증가하였다.
요약
또다른 방식의 크로마토그래피 (HIC) 가 약한 분배성 방식에서 성공적으로 작동하는 것으로 나타났다. 약한 분배성 조건 하에서의 HIC 단계의 성능이 통과-흐름성 조건 뿐만 아니라 더욱 강한 결합성 조건 하에서의 작동 모두에 비해 생성물 회수율 및 HCP/단백질 A 제거율 면에서 우수한 것으로 나타났다. 약한 분배성 조건 하에서, 100 mg/(수지)mL 의 높은 로드 챌린지 용량이 성공적으로 처리되었고, 여기서, (로드 농도가 3.27 mg/mL 였음에도 불구하고) 수지에 결합된 생성물은 3 mg/mL 를 초과했다. 최적의 약한 분배성 조건에 해당하는 분배 계수는 음이온 교환 크로마토그래피의 것보다 약간 높은 것으로 나타났다.
시리즈 5 - 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I 및 Mab - MYA 를 이용한 히드록 시아파타이트
실험 5.1 - WP 및 FT 조건을 확립하기 위한 대량 처리 스크린
세라믹 히드록시아파타이트 매질과 Mab-MYA 에 관한 약한 분배성 및 통과-흐름성 조건을 확인하기 위해 대량 처리 스크린 (HTS) 을 시행하였다. 이러한 스크린에서, 염화나트륨 및 인산나트륨의 농도를 변화시켜, 히드록시아파타이트 매질에의 MAB-MYA 결합 정도에 대한 이들의 효과를 측정하였다.
50 μL 의 세라믹 히드록시아파타이트 매질을 96 웰 필터 플레이트의 30 웰에 첨가하였다. pH 7.2 의 아르기닌 100 mM 함유 10O mM HEPES 완충액 중 적절한 염화나트륨 및 인산나트륨 농도로 이루어진 용액에서 각 웰을 평형화시켰다. 상기 용액 중 두 염의 농도를 표 5.1.1 및 5.1.2 에 제시하였다. 각 조건을 이중으로 수행하였다. 상기 웰 각각에서 MAB-MYA 로드 챌린지는 5.0 mg/(수지)mL 였다.
[표 5.1.1]: 각 웰에서의 염화나트륨 농도 (mM)
Figure pat00022
[표 5.1.2]: 각 웰에서의 인산나트륨 농도 (mM)
Figure pat00023
HTS 실험의 제 1 단계에서, 각 웰을, 상 부피비 6:1 (용액 30O μL: 수지 5O μL) 로, 표 5.1.1 및 5.1.2 에 기재된 바와 같은 염화나트륨 및 인산나트륨 조건에서 평형화하였다. 각 플레이트를 20 분간 진탕시켜 평형에 이르게 하였다. 이어서, 필터 플레이트를 원심분리시켜 용액을 제거하였다. 이러한 평형화 주기를 3 회 반복하였다.
제 2 단계에서, 적절한 염화나트륨 및 적절한 인산나트륨 농도에서 6:1 의 부피비 (용액 300 μL: 수지 50 μL) 로 적절한 단백질 로드 챌린지가 되도록 각 웰 내 수지에 농축 MAb-MYA 용액을 챌린지하였다. 50 mM NaCl, 100 mM HEPES, 100 mM 아르기닌 (pH 7.2) 중 Mab-MYA 의 7.0 mg/mL 용액을 저장 용액으로서 이용하였다. 로딩된 플레이트를 20 분간 진탕시켜 수지 및 용액이 평형에 이르게 하였다. 원심 분리를 통해 상기 필터 플레이트에서 상청액을 제거하고, 수집 플레이트 내로 수집하였다. 각 웰 내 상청액에서의 단백질 농도를 A280 nm 에서의 흡광도로 측정하였다.
제 3 단계에서는, 표 5.1.1 및 5.1.2 에 나열된 특정 염화나트륨 및 인산나트륨 조건의 용액을 첨가하여 수지를 세정하였다. 20 분간 진탕시킨 후 상청액을 제거하였다.
제 4 단계에서, 10O mM 인산나트륨, 1 M NaCl 로 이루어진 완충액 (pH 7.2)을 첨가하여, 상기 수지에 결합된 잔여 단백질을 제거하였다.
