BRPI0608584A2

BRPI0608584A2 - mÉtodos de recuperar um produto e um anticorpo purificado de um fluido de carregamento

Info

Publication number: BRPI0608584A2
Application number: BRPI0608584-9A
Authority: BR
Inventors: Paul Brown; Jon Coffman; Ranganathan Godavarti; Tim Iskra; Brian D Kelley; Suresh Vunnum; Shujun Sun; Tianning Yu; James Edward Booth; Mary Beth Switzer
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2005-03-11
Filing date: 2006-03-10
Publication date: 2010-01-19
Also published as: US8067182B2; WO2006099308A2; BRPI0608584B8; IL185687A0; HK1210476A1; CA2601062A1; DK1869065T3; BRPI0608584B1; US20070060741A1; AU2006223180B2; PT1869065T; RU2007132851A; IL185687A; EP1869065A2; RU2457214C2; JP2008533473A; EP1869065B1; US20120138537A1; HUE049797T2; KR20070121667A

Abstract

MÉTODOS DE RECUPERAR UM PRODUTO E UM ANTICORPO PURIFICADO DE UM FLUIDO DE CARREGAMENTO. Esta invenção refere-se aos métodos de uso de cromatografia de partição fraca para a purificação de um produto de um fluido de carregamento contendo uma ou mais impurezas. Em adição, a invenção refere-se aos métodos de cromatografia de partição fraca definidos pelas condições de operação que fazem com que um meio ligue pelo menos 1 mg de produto por ml de meio, ou alternativamente, definidos por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1.

Description

PI0608584-9

"MÉTODOS DE RECUPERAÇÃO DE UM PRODUTO PURIFICADO, DE UMA PROTEÍNA PURIFICADA E DE UM ANTICORPO PURIFICADO DE UM FLUIDO DE CARREGAMENTO INCLUINDO UMA OU MAIS IMPUREZAS, PRODUTO PURIFICADO, PROTEÍNA PURIFICADA, E, 5 ANTICORPO PURIFICADO"

Campo da invenção A invenção refere-se aos métodos de recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas. Em certas modalidades da invenção, os métodos compreendem passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio, e recuperar o produto purificado do meio no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática. Em outras modalidades da invenção, os métodos compreendempassar o carregamento através de um meio em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1.

Fundamentos da invenção Dentro da indústria de biotecnologia, a purificação de proteínas em uma escala comercial é um desafio importante para o desenvolvimento de proteínas recombinantes para propósitos terapêuticos e diagnósticos. Problemas relacionados com rendimento, pureza, e taxa de transferência incomodam o setor de manufatura. Com o advento de tecnologia de proteína recombinante, uma proteína de interesse pode ser produzida usando linhagens de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas engenhadas para expressarem um gene codificador da proteína. O que resulta do processo de cultua de célula hospedeira, contudo, é uma mistura da proteína desejada juntamente com impurezas que são quer derivadas da própria proteína, tais como variantes de proteína, quer da célula hospedeira, tais como as proteínas da célula hospedeira. O uso da proteína recombinante

PI0608584-9desejada em aplicações farmacêuticas é dependente da capacidade de recuperação segura de níveis adequados da proteína destas impurezas.

Métodos de purificação de proteína convencionais são projetados para separarem a proteína de interesse das impurezas baseado em 5 diferenças de tamanho, carga, solubilidade, e grau de hidrofobicidade. Tais métodos incluem métodos cromatográficos tais como cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade de metal imobilizado, e cromatografia de hidroxiapatita. Estes métodos muitas vezes empregam um meio de separação que pode ser projetado para seletivamente aderir quer a proteína de interesse quer as impurezas. No modo de ligação-eluição, a proteína desejada liga-se seletivamente no meio de separação e é diferentemente eluída do meio por solventes diferentes. No modo de fluxo transpassante, as impurezas especificamente se ligam no meio de separação enquanto que a proteína de interesse não, permitindo assim a recuperação da proteína desejada no "fluxo transpassante".

Métodos correntes para a purificação de proteínas, tais como anticorpos, incluem duas ou mais etapas cromatográficas. Por exemplo, a primeira etapa no protocolo de purificação de proteína muitas vezes envolve uma etapa de cromatografia de afinidade que utiliza uma interação específica entre a proteína e interesse e um reagente de captura imobilizado. Absorventes de Proteína A são particularmente úteis para a captura de afinidade de proteínas, tais como anticorpos, que contêm uma região Fc. Contudo, desvantagens do uso de cromatografia de Proteína A para a purificação de proteína incluem vazamento do agente de captura de Proteína A, acarretando contaminação do produto de proteína eluído. Adicionalmente, captura de afinidade não separa variantes de proteína, tais como formas agregadas da proteína, da proteína de interesse.

Pesquisadores têm usado os métodos de ligação-eluição,métodos de fluxo transpassante, e métodos de deslocamento em esforços pararecuperar proteínas livres de impurezas resultantes tanto do processo decultura e quanto das possíveis tapas anteriores no próprio processo depurificação. Exemplos de grupos usando uma etapa de ligação-eluição como uma típica segunda etapa para purificar proteínas após uma etapa de capturade afinidade incluem: Patente U.S. 4.983.722, descrevendo um método detroca iônica de ligação-eluição de reduzir Proteína A de uma mistura; PatenteU.S. 5.429.746, descrevendo um método de cromatografia de interaçãohidrofóbica de ligação-eluição para purificar anticorpo IgG de uma mistura incluindo impurezas de Proteína A; e Patente U.S. 5.644.036, descrevendo umprocesso de três etapas para obter uma preparação de anticorpo IgGpurificado compreendendo uma etapa de Proteína A, uma etapa de trocaiônica de ligação-eluição, e uma etapa de exclusão de tamanho. Outros grupostêm usado uma etapa de fluxo transpassante após a etapa de cromatografia de afinidade. Por exemplo, Publicação PCT de número WO 04/076485 descreveum método para remover Proteína A vazada de um anticorpo purificado poruma etapa de cromatografia de Proteína A seguida por uma etapa de trocaiônica de fluxo transpassante. Publicação PCT de número WO 03/059935descreve um método para purificar uma proteína em uma amostra compreendendo submeter a amostra a uma etapa de cromatografia dehidroxiapatita de fluxo transpassante após uma etapa de cromatografia deafinidade.

Outros grupos têm usado um esquema de purificação de únicaetapa de acabamento para se evitarem os problemas associados com as etapas de purificação anteriores. Por exemplo, Patente U.S. 6.177.548 descreve ummétodo de troca iônica de fluxo transpassante de etapa única para removeragregados de uma amostra biológica onde o pH da amostra é ajustado para 0,2logs abaixo do ponto isocrático da amostra biológica. Patente U.S. 5.451,662descreve um método de troca iônica de ligação-eluição de etapa única onde opH da mistura de proteína bruta é ajustado para um ponto entre as faixas depontos isoelétricos das frações de proteína a serem separadas. Publicação PCTde número WO 05/044856 descreve um método de deslocamento de etapaúnica para remoção de agregados de peso molecular alto de preparações de anticorpo usando cromatografia de hidroxiapatita.

Nenhum dos métodos convencionais de ligação-eluição ou defluxo transpassante na técnica anterior, contudo, é capaz de atender àsnecessidades da indústria de biotecnologia em termos de todos osrequerimentos de taxa de transferência, rendimento, e pureza de produto. Métodos de ligação-eluição e métodos de deslocamento são limitados, dentreoutros fatores, pelo limite de capacidade do meio de separação para a proteínadesejada. Os métodos de fluxo transpassante, por outro lado, permitemdesafios de carregamento maior do que os métodos de ligação-eluição massão limitados pela capacidade do meio de separação para as impurezas. Com os métodos de fluxo transpassante, não ocorre qualquer ligação substancial doproduto na coluna; qualquer ligação de produto substancial é vista comoinfluenciando negativamente a recuperação de produto. Ainda há umanecessidade de métodos de recuperação de proteínas purificadas em taxa detransferência alta que atendam aos requerimentos de pureza e de rendimento necessários para as aplicações terapêuticas e diagnosticas. Em adição,processos de manufatura comerciais adicionam as necessidades de esquemasde purificação confiáveis, robustos, e efetivos em termos de custo.

Sumário da invençãoA presente invenção refere-se aos métodos de recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou maisimpurezas pela passagem do fluido de carregamento através de um meio emcondições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg deproduto por mL de meio e recuperação do produto purificado no efluente dacoluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmenteisocrática. Em outras modalidades, as condições de operação fazem com queo meio ligue pelo menos 5 mg de produto por mL de meio. Em outramodalidade, as condições de operação fazem com que o meio ligue pelomenos 10 mg de produto por mL de meio. Em outras modalidades, as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 20, 30, 40,50, ou 60 mg de produto por mL de meio.

A presente invenção também se refere aos métodos derecuperação de um produto purificado de um fluido de carregamentoincluindo uma ou mais impurezas pela passagem do fluido de carregamentoatravés de um meio em condições de operação definida por um coeficiente departição de pelo menos 0,1 e recuperação do produto purificado no efluenteda coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmenteisocrática. Em uma modalidade, o coeficiente de partição está dentro da faixade cerca de 0,2 a cerca de 20,0. Em outra modalidade, o coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,2 a cerca de 10,0. Em outramodalidade, o coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 1,0 acerca de 5,0. Em outra modalidade, o coeficiente de partição está dentro dafaixa de cerca de 0,5 a cerca de 5,0. Em uma modalidade adicional, ocoeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 1,5. A presente invenção também se refere aos métodos de

recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamentoincluindo uma ou mais impurezas pela passagem do fluido de carregamentoatravés de um meio em condições de operação que fazem com que o meioligue pelo menos 1 a cerca de 70 mg de produto por mL e definidas por umcoeficiente de partição de 0,3 a 20, recuperação do produto purificado noefluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagemessencialmente isocrática.

A invenção também proporciona a identificação, em uma etapade triagem, das condições de operação que fazem com que o meio ligue pelomenos 1 mg de produto por mL de meio ou alternativamente, são definidaspor um coeficiente de partição de pelo menos 0,1. A etapa de triagem podeempregar estudos de ligação em batelada ou estudos de ligação em coluna,tais como estudos de eluição em gradiente ou estudos de eluição isocrática.

As condições de operação incluem níveis de pH, forçasiônicas, concentrações de sal, concentrações de excipiente (tais comoconcentrações de fosfato, concentrações de cálcio, concentrações de arginina,concentrações de glicina, e concentrações de HEPES), e níveis de contra-ligante (tais como concentrações de imidazol), dependendo da seleção domeio.

O meio pode ser qualquer tipo de meio de separação ou resinacromatográfica, tal como um meio de troca aniônica ou um meio de trocacatiônica, uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica, uma resinade hidroxiapatita, ou uma resina de cromatografia de afinidade de metalimobilizado.

Produtos purificados que podem ser purificados usando ainvenção incluem proteínas de fusão, proteína contendo Fc,imunoconjugados, citocinas, interleucinas, hormônios, e enzimas terapêuticas.

Impurezas que podem ser removidas usando a invençãoincluem proteínas de célula hospedeira, ácidos nucleicos, variantes deproduto, endotoxinas, Proteína A, e vírus.

Em uma modalidade, o meio remove pelo menos 99,9% dasimpurezas no fluido de carregamento incluindo proteínas de célulahospedeira, ácidos nucleicos, variantes de produto, endotoxinas, Proteína A.

Em outra modalidade, a concentração de variantes de produtono produto purificado é não maior do que cerca de 2%.

Em modalidades adicionais, o carregamento no meio pode serem um desafio de carregamento de pelo menos 500 mg ou de pelo menos1.000 mg de produto por mL de meio.Em um aspecto da invenção, um produto purificado érecuperado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezaspela passagem do fluido de carregamento através de um meio de troca iônicacarregado em condições de operação compreendendo níveis de pH e forças iônicas que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mLde meio ou alternativamente, em condições de operação definidas por umcoeficiente de partição de pelo menos 0,1.

Em outro aspecto da invenção, um produto purificado érecuperado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas pela passagem do fluido de carregamento através de uma resina decromatografia de interação hidrofóbica em condições de operaçãocompreendendo níveis de pH, forças iônicas, e concentrações de sal quefazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio oualternativamente, em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1.

Em outro aspecto da invenção, um produto purificado érecuperado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezaspela passagem do fluido de carregamento através de uma resina decromatografia de hidroxiapatita em condições de operação compreendendo níveis de pH, forças iônicas, concentrações de fosfato, concentrações decálcio, concentrações de arginina, concentrações de glicina, concentrações deHEPES, e concentrações de imidazol que fazem com que o meio ligue pelomenos 1 mg de produto por mL de meio ou alternativamente, em condiçõesde operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1.

Em outro aspecto da invenção, um produto purificado érecuperado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezaspela passagem do fluido de carregamento através de uma resina decromatografia de afinidade de metal imobilizado em condições de operaçãocompreendendo níveis de contra-ligante e níveis de pH que fazem com que omeio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio ou alternativamente,em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelomenos 0,1.

Os métodos da invenção podem ser opcionalmentecombinados com uma ou mais etapas de purificação. A(s) etapa(s)opcional(ais) pode(m) ser realizada(s) quer antes da quer após a prática dométodo da invenção. Por exemplo, os métodos da invenção podem seropcionalmente combinados com uma etapa de cromatografia de Proteína Acomo uma etapa inicial. Em uma modalidade da invenção, um fluido contendo produto

é eluído de uma coluna de Proteína A usando um tampão de eluição de forçaiônica baixa; o pH e a condutividade do fluido contendo produto são ajustadosusando um tampão de neutralização que resulta em não mais do que 200 mMda força iônica do fluido contendo produto, resultando no fluido de carregamento; a o fluido de carregamento é passado através de um meio detroca aniônica sob condições de operação da invenção.

Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreendemoléculas com um grupo catiônico carregado com um pKa de 6,5-10. Emoutras modalidades, o tampão de eluição adicionalmente compreende moléculas com um grupo aniônico carregado com um pKa de 2-5. Em certasmodalidades, o tampão de eluição compreende moléculas que são zwitteríonsem pHs entre 7 e 9.

A invenção também proporciona produtos purificados,incluindo proteínas purificadas e anticorpos purificados, preparados pelos métodos da invenção.

Objetivos e vantagens adicionais da invenção serão descritosem parte na descrição que segue, e em parte serão óbvios a partir dadescrição, ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os objetivos evantagens da invenção serão realizados e alcançados por meio dos elementose das combinações particularmente realçados nas reivindicações apendidas.

É para ser entendido que tanto a descrição geral acima quantoa descrição detalhada seguinte são apenas exemplares e explanatórias e nãosão restritivas da invenção, como reivindicada.Os desenhos acompanhantes, que são aqui incorporados e

constituem parte deste relatório descritivo, e juntos com a descrição, servempara explicar os princípios da invenção.

Breve descrição das figurasFigura 1 mostra (A) a relação entre um coeficiente de partição e uma isoterma de adsorção de produto; e (B) isotermas de adsorção paraligação de produto em resina, para três modos de operação: modo de ligação-eluição; modo de partição fraca, e modo de fluxo transpassante.

Figura 2 mostra (A) as regiões de partição para três modos deoperação em cromatografia de troca iônica: modo de ligação-eluição, modode partição fraca, e modo de fluxo transpassante; e (B) as regiões de partiçãopara três modos de operação em hidroxiapatita.

Figura 3 mostra cromatogramas esquemáticos para três modosde operação: modo de ligação-eluição, modo de partição fraca, e modo defluxo transpassante.Figura 4 mostra uma comparação entre cromatogramas de

partição fraca e de fluxo transpassante

Figura 5 mostra (A) perfil de remoção de contaminantes

típicos como uma função de Kp; e (B) recuperação como uma função de

desafio de carregamento e Kp.Figura 6 mostra progressão típica do desenvolvimento de etapa

de cromatografia de partição fraca, incluindo 1) triagem de taxa de

transferência alta para determinar Kp, 2) corridas de desafio de carregamento

baixo, 3) corridas de capacidade de desafio alto, e 4) corridas de

cromatografia de partição fraca ótima.Figura 7 mostra uma plotagem de contorno de Kp versus pH ea concentrações de cloreto total do conjunto de dados de concentração baixa,como descrito em Experimento 1.1.