단계 4 에서 용리된 질량 및 단계 2 로부터의 생성물 농도를 이용하여 각 웰에 대한 분배 계수를 계산하고, 이를 표 5.1.3 에 나타내었다.
[표 5.1.3]: MAB-MYO 에 대한 96 웰 HTS 스크린에 관한 분배 계수 (Kp)
Figure pat00024
표 5.1.3 에 제시된 바와 같이, MAB-MYA 가 상이한 강도로 히드록시아파타이트 매질에 결합하는 영역을 기술하기 위해 상기 Kp 값을 이용할 수 있다. 클로라이드 및 포스페이트의 농도의 조건을 통과-흐름성 (Kp≤0.1), 약한 분배성 (0.1<Kp<20) 및 결합성 구역으로 변화시켜, 세라믹 히드록시아파타이트에 대한 MAB-MYA 의 결합 강도를 조절할 수 있다.
실험 5.2 - WP 조건 하에서의 컬럼 시행
여기서 논의된 실험은 약한 분배성 조건 하에서 cHA 단계의 우수한 성능을 강조하기 위해 특별히 수행하였다. 따라서, HTS 스크린 (실험 5.1) 에 의해 확인된 분배 계수의 범위에 상응하는 조건 하에서 실험을 수행하였다. 100 mg/(수지)mL 의 생성물 로드 챌린지로 12 회 시행하였다.
Mabselect 단백질 A 크로마토그래피
단클론 항체를 함유한 배양액을 MabSelect 컬럼을 이용하여 정제하였다. 50 mM Tris/150 mM NaCl (pH 7.5) 5 컬럼 부피를 이용하여 300 cm/시간 의 유속에서 Mabselect 단백질 A 컬럼을 평형화하였다. 이어서, 적절한 40 (생성물)mg/(수지)mL 의 로드 챌린지로 상기 컬럼에 로딩시켰다. 그 다음에, 1 M 아르기닌, 5O mM Tris (pH 7.5) 중 세정액 10 CV 로, 그리고 10 mM Tris, 75 mM NaCl (pH 7.5) 세정액을 함유한 세정액 5 CV 로 세정하였다. 이어서, 10O mM 아르기닌, 5O mM NaCl (pH 3.0)을 이용하여 상기 컬럼을 용리시켰다. 2 M HEPES (pH 8.0)을 이용하여 생성물 풀을 pH 7.2 로 중화시켰다.
세라믹 히드록시아파타이트 크로마토그래피
단백질 A 단계로부터 부분적 정제 항체 풀을 히드록시아파타이트 상에서 추가로 정제하였다. 컬럼 직경은 0.5 cm 이고 컬럼 높이는 10 cm 였다.
실험 5 시리즈에 기재된 모든 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계에 대해 하기 조건을 이용하였다 (예외 사항은 개별적인 실험 설명에 기재됨).
작동 유속 - 150 ~ 240 cm/시간
평형화 1 - 300 mM 인산나트륨, 1.0 M NaCl, pH 6.8 (3 컬럼 부피)
평형화 2 - 5 ~ 30 mM 인산나트륨, 50 ~ 760 mM NaCl, 10O mM 아르기닌, 10O mM HEPES pH 7.2 (5 컬럼 부피)
세정액 - 5 ~ 30 mM 인산나트륨, 50 ~ 760 mM NaCl, 10O mM 아르기닌, 10O mM HEPES pH 7.2 (5 ~ 10 컬럼 부피)
컬럼을 5 컬럼 부피의 평형화 완충액 1 로 평형화시키고, 이어서 또다른 평형화 2 단계를 시행하였다. 이어서, 전술한 단계로부터의 단백질 A 피크 (적절한 평형화 2 완충액으로 조절됨) 를 100 (생성물)mg/(수지)mL 로 컬럼에 로딩하고, 로드 순환 중의 컬럼 용리액 및 세정액 분획의 일부 컬럼 부피에서 생성물을 회수하였다. 상기 실험 결과를 표 5.2.1 및 도 11 에 제시하였다.
이러한 로드 조건은 통과-흐름성, 약한 분배성 (WP) 및 결합성 영역 내였다. 실험 5.1 에 기재된 대량 처리 스크린으로부터 이러한 클로라이드 및 포스페이트 농도 조건 하에서의 분배 계수 (Kp) 값 및 결합 생성물 (mg/(수지)mL) 의 추정치를 수득하였다. 상기 컬럼 시행으로부터의 생성물 파과 부피로부터 결합 생성물을 측정하였다. 상기 실험으로부터의 HCP 및 단백질 A 결과를 표 5.2.1 및 도 11 에 제시하였다.
[표 5.2.1]: 통과-흐름성, 약한 분배성 및 결합성 조건 하에서의 HCP 및 단백질 A 제거율
Figure pat00025
표 5.2.1 및 도 11 에 제시된 데이터로부터 명확한 바와 같이, 통과-흐름성 조건에서 약한 분배성 조건으로서 이동시 cHA 단계의 성능은, 생성물 회수율은 유사하면서 오염원 제거율 면에서는 현저히 개선되었다. 분배 계수의 추가적 증가에 상응하는 조건 하에서의 작동 (즉, 결합성 영역에서의 작동) 은 오염원 제거율 면에서 추가적인 이점을 제공하지 않았다. 그러나, 상기 단계 전체에 걸친 생성물 회수율은 강한 결합 조건 하에서 감소하기 시작하였다. 즉, 상기 분리에 대한 최적의 작동 윈도우는 약한 분배성 크로마토그래피의 윈도우에 해당하였다. 이러한 조건 하에서, 2 를 초과하는 단백질 A 의 log 감소율 및 1.2 를 초과하는 숙주 세포 단백질의 log 감소율이 100 (생성물)mg/(수지)mL 의 로드 챌린지에서 수득되었다. 본 실시예에서, 약한 분배성 조건 하에서의 결합 생성물 수준은 3.0 ~ 10.2 mg/(수지)mL 였다.
요약
제 3 의 방식의 크로마토그래피 (히드록시아파타이트) 가 약한 분배성 방식으로 성공적으로 작동됨을 나타내었다. 단백질 A 및 HCP 는 WP 조건 하에서 생성물 항체보다 세라믹 수지에 더욱 강하게 결합되고, 강하게 체류하였다. WP 영역 내에서 보다 높은 Kp 값은 일부 경우에 10 내지 20 이었고, 여전히 양호한 생성물 회수율 (> 90 %) 을 제공하였다. 일치하게도, 더 낮은 수준의 Kp 가 더 높은 회수율을 제공하였다.
본 실시예에서, 주로 컬럼을 시행하는데 이용되는 분배 계수의 선택을 통해 컬럼 단계의 성능을 최적화할 수 있다는 것을 나타내었다. 히드록시아파타이트에서의 분배 계수는 pH, 염 (유형 및 농도), 포스페이트 및 완충액 성분의 복합적인 함수이다. 일반적으로, 이러한 변수 모두가 컬럼 단계의 성능에 영향을 준다. 여기에 제시된 접근법은 상기 변수 중 어느 하나를 변화시킨 경우의 컬럼 성능에 대한 영향에 관한 간단한 방법을 제공한다. 본 실시예에 제시된 단일화된 분배 계수 접근법은, 이러한 방식의 크로마토그래피에서, 이전보다 더욱 넓은 작동 공간에서 작동할 수 있는 가능성을 열어준다. 최적 성능을 위한 약한 분배성 조건을 전술한 HTS 방법을 이용하여 용이하게 확인할 수 있다.
시리즈 6 - 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I 및 Mab - A5T 를 이용한 히드록 시아파타이트
실험 6.1 - WP 및 FT 조건을 확립하기 위한 대량 처리 스크린
대량 처리 스크린 (HTS) 을 수행하여 세라믹 히드록시아파타이트 매질과 Mab-A5T 에 대한 약한 분배성 조건 및 통과-흐름성 조건을 확인하였다. 이러한 스크린에서, pH, 염화나트륨 및 인산나트륨 농도를 변화시켜 히드록시아파타이트 매질에의 MAB-A5T 결합 정도에 대한 이들의 효과를 측정하였다.