Figura 8 mostra remoção de Proteína A como uma função docoeficiente de partição, Kp, como descrito em Experimento 1.1. O log devalor de remoção aumenta com Kp. Modo de fluxo transpassante é indicadopelo retângulo tracejado com "FT", enquanto que o modo de partição fraca éindicado por retângulo tracejado com "WP".

Figura 9 mostra uma plotagem de contorno de logi0Kp versuspH e o log da concentração de cloreto total, como descrito em Experimento2.1.

Figura 10 mostra (A) para Mab-AAB, perfis de aparecimentode proteína de célula hospedeira como uma função de Kp em cromatografiade troca iônica; e (B) para Mab-AAB, aparecimento de Proteína A como umafunção de Kp em cromatografia de troca iônica.

Figura 11 mostra para Mab-MYA, a janela de operação ótimapara cromatografia de partição fraca em hidroxiapatita. O Kp ótimo nesteexemplo está entre 1,5 e 20.

Figura 12 mostra para Mab-A5T4, a janela de operação ótimapara cromatografia de partição fraca em hidroxiapatita. O Kp ótimo nesteexemplo está entre 2 e 20.

Figura 13 mostra para Mab-MYO, a janela de operação ótimapara cromatografia de partição fraca em hidroxiapatita. O Kp ótimo nesteexemplo está entre 5 e 20.

Descrição detalhada da invenção

A. Definições

Com o objetivo de que a presente invenção possa ser maisprontamente entendida, certos termos são primeiro definidos. Definiçõesadicionais são descritas em toda a descrição detalhada.O termo "modo de fluxo transpassante" refere-se a umatécnica de separação de produto na qual pelo menos um produto contido napreparação é intencionado para fluir através de um meio ou de uma resinacromatográfica, enquanto que pelo menos uma impureza ou um contaminantepotencial se liga no meio ou na resina cromatográfica. Geralmente, ocoeficiente de partição de produto para o modo de fluxo transpassante émenor do que 0,1 e a concentração de produto ligado é < 1 mg/mL. O "modode fluxo transpassante" é uma operação isocrática.

O termo "modo de ligação-eluição" refere-se a uma técnica deseparação de preparação de produto na qual pelo menos um produto contidona preparação se liga em um meio ou uma resina cromatográfica. Geralmente,o coeficiente de partição de produto para o modo de ligação-eluição é maiordo que 20 e as concentrações de produto ligado estão entre 1 e 20 mg/mL. Oproduto ligado neste modo é eluído durante a fase de eluição.

O termo "modo de partição fraca" refere-se a uma técnica deseparação de preparação de produto na qual pelo menos um produto contidona preparação, e pelo menos um contaminante ou uma impureza, ambos seligam em um meio ou uma resina cromatográfica. A ligação de produto emmodo de partição fraca é pelo menos 1 mg de produto por mL de meio ouresina cromatográfica. Geralmente, o coeficiente de partição de produto paramodo de partição fraca é pelo menos 0,1.0 "modo de partição fraca" é umaoperação isocrática.

O termo "coeficiente de partição" (Kp) refere-se à razão deequilíbrio da concentração de produto absorvido na resina (Q) para a

25 concentração de produto na solução (c), sob condições especificadas de pH ede concentração de solução. O coeficiente de partição Kp também estárelacionado com as isotermas de adsorção de produto como mostrado naFigura 1. O coeficiente de partição Kp corresponde à inclinação da isotermade adsorção de produto em concentrações de solução muito baixas. Estárelacionado com a capacidade máxima como segue:<formula>formula see original document page 13</formula>

onde Qmax é a capacidade máxima da resina para o produto, ekd é a constante de dissociação para interação de 'resina-produto'. Ocoeficiente de partição é tipicamente medido com uma técnica de ligação em batelada, mas outras técnicas, tal como cromatografia isocrática, podem serusadas.

O termo "produto ligado" (Q) refere-se à quantidade deproduto que se liga na resina quando em equilíbrio com uma corrente dealimentação.

O termo "anticorpo" refere-se a qualquer imunoglobulina ouseu fragmento, e inclui qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio deligação de antígeno. O termo inclui, mas não é limitado a, anticorpospoliclonais, monoclonais, monoespecíficos, poliespecíficos, não-específicos,humanizados, de humano, de cadeia única, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, enxertados, e gerados in vitro. O termo"anticorpo" também inclui fragmentos de anticorpo tais como Fab, F(ab')2,Fv, scFv, dAb, e outros fragmentos de anticorpo que retêm a função deligação de antígeno. Tipicamente, tais fragmentos compreenderiam umdomínio de ligação de antígeno.

Em certas modalidades da invenção, o anticorpo é um quecompreende uma região Ch2/Ch3 e portanto é sujeitável à purificação porcromatografia de Proteína A. O termo "região Ch2/Ch3" refere-se àquelesresíduos de aminoácido na região Fc de uma molécula de imunoglobulina queinterage com a Proteína A. Em algumas modalidades, a região Ch2/Ch3 compreende uma região CH2 intacta seguida por uma região CH3 intacta, e emoutras modalidades, compreende uma região Fc de uma imunoglobulina.Exemplos de proteínas contendo região CH2/CH3 incluem anticorpos,imunoadesões e proteínas de fusão compreendendo uma proteína de interesserusionada em, ou conjugada com, uma região CH2/CH3.

O termo "carregamento" refere-se a qualquer material decarregamento contendo o produto, quer derivado de cultura celular clarificadaou de meio condicionado de fermentação, quer de um intermediárioparcialmente purificado derivado de uma etapa de cromatografia. O termo"fluido de carregamento" refere-se a um líquido contendo o material decarregamento, passando através de um meio sob as condições de operação dainvenção.

O termo "impureza" refere-se a qualquer molécula estranha ou objetável, incluindo uma macromolécula biológica tal como um DNA, umRNA, ou uma proteína, diferente da proteína de interesse sendo purificadaque também está presente em uma amostra da proteína de interesse sendopurificada. Impurezas incluem, por exemplo, variantes de proteína, tais comoproteínas agregadas, espécies de peso molecular alto, espécies de pesomolecular baixo e fragmentos, e espécies desamidadas; outras proteínas dascélulas hospedeiras que secretam a proteína sendo purificada (proteínas decélula hospedeira); proteínas que são parte de um absorvente usado emcromatografia de afinidade que podem vazar para dentro de uma amostradurante as etapas de purificação, tal como Proteína A; endotoxinas; e vírus. O termo "lavagem essencialmente isocrática" refere-se a uma

solução que varia apenas ligeiramente do fluido de carregamento em termosde composição e pH.

O termo "efluente da coluna" refere-se ao líquido saindo domeio ou da coluna durante o ciclo de carregamento, ou no período que o carregamento está sendo aplicado.

O termo "desafio de carregamento" refere-se à massa total deproduto carregada na coluna no ciclo de carregamento de uma etapa decromatografia ou aplicada na resina em ligação em batelada, medida emtermos de massa de produto por volume unitário de resina.O termo "log de valor de remoção" (LRV) refere-se aolog(base 10) da razão da massa de impureza no carregamento de uma etapa depurificação para a massa de impureza na reunião de produto.

O termo "cromatografia isocrática" refere-se à operação de uma coluna cromatográfica com um solvente que não muda a concentraçãodurante o período de interesse.B. Descrição do método

A presente invenção proporciona métodos para recuperação deprodutos purificados de um fluido de carregamento contendo uma ou mais impurezas. A invenção possui aplicação em preparação em grande escala deproteínas para propósitos terapêuticos e diagnósticos.1. Modo de partição fraca

Requerentes têm verificado de modo surpreendente que pelaoperação em um modo cromatográfico residindo na região entre os modos15 cromatográficos de ligação-eluição e de fluxo transpassante, um grau alto deredução de impureza, bem como desafio de carregamento de produto alto erecuperação de produto alta, podem ser obtidos. Requerentes têm nomeadoeste modo de ligação de produto intermediário, como o "modo de partiçãofraca".No modo de partição fraca, um fluido de carregamento

contendo um produto de interesse e uma ou mais impurezas é passado atravésde um meio cromatográfico, com ambos o produto e as impurezas se ligandono meio. Contudo, as impurezas se ligam mais fortemente no meio do que oproduto e à medida que o carregamento continua, produto não ligado passa através do meio e é recuperado do efluente da coluna. O meio éopcionalmente subseqüentemente lavado sob condições isocráticas pararecuperar produto fracamente ligado adicional do meio e o produto purificadode qualquer lavagem essencialmente isocrática é reunido com o produtopurificado do efluente da coluna durante o ciclo de carregamento.De acordo com a invenção, o modo de partição fraca édefinido pelas condições de operação que fazem com que o meio ligue pelomenos 1 mg de produto por mL de meio. Em uma modalidade, as condiçõesde operação fazem com que o meio ligue pelo menos 5 mg de produto por mLde meio. Em outra modalidade, as condições de operação fazem com que omeio ligue pelo menos 10 mg de produto por mL de meio. Em outramodalidade, as condições de operação fazem com que o meio ligue pelomenos 20 mg de produto por mL de meio.

Em certas modalidades da invenção, a massa de produto totalligada no meio é pelo menos 10% da massa de produto total carregada nomeio. Em algumas modalidades da invenção, a massa de produto total ligadano meio é pelo menos 20% da massa de produto total carregada no meio. Emoutras modalidades da invenção, a massa de produto total ligada no meio épelo menos 30% da massa de produto total carregada no meio.

De acordo com a invenção, o modo de partição fraca é tambémdefinido por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1. Em algumasmodalidades, operação em modo de partição fraca compreende operação sobcondições definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 0,2a cerca de 20,0. Em algumas modalidades, operação em modo de partição fracacompreende operação sob condições definidas por um coeficiente de partiçãodentro da faixa de cerca de 0,2 a cerca de 10,0. Em outras modalidades, operaçãoem modo de partição fraca compreende operação sob condições definidas por umcoeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 1,0 a cerca de 5,0. Em outrasmodalidades, operação em modo de partição fraca compreende operação sobcondições definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa de cerca de0,5 a cerca de 5,0. Em ainda outras modalidades, operação em modo departição fraca compreende operação sob condições definidas por umcoeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 1,5.

Pelo menos uma modalidade da presente invenção proporcionacondições de operação de modo de partição fraca que fazem com que o meioligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de produto por mL de meio, e que sãodefinidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20.

Figura 1 mostra as isotermas de adsorção de produto para osmodos de ligação-eluição, fluxo transpassante, e de partição fraca, comligação de produto para modo de partição fraca sendo claramenteintermediária em comparação com os modos de ligação-eluição e de fluxotranspassante. Devido ao fato de o valor de coeficiente de partição de produto(Kp) ser a razão da concentração de produto adsorvido para a concentração de produto em solução, os valores de Kp para o modo de partição fraca tambémsão os valores para os modos de ligação-eluição e de fluxo transpassante.

Figura 2A mostra as regiões de partição para os modos deligação-eluição, de partição fraca, e de fluxo transpassante como uma funçãoda força iônica, mostrando que Kimp é maior em modo de partição fraca doque em modo de fluxo transpassante. Sob condições de ligação maisestringentes do modo de partição fraca, uma capacidade de produto maiorpode ser alcançada - maior do que o modo de fluxo transpassante, porque asimpurezas são mais fortemente ligadas, e maior do que o modo de ligação-eluição, porque o produto se liga muito fracamente em comparação com as impurezas e não aproveita da maior parte da capacidade da resina. Ocoeficiente de partição de impureza (Kjmp) é maior nas condições de ligaçãomais estringentes, resultando em concentrações menores de impurezasresiduais na reunião de produto de modo de partição fraca comparado com areunião de produto do modo de fluxo transpassante. As regiões de fluxo transpassante, de partição fraca e de ligação-eluição em hidroxiapatita, comouma função de concentração de fosfato e de NaCl, são mostradas na Figura 2B.

Tabela A sumaria as diferenças em características entre os trêsmodos de ligação: ligação-eluição (B-E), partição fraca (WP), e fluxotranspassante (FT).Tabela A: Características de modos FTAVP/B-E<table>table see original document page 18</column></row><table>Modo de partição fraca também pode ser distinguido dos

modos de ligação-eluição e de fluxo transpassante por seus cromatogramas,como mostrado na Figura 3. Primeiro, os cromatogramas dos modos de fluxotranspassante e de partição fraca podem se parecer bastante similares - oproduto é recuperado no efluente da coluna e nas frações de lavagem, sobcondições isocráticas. Contudo, há distinções sutis mas significativas noscromatogramas que podem ser usadas para distinguir estes modos, comomostrado na Figura 4. Há um atraso no perfil de aparecimento inicial (> 0,1volume de coluna ou CV) para o modo de partição fraca comparado com omodo de fluxo transpassante. Há um perfil de lavagem mais lento no modo departição fraca. Um pico de extração pequeno contendo produto pode estarpresente (que corresponde à resina ainda ligando 10-50% da concentração deproduto de carregamento após o estágio de lavagem), que pode ser recuperadoda resina por aplicação de 1-5 CV após o carregamento sob condiçõesisocráticas subseqüente à recuperação, do efluente de coluna durante o ciclode carregamento.

Figura 5A mostra as tendências gerais em LRV decontaminante para vários níveis de valores de coeficiente de partição deproduto. LRVs de contaminante são relativamente baixos em condições de Kpcorrespondendo às operações de fluxo transpassante. Operação sob condiçõesde aumento de Kp aumenta significativamente LRVs nas frações de efluenteda coluna antes do aparecimento do contaminante. Como mostrado nosexemplos, operação em valores de Kp maiores melhora os LRVs de contaminante em tanto quanto 2 logs daqueles correspondentes às condiçõesde fluxo transpassante padrão.

Kp crescente tipicamente aumenta a ligação na resina deambos o produto e o contaminante. A ligação mais forte do contaminante emKp maior acarreta um LRV mais alto nas frações de efluente da coluna antes do aparecimento do contaminante. Contudo, o desafio de carregamento noponto da aparecimento de contaminante diminui com o Kp crescente porque oproduto começa a competir com o contaminante pelos sítios de ligação sobrea resina, como representado esquematicamente na Figura 5A pela curva de Kpalto. A região de partição fraca portanto corresponde a uma janela de operação que equilibra a melhoria em LRV de contaminante com osrequerimentos de capacidade da coluna para uma separação dada.

O limite superior de Kp para cromatografia de partição fracatambém é dependente do desafio de carregamento da coluna como mostradoem Figura 5B. O coeficiente de partição não tem impacto sobre a recuperaçãode produto em valores margeando as condições de fluxo transpassante. Arecuperação de produto começa a cair em valores de Kp altos onde ascondições de lavagem isocrática não são efetivas na lavagem do produtoligado da coluna em um número razoável de volumes de lavagem. A extensãode perda de produto devido à lavagem ineficiente é sensível ao desafio decarregamento, bem como à natureza e à proporção de contaminante nocarregamento. Assim, o limite inferior da região WP é definido pelosrequerimentos de remoção de contaminante, enquanto que o limite superiorpara um dado desafio de carregamento é definido pelas restrições decapacidade ou recuperação de produto.

Em uma ou mais modalidades da invenção, condições departição fraca ótimas podem ser identificadas usando a seguinte seqüência deexperimentos, como mostrada na Figura 6:

(i) Realizar uma triagem de HTS (ou experimentos de ligaçãoem batelada padrão) para determinar os coeficientes de partição de produto

Kp como uma função de condições de operação. Janela de operação deidentidade correspondendo à região de partição fraca (0,1 < Kp < 20) destesexperimentos.