50 μL 의 세라믹 히드록시아파타이트 매질을 96 웰 필터 플레이트의 36 웰에 첨가하였다. pH 7.0 또는 pH 8.0 의 아르기닌 50 mM 함유 50 mM HEPES 완충액 중 적절한 염화나트륨 및 인산나트륨 농도로 이루어진 용액에서 각 웰을 평형화시켰다. 상기 용액 중 두 염의 농도를 표 6.1.1 및 6.1.2 에 제시하였다. 1 ~ 3 열에 제시된 조건은 pH 7.0 에서 시행되었고, 4 ~ 6 열은 pH 8.0 에서 시행되었다. 상기 웰 각각에서 MAB-A5T 로드 챌린지는 5.0 mg/(수지)mL 였다.
[표 6.1.1]: 각 웰에서의 염화나트륨 농도 (mM)
Figure pat00026
[표 6.1.2]: 각 웰에서의 인산나트륨 농도 (mM)
Figure pat00027
HTS 실험의 제 1 단계에서, 각 웰을, 표 6.1.1 및 6.1.2 에 기술된 바와 같은 염화나트륨, 인산나트륨 및 pH 의 조건에서 상 부피비 6:1 (300 μL 용액:50 μL 수지) 로 평형화하였다. 플레이트를 20 분 동안 진탕시켜, 평형에 도달하도록 하였다. 이어서, 필터 플레이트를 원심분리하여 용액을 제거하였다. 이 평형화 주기를 3 회 반복하였다.
제 2 단계에서, 적절한 pH 및 염화나트륨 및 인산나트륨 농도에서 부피비 6:1 (300 μL 용액:50 μL 수지) 로, 적절한 단백질 로드 챌린지가 되도록 각 웰 내 수지에 농축 MAb-A5T 용액을 챌린지하였다. 1 mM HEPES, 100 mM NaCl, pH 7.0 중 Mab-A5T 의 6.9 mg/mL 용액을 저장 용액으로 이용하였다. 로딩된 플레이트를 20 분 동안 진탕시켜, 수지 및 용액을 평형에 이르게 하였다. 상청액을 원심 분리에 의해 필터 플레이트에서 제거하고 수집 플레이트에 수집하였다. 각 웰 내 상청액에서의 단백질 농도를 A280 nm 에서의 흡광도로 결정하였다.
제 3 단계에서, 표 6.1.1 및 6.1.2.에 기입된 특정 염화나트륨, 인산나트륨 및 pH 조건의 용액을 첨가함으로써 수지를 세정하였다. 20 분 동안 진탕시킨 후, 상청액을 제거하였다.
제 4 단계에서, 100 mM 인산나트륨, 1 M NaCl, pH 7.2 를 포함하는 완충액을 첨가하여 수지에 결합된 잔여 단백질을 제거하였다. 분배 계수를 단계 4 로부터 용리된 질량 및 단계 2 로부터의 생성물 농도를 이용하여 각 웰에 대하여 계산하였고, 표 6.1.3 에 나타냈다.
[표 6.1.3]: MAB-A5T 에 대한 HTS 스크린에서의 분배 계수 (Kp)
Figure pat00028
표 6.1.3 에 나타낸 바와 같이, MAB-A5T 가 상이한 세기로 히드록시아파타이트 매질에 결합된 영역을 확인하는 것에 Kp 값을 이용할 수 있다. NaCl, 포스페이트 및 pH 의 조건을 통과-흐름성, 약한 분배성 및 결합성 영역으로 변화시킴으로써 세라믹 히드록시아파타이트 매질에 결합된 MAB-A5T의 세기를 조정할 수 있다.
실험 6.2 - WP 조건 하에서의 컬럼 실시
실험을 수행하여 약한 분배성 조건 하에서 cHA 단계의 우수한 성능을 강조하였다. 따라서, 실험을 HTS 스크린에 의해 확인된 분배 계수의 범위 (실험 6.1) 에 해당하는 조건 하에서 수행하였다. 110 (수지)mg/ml 의 생성물 로드 챌린지로, 8 회 실시하였다.
Mabselect 단백질 A 크로마토그래피
단클론 항체를 포함한 배양액을 MabSelect 컬럼을 이용하여 정제하였다. Mabselect 단백질 A 컬럼을 50 mM 트리스/150 mM NaCl, pH 7.5 의 5 컬럼 부피로 300 cm/시간의 유속에서 평형화시켰다. 이어서, 약 40 (생성물)mg/(수지)mL 의 로드 챌린지로 컬럼에 로딩시켰다. 이어서, 1 M NaCl, 50 mM 트리스, pH 7.5 중의 5 CV 세정액, 및 10 mM 트리스, 75 mM NaCl, pH 7.5 를 포함하는 5 CV 세정액으로 세정했다. 이어서, 컬럼을 100 mM 아르기닌, 50 mM NaCl, pH 3.0 을 이용하여 용리하였다. 생성물 풀을 2 M HEPES pH 8.0 을 이용하여 pH 7.2 로 중화하였다.
세라믹 히드록시아파타이트 크로마토그래피
단백질 A 단계로부터의 부분적 정제 항체 풀을 히드록시아라타이트 상에서 추가 정제하였다. 컬럼 직경이 0.5 cm 이고 컬럼 높이가 10 cm 였다.
실험 6 시리즈에 기술된 모든 히드록시아파타이트 크로마토그래피 단계에서, 하기 조건을 이용하였다 (예외 사항은 개별적인 실험 설명에 기재됨).
작업 유속 - 150 ~ 240 cm/시간
평형화 1 - 300 mM 인산나트륨, 1.0 M NaCl, pH 6.8 (3 컬럼 부피)
평형화 2 - 2 ~ 32 mM 인산나트륨, 50 ~ 400 mM NaCl, 5 mM 이미다졸, 50 mM 글리신, 10 mM HEPES, pH 7.0 (5 컬럼 부피)
세정액 - 평형화 2 와 동일.
컬럼을 평형화 완충액 1 의 5 컬럼 부피 및 이후 또다른 평형화 2 단계에에 의해 평형화시켰다. 이어서, 이전 단계로부터의 단백질 A 피크 (적당한 평형화 2 완충액으로 조절됨) 를 110 (생성물)mg/(수지)mL 로 컬럼에 로딩시키고, 생성물을 로드 순환 중의 컬럼 용리액 및 세정액 분획의 일부 컬럼 부피에서 회수하였다. 이러한 실험으로부터의 결과를 표 6.2.1 및 도 12 에 나타냈다.
[표 6.2.1]: cHA 수지 상의 MAB-A5T 에 대한 분배 계수 및 상응하는 작동 윈도우
Figure pat00029
이 실험에서 작동 조건은 통과-흐름성, 약한 분배성 (WP) 영역 및 결합성 영역에 해당한다. 실험 6.1 에 기술된 HTS 실험은 pH, 클로라이드 및 포스페이트 농도의 이러한 조건 하에서 분배 계수 (Kp) 값에 대한 추정치를 제공하였다. 표 6.2.1 에서의 실시는 분배 계수로 순위를 매겼다. 결합 생성물을 UV 흡광도를 이용하여 컬럼 스트립 내 단백질을 측정함으로써 결정하였다. 이러한 결합 생성물 측정 방법은 통상적으로, 세정하는 동안 생성물이 점차적으로 제거되기 때문에, 로딩 중의 결합 생성물의 양을 적게 추정한다. 이러한 실험으로부터의 HCP 및 HMW 관련 단백질의 제거율뿐 아니라 생성물 회수율의 결과를 도 12 에 나타냈다.
표 12 에 제시된 데이터에서 명백한 바와 같이, 통과-흐름성 조건에서 약한 분배성 조건으로의 이동시 HIC 단계의 성능은, 생성물 회수율은 80 % 초과로 유지하면서, HCP 및 HMW 감소율 면에서 현저하게 개선되었다. 분배 계수의 추가적 증가에 상응하는 조건 하에서의 작동 (즉, 결합성 영역에서의 작동) 은 오염원 제거율에 대하여 추가적 이익을 제공하지 않는다. 그러나, 상기 단계 전체에 걸친 생성물 회수율은 강한 결합성 조건 하에서 감소되기 시작한다. 따라서, 이 분리에 대한 최적의 작동 윈도우는 약한 분배성 크로마토그래피의 윈도우에 해당하였다. 이러한 조건 하에서, HMW 종과 관련된 생성물의 4-배 감소 및 1.4 를 초과하는 HCP 의 log 감소율이 100 (생성물)mg/(수지)mL 의 로드 챌린지에서 수득되었다. 본 실시예에서, 약한 분배성 조건 하에서의 결합 생성물 수준은 1.6 ~ 6.7 mg/ml 였다.