(ii) Preferivelmente, após identificação da região de partiçãofraca, pode-se realizar corridas de observação em uma coluna de escala

pequena em um desafio de carregamento similar àqueles usados para aoperação de fluxo transpassante padrão (aproximadamente 50 mg/mL). Pode-se adicionalmente ajustar finamente a janela de operação de partição fracabaseado em valores de recuperação de produto e de remoção de contaminantedestes experimentos.

(iii) Mais preferivelmente, pode-se então gerar dados deaparecimento de contaminante para umas poucas condições de Kp dentro daregião de partição fraca. Baseado nestes resultados, seleciona-se o coeficientede partição ótimo na região de partição fraca que proporciona a remoção maisalta de contaminantes em um desafio de carregamento aceitável.

(iv) Pode-se então mais preferivelmente realizar corridas decromatografia de partição fraca sob condições de Kp ótimas e adicionalmenteajustar finamente o desafio de carregamento e os volumes de lavagemconforme a necessidade para se obterem ótimas remoção de contaminante erecuperação.

Uma pessoa experiente na técnica poderia usar estas diretrizesou uma sua variação para facilmente definir uma etapa de cromatografia departição fraca que proporciona remoção de contaminante intensificada emdesafios de carregamento comparáveis ou maiores do que os dos modospadrão de fluxo transpassante ou ligação-eluição da operação da coluna. Osistema geral discutido acima pode, com ajustes menores se houver, seraplicado para desenvolver uma etapa de purificação em um sistema de trocaiônica, de interação hidrofóbica, de hidroxiapatita, ou de multi-modos que combina elementos de qualquer uma das ou de todas estas interações.

2. Técnicas de separação

Modo de partição fraca pode ser usado conjuntamente comqualquer meio ou resina cromatográfica para separação de um produto dasimpurezas. Em uma modalidade, o meio é um meio de troca iônica carregado. Troca iônica é uma forma de cromatografia que separa de acordo com a cargaefetiva. Separação de moléculas ocorre como um resultado da competiçãoentre o produto carregado de interesse e os contra-íons por grupos ligantesopostamente carregados sobre o meio de troca iônica. Interações de ligaçãoentre o produto e o meio de troca iônica dependem da carga efetiva doproduto. Carga efetiva é dependente do pH e da força iônica do meio, queafeta as características de carga diferentes de aminoácidos e de outroscomponentes sobre a superfície exposta da(s) molécula(s) de produto deinteresse.

Resinas de troca iônica que podem ser usadas na invençãoincluem resinas de troca aniônica e resinas de troca catiônica. Resinas detroca aniônica podem empregar substituintes tais como grupos dietil-amino-etila (DEAE), trimetil-amino-etila (TMAE), amino-etila quaternário (QAE) eamina quaternária (Q). Troca catiônica pode empregar substituintes tais comocarbóxi-metila (CM), sulfo-etila (SE), sulfo-propila (SP), fosfato (P) esulfonato (S). Resinas de troca iônica celulósicas tais como DE23, DE32,DE52, CM-23, CM-32 e CM-52 estão comercialmente disponíveis naWhatman Ltd. Maidstone, Kent, U.K. trocadores de íons reticulados ebaseados em Sephadex também são conhecidos. Por exemplo, DEAE-, QAE-,CM-, e SP-Sephadex, e DEAE-, Q-, CM- e S-Sepharose, e Sepharose estãotodas disponíveis na Amersham Biosciences, Piscataway, NJ. Em adição,copolímeros de etileno-glicol-metacrilato derivados tanto com DEAE quantocom CM tais como TOYOPEARL™ DEAE-650S ou M e TOYOPEARL™CM-650S ou M estão disponíveis na Toso Haas Co., Philadelphia, PA.

Em certas modalidades da invenção, modo de partição fraca éusado com uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) parapurificação de produto. HIC é uma técnica para separar moléculas baseada emhidrofobicidade. Geralmente, moléculas da amostra em um tampão alto emsal são carregadas na resina de HIC. O sal no tampão interage com asmoléculas de água para reduzir a solvatação das moléculas em solução,expondo deste modo regiões hidrofóbicas nas moléculas de amostra que sãoconseqüentemente absorvidas pelo meio de HIC. Quanto mais hidrofóbica amolécula, menos sal será necessário para promover a ligação. Interações deligação entre as moléculas de produto e um meio de HIC portanto dependemde condições tais como pH, força iônica, e concentrações de sal do meio.

Várias resinas de HIC comercialmente disponíveis que podemser usadas na invenção incluem resinas compreendendo uma matriz de base(e.g., material de copolímero sintético ou agarose reticulada) na qual liganteshidrofóbicos (e.g., grupos alquila ou arila) estão copulados. Exemplosincluem e Phenyl SEPHAROSE™ 6 FAST FLOW™ (Pharmacia LKBBiotechnology, AB, Suécia); Phenyl SEPHAROSE™ High Performance(Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); Octyl SEPHAROSE™ HighPerformance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); Fractogel™EMD Propyl ou FRACTOGEL™ EMD Phenyl (E. Merck, Alemanha);MACRO-PREPTM Methyl ou MACRO-PREPTM t-Butyl Supports (Bio-Rad, CA); WP Hl-Propyl (C3)TM (J. T. Baker, NJ); e TOYOPEARL™ ether,phenyl ou butyl (TosoHaas, PA).

Em outras modalidades da invenção, o modo de partição fraca é usado com cromatografia de hidroxiapatita para purificação de produto.Cromatografia de hidroxiapatita é uma técnica que utiliza um fosfato decálcio hidroxilado insolúvel de fórmula [Cai0(PO4)6(OH)2], tanto como amatriz quanto como o ligante. Grupos funcionais consistem de íons cálciopositivamente carregados (sítios-C) e agrupamentos de grupos fosfatonegativamente carregados (sítios-P). Interações de ligação entre o produto e omeio de hidroxiapatita dependem de condições tais como o pH, a força iônica,e as concentrações de excipiente, tais como concentrações de fosfato,concentrações de cálcio, concentrações de arginina, concentrações de glicina,e concentrações de HEPES do meio. Várias resinas cromatográficas dehidroxiapatita estão comercialmente disponíveis e podem ser usadas nainvenção.

Em outras modalidades da invenção, o modo de partição fracaé usado com uma resina de cromatografia de afinidade de metal imobilizado(IMAC) para purificação de produto. IMAC é baseado na interação entre os íons de metal de transição quelados imobilizados sobre a resina e as cadeiaslaterais de imidazol de resíduos de histidina sobre o produto selecionado deinteresse. Separação das moléculas ocorre como um resultado de competição entreo produto selecionado de interesse e os contra-ligantes para grupos metal sobre aresina de IMAC. Interações de ligação entre o produto e o meio de IMAC carregado de metal dependem de condições tais como níveis de contra-ligante, taiscomo concentrações de imidazol, e força iônica do meio. Várias resinas de IMACestão comercialmente disponíveis e podem ser usadas na invenção.3. Produtos de purificação

A invenção pode ser usada para a purificação em escalacomercial de vários produtos de interesse, incluindo proteínas naturalmenteocorrentes, proteínas de fusão, proteínas contendo Fc, imunoconjugados,citocinas, interleucinas, hormônios, e enzimas terapêuticas. Em umamodalidade, a proteína sofrendo purificação pode compreender um ou maisdomínios de imunoglobulina de anticorpo constantes. Em uma modalidade, aproteína também pode compreender um único ou múltiplos domínio(s)variável(eis) de imunoglobulina de anticorpo. Em outra modalidade, aproteína contendo Fc pode compreender um anticorpo. As proteínas podemser derivadas de várias fontes, incluindo linhagens de células hospedeirasprocarióticas ou eucarióticas recombinantes cultivadas.

As preparações de anticorpo da invenção podem ser isoladasde numerosas fontes incluindo, mas não limitadas a, soro de animaisimunizados, fluido de ascite, sobrenadantes de mieloma ou de hibridoma,meios condicionados derivados de cultura de uma linhagem de célula recombinante que expressa a molécula de anticorpo e de todos os extratoscelulares de células produtoras de anticorpo. Em uma modalidade dainvenção, são purificados anticorpos de meio de cultura de célulacondicionada de uma variedade de linhagens de células recombinantesprodutoras de anticorpo. Embora possa-se esperar alguma variação de

linhagem celular para linhagem celular e dentre os vários produtos deanticorpo, baseado na descrição aqui, está bem dentro da competência de umapessoa ordinariamente experiente na técnica adaptar a invenção aqui a umacombinação particular de proteína de anticorpo e linhagem de célulaprodutora. Para apenas propósitos de ilustração, esta invenção foi

aplicada para a purificação de vários anticorpos do isótipo IgG. Maisespecificamente, esta invenção foi aplicada para a purificação de umanticorpo monoclonal beta anti-A, humanizado, um anticorpo anti-GDF8, eum anticorpo monoclonal anti-IL-3, humanizado.4. Condições de carregamento e capacidades

Antes do carregamento do fluido contendo o produto e asimpurezas no meio, pode ser necessário identificar a região de partição fracapela descoberta das condições operacionais que fazem com que o meio liguepelo menos 1 mg de produto por mL de meio. Em uma modalidade, ascondições de operação encontradas fazem com que o meio ligue pelo menos 5mg de produto por mL de meio. Em outra modalidade, as condições deoperação encontradas fazem com que o meio ligue pelo menos 10 mg deproduto por mL de meio. Em outras modalidades, as condições de operaçãoencontradas fazem com que o meio ligue pelo menos 20 mg de produto pormL de meio. Alternativamente, a região de partição fraca é identificada peladescoberta das condições de operação definidas por um coeficiente departição de pelo menos 0,1. Em certas modalidades, as condições de operaçãodescobertas são definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa decerca de 0,2 a cerca de 20,0. Em outras modalidades, as condições deoperação descobertas são definidas por um coeficiente de partição dentro dafaixa de cerca de 0,2 a cerca de 10,0. Em ainda outras modalidades, ascondições de operação descobertas são definidas por um coeficiente departição dentro da faixa de cerca de 1,0 a cerca de 5,0, dentro da faixa decerca de 0,5 a cerca de 5,0, ou dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 1,5.Em modalidades adicionais, a região de partição é identificada peladescoberta de condições de operação que fazem com que o meio ligue pelomenos 1 a cerca de 70 mg de produto por mL de meio, e que é definida porum coeficiente de partição de 0,3 a 20.

Uma pessoa experiente na técnica reconhecerá que ascondições de operação adequadas dependerão da escolha do meio selecionadopara a purificação de produto. Em certas modalidades, as condições deoperação compreendem níveis de pH e forças iônicas. Em outrasmodalidades, as condições de operação compreendem adicionalmenteconcentrações de sal. Em ainda outras modalidades, as condições de operaçãocompreendem adicionalmente níveis de excipiente, tais como concentraçõesde fosfato e concentrações de cálcio. Em algumas modalidades, as condiçõesde operação compreendem níveis de contra-ligante, tais como concentraçõesde imidazol, e níveis de pH.

Uma etapa de triagem pode ser usada para identificar ascondições de operação para modo de partição fraca. Uma tal etapa de triagempoderia incluir estudos de ligação em batelada ou estudos de ligação emcoluna. Estudos de ligação em coluna poderiam incluir estudos de eluição em gradiente ou estudos de eluição isocrática. Por exemplo, uma pessoaexperiente na técnica pode determinar qual tampão ou sal é apropriado para aproteína particular sendo purificada e para as condições de operação que estãosendo identificadas. A concentração ótima do tampão ou sal selecionado podeser então determinada, por exemplo, por corrida de um gradiente de tampãoou sal selecionado através de uma coluna à qual tem sido aplicado um fluidode carregamento compreendendo o produto a ser purificado e as impurezas.Frações do efluente da coluna podem ser coletadas e analisadas paradeterminar a concentração de tampão ou sal na qual a ligação de produto é depelo menos 1 mg de produto por mL de meio ou alternativamente, na qual ocoeficiente de partição para o produto é de pelo menos 0,1. Em certasmodalidades da invenção, o coeficiente de partição é medido entre 1 e 10mg/mL de desafio de carregamento com uma razão de fases (volume delíquido para volume de resina) de três a seis em um experimento de ligaçãoem batelada.Uma vez determinada as condições de operação, as condições

do meio e/ou fluido de carregamento podem ser conseqüentemente ajustadas.Por exemplo, o meio pode ser equilibrado por sua lavagem com uma soluçãoque o trará para as condições de operação necessárias de modo de partiçãofraca. O fluido de carregamento também pode ser tampão trocado por umtampão apropriado ou tampão de carregamento na preparação para o modo departição fraca. O tampão de carregamento pode ser um tampão igual ou umtampão diferente do tampão de equilíbrio.

Em uma modalidade, a força iônica do fluido de carregamento é não maior do que 100 mM. Em outra modalidade, a força iônica do fluidode carregamento é não maior do que 50 mM. Em outra modalidade, a forçaiônica do fluido de carregamento é não maior do que 25 mM, Em ainda outramodalidade, a força iônica do fluido de carregamento é não maior do que 10mM.

O fluido de carregamento pode ser passado através de ummeio de separação que está empacotado dentro de uma coluna de leito,empacotado dentro de uma coluna de leito expandido / fluidizado contendo amatriz de fase sólida, e/ou em um formato em batelada onde a matriz de fasesólida é misturada com o fluido de carregamento por um certo tempo. Após o fluido de carregamento ter sido passado através do meio, o meio éopcionalmente lavado com um volume de lavagem essencialmente isocrática.O produto purificado pode ser obtido de qualquer lavagem essencialmenteisocrática e reunido com o produto purificado do efluente da coluna durante ociclo de carregamento. Após a etapa de lavagem opcional, o meio pode ser opcionalmente extraído e regenerado. Este procedimento é tipicamenterealizado regularmente para minimizar o acúmulo de impurezas sobre asuperfície da fase sólida e/ou para esterilizar o meio para evitar acontaminação do produto com microorganismos.

Concentrações de carregamento altas e volumes de carregamento altos são possíveis com o modo de partição fraca. Em umamodalidade, a concentração de produto no fluido de carregamento é de pelomenos 1 mg de produto por mL de fluido de carregamento, em outramodalidade, a concentração de produto no fluido de carregamento é de pelomenos 5 mg de produto por mL de fluido de carregamento, em outramodalidade, de pelo menos 50 mg de produto por mL de fluido decarregamento, e em outra modalidade, de pelo menos 100 mg de produto pormL de fluido de carregamento. Produto purificado pode ser recuperado de até50 CVs de fluido de carregamento passado através do meio.Desafios de carregamento altos também são possíveis com o

modo de partição fraca. Em uma modalidade, o carregamento no meio podeser de um desafio de carregamento de pelo menos 10 mg de produto por mLde meio. Em outra modalidade, o carregamento de produto no meio é de pelomenos 50 mg de produto por mL de meio. Em certas modalidades, ocarregamento de produto no meio é de pelo menos 100 mg de produto por mLde meio. Em outras modalidades, o carregamento de produto no meio é depelo menos 500 mg de produto por mL de meio. Em ainda outrasmodalidades, o carregamento de produto no meio é de pelo menos 1.000 mgde produto por mL de meio.

5. Remoção de impurezas

Tem sido mostrado que o modo de partição fraca é útil pararemover todos os tipos de impurezas de preparações de produto, incluindoproteínas de célula hospedeira, ácidos nucleicos, variantes de produto,incluindo produto agregado e espécies de peso molecular alto, endotoxinas, vírus, e contaminantes de Proteína A de etapas de purificação anteriores.

Em uma modalidade da invenção, a concentração de proteínasde célula hospedeira presentes no produto purificado é não maior do que cercade 500 ng de proteínas de célula hospedeira por mg de produto. Em outrasmodalidades, a concentração de proteínas de célula hospedeira pode ser reduzida para não mais do que 250 ng por mg de produto, e em outrasmodalidades, para não mais do que 100 ng por mg de produto. Em certasmodalidades, o log do valor de remoção de proteínas de célula hospedeira épelo menos 1,0, em outras modalidades, o log do valor de remoção deproteínas de célula hospedeira é pelo menos 2,0, e em outras modalidades, olog do valor de remoção de proteínas de célula hospedeira é pelo menos 3,0.