요약
약한 분배성 크로마토그래피 하에서의 작업이 HCP 및 HMW 감소 및 생성물 회수율 (> 80 %) 에 대해 향상된 성능을 제공하는 것으로 나타난 히드록시아파타이트로 제 2 실시예를 설명하였다. 이전 실시예에서와 같이, 단계의 성능은 주로, 컬럼 시행을 위해 이용되는 분배 계수의 선택을 통해 최적화하였다. 여기에 제시된 접근법은 다양한 변수 (pH, 염, 포스페이트, 이미다졸, 글리신, HEPES 등) 중 임의의 하나를 변화시킨 경우의 컬럼 성능에 대한 간단한 방법을 제공한다. 최적의 성능을 위한 약한 분배성 조건은 이 실시예에서 기술된 HTS 방법을 이용하여 용이하게 확인할 수 있다. 여기에 제시된 접근법은, 이러한 방식의 크로마토그래피에서, 이전보다 더욱 넓은 작동 공간에서 작동할 수 있는 가능성을 열어준다. 이 실시예에서 최적의 WP 영역은 분배 계수 2 내지 20 사이에 해당한다.
시리즈 7 - 세라믹 히드록시아파타이트 유형 I 및 Mab - MYO 를 이용한 히드록시아파타이트
실험 7.1 - FT , WP 및 강한 결합성 조건을 확립하기 위한 대량 처리 스크린
대량 처리 스크린 (HTS) 을 수행하여 세라믹 히드록시아파타이트 매질과 Mab-MYO 에 대한 통과-흐름성, 약한 분배성 및 결합성 조건을 확인하였다. 상기 스크린은 pH, 아르기닌/글리신, HEPES, 인산나트륨 및 염화나트류의 농도를 변화시켜, 히드록시아파타이트 매질에의 MAB-MYO 결합 정도에 대한 이들의 효과를 측정하였다.
이 실시예에서 이용된 HTS 절차는 시리즈 5 및 시리즈 6 에 기술된 바와 유사하며, 여기서는 논의되지 않는다. HTS 데이터에 맞추어진 반응 표면으로부터 유래된 예측 Kp 값을 컬럼 실험을 위한 특정 조건을 고르는 것에 이용하였다.
실험 7.2 - WP 조건 하에서 컬럼 실시.
여기에 논의된 실험을 HTS 실험에 의해 확인된 분배 계수의 범위에 해당하는 조건 하에서 수행하였다. 이 실험은, HCP 및 HMW 종과 관련된 생성물의 제거를 위한 약한 분배성 조건 하에서 cHA 단계의 우수한 성능을 강조하기 위해 수행했다. 55 mg/(수지)mL 의 생성물 로드 챌린지로 4 회 시행을 수행하였다. 이 실험에서 이용된 로드 챌린지는 약한 분배성 크로마토그래피에 대해 낮지만, 통과-흐름성 작동에 대해서는 통상적인 것이다. 이 실험에서는 약한 분배성 크로마토그래피에 대한 로드 챌린지를 최적화하는 시도를 하지 않았다.
단백질 A 단계로부터의 부분적 정제 항체 풀을 이 실험에서 이용하였다. 컬럼 직경이 0.5 cm 이고 컬럼 높이가 10 cm 이었다.
실험 7 시리즈에서 기술된 모든 히드록시아파타이트 크로마토그래피에서, 하기 조건을 이용하였다 (예외 사항은 개별적인 실험 설명에 기재됨).
작동 유속 - 150 ~ 240 cm/시간
평형화 1 - 300 mM 인산나트륨, 1.0 M NaCl, pH 6.8 (2 ~ 5 컬럼 부피)
평형화 2 - 1 ~ 8 mM 인산나트륨, 50 ~ 1750 mM NaCl, 12 ~ 50 mM Arg, 20 ~ 50 mM HEPES pH 7.0 (5 컬럼 부피)
세정액 - 평형화 2 와 동일.