Em uma modalidade da invenção, a concentração de ProteínaA presente no produto purificado é não maior do que cerca de 500 ng deProteína A por mg de produto. Em algumas modalidades, a concentração deProteína A pode ser reduzida para não mais do que 50 ng por mg de produto,e em outras modalidades, para não mais do que 10 ng por mg de produto. Emcertas modalidades, o log do valor de remoção de Proteína A é pelo menos1,0, em outras modalidades, o log do valor de remoção de Proteína A é pelomenos 2,0, e em outras modalidades, o log do valor de remoção de Proteína Aé pelo menos 3,0.

Em uma modalidade da invenção, impurezas virais sãoremovidas do produto purificado. Em certas modalidades, o log de valor deremoção de vírus é maior do que 1,0, em outras modalidades, maior do que2,0, e em outras modalidades, maior do que 3,0.

Em algumas modalidades da invenção, impurezas de ácidonucleico codificador são removidas do produto purificado. Em certasmodalidades, a quantidade de ácido nucleico presente no produto purificadopode ser reduzida para não mais do que 1 ng de ácidos nucleicos por mg deproduto.

Em modalidades adicionais, a concentração de variantes deproteína no produto purificado é não maior do que cerca de 10%. Em algumasmodalidades, a concentração de variantes de proteína pode ser reduzida paranão mais do que cerca de 5%, em algumas modalidades, para não mais do que2%, e em algumas modalidades, para não maior do que 0,5%.

Sob as condições de ligação estringentes do modo de partiçãofraca, o meio de separação remove pelo menos 90% de proteína de célulahospedeira, de ácido nucleico, de variante de proteína, e de endotoxina, deimpurezas de Proteína A. Em algumas modalidades, o meio remove pelomenos 99% das impurezas, e em outras modalidades, o meio remove pelomenos 99,9% das impurezas.

6. Etapas opcionais adicionais

O método de purificação da invenção pode ser usado emcombinação com outras etapas de purificação de proteína. Em uma modalidade da invenção, uma ou mais etapas precedendo a etapa de partiçãofraca podem ser desejáveis para reduzir o desafio de carregamento. Em outramodalidade da invenção, uma ou mais etapas de purificação após a etapa departição fraca podem ser desejáveis para remover as impurezas ou oscontaminantes adicionais. O procedimento de purificação de partição fraca descrito pode

ser opcionalmente combinado com outras etapas de purificação, incluindomas não limitadas a, cromatografia de Proteína A, cromatografia de afinidade,cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade de metalimobilizado, cromatografia de exclusão de tamanho, diafiltração, ultrafiltração, filtração de remoção viral, e/ou cromatografia de troca iônica.As etapas de purificação opcionais precedendo e/ou posteriores à etapa departição fraca também podem ser operadas no modo de partição fraca, ou emoutros modos, tais como o modo de ligação-eluição ou o modo de fluxotranspassante. Em uma modalidade, antes da etapa de purificação de partição

fraca, o meio de colheita pode ser opcionalmente inicialmente purificado poruma etapa de cromatografia de Proteína A. Por exemplo, pode ser empregadoPROSEP-A™ (Millipore, U.K.),: que consiste de Proteína A covalentementecopulada em vidro de porosidade controlada. Outras formulações de ProteínaA úteis incluem as colunas Protein A Sepharose FAST FLOW™ (AmershamBiosciences, Piscataway, NJ), TOYOPEARL™ 650M Protein A (TosoHaasCo., Philadelphia, PA), e MABSELECT™ (Amersham Biosciences,Piscataway, NJ).

7. Tampões zwitteriônicos usados em tandem com cromatografia deProteína A e cromatografia de troca iônica

Em certas modalidades, um fluido contendo produto é eluídode uma coluna de Proteína A usando um tampão de eluição de força iônicabaixa. O pH e a condutividade do fluido contendo produto são então ajustados usando um tampão de neutralização, que resulta em não mais do que 20 mMde força iônica do fluido contendo produto. O fluido de carregamentoresultante é então passado através de um meio de troca aniônica ou meio dehidroxiapatita sob condições de modo de partição fraca. Em certasmodalidades, o pH e a condutividade do fluido contendo produto sãoajustados usando um tampão de neutralização que resulta em não mais do que40 mM de força iônica do fluido contendo produto. Em outras modalidades, opH e a condutividade do fluido contendo produto são ajustados usando umtampão de neutralização que resulta em não mais do que 60 mM de forçaiônica do fluido contendo produto. Em ainda outras modalidades, o pH e acondutividade do fluido contendo produto são ajustados usando um tampão deneutralização que resulta em não mais do que 80 mM de força iônica dofluido contendo produto.

Tampões que podem ser usados para eluição da coluna deProteína A incluem tampões compreendendo moléculas com um grupo aniônico carregado com um pKa de 2-5. Tais tampões de eluição poderiamcompreender adicionalmente moléculas com um grupo catiônico carregadocom um pKa de 6,5-10. Em uma modalidade, o tampão de eluiçãocompreende moléculas que são zwitteríons em pHs entre 4 e 9, tais comoglicina; ácido l,4-piperazina-bis-(etano-sulfônico); glicil-glicina; ácido ciclo-pentano-tetra-l,2,3,4-carboxílico; ácido N,N-bis(2-hidróxi-etil)-2-amino-etano-sulfônico; ácido 2-(N-morfolino)-propano-sulfônico; ácido N-tris(hidróxi-metil)-metil-2-amino-etano-sulfônico; ácido N-2-hidróxi-etil-piperazina-N'-2-etano-sulfônico; ácido 4-(2-hidróxi-etil)-1 -piperazina-propano-sulfônico; N-tris(hidróxi-metil)metil-glicina; glicinamida; N,N-bis(2-hidróxi-etil)glicina; ácido N-tris(hidróxi-metil)metil-2-amino-propano-sulfônico; ou N-glicil-glicina.

A eluição de uma coluna de Proteína A com um tampãozwitteriônico proporciona a vantagem de força iônica baixa sob algum graude neutralização. A força iônica baixa do tampão não afeta adversamente aoperação das colunas de troca iônica subseqüentes, incluindo as colunas dehidroxiapatita. Níveis altos de força iônica diminuirão a ligação de impurezasnas colunas de troca iônica, que pode diminuir a eficiência total dapurificação. Soluções de força iônica menor são preferidas paracarregamentos em colunas de troca iônica, porque a força iônica pode serelevada facilmente com a adição de soluções concentradas de sal; diminuiçãoda força iônica de soluções não é fácil. Surpreendentemente, há tampões quepossuem um pKa baixo que permite o uso em níveis de pH baixo úteis emetapas de eluição de Proteína A, mas que também possuem um segundo pKa que permite o uso em níveis de pH maiores úteis em cromatografia de trocaiônica; estes tampões, se usados em um segundo pH apropriado, possuempouca carga efetiva durante a operação da etapa de troca iônica subseqüente àetapa de Proteína A.

Um tampão zwitteriônico que possui um pKa próximo àquele do pH de eluição preferido para Proteína A (entre pH 2 e 5, preferivelmenteentre 2,5 e 4,0) permite que o tampão seja usado para manter o pH próximodo pi do tampão e para eluir a coluna. Tampões zwitteriônicos que tambémpossuem um pKa próximo daquele da operação de uma subseqüente colunade troca iônica (pH 5,5 a 11) permitiria que o tampão controlasse o pH nesta faixa de pH bem como na faixa de pH de eluição de Proteína A. O uso de umcomposto único para ambos a eluição da coluna de Proteína A em tampãobaixo e para a manutenção do pH maior útil em cromatografia de troca iônicasimplifica a operação de ambas as etapas, e também simplifica a composiçãoda reunião de produto após a neutralização.Em uma outra modalidade da invenção, um tampãozwitteriônico com pKal e pKa2 pode eluir uma coluna de Proteína A emnível de pH dentro de uma unidade de pH de pKal. Em adição, se a reuniãode Proteína A for neutralizada com uma solução básica do tampãozwitteriônico para um segundo pH dentro de uma unidade de pH de pKa2, otampão zwitteriônico será capaz de manter o pH da solução. Se o segundo pHestiver abaixo de pKa2, o tampão permanece zwitteriônico e contribui poucopara a força iônica total da solução. Por exemplo, um tampão zwitteriônicocom concentração x em um pH igual ao pKa2 contribuirá para a força iônicatotal apenas x/2. Um tampão zwitteriônico com concentração x em 1 unidadede pH abaixo de pKa2 do tampão terá uma força iônica de um décimo de x.Esta redução em força iônica é significativamente útil para operação decromatografia de troca iônica.

A existência de tampões que possuem um pKal útil paraeluição de colunas de Proteína A e um pKa2 útil para operação decromatografia de troca iônica não é óbvia, pelo fato de que o pKal destestampões não é comumente relatado. Tampões são comumente usados emníveis de pH próximos daquele de pKa2, e não são conhecidos por aquelaspessoas experientes na técnica de cromatografia como sendo úteis paraeluição de uma coluna de Proteína A. Em adição, embora a utilidade destestampões para eluição de colunas cromatográficas de Proteína A não sejageralmente realizada, também não é realizado o fato de que estes tampõeszwitteriônicos possuiriam utilidade adicional como tampões para colunas detroca iônica subseqüentes às colunas de Proteína A porque eles contribuemmenos para a força iônica para a reunião de Proteína A neutralizada.

C. Exemplos

Os seguintes exemplos são oferecidos apenas para propósitosilustrativos.

Exemplos são proporcionados para três modos decromatografia (troca iônica, interação hidrofóbica, e hidroxiapatita ), usandotrês anticorpos monoclonais diferentes. Quatro séries separadas deexperimentos são descritas, cada uma representando um pareamento diferentedo modo de cromatografia e o anticorpo monoclonal a ser purificado. Osestudos de triagem iniciais são apresentados primeiro, o que determina ocoeficiente de partição e/ou a concentração de produto ligado na resina sobvárias condições de solução, definindo assim as regiões de operação de modosde partição fraca (WP) e de fluxo transpassante (FT). Vários estudos decoluna são então sumariados, com dados sobre remoção de impureza erecuperação de produto. As recuperações de produto são excelentes para ascorridas de coluna WP, e os níveis de impureza são menores do que nosestudos FT correspondentes. As corridas WP foram conduzidas com desafiosde carregamento maiores para a resina do que os estudos FT.

Os níveis de resíduos de Proteína A nas amostras de testeforam medidos usando um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA)de Proteína A. A quantidade de agregado de peso molecular alto foi medidausando uma cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) analítica. Os níveisde proteínas de célula hospedeira (HCPs) foram medidos usando um HCPELISA. Todos os estudos de triagem e de coluna foram conduzidos natemperatura ambiente.

Série 1 - Troca aniônica usando TMAE-HiCap (M) e Mab-AABExperimento 1.1 - Triagem de taxa de transferência alta para estabelecercondições de WP e de FT

Uma triagem de taxa de transferência alta (HTS) foi realizadapara identificar as condições de partição fraca e de fluxo transpassante para omeio Mab-AAB e TMAE-HiCap (M). Esta triagem variou a concentração decloreto de sódio e o pH para determinar seu efeito sobre a extensão de ligaçãode Mab-AAB e as impurezas relacionadas com o processo (Proteína A eHCP) para o meio TMAE.50 |jL de meio TMAE HiCap foram adicionados em cadacavidade de uma placa de filtro de 96 cavidades. Cada cavidade foiequilibrada em soluções compostas de glicina 50 mM e uma quantidadevariável de tampão Tris (dependendo da quantidade necessária de neutralização para o pH especificado na Tabela 1.1.1) e de cloreto de sódio(especificado na Tabela 1.1.2). O pH variou de 7,6 a 9,0 e o cloreto de sódiovariou de 0 mM a 80 mM.

As soluções de tampão usadas em cada fileira foram diluídasem sistema de pipetação automática (Tecan 100 RST). A solução de estoque para os tampões foram preparadas de glicina 50 mM acidulada com HC1 parapH 3,0, e subseqüentemente neutralizada com Base Tris 2 M para os níveis depH indicados na Tabela 1.1.1. Esta titulação resultou em um nível de Tris quedependeu do pH do tampão. O pH do tampão foi medido em uma diluição de1 para 10 da concentração de tampão de estoque, que correspondeu à diluição feita pelo sistema de pipetação automática. Como um resultado da acidulaçãode glicina para pH 3,0, o tampão contribui com cerca de 10 mM de forçaiônica para a solução final. Dois desafios de carregamento foram feitos para aresina: 5 mg/mL para medir o coeficiente de partição, K, e 122 mg/mL, paramedir a capacidade da resina para remover as impurezas e o produto ligado,

Q, em equilíbrio com uma solução de proteína em uma concentraçãoaproximadamente igual à concentração de carregamento da coluna.Tabela 1.1.1: Tipo de tampão e alvo de pH em cada cavidade<table>table see original document page 35</column></row><table>Tabela 1.1.2: Níveis de NaCl (em mM) e desafios de proteína (mg/mL) emcada cavidadeTodas as fileiras

<table>table see original document page 36</column></row><table>

No primeiro estágio do experimento HTS, cada cavidade foiequilibrada nas condições de NaCl e de pH como descritas nas Tabelas 1.1.1 e1.1.2 uma razão volumar de fases de 6:1 (300 uL de solução: 50 uL deresina). A placa foi agitada por 20 minutos, permitindo que o equilíbrio fossealcançado. A solução foi então removida por centrifugação da placa de filtro.Este ciclo de equilíbrio foi repetido três vezes.

No segundo estágio, a resina em cada cavidade foi desafiadacom uma solução concentrada de MAb-AAB para 5 mg/mL de resina comuma razão volumar de 6:1 (300 uL de solução: 50 [iL de resina) emconcentração de NaCl e em pH apropriados. Uma solução de Mab-AAB a36mg/mL em HEPES 1 mM, NaCl 10 mM, pH 7,0 semeada com 300 ppm deProteína A foi usada como solução de estoque. A placa carregada foi agitadapor 20 minutos, permitindo que a resina e a solução se equilibrassem. Osobrenadante foi removido da placa de filtro por centrifugação e coletado emuma placa de coleta. A concentração de proteína no sobrenadante em cadacavidade foi determinada por absorbância a A280nm.

No terceiro estágio, a resina foi lavada por adição de soluçõesde condições especificadas de NaCl e de pH listadas na Tabela 1.1.2. Osobrenadante foi removido após agitação por 20 minutos. No quarto estágio,NaCl 2 M foi adicionado para remover a proteína restante que estava ligadana resina. Os coeficientes de partição foram calculados para cada cavidadeusando a massa eluída de estágios 3 e 4 e a concentração de produto doestágio 2, e são mostrados na Tabela 1.1.3. Uma plotagem de contorno do logdo coeficiente de partição como uma função do pH e de cloreto é mostrada naFigura 7.

Tabela 1.1.3: Coeficientes de partição (K) para a triagem HTS de 96<table>table see original document page 37</column></row><table>a coluna. Duas corridas foram realizadas com desafios de carregamento de110 mg/mL e 200 mg/ml de resina.

Para todas as corridas de cromatografia de troca iônica deTMAE (HiVapM) descritas na Série 1 de experimentos, as seguintes condições foram usadas (exceções são anotadas nas descrições experimentaisindividuais).

Vazão operacional - 150-300 cm/h.

Equilíbrio 1 - Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 (5 volumes decoluna).

Equilíbrio 2 - como especificado, aproximadamenteequivalente ao pH e ao contendo de cloreto do carregamento.

Lavagem após carregamento - como especificada,aproximadamente equivalente ao pH e ao contendo de cloreto docarregamento. Tampão de extração - Tris 50 mM, NaCl 2,0 m, pH 7,5 (5volumes de coluna).