컬럼을, 평형화 완충액 1 의 2 ~ 5 컬럼 부피 및 이후 평형화 2 의 5 컬럼 부피로 평형화시켰다. 이어서, 단백질 A 피크 (적절한 평형화 2 완충액으로 조정됨) 를, 55 (생성물)mg/(수지)mL 로 컬럼에 로딩시키고, 로드 순환 중의 컬럼 용리액 및 세정액 분획의 일부 컬럼 부피에서 생성물을 회수하였다. 이 실험으로부터의 결과를 표 7.2.1 및 도 13 에 나타냈다.
[표 7.2.1]: cHA 수지상의 MAB-MYO 에 대한 분배 계수 및 상응하는 작동 방식
Figure pat00030
이 실험에서 작동 조건은 통과-흐름성, 약한 분배성 (WP) 및 결합성 영역에 해당한다. 실험 7.1 에 기술된 HTS 실험은 pH, 클로라이드, 포스페이트, 글리신/아르기닌 및 HEPES 농도의 이러한 조건 하에서 분배 계수 (Kp) 의 값에 대한 추정치를 제공하였다. 표 7.2.1 에서의 시행은 분배 계수로 순위를 매겼다. 결합 생성물을 UV 흡광도를 이용하여 컬럼 스트립 내 단백질을 측정함으로써 결정하였다. 이러한 결합 생성물 측정 방법은 통상적으로, 세정하는 동안 생성물이 점차적으로 제거되기 때문에, 로딩 중의 결합 생성물의 양을 적게 추정하였다. 이 실험으로부터의 고분자량 (HMW) 관련 생성물 제거율 및 생성물 회수율 결과를 또한 도 13 에 나타냈다.
도 13 에 제시된 데이터에서 명백한 바와 같이, 통과-흐름성 조건에서 약한 분배성 조건으로의 이동시 HIC 단계의 성능은, 생성물 회수율은 80 % 초과로 유지하면서, HMW 감소율 면에서 현저하게 개선되었다. 분배 계수의 추가적 증가에 상응하는 조건 하에서의 작동 (즉, 결합성 영역에서의 작동) 은 오염원 제거율에 대하여 추가적 이익을 제공하지 않는다. 그러나, 상기 단계 전체에 걸친 생성물 회수율은 강한 결합성 조건 하에서 감소되기 시작한다. 따라서, 이 분리에 대한 최적의 작동 윈도우는 약한 분배성 크로마토그래피의 윈도우에 해당하였다. 이러한 조건 하에서, HMW 종과 관련된 생성물의 20-배 감소를 수득하였다. 본 실시예에서, 약한 분배성 조건 하에서의 결합 생성물 수준은 5.1 ~ 9.5 mg/ml 였다.
요약
약한 분배성 크로마토그래피 하에서의 작업이 양호한 생성물 회수율 (> 80 %) 과 HMW 감소에 대한 향상된 성능을 제공하는 것으로 나타난 히드록시아파타이트로 제 2 실시예를 설명하였다. HMW 종 관련 생성물 및 HMW 종은 WP 조건 하에서 생성물 항체보다 세라믹 수지에 더 단단히 결합하고, 강하게 체류했다. 이 실시예에서 WP 영역은 분배 계수가 8 내지 20 사이에 해당했다.
컬럼 단계의 성능은 주로, 컬럼 시행을 위해 이용되는 분배 계수의 선택을 통해 최적화할 수 있다는 것이 다시 한번 나타났다. 여기에 제시된 접근법은 다양한 변수 (pH, 염, 포스페이트, 이미다졸, 글리신, HEPES 등) 중 임의의 하나를 변화시킨 경우의 컬럼 성능에 대한 간단한 방법을 제공한다. 최적의 성능을 위한 약한 분배성 조건은 이 실시예에서 기술된 HTS 방법을 이용하여 용이하게 확인할 수 있다. 여기에 제시된 접근법은, 이러한 방식의 크로마토그래피에서, 이전보다 더욱 넓은 작동 공간에서 작동할 수 있는 가능성을 열어준다.