Cromatografia em Mabselect Protein A

A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi purificada emescala piloto usando uma coluna Mabselect (2.389 mL) conectada em umsistema de cromatografia Millipore K-prime 400. Uma coluna MabselectProtein A foi equilibrada com 5 volumes de coluna de Tris 50 mM, NaCl 2,0M, pH 7,5 em uma vazão de 300 cm/h. A coluna foi então carregada com umcarregamento de aproximadamente 40 mg de produto / mL de resina. Isto foiseguido por uma lavagem de 5CV em NaCl 1 M, Tris 50 mM, pH 7,5 e uma lavagem de 5CV contendo Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5. A coluna foientão eluída usando glicina 50 mM, NaCl 75 mM, pH 3,0. A reunião deproduto foi neutralizada para pH 7,6 usando Tris 2 M pH 8,5. O piconeutralizado teve uma concentração de cloreto de aproximadamente 90 mM.Cromatografia de TMAE HiCap (M)A reunião de Proteína A neutralizada foi adicionalmentepurificada sobre a etapa TMAE com as soluções de equilíbrio, decarregamento, e de lavagem em pH 7,5 com Tris 50 mM e cloreto de sódio 75mM. 5 Volumes de coluna de lavagem foram usados. As dimensões da colunae os desafios de carregamento para estes dois estudos foram: Corrida 1: 7,0cm de diâmetro x 20,6 cm de altura de leito (volume - 793 mL) com umaconcentração de carregamento de 11,9 mg/mL, e Corrida 2: 7,0 cm dediâmetro x 13 cm de altura de leito (volume - 500 mL) com umaconcentração de carregamento de 17,6 mg/mL.Estas condições de carregamento foram na região de fluxo

transpassante (FT) (Tabela 1.2.1). Estudos de ligação em batelada foramusados para medir o coeficiente de partição (Kp) e o produto ligado foideterminado por proteína na extração de coluna pelo uso de absorbância emUV. Este método de determinação de produto ligado tipicamente subestima a quantidade de produto ligado durante o carregamento devido à eluiçãoisocrática do produto durante a lavagem. Os níveis de Proteína A, HCP eHMW no carregamento e na reunião de produto foram medidos, e a extensãode remoção foi calculada. Os resultados são apresentados na Tabela 1.2.1. Háremoção insatisfatória de Proteína A e de HMW, e redução modesta em níveis de HCP.

Tabela 1.2.1: Remoção de HCP, Proteína A, e HMW sob condições defluxo transpassante

Corrida Desafio de carregamento (mg/mL) Coeficiente de partição (Kp) Produto ligado (mg/mL resina) HCP (LRV) Proteína A (LRV) BMW (vezes) Recuperaç ão (%)

1 110 0,17 1.4 2,3 0,1 - 96

2 200 0,17 3,3 2,0 <0,1 1,5 96

*Níveis de impureza foram 38,5 ppm de ProA e 51,943 ppm de HCP (Corrida 1), 8,8 ppmde ProA e 25,398 de ppm HCP (Corrida 2). Experimento 1.3 — Corridas em coluna sob condições de partição fraca(desafio de produto alto)

Cromatografia de troca aniônica em TMAE (HiCap M)

Várias corridas em Mabselect Protein A foram realizadasessencialmente como descrito no Experimento 1.2 para gerar o material decarregamento para estas corridas. A reunião de anticorpo parcialmentepurificado da etapa de Proteína A foi adicionalmente purificada sobre acoluna TMAE. O carregamento para a coluna TMAE foi em Tris 50mM, pH5 8,2. O diâmetro da coluna foi 0,5 cm e a altura do leito foi 10 cm (volume ~2,0 mL). A coluna foi desafiada para um carregamento de 500 mg/mL deresina, com uma concentração de carregamento de 27,7 mg/mL.

A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de umasolução contendo Tris 50 mM, NaCl 2 M pH 7,5 seguida por outra etapa deequilíbrio compreendendo solução de Tris 50 mM Tris, pH 8,2. A coluna foientão carregada para 500 mg de produto/mL de resina com pico de Proteína Aneutralizada das várias etapas anteriores e o produto foi recuperado noefluente da coluna durante o ciclo de carregamento e alguns volumes decoluna da fração de lavagem. Estas condições de carregamento estão na região de partição

fraca. Estudos de ligação em batelada foram usados para medir o coeficientede partição (Kp), e a ligação de produto em concentrações de proteína altas.Em pH 8,2, e em um conteúdo de cloreto aproximado de 12 mM, ocoeficiente de partição, Kp, estimado é de 1,9 (da interpolação do conjunto de dados da triagem HTS).

Os níveis de HCP e de Proteína A foram medidos em trêsfrações durante o estágio de carregamento representando desafios decarregamento de aproximadamente 250, 375, e 500 mg/mL de resina. Osresultados do experimento 1.3 são apresentados na Tabela 1.3.1. Estesresultados demonstram que desafios de produto muito altos podem seralcançados no modo de partição fraca, sem aparecimento de impurezas.Reduções excelentes em ambas HCP e Proteína A foram alcançadas,juntamente com redução de 50% em conteúdo de HMW. Em comparação aosresultados para operação no modo de fluxo transpassante na Tabela 1.2.1, aremoção de impurezas foi muito melhor no modo de partição fraca.

Tabela 1.3.1: Remoção de HCP, Proteína A e HMW para um desafio de

<table>table see original document page 41</column></row><table>

* As impurezas no carregamento foram 24.398 ppm de HCP, 99,5 ppm de Proteína A, e 2,3% de HMW.

Experimento 1.4 — Corridas em coluna sob condições de partição fraca(estudos de robustez)

Para adicionalmente confirmar o desempenho da colunaTMAE na região de partição fraca, várias corridas foram planejadas variandoo pH e a concentração de NaCl no carregamento para testar a robustez doprocesso. Todas as corridas foram realizadas em um desafio de carregamentode 250 mg/mL de resina. Várias corridas em Mabselect Protein A foramrealizada essencialmente como descrito em Experimento 1.2 para gerar omaterial de carregamento para estas corridas. O único fator variado naquelas corridas foi a concentração de cloreto de sódio na eluição de Proteína A, quefoi variada para igualar à concentração de NaCl no carregamento de TMAEpara um experimento particular. As colunas foram equilibradas com tampõesEquil 2 e lavadas com tampões de Lavagem que tinham aproximadamente omesmo pH e o mesmo conteúdo de NaCl do carregamento. Estas condições de carregamento estão na região de partição

fraca. Estudos de ligação em batelada foram usados para medir o coeficientede partição (Kp). As corridas são classificadas pelos coeficientes de partiçãolistados na Tabela 1.4.1. O produto ligado foi determinado pela medição daproteína na extração de coluna usando absorbância em UV, e varia de 7,8-25,3 mg/mL. Resultados de Proteína A, HCP e HMW destes experimentostambém são apresentados na Tabela 1.4.1. Foi verificado que a remoção detodas as impurezas é robusta nas faixas de operação que cobrem 13,5-38,8mM de cloreto total e pH 7,8-8,4.

Tabela 1.4.1: Estudos de robustez de processo sobre remoção de HCP,

Proteína A e HMW no modo de partição fraca

<table>table see original document page 42</column></row><table> *Níveis de impureza foram 38,5 ppm de ProA e 51.943 ppm de HCP (Corrida 1), 8,8 ppmde ProA e 25.398 ppm de HCP (Corrida 2).+ inclui a contribuição de íon Cl" de NaCl, tampões e titulantes

Sumário

Deste estudo, pode ser visto que a remoção (LRV) de Proteína A varia fortemente com Kp, enquanto que LRV de HCP é excelente em todosos valores de Kp em ou acima de 0,26, mas muito reduzido em Kp = 0,17(sob condições de fluxo transpassante). Remoção de proteína de célulahospedeira é mais do um log mais baixo para as condições de fluxotranspassante comparadas com condições de partição fraca, até mesmo para um desafio de carregamento reduzido. O produto ligado varia de 7,8 - 25mg/mL para estas condições de partição fraca sobre esta combinação deresina e anticorpo monoclonal. O coeficiente de partição parece ser ótimo em0,41<Kp<5,4. Não parece ser ótimo em Kp=0,17 e um produto ligado de 1,4 -3,3mg/mL, as condições de Experimento 1.2. Série 2 - Troca aniônica usando TMAE-HiCapM e Mab-IMA

Experimento 2.1- Triagem de taxa de transferência alta para estabelecer ascondições de WP e de FT

Uma triagem de taxa de transferência alta (HTS) foi realizadapara identificar as condições de fluxo transpassante para Mab-IMA com o meio TMAE-HiCap (M). Esta triagem variou a concentração de cloreto desódio e o pH para determinar seus efeitos sobre a extensão de ligação deMAB-IMA e as impurezas relacionadas com o processo (Proteína A e HCP)para o meio TMAE. 100 uL de meio TMAE HiCap foram adicionados emcada cavidade de uma placa de filtro de 96 cavidades. Cada cavidade foiequilibrada em soluções compostas de tampão 25 mM não mais do que 1unidade de pH afastada do pKa de tampão (Tabela 2.1.1) e o nível apropriadode cloreto de sódio (Table 2.1.2). O pH variou de 7,00 a 8,75 e a concentraçãode cloreto de sódio variou de 1 mM 190 mM.

Todos os tampões foram titulados para o pH alvo usando HC112 M. Como um resultado de que espécies tampão diferentes requereramníveis diferentes de titulante, a concentração de cloreto variou de cavidadepara cavidade dependendo de qual tampão foi usado para aquela cavidade. Aquantidade de Cl" necessária para titular o tampão para o pH alvo foicalculada usando a equação de Henderson-Hasselbach e adicionada ao Cl"total contribuído de ambos o NaCl e a quantidade no material decarregamento. O nível de Cl" calculado para cada cavidade no experimentoestá listado na Tabela 2.1.3

Tabela 2.1.1: Tipo de tampão e pH alvo em cada cavidade

Todas as colunas

A Etanol-amina (pH = 8,75)

B Tris (pH = 8.5)

C Tris (pH = 8,25)

D Tris (pH = 8,0)

E Tris (pH = 7,75)

F Tris (pH = 7,5)

G Bis-Tris (pH = 7,25)

H Bis-Tris (pH = 7,0)

Tabela 2.1.2: Níveis de NaCl em cada cavidade (em mM)

<table>table see original document page 43</column></row><table>

Tabela 2.1.3: Níveis de Cl" em cada cavidade (em mM)

<table>table see original document page 43</column></row><table>No primeiro estágio do experimento de HTS, cada cavidadefoi equilibrada nas condições de NaCl e de pH como descritas nas Tabelas2.1.1 e 2.1.2 em uma razão volumar de fases de 3:1 (300 uL de solução: 100uL de resina). A placa foi agitada por 20 minutos, permitindo que o equilíbriofosse alcançado. A solução foi então removida por centrifugação da placa defiltro. Este ciclo de equilíbrio foi repetido três vezes.

No segundo estágio, a resina em cada cavidade foi desafiada comuma solução concentrada de MAb-EVIA para 3 mg/mL de resina com uma razãovolumar de 3:1 (300 uL de solução: 100 uL de resina) na concentração de NaCl eem pH apropriados. Uma solução de Mab-DVIA a 30 mg/mL em Mes 1 mM, NaCl15 mM, pH 6,5 com 300 ppm de Proteína A foi usada como solução de estoque. Aplaca carregada foi por 20 minutos, permitindo que a resina e a soluçãoequilibrassem. O sobrenadante foi removido da placa de filtro por centrifugação emuma placa de coleta. A concentração de proteína no sobrenadante em cada cavidadefoi determinada por absorbância em A280 nm. Qualquer decréscimo em níveis deProteína A e/ou de HCP indica uma condição que conduz à purificação.

No terceiro estágio, a resina foi lavada por adição de soluçõesde NaCl e em pH nas condições especificadas listadas na Tabela 2.1.2. Osobrenadante foi removido após agitação por 20 minutos. No quarto estágio,NaCl 2 M foi adicionado para remover a proteína restante que estava ligada naresina. Os coeficientes de partição foram calculados para cada cavidade usando amassa eluída dos estágios 3 & 4 e a concentração de produto do estágio 2, e sãomostrados na Tabela 2.1.4. Uma plotagem de contorno do log de coeficiente departição como uma função de pH e de cloreto é mostrada na Figura 9.

Tabela 2.1.4: Coeficientes de partição (Kp) para a triagem THS de 96cavidades para MAB-IMA

<table>table see original document page 44</column></row><table>Como mostrado na tabela 2.1.4, o valor de Kp pode ser usadopara descrever as regiões onde MAB-IMA se liga no meio TMAE com forçasdiferentes. Estas regiões são mais claramente visualizadas na Figura 9. Aforça de ligação de MAb-IMA no meio TMAE pode ser manipulada pelavariação das condições de pH e de concentração de cloreto nas zonas de fluxotranspassante (Kp<0,l), de partição fraca (0,l<Kp<20), e de ligação (Kp>20).

Os sobrenadantes do estágio de carregamento de váriascavidades de cada zona foram amostrados e submetidos às análises deProteína A. O carregamento teve 300 ppm de Proteína A. Os resultados deensaio destas amostras estão sumariados na Tabela 2.1.5. Há uma região depH e de condutividade onde a etapa de cromatografia em TMAE proporcionaremoção muito significativa de Proteína A com perda de proteína limitadapara a resina. E verificado que esta região está intimamente relacionada com ovalor do coeficiente de partição, Kp, e não com qualquer concentração de cloreto ou pH específico.

Tabela 2.1.5: Níveis residuais de Proteína A e dados de ligação de MAB-

IMA da triagem THS

<table>table see original document page 45</column></row><table>Valores de Kp preditos são derivados de um ajuste desuperfície de resposta à triagem de HTS, e predição subseqüente do Kp20 baseado neste modelo de regressão.

Experimento 2.2 - Corridas em coluna sob condições FT usando TMAE-HiCapM e Mab-IMAO seguinte experimento foi realizado no modo de fluxotranspassante (FT), onde Mab-IMA interage apenas muito fracamente com acoluna. Quatro corridas foram conduzidas, com desafios de produto de 109 -275 mg/niL de resina. Cromatografia de troca aniônica em TMAE (HiCap M)

Para todas as etapas de cromatografia de troca aniônica emTMAE (HiCapM) descritas na série de Experimento 2, as seguintes condiçõesforam usadas (exceções são anotadas nas descrições experimentaisindividuais). Vazão operacional -150-300 cm/hr

Equilíbrio 1- Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 ou 8,0 (5volumes de coluna)

Equilíbrio 2 - NaCl 75 mM, Tris 50 mM, pH 7,5 (corridas 3 e4 continham Glicina 50 mM)Lavagem após carregamento - NaC17 5mM, Tris 50 mM, pH

7,5 (corridas 3 e 4 continham Glicina 50 mM)

Tampão de extração - Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 ou 8,0(5 volumes de coluna).

Várias corridas em Mabselect Protein A foram realizadasessencialmente como descrito em Experimento 1.2 para gerar o material decarregamento para estas corridas. As reuniões de anticorpo parcialmentepurificado da etapa de Proteína A previamente descritas foram adicionalmentepurificadas na etapa de extração de ânions em um modo de fluxotranspassante (FT). Diâmetros de coluna variaram de 1,0 - 3,2 cm e as alturas de coluna foram 7,2 - 8,5 cm.

As colunas foram equilibradas com 5 volumes de coluna deuma solução contendo Tris 50 mM, NaCl 2M pH 7,5 seguida por outra etapade equilíbrio compreendendo uma solução de Tris 50 mM, pH 7,5. As colunasforam então carregadas para entre 109 mg/mL e 275 mg/mL com o pico deProteína A parcialmente purificada e o produto foi recuperado no efluente dacoluna durante o ciclo de carregamento e em alguns volumes de lavagem dafração de lavagem.

Estas condições de carregamento estavam na região de fluxotranspassante (FT). A triagem de taxa de transferência alta descrita emExperimento 2.1 proporciona o valor do coeficiente de partição (Kp) sob estascondições de pH e de concentração de cloreto. As corridas foram classificadaspelos coeficientes de partição listados na Tabela 2.2.1. O produto ligado foideterminado pela medição da proteína na extração de coluna usando absorbância em UV. Este método de determinação da quantidade de produtoligado tipicamente subestima a quantidade total de produto ligado devido àeluição isocrática de produto na lavagem. Resultados de remoção de ProteínaA, HCP, HMW e LMW destes experimentos também são apresentados naTabela 2.2.1. Há uma remoção relativamente insatisfatória e variável de HCP, e nenhuma remoção de Proteína A de variantes de produto (espécies HMW eLMW).

Tabela 2.2.1: Remoção de HCP, Proteína A e HMW e LMW no modo FT

<table>table see original document page 47</column></row><table>ND = Não determinado

Experimento 2.3 - Corridas em colunas sob condições de partição fraca paraMab-IMA

Os seguintes experimentos em coluna foram realizados nomodo de partição fraca sob condições identificadas para a triagem HTS(Experimento 2.1). Sete corridas foram realizadas sobre a coluna de TMAE apartir das reuniões de Proteína A particularmente purificada. Cromatografia em TMAE HiCap

O anticorpo parcialmente purificado de uma etapa de ProteínaA corrida essencialmente igual como previamente descrito foi adicionalmentepurificado na etapa TMAE sob condições de partição fraca (WP) de pH e deconteúdo de cloreto como descrito abaixo. Diâmetros de coluna variaram de0,5 a 3,2 cm e as alturas de coluna foram de 9,4-9,5 cm.

As colunas foram equilibradas com 5 volumes de coluna deuma solução contendo Tris 50 mM, NaCl 2 M, pH 7,5 ou 8,0 seguido poroutra etapa de equilíbrio compreendendo solução de glicina 50 mM, Tris 50mM, pH 7,5 ou 8,0. As colunas foram então carregadas para entre 124 mg/mLe 303 mg/mL com o pico de Proteína A parcialmente purificada e o produtofoi recuperado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e emalguns volumes de coluna da fração de lavagem. Os resultados desteexperimento são apresentados na Tabela 2.3.1

As condições de carregamento na região de partição fraca(WP). A triagem de taxa de transferência alta descrita em Experimento 2.1proporciona o valor do coeficiente de partição (Kp). As corridas foramclassificadas pelos coeficientes de partição listados na Tabela 2.3.1. Oproduto ligado foi determinado pela medição da proteína na extração decoluna usando absorbância em UV. Este método de determinação daquantidade de produto ligado tipicamente subestima a quantidade total deproduto ligado devido à eluição isocrática de produto na lavagem. Resultadosde remoção de Proteína A, HCP, HMW e LMW destes experimentos tambémsão apresentados na Tabela 2.2.1. Há uma remoção alta e consistente de HCP,e excelente remoção de Proteína A, e redução valiosa de variantes de produto(espécies HMW e LMW).

Uma comparação de dados apresentados nas Tabelas 2.2.1 e2.3.1 confirma que a remoção de HCP, Proteína A, HMW, e LMW sobcondições de um modo de fluxo transpassante (valores de Kp de < 0,3) émuito menor do que aquela que pode ser conseguida sob condições departição fraca (valores de Kp > 0,3), até mesmo quando o desafio decarregamento ultrapassa 300 mg/mL.Tabela 2.3.1: Remoção de HCP, Proteína A e HMW e LMW sobcondições de partição fraca

ND - não determinado

<table>table see original document page 49</column></row><table>Experimento 2,4: Desempenho de corridas em coluna de partição fraca em escala de manufatura piloto e clínica

A etapa de processo TMAE para a purificação de Mab-IMAoperado na zona de partição fraca foi aumentada em escala para a manufaturaclínica e em instalação Piloto. A cultura contendo o anticorpo monoclonal foiprimeiro purificada usando uma coluna MabSelect de 3 L ou 5 L em Piloto e

uma coluna MabSelect de 28 L durante manufatura clínica. A colunaMabSelect foi essencialmente operada como descrito em Experimento 1.2. Asreuniões de pico de Proteína A neutralizada destas corridas foramadicionalmente purificadas em uma coluna TMAE de 1,5 L em Piloto euma coluna TMAE de 7 L na instalação de manufatura clínica. Osresultados das três corridas Piloto e das nove corridas de manufaturaclínica estão sumariados nas Tabelas 2.4.1 e 2.4.2, respectivamente. Odesempenho de etapa foi consistente através das corridas, com reduçãoexcelente de HCP, Proteína A, e remoção boa de espécies HMW e LMWrelacionadas com o produto. Recuperação de produto foi > 87% em todasas corridas. Uma estimativa de produto ligado na resina durante as corridasPiloto foi obtida do produto na extração de coluna, que variou de 6-14mg/mL de resina.

Tabela 2.4.1: Desempenho de corridas em escala Piloto sob condições de<table>table see original document page 50</column></row><table>

Tabela 2.4.2: Desempenho de corridas em escala de manufatura sob

<table>table see original document page 50</column></row><table>

* Os níveis de HCP e de Proteína A na reunião de pico de TMAE ficaram abaixo do limite

de quantificação.Sumário

Condições identificadas com HTS para operação WP e FT. Omodo FT proporcionou uma redução modesta em espécies HCP e LMW, enenhuma redução em resíduos de Proteína A ou espécies HMW. Operação nomodo WP melhora a remoção de todas as impurezas sem prejudicar orendimento de produto.A etapa de processo foi aumentada em escala para ainstalação Piloto e operada consistentemente para três corridas, com LRVsmuito altos para HCP e Proteína A, e reduções boas em espécies HMW eLMW.

Série 3 — Troca aniônica usando TMAE-HiCapM e Mab-AAB

Experimento 3.1— Triagem de taxa de transferência alta para estabelecercondições de WP e FT

Experimento 3.1 foi realizado usando os procedimentos comodescritos em Experimento 1.1.

Experimento 3.2 — Corridas de capacidade de coluna sob condiçõescorrespondendo a coeficientes de partição variados

Cinco experimentos de cromatografia foram realizados sobcondições correspondendo a uma faixa de coeficientes de partiçãoidentificados pela triagem HTS (Experimento 3.1). As colunas TMAE foramcarregadas para um desafio de carregamento muito alto (> 1.000 g/L) paraespecificamente realçar o desempenho superior da etapa AEX sob condiçõesde partição fraca.

As seguintes condições foram usadas para as corridas AEXrealizadas em Série 3 (exceções estão anotadas nas descrições experimentaisindividuais).

Vazão operacional - 150-300 cm/h.

Equilíbrio 1-Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 (5 volumes de coluna).

Equilíbrio 2 - como especificado, aproximadamenteequivalente ao pH e ao conteúdo de cloreto de carregamento.

Lavagem após carregamento - como especificado,aproximadamente equivalente ao pH e ao conteúdo de cloreto decarregamento.

Tampão de extração - Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 (5volumes de coluna)

A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão1 de equilíbrio seguidos por 5 volumes de coluna de etapa de equilíbrio 2. Acoluna foi então carregada para entre 940 e 2.144 mg de produto / mL deresina com a reunião de pico de Proteína A (refere-se à Série 1, Experimento1.1) ajustada para o tampão de equilíbrio 2 apropriado.

As frações de efluente da coluna foram coletadas esubseqüentemente ensaiadas para níveis de HCP e de Proteína A residual. Ascondições de carregamento usadas nestes experimentos correspondem aoscoeficientes de partição progressivamente crescentes que incluem as regiõesde partição fraca (WT) e de fluxo transpassante. A triagem de taxa detransferência alta descrita em Experimento 3.1 proporcionou estimativas parao valor do coeficiente de partição (Kp). Os valores de produto ligado nesteexemplo foram calculados baseados no produto eluído na extração. Osresultados destes experimentos estão listados na Tabela 3.2.1 e nas FiguraslOAe 10B.

Tabela 3.2.1 - Sumário dos resultados de experimentos de desafio de

<table>table see original document page 52</column></row><table>

Baseado em cálculo de balanço de massa.

O valor de produto ligado para a corrida correspondendo a umKp de 0,1 foi próximo de zero, como é esperado para uma típica operação defluxo transpassante. Os valores de produto ligado para experimentosrealizados na região de partição fraca foram > 12,0 mg/mL em todos os caso.De fato, o valor de produto ligado para a corrida correspondendo ao Kp de 7foi tão alto quanto 71 mg/mL. A recuperação de produto no eluato decarregamento combinado e nas frações de lavagem em todos os casos foi,contudo, > 93%.

Remoção de HCP e de Proteína A, como uma função dedesafio de carregamento, é apresentada nas Figuras 10A e 10B. Comodiscutido no início, a remoção de HCP aumenta significativamente à medidaque as condições se movem de fluxo transpassante para partição fraca.

Operação sob condições de fluxo transpassante proporciona aproximadamentelogs de depuração de HCP de 1,5, enquanto que os logs de valores deremoção de HCP foram tão altos quanto logs de 3,8 em desafios decarregamento < 450 mg /mL de resina quando operados em um Kp de 7 naregião de partição fraca. Em um Kp de 0,8 na região de partição fraca, logs dedepuração de HCP de 2,8 foram obtidos para desafios de carregamento de até1.000 mg/mL de resina, e logs de depuração de HCP > 3 para um desafio decarregamento de 800 mg/mL de resina em um Kp de 2,7 na região de partiçãofraca.

Como no caso de HCP, remoção de Proteína A aumentasignificativamente à medida que movemos as condições de fluxo transpassante para condições de partição fraca. Os resultados apresentados nasFiguras 10A e 10B também realçam o fato de que o aumento de Kp deoperação da região de fluxo transpassante para região de partição fracaaumenta o log de valores de depuração de HCP e de Proteína A obtidos antesdo aparecimento do contaminante, bem como o desafio de carregamento até oponto de aparecimento. Um aumento adicional em Kp continua a aumentar oLRV de HCP e de Proteína A antes da passagem do contaminante. Contudo, oponto de aparecimento ocorre em desafios de carregamento relativamentemenores porque o produto ligado agora compete com os contaminantes pelossítios de ligação. Todavia, as capacidades da coluna para as corridas aqui apresentadas foram muito altas até mesmo em corrida de Kp elevado.Sumário

Neste exemplo foi mostrado que remoção de HCP e ProteínaA pode ser significativamente melhorada pela operação da etapa AEX sobcondições de partição fraca e em desafios de carregamento acima de 1.000mg/mL de resina. Este exemplo realça uma diferença fundamental entrecromatografia de partição fraca e as operações padrão sob condições deligação. As condições de partição fraca empurram os limites de ligação deproduto apenas até um ponto onde a depuração de contaminante ésignificativamente melhorada, enquanto que a recuperação de produto e osdesafios de carregamento permanecem altos. Os valores de Kpcorrespondendo às condições de ligação são > 20 em AEX; sob estascondições os efeitos competitivos entre o produto e o contaminante são muitofortes acarretando capacidade reduzida em comparação com a cromatografiade partição fraca.Série 4 - Interação hidrofóbica utilizando Phenyl Toyopearl e Mab-AAB

Experimento 4.1 — Estudos de ligação em batelada para estabelecer as condições WP e FT

Estudos de ligação em batelada foram conduzidos para identificar as condições de partição fraca e de fluxo transpassante para Mab-AAB com meio Phenyl Toyopearl da Tosoh Biosciences. O sal modulando a força da interação de produto com a resina é Na2S04, que foi variado de 0,20 M a 0,90 M. As soluções foram tamponadas para controle em pH 7,5. Placas de filtro de 45 um foram usadas para incubar a resina com líquido e para decantar o sobrenadante através de centrifugação. Oito tampões Tris/ Na2S04 foram preparados com

Na2S04 em concentrações diferentes (0,2 M a 0,9 M). Mab-AAB que foi parcialmente purificado por cromatografia de Proteína A foi diluído em solução de Tris/ Na2S04 para uma concentração final de 0,87 mg/mL. 50 uL de resina foram equilibrados com 300 uL de tampão e então o sobrenadante foi decantado para cada uma das condições de Tris/ Na2S04; este equilíbrio foi repetido três vezes. Após o equilíbrio, a resina decantada foi misturada com o produto na mesma concentração de sal e no mesmo pH e incubada por 30 minutos com agitação suave. O desafio de carregamento foi de 5,2 mg de produto / mL de resina para todas as condições. Uma placa de UV foi então empilhada no fundo da placa de filtro para coletar o sobrenadante sob centrifugação. Subseqüentemente, 300 uL de tampão Tris 50 mM, pH 7,5 foram aplicados na resina para extrair o produto ligado. Após uma incubação de 20 minutos, a extração foi coletada em uma placa de UV separada por meio de centrifugação. A concentração do produto em cada fração foi medida por absorbância em UV e o coeficiente de extinção para este MAb. Os cálculos foram ajustados para um alcance de estágio-para-estágio sobre volume de 29 uL que foi determinado por um conjunto separado de experimentos. O experimento foi repetido quatrovezes sob cada condição de sal e um coeficiente de partição médio é relatado.

Tabela 4.2.1 sumaria os coeficientes de partição deste experimento. As concentrações mais altas de Na2S04 causaram forte ligação de produto, enquanto que concentrações de sal dentro da faixa de 0,40-0,55 M representam condições de partição fraca.

Experimento 4.2 — Corridas em coluna sob condições de partição fraca, de fluxo transpassante e de ligação (estudos de desafio de produto alto)

Corridas em coluna foram realizadas sob condições de partição fraca, de fluxo transpassante e de ligação forte. Para todas as corridas de cromatografia de interação em Phenyl Toyopearl descritas nos experimentos de Série 4, as seguintes condições foram usadas (exceções são anotadas nas descrições experimentais individuais).

Dimensão de coluna: diâmetro 0,5 cm, altura de leito 9,5-10,5

cm

Equilíbrio - Tris 50 mM, pH 7,5 com [Na2S04] aproximadamente equivalente à do carregamento.

Carregamento - [Na2S04] como especificado abaixo.

Lavagem - [Na2S04] igual à do carregamento (exceções anotadas abaixo).

Extração - Tris 50 mM, pH 7,5.

Dois carregamentos diferentes foram usados: i) reuniões de anticorpo particularmente purificado de uma etapa de Proteína A corrida essencialmente na mesma maneira que aquelas previamente descritas ou ii) reuniões de produto de TMAE Q Sepharose FF mais puro da operação de modo FT.

Experimento 4.2.1 — Corridas em coluna usando reunião de pico de Proteína A como carregamento

Os experimentos aqui discutidos foram realizados para realçaro desempenho superior de HIC sob condições de partição fraca. Corridas em coluna foram realizadas sob concentrações de sal variadas para cobrir uma faixa de coeficientes de partição que corresponde às condições de partição fraca, de fluxo transpassante e de ligação forte. A triagem de ligação em 5 batelada descrita em Experimento 4.1 proporciona estimativas para o valor do coeficiente de partição(Kp). As colunas foram equilibradas com 5 volumes de coluna de uma solução contendo Tris 50 mM, pH 7,5 e [Na2S04] apropriada em concentração específica. O pico de Proteína A foi primeiro concentrado 10 vezes, e subseqüentemente diluído para 14,77 mg/mL na concentração de sal apropriada. Níveis de proteína de célula hospedeira (HCP) e de Proteína A residual no material de carregamento foram 30.911 ppm e 17,1 ppm, respectivamente. Todas as corridas em colunas foram realizadas em um desafio de carregamento de 100 mg/mL de resina. O produto foi coletado no efluente da coluna durante a fração de ciclo de carregamento. Após ofluxo transpassante de produto, dez volumes de coluna de tampão de lavagem na mesma concentração de sal como carregamento foram aplicados na coluna, seguidos por cinco volumes de coluna de um tampão de extração contendo Tris 50 mM, pH 7,5. Conteúdos de HCP e Proteína A no eluato de carregamento e nas amostras de lavagem foramsubseqüentemente analisados por ELISA. O nível de impureza combinada em ambos o eluato de carregamento e as frações de lavagem é relatado na Tabela 4.2.1.