또한 약한 분배성 크로마토그래피의 개념은 전하 상호작용 단독에 의해서는 구동되지 않는 시스템으로 작용한다는 것을 주목해야 한다. 이 적용에서 기술된 일반적인 접근은 HIC 및 히드록시아파타이트와 같은 복합 시스템에 성공적으로 적용할 수 있다. 예를 들어, pH, NaCl, 포스페이트, 아르기닌/글리신, 완충액 종과 같은 여러 다른 변수를 조정하는 것에 더하여, 수지의 유형 또한 모두 히드록시아파타이트에서의 단계 성능에 영향을 줄 수 있다. 그럼에도 불구하고, 원하는 생성물이 단일할 때는 간단한 배치 결합 실험을 시행함으로써 WP 윈도우를 용이하게 확인할 수 있다.
시리즈 8 - 단백질 A 용리를 위한 쯔비터이온 완충액 및 이후의 이온 교환 단계
단클론 항체를 포함하는 배양액을 MabSelect 수지를 이용하여 정제하였다. MabSelect 단백질 A 컬럼을 50 mM 트리스/150 mM NaCl, pH 7.5 의 5 컬럼 부피로 평형화했다. 이어서, 컬럼에 약 40 (생성물)mg/(수지)mL 로 로딩하였다. 1 M NaCl, 50 mM 트리스, pH 7.5 중의 5 CV 세정액, 및 10 mM 트리스, 75 mM NaCl 을 포함하는 5 CV 세정으로 세정했다. 이어서, 컬럼을 30 mM HEED, pH 3.1 을 이용하여 용리시켰다. 1 M HEPES pH 8.0 을 이용하여 생성물 풀을 pH 7.2 로 중화시키고, 총 HEPES 농도가 55 mM 이 되도록 하였다. pH 7.2 에서, HEPES는 완충액에 17 mM 의 이온 강도를 기여했다.
본원에 언급된 모든 참조 문헌은 각각의 개별 공보 또는 특허 또는 특허원이 모든 목적용으로 구체적이고 개별적으로 참고로 인용되는 것처럼 동일한 정도로 모든 목적용으로 본원에 참고로 인용된다. 참고로 인용된 공보 및 특허 또는 특허원이 명세서에 포함된 기재 내용을 반박할 정도로 명세서는 이러한 반박 내용을 능가하여 우위를 점한다.
본 명세서와 청구의 범위에서 사용되는 성분의 양, 반응 조건 등을 나타내는 모든 수는 용어 "약" 에 의해 변형될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 상반되도록 나타내지 않는 한, 명세서 및 첨부된 청구항에 개시되는 수적인 매개변수는 본 발명에 의해 수득하고자 하는 원하는 특성에 의존하여 변화할 수 있는 근사값이다. 적어도 수적인 매개변수는 청구의 범위에 대한 등가물의 원칙의 적용을 제한하려는 시도로서가 아니라 유효한 아라비아 숫자와 통상의 선회 근사 (rounding approach) 면에서 이해되어야 한다.
당업자에게 자명한 바와 같이, 본 발명의 정신 및 범위를 벗어남이 없이 본 발명의 다수의 변경 및 변형이 이루어질 수 있다. 본원에 기재된 특정 양태들은 단지 예로서 제공된 것이지 어떤 식으로든 제한하려는 의도는 없다. 명세서 및 실시예는 단지 예시로서 간주되어야 하며, 본 발명의 진정한 범위 및 정신은 다음 청구의 범위에 나타내고자 한다.
[도 1A]
Figure pat00031
[도 1B]
Figure pat00032
[도 2A]
Figure pat00033
[도 2B]
Figure pat00034
[도 3]
Figure pat00035
[도 4]
Figure pat00036
[도 5A]
Figure pat00037
[도 5B]
Figure pat00038
[도 6]
Figure pat00039
[도 7]
Figure pat00040
[도 8]
Figure pat00041
[도 9]
Figure pat00042
[도 10A]
Figure pat00043
[도 10B]
Figure pat00044
[도 11]
Figure pat00045
[도 12]
Figure pat00046
[도 13]
Figure pat00047

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  1. 본원 명세서에 기재된 제조 방법.
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