As corridas são classificadas pelos coeficientes de partição. O produto ligado foi determinado por medição da proteína na extração de 25 coluna usando absorbância em UV. Este método de determinação de produto ligado tipicamente subestima a quantidade de produto ligado durante o carregamento devido à dessorção gradual do produto durante a lavagem.

Tabela 4.2.1.: Remoção de impurezas em condições de fluxo<table>table see original document page 57</column></row><table>

(O coeficiente de partição Kp considera a razão volumar de fases de 6 a 50 microlitros de resina e 300 microlitros de solução)

Como é evidenciado dos dados apresentados na Tabela 4.2.1, o 5 desempenho da etapa HIC melhora significativamente com respeito à redução de contaminantes à medida que movemos das condições de fluxo transpassante para as condições de partição fraca, enquanto que a recuperação de produto é comparável. Um aumento adicional na concentração de sal operacional acarreta coeficientes de partição que correspondem às condições de ligação forte. Mais uma vez está de novo claro dos dados apresentados na Tabela 4.2.1 que o desempenho da etapa HIC deteriora com respeito tanto à redução de contaminantes quanto à recuperação de produto, à medida que movemos das condições de partição fraca para as condições de ligação forte. A janela de operação ótima para esta separação portanto corresponde àquela de cromatografia de partição fraca. Sob condições de partição fraca, a etapa HIC proporciona log de redução de HCP de 1 e redução de 3,4 vezes de Proteína A. Os níveis de produto ligado sob as condições de partição fraca, neste exemplo, estiveram entre 2,8 e 5 mg/mL de resina. Experimento 4.2.2 — Corridas em coluna usando reunião de pico de Q- Sepharose como carregamento

A reunião de pico de Q Sepharose FF foi usada nestes conjuntos de experimentos para realçar o fato de que o desempenho da etapa HIC sob as condições ótimas de cromatografia de partição fraca pode ser adicionalmente melhorado com uma alimentação mais limpa. O material de carregamento neste caso continha 2.880 ppm de HCP e foi gerado porpurificação de reunião de pico de Proteína A em uma coluna Q Sepharose FF. Dois experimentos, um sob condições de partição fraca e outro sob condições de fluxo transpassante, foram conduzidos para comparar o desempenho da coluna com respeito à remoção de impurezas. O pico de Q-Sepharose foi diluído para 3,27 mg/mL em Na2S04 550 mM e carregado na coluna em um desafio de carregamento de 100 mg/mL de resina para operação sob condições de partição fraca. A coluna foi subseqüentemente lavada com 10 CVs de um tampão contendo a mesma concentração de sal como a do carregamento e extraída com 6 CV de tampão Tris 50 mM, pH 7,5. O segundo experimento foi conduzido sob condições de fluxo transpassante. O carregamento foi ajustado para 3,03 mg/mL em Na2S04 200 mM e carregado na coluna em um desafio de carregamento de 90 mg/mL de resina. A coluna foi então lavada com 6 CV de um tampão contendo a mesma concentração de sal que a do carregamento, e subseqüentemente extraída com 6 CV de tampão Tris 50 mM, pH 7,5. Em ambas as corridas, as frações de fluxo transpassante e de lavagem foram coletadas para análise de impurezas e de recuperação. Os resultados destas corridas estão relatados na Tabela 4.2.2.

Tabela 4.2.2: Comparação de resultados de partição fraca de HIC com resultados de fluxo transpassante

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Os valores de recuperação de produto sob as condições departição fraca foram comparáveis com os das operações de fluxo transpassante e também foram independentes da alimentação usada nestes experimentos. O desempenho das etapas com respeito à remoção de HCP é significativamente maior sob condições de partição fraca em comparação com a operação de fluxo transpassante.

LRV de HCP através da etapa HIC com qualquer alimentação foi comparável sob condições de fluxo transpassante (LRV ~ 0,4-0,5).Contudo, os valores LRV de HCP para os experimentos realizados sob condições de partição fraca aumentaram de LRV de 1 com o material de carregamento de Proteína A para LRV maior do que 2 com material de carregamento purificado através de colunas de Proteína A e Q Sepharose FF. Sumário

Foi mostrado que outro modo de cromatografia (FflC) opera com sucesso em um modo de partição fraca. Foi mostrado que o desempenho da etapa FflC sob condições de partição fraca é superior em ambas as condições de fluxo transpassante e operações sob condições de ligação mais forte, com respeito à recuperação de produto e remoção de HCP/Proteína A. Uma capacidade de desafio de carregamento alto de 100 mg/mL de resina foi processada com sucesso sob condições de partição fraca, onde > 3 mg/mL de produto ligado na resina (embora as condições ótimas de partição fraca parecem ser ligeiramente melhores do que aquelas para cromatografia de troca aniônica).

Série 5: Hidroxiapatita usando hidroxiapatita de tipo I e Mab-MYA Experimento 5.1 - Triagem de taxa de transferência alta para estabelecer condições WP e FT

Uma triagem de taxa de transferência alta (HTS) foi realizada para identificar as condições de partição fraca e de fluxo transpassante para Mab-MYA com meio de hidroxiapatita cerâmica. Esta triagem variou a concentração de cloreto de sódio e de fosfato de sódio para determinar seu efeito sobre a extensão de ligação de MAB-MYA no meio de hidroxiapatita.

50 uL de meio de hidroxiapatita cerâmica foram carregados em 30 cavidades de uma placa de filtro de 96 cavidades. Cada cavidade foi equilibrada em soluções compostas de concentrações apropriadas de cloreto de sódio e de fosfato de sódio em tampão HEPES 100 mM contendo arginina 100 mM em pH 7,2. As concentrações de cada um dos dois sais na solução são mostradas nas Tabelas 5.1.1 e 5.1.2. Cada condição foi realizada emduplicata. O desafio de carregamento de MAB-MYA em cada uma destas cavidades foi de 5,0 mg/mL de resina.

Tabela 5.1.1: Níveis de cloreto de sódio em cada cavidade (em mM)

<table>table see original document page 60</column></row><table>

No primeiro estágio do experimento HTS, cada cavidade foi

equilibrada nas condições de cloreto de sódio e de fosfato de sódio como descritas nas Tabelas 5.1.1 e 5.1.2, em uma razão volumar de fase 6:1 (300 uL de solução: 50 uL de resina). A placa foi agitada por 20 minutos, permitindo que o equilíbrio fosse alcançado. A solução foi então removida 10 por centrifugação da placa de filtro. Este ciclo de equilíbrio foi repetido três vezes.

No segundo estágio, a resina em cada cavidade foi desafiada com uma solução concentrada de MAb-MYA para o desafio de carregamento de proteína apropriado com uma razão volumar de 6:1 (300 uL de solução: 50uL de resina) na concentração apropriada de cloreto de sódio e de fosfato de potássio. Uma solução de Mab-MYA a 7,0 mg/mL em NaCl 50 mM, HEPES 100 mM, argininalOO mM, pH 7,2 foi usada como solução de estoque. A placa carregada foi agitada por 20 minutos, permitindo que a resina e a solução equilibrassem. O sobrenadante foi removido da placa de filtro por centrifugação e coletado em uma placa de coleta. A concentração de proteínano sobrenadante em cada cavidade foi determinada em A280nm.

No terceiro estágio, a resina foi lavada por adição de soluções de cloreto de sódio e de fosfato de sódio nas condições especificadas listadas nas Tabelas 5.1.1 e 5.1.2. O sobrenadante foi removido após agitação por 20 5 minutos.

No quarto estágio, um tampão compreendido de fosfato de sódio 100 mM, NaCl 1 M, pH 7,2 foi adicionado para remover a proteína restante que estava ligada na resina.

Os coeficientes de partição foram calculados para cada 10 cavidade usando a massa eluída do estágio 4 e a concentração de produto do estágio 2, e são mostrados na Tabela 5.1.3.

Tabela 5.1.3: Coeficientes de partição (Kp) para a triagem HTS de 96 cavidades para MAB-MYO

<table>table see original document page 61</column></row><table>Como mostrado na Tabela 5.1.3, o valor de Kp pode ser usado 15 para descrever as regiões onde MAB-MYA se liga no meio de hidroxiapatita com forças diferentes. A força de ligação de MAB-MYA em meio de hidroxiapatita cerâmica pode ser manipulada pela variação das condições de concentração de cloreto de sódio e de fosfato de sódio nas zonas de fluxo transpassante (Kp=<0,l), de partição fraca (0,KKp<20), e de ligação 20 (Kp=>20).

Experimento 5.2 - Corridas em coluna sob condições WP

Os experimentos aqui discutidos foram especificamente realizados para realçarem o desempenho superior da etapa cHA sob condições de partição fraca. Os experimentos foram portanto realizados sob condições 25 correspondendo a uma faixa de coeficientes de partição identificados pelatriagem HTS (Experimento 5.1). Doze corridas foram conduzidas, com desafios de carregamento de produto de 100 mg/mL de resina. Cromatografia em Mabselect Protein A

A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi purificada 5 usando uma coluna MabSelect. Uma coluna Mabselect Protein A foi equilibrada com 5 volumes de coluna de Tris 50 mM / NaCl 150 mM, pH 7,5 em uma vazão de 300 cm/h. A coluna foi então carregada com um carregamento de aproximadamente 40 mg de produto / mL de resina. Isto foi seguido por uma lavagem de 10CV em arginina 1 M, Tris 50 mM, pH 7,5 e 10 uma lavagem de 5CV contendo Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5. A coluna foi então eluída usando arginina 100 mM, NaCl 50 mM, pH 3,0. A reunião de produto foi neutralizada para pH 7,2 usando HEPES 2 M pH 8,0. Cromatografia em hidroxiapatita cerâmica

As reuniões de anticorpo parcialmente purificado da etapa 15 Proteína A foram adicionalmente purificadas sobre hidroxiapatita. O diâmetro de coluna foi de 0,5 cm e a altura de coluna foi de 10 cm.

Para todas as etapas de cromatografia de hidroxiapatita descritas na série 5 de Experimento, as seguintes condições foram usadas (exceções são anotadas nas descrições experimentais individuais). 20 Vazão operacional - 150-240 cm/h.

Equilíbrio 1 - fosfato de sódio 300 mM, NaCl 1,0 M, pH 6,8 (3 volumes de coluna).

Equilíbrio 2 - fosfato de sódio 5-30 mM, NaCl 50-760 mM, Arg 100 mM, HEPES 100 mM pH 7,2 (5 volumes de coluna). 25 Lavagem - fosfato de sódio 5-30 mM, NaCl 50-760 mM, Arg

100 mM, HEPES 100 mM pH 7,2 (5-10 volumes de coluna).

A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 seguido por outra etapa de equilíbrio 2. A coluna foi então carregada com 100 mg de produto/mL de resina com o pico de Proteína A daetapa prévia (ajustado para o tampão de equilíbrio 2 apropriado), e o produto foi recuperado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e em alguns volumes de coluna da fração de lavagem. Os resultados destes experimentos são apresentados na Tabela 5.2.1. e na Figura 11.

Estas condições de carregamento foram nas regiões de fluxo transpassante, de partição fraca (WP) e de ligação. A triagem de taxa de transferência alta descrita em Experimento 5.1 proporciona estimativas para o valor de coeficiente de partição (Kp) e o produto ligado (mg/mL de resina) sob estas condições de concentração de cloreto e de fosfato. O produto ligado foi determinado dos volumes de aparecimento de produto das corridas de coluna. Resultados de HCP e de Proteína A destes experimentos são apresentados na Tabela 5.2.1 e na Figura 11.

Tabela 5.2.1: Remoção de HCP e de Proteína A sob condições de fluxo

transpassante, de partição fraca, e de ligação

<table>table see original document page 63</column></row><table> É evidente dos dados apresentados na Tabela 5.2.1 e na Figura

11 que o desempenho da etapa cHA melhora significativamente com respeito à redução de contaminantes à medida que movemos das condições de fluxo transpassante para condições de partição fraca, enquanto que a recuperação deproduto é comparável. Operação sob condições correspondentes a um aumento adicional no coeficiente de partição (i.e., operando na região de ligação) não proporciona beneficio adicional com respeito à remoção de contaminantes. Contudo, a recuperação de produto através da etapa começa a cair sob condições de ligação forte. Assim, a janela de operação ótima para esta separação corresponde àquela de cromatografia de partição fraca. Sob estas condições, log de redução de Proteína A > 2 e log de redução de proteína de célula hospedeira > 1,2 foram obtidos em um desafio de carregamento de 100 mg de produto / mL de resina. Níveis de produto ligado sob condições de partição fraca, neste exemplo, estiveram entre 3,0 e 10,2 mg/mL de resina.

Sumário

Foi mostrado que um terceiro modo de cromatografia (hidroxiapatita ) opera com sucesso em um modo de partição fraca.

Proteína

A e HCP ligam-se mais fortemente do que o anticorpo produto na resina cerâmica, e são retidos mais fortemente sob condições WP. Valores maiores de Kp ma região WP estão entre 10 e 20 em alguns casos, o que ainda proporcionará boa recuperação de produto (> 90%). Níveis menores de Kp dão recuperações correspondentemente mais altas.

Neste exemplo foi mostrado que o desempenho da etapa de coluna pode ser otimizado primariamente por intermédio da escolha do coeficiente de partição usado para correr a coluna. O coeficiente de partição em hidroxiapatita é uma função complexa do pH, do sal (concentração e tipo), do fosfato, e dos componentes do tampão. Todas estas variáveis em geralpossuem um impacto sobre o desempenho da etapa de coluna. A abordagem aqui apresentada proporciona um meio simples de relacionar o impacto de mudança de qualquer uma destas variáveis sobre o desempenho da coluna. A abordagem de 'coeficiente de partição' unificada apresentada neste exemplo abre a possibilidade de operação em um espaço de operação mais amplo nestemodo de cromatografia do que tem sido anteriormente feito. As condições de partição fraca para desempenho ótimo podem ser facilmente identificadas usando os métodos HTS acima descritos.

Série 6 - Hidroxiapatita usando hidroxiapatita cerâmica de tipo I e Mab-

A5T

Experimento 6.1 - Triagem de taxa de transferência alta para estabelecer condições WP e FT

Uma triagem de taxa de transferência alta (HTS) foi realizada para identificar as condições de partição fraca e de fluxotranspassante para Mab-A5T com meio de hidroxiapatita cerâmica. Esta triagem variou pH, concentrações de cloreto de sódio e de fosfato de sódio para determinar seu efeito sobre a extensão de ligação de MAB-A5T no meio de hidroxiapatita.

50 uL de meio de hidroxiapatita cerâmica foram adicionadosem 36 cavidades de uma placa de filtro de 96 cavidades. Cada cavidade foi equilibrada com soluções compostas de concentrações apropriadas de cloreto de sódio e de fosfato de sódio em um tampão HEPES 50 mM contendo arginina 50 mM quer em pH 7,0 quer em pH 8,0. As concentrações dos dois sais na solução são mostradas em Tabelas 6.1.1 e 6.1.2. as condições mostradas nas colunas 1-3 foram realizadas em pH 7,0, e colunas 4-6 foram realizadas em pH 8,0. O desafio de carregamento de MAB-A5T em cada uma destas cavidades foi de 5,0 mg/mL de resina.

Tabela 6.1.1: Níveis de cloreto de sódio em cada cavidade (em mM)

<table>table see original document page 65</column></row><table>Tabela 6.1.2: Níveis de fosfato de sódio em cada cavidade (em mM)

<table>table see original document page 66</column></row><table>

No primeiro estágio do experimento HTS, cada cavidade foi equilibrada nas condições de cloreto de sódio, fosfato de sódio e pH como descritas em Tabelas 6.1.1 e6.1.2em uma razão volumar de fases de 6:1 (300 5 uL de solução: 50 uL de resina). A placa foi agitada por 20 minutos, permitindo que equilíbrio fosse alcançada. A solução foi então removida por centrifügação da placa de filtro. Este ciclo de equilíbrio foi repetido três vezes.

No segundo estágio, a resina em cada cavidade foi desafiada 10 com uma solução concentrada de MAb-A5T para o desafio de carregamento de proteína apropriado com uma razão de volume de 6:1 (300 uL de solução: 50 uL de resina) em concentração de cloreto de sódio e de fosfato de sódio e em pH apropriados. Uma solução de Mab-A5T a 6,9 mg/mL em HEPES 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0 foi usada como solução de estoque. A placa 15 carregada foi agitada por 20 minutos, permitindo que a resina e a solução equilibrassem. O sobrenadante foi removido da placa de filtro por centrifügação e coletado em uma placa de coleta. A concentração de proteína no sobrenadante em cada cavidade foi determinada por absorbância em A280nm.No terceiro estágio, resina foi lavada pela adição de soluções

de cloreto de sódio, de fosfato de sódio e em pH nas condições especificadas listadas em Tabelas 6.1.1 e 6.1.2. O sobrenadante foi removido após agitação por 20 minutos.

No quarto estágio, um tampão compreendendo fosfato desódio 100 mM, NaCl 1 M pH 7,2 foi adicionado para remover a proteína resultante que estava ligada na resina. Os coeficientes de partição foram calculados para cada cavidade usando a massa eluída do estágio 4 e a concentração de produto do estágio 2, e são mostrados em Tabela 6.1.3. 5 Tabela 6.1.3: Coeficientes de partição (Kp) para a triagem HTS para Mab-A5T

<table>table see original document page 67</column></row><table>

Como mostrado em Tabela 6.1.3, o valor de Kp pode ser usado para identificar as regiões onde MAB-A5T se liga no meio de hidroxiapatita com forças diferentes. A força de ligação de MAB-A5Tem meio de 10 hidroxiapatita cerâmica pode ser manipulada pela variação das condições de NaCl, fosfato e pH em zonas de fluxo transpassante, de partição fraca, e de ligação.

Experimento 6.2 — Corridas em coluna sob condições WP

Experimentos foram realizados para realçar o desempenhosuperior da etapa cHA sob condições de partição fraca. Os experimentos foram portanto realizados sob condições correspondendo a uma faixa de coeficientes de partição identificados pela triagem de HTS (Experimento 6.1). Oito corridas foram conduzidas, com desafios de carregamento de produto de 110 mg/mL de resina. Cromatografia em Mabselect Protein A

A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi purificada usando uma coluna MabSelect. Uma coluna Mabselect Protein A foi equilibrada com 5 volumes de coluna de Tris 50 mM / NaCl 150, pH 7,5 em uma vazão de 300 cm/h. A coluna foi então carregada em um desafiode carregamento de aproximadamente 40 mg de produto/mL de resina. Isto foi seguido por uma lavagem de 5CV em NaCl 1 M, Tris 50mM, pH 7,5 e uma lavagem de 5CV contendo Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5. A coluna foi então eluída usando arginina 100 mM, NaCl 50 mM, pH 3,0. A 5 reunião de produto foi neutralizada para pH 7,2 usando HEPES 2 M pH 8,0.

Cromatografía em hidroxiapatita cerâmica

As reuniões de anticorpo particularmente purificado da etapa de Proteína A foram adicionalmente purificadas sobre hidroxiapatita. O 10 diâmetro da coluna foi de 0,5 cm e a altura da coluna foi de 10 cm.

Para todas as etapas de cromatografía em hidroxiapatita descritas na série 6 de Experimentos, as seguintes condições foram usadas (exceções são anotadas nas descrições experimentais individuais).

Vazão de operação — 150-240 cm/h 15 Equilíbrio 1 - fosfato de sódio 300 mM, NaCl 1,0 M, pH 6,8 (3

volumes de coluna)

Equilíbrio 2 — fosfato de sódio 2-32 mM, NaCl 50-400 mM, Imidazol 5 mM, glicina 50 mM, HEPES 10 mM, pH 7,0 (5 volumes de coluna) Lavagem Mesmo que Equilíbrio 2.

A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 seguido por outra etapa de equilíbrio 2. A coluna foi então carregada com 110 mg de produto/mL de resina com o pico de Proteína A das várias etapas anteriores (ajustado para o tampão de equilíbrio 2apropriado), e o produto foi recuperado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e em alguns volumes de coluna da fração de lavagem. Os resultados destes experimentos são apresentados em Tabela 6.2.1 e Figura 12.

Tabela 6.2.1: Coeficientes de partição para Mab-A5T sobre resina cHA e<table>table see original document page 69</column></row><table>

As condições de operação nestes experimentos correspondemàs regiões de fluxo transpassante, de partição fraca (WP) e de ligação. O experimento HTS descrito em Experimento 6.1 proporciona estimativas para o valor do coeficiente de partição (Kp) sob estas condições de pH, e de concentrações de cloreto e de fosfato. As corridas em Tabela 6.2.1 são .classificadas pelos coeficientes de partição. O produto ligado foi determinado pela medição da proteína na extração de coluna usando absorbância em UV. Este método de determinação do produto ligado tipicamente subestima a quantidade de produto ligado durante o carregamento devido à dessorção gradual do produto durante a lavagem. Resultados de remoção de HMW relacionado com produto e HCP, bem como resultados de recuperação de produto destes experimentos são apresentados em Figura 12.

Está claro dos dados apresentados em Figura 12 que o desempenho da etapa cHA melhora significativamente com respeito à redução de HCP e FEVIW à medida que movemos das condições de fluxo transpassante para as condições de partição fraca, enquanto que a recuperação de produto é mantida em > 80%. Operação sob condições correspondendo a um aumento adicional no coeficiente de partição (i.e., operação na região de ligação) não proporciona benefício adicional com respeito à remoção de contaminantes. Contudo, a recuperação de produto por intermédio da etapa começa a cair sob condições de ligação forte. Assim, a janela de operação ótima para esta separação corresponde àquela da cromatografia de partição fraca. Sob estas condições, uma redução de 4 vezes relacionada à espécie FfMW e log deredução de HCP > 1,4 foram obtidos em um desafio de carregamento de 110 mg de produto/mL de resina. Os níveis de produto ligados sob condições de partição fraca, neste exemplo, estiveram entre 1,6 e 6,7 mg/mL de resina. SumárioUm segundo exemplo foi apresentado em hidroxiapatita onde

foi mostrado que operação sob cromatografia de partição fraca proporciona desempenho melhorado com respeito à redução de HCP e HMW e à recuperação de produto (> 80%). Como nos exemplos anteriores, o desempenho da etapa foi otimizado primariamente por intermédio da escolha de coeficientes de partição usados para correr a coluna. A abordagem aqui apresentada proporciona um meio simples de relacionar o impacto de mudança de qualquer uma das variáveis ((pH, sal fosfato, imidazol, glicina, HEPES, etc.,) no desempenho da coluna. As condições de partição fraca para desempenho ótimo podem ser facilmente identificadas usando métodos HTS descritos neste exemplo. A abordagem aqui apresentada abre a possibilidade de operar em um espaço de operação mais amplo neste modo de cromatografia do que antes tem sido feito. A região WP ótima neste exemplo corresponde aos coeficientes de partição entre 2 e 20.

Série 7 — Hidroxiapatita usando hidroxiapatita cerâmica de tipo I e 20 Mab-MYO

Experimento 7.1— Triagem de taxa de transferência alta para estabelecer condições de FT, de WP e de ligação forte

Uma triagem de taxa de transferência alta (HTS) foi realizada para identificar condições de fluxo transpassante, de partição fraca e de 25 ligação para Mab-MYO com meio de hidroxiapatita cerâmica. Esta triagem variou o pH, e a concentração de arginina/glicina, HEPES, fosfato de sódio e cloreto de sódio para determinar seu efeito sobre a extensão de ligação de MAB-MYO no meio de hidroxiapatita.

Os procedimentos de HTS usados neste exemplo foramsimilares àqueles descritos nas Série 5 e Série 6 e não são discutidos aqui. Valores de Kp preditos derivados de um ajuste de superfície de resposta aos dados de HTS foram usados para escolher condições específicas para experimentos em coluna.

Experimento 7.2 — Corridas em coluna sob condições de WP

Os experimentos aqui discutidos foram realizados sob condições correspondendo a uma faixa de coeficientes de partição identificados pelos experimentos de HTS. Estes experimentos foram especificamente realizados para realçarem o desempenho superior da etapa cHA sob condições de partição fraca para a remoção de HCP e de espécies HMW relacionadas com produto. Quatro corridas foram conduzidas com um desafio de carregamento de produto de 55 mg/mL de resina. O desafio de carregamento usado nestes experimentos é baixo para cromatografia de partição fraca, mas é típico para a operação de fluxo transpassante. Não foifeita tentativa nestes experimentos para otimizar o desafio de carregamento para cromatografia de partição fraca.

As reuniões de anticorpo parcialmente purificado da etapa de Proteína A foram usadas nestes experimentos. O diâmetro de coluna foi 0,5 cm e a altura de coluna foi 10 cm.

Para todas as etapas de cromatografia de hidroxiapatitadescritas na série 7 de Experimentos, as seguintes condições foram usadas (exceções são anotadas nas descrições experimentais individuais).

Vazão de operação 50 - 240 cm/h.

Equilíbrio 1 fosfato de sódio 300 mM, NaCl 1,0M, pH 6,8 (2-5 volumes de coluna).

Equilíbrio 2 fosfato de sódio 1-8 mM, NaCl 50-

1.750 mM, Arg 12-50 mM, HEPES 20-50 mM pH 7,0 (5 volumes de coluna).

Lavagem Mesma como Equilíbrio 2

A coluna foi equilibrada com 2-5 volumes de coluna detampão de equilíbrio 1 seguido por 5 volumes de coluna de equilíbrio 2. A coluna foi então carregada para 55 mg produto/mL de resina com o pico de Proteína A (ajustado para o tampão de equilíbrio 2 apropriado), e o produto foi recuperado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e em 5 alguns volumes de fração de lavagem. Os resultados destes experimentos são apresentados em Tabela 7.2.1 e Figura 13.

Tabela 7.2.1: Coeficientes de partição para Mab-MYO sobre resina de cHA e o modo de operação correspondente

<table>table see original document page 72</column></row><table>* Condição de Kp ótimo, veja Figura 1As condições de operação nestes experimentos correspondem

às regiões de fluxo transpassante, de partição fraca (WP) e de ligação. O experimento de HTS descrito em Experimento 7.1 proporciona estimativa para o valor do coeficiente de partição (Kp) sob estas condições de pH, de concentração de cloreto, de fosfato, de glicina / arginina e HEPES. As corridas em Tabela 7.2.1 são classificadas pelos coeficientes de partição. O produto ligado foi determinado pela medição da proteína na extração de coluna usando absorbância em UV. Este método de determinação de produto ligado tipicamente subestima a quantidade de produto ligado durante o carregamento devido à dessorção gradual do produto durante a lavagem.Também são apresentados na Figura 13 os resultados de remoção de Peso Molecular Alto (HMW) relacionado com produto e de recuperação de produto.

É evidente dos dados apresentados em Figura 13 que o desempenho da etapa de cHA melhora significativamente com respeito à redução de HMW à medida que movemos das condições de fluxo transpassante para as condições de partição fraca, enquanto que a recuperaçãode produto é >80%. Operação sob condições correspondendo a um aumento adicional em coeficiente de partição (i.e., operação na região de ligação) não proporciona benefício adicional com respeito à remoção de contaminantes.

Contudo, a recuperação de produto por intermédio da etapa 5 começa a cair sob condições de ligação forte. Assim, a janela de operação ótima para esta separação correspondem àquela da cromatografia de partição fraca. Sob estas condições, foi obtida uma redução de 20 vezes das espécies HMW relacionadas com produto. Os níveis de produto ligados sob as condições de partição fraca, neste exemplo, estiveram entre 5,1 e 9,5 mg/mL 10 de resina. Sumário

Um segundo exemplo foi apresentado em hidroxiapatita onde foi mostrado que operação sob cromatografia de partição fraca proporciona desempenho melhorado com respeito à redução de HMW com boa 15 recuperação de produto (> 80%). Espécies HMW relacionadas com produto e espécies HMW se ligam mais fortemente na resina cerâmica do que o anticorpo produto, e são retidas mais fortemente sob condições de WP. A região de WP neste exemplo corresponde aos coeficientes de partição entre 8 e20.Mais uma vez foi mostrado de novo que o desempenho da

etapa de coluna pode ser otimizado primariamente por intermédio da escolha de coeficientes de partição usados para correr a coluna. A abordagem aqui apresentada proporciona um meio simples de relacionar o impacto da mudança de qualquer uma das várias variáveis (pH, sal, fosfato, arginina, HEPES etc.,) no desempenho da coluna. As condições de partição fraca para desempenho ótimo podem ser facilmente identificadas usando métodos HTS descritos neste exemplo. A abordagem aqui apresentada abre a possibilidade de operar em um espaço de operação mais amplo neste modo de cromatografia do que antes tem sido feito.Também é aqui digno de nota que o conceito de cromatografia de partição fraca também funciona em sistemas que não são conduzidos apenas por interações de carga. A abordagem geral descrita neste pedido pode ser aplicada com sucesso em sistemas complexos tais como HIC e também 5 hidroxiapatita. Por exemplo, em adição ao pH de operação ótimo, várias outras variáveis tais como sais NaCl, fosfato, arginina / glicina, espécies tampão, bem como o tipo de resina podem todas influenciar no desempenho da etapa em hidroxiapatita. Contudo, poder-se-ia facilmente identificar a janela de WP pela realização de experimentos de ligação em batelada simples com apenas o produto de interesse.

Série 8 — Tampão zwitteriônico para eluição de Proteína A e subseqüentes etapas de troca iônica

Uma cultura contendo um anticorpo monoclonal foi purificada usando a resina Mabselect. Uma coluna Mabselect Protein A foi equilibrada com 5 volumes de coluna of Tris 50 mM / NaCl 150 mM, pH 7,5. A coluna foi então carregada em um carregamento de aproximadamente 40 mg de produto/mL de resina. Isto foi seguido por uma lavagem de 5CV em NaCl 1 M, Tris 50mM, pH 7,5 e uma lavagem de 5CV contendo Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5. A coluna foi então eluída usando HEPES 30m M, pH 3,1. A reunião de produto foi neutralizada para pH 7,2 usando HEPES 1 M pH 8,0, resultando em uma concentração de HEPES total de 55 mM. Em pH 7,2, o HEPES contribui com força iônica de 17 mM para o tampão.

Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas em suas totalidades e para todos os propósitos na mesma extensão se cada pedido de patente ou patente ou publicação individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado como referência em sua totalidade para todos os propósitos. A extensão na qual as publicações e patentes ou pedidos de patente incorporados como referência contradizem a descrição contida neste relatório descritivo, o relatório descritivo éintencionado para substituir e/ou preceder qualquer tal material contraditório.

Todos os números expressando quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim por diante usados no relatório descritivo e nas reivindicações são para serem entendidos como estando modificados em todas as situações pelo termo "cerca de". Conseqüentemente, a não ser que seja indicado ao contrário, os parâmetros numéricos descritos no relatório descritivo e nas reivindicações anexadas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas almejadas para serem obtidas pela presente invenção. Pelo menos, e não como uma tentativa para limitar opedido da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser entendido à luz do número de dígitos significativos e de abordagens de arredondamento ordinárias.

Muitas modificações e variações desta invenção podem ser feitas sem se desviarem do espírito e do escopo, como serão evidentes para aquelas pessoas experientes na técnica. As modalidades específicas aqui descritas são oferecidas apenas por meio de exemplo e em nenhum modo significam que são limitantes. É intencionado que o relatório descritivo e os exemplos sejam considerados apenas exemplares, com um escopo e um espírito verdadeiros da invenção sendo indicados pelas seguintes reivindicações.

Claims

1. Método de recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio; erecuperar o produto purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

2. Método de recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1; erecuperar o produto purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

3. Método de recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de produto por mL de meio e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; erecuperar o produto purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que as condições de operação são identificadas em uma etapa de triagem.

5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que as condições de operação compreendem níveis de pH e forças iônicas.

6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as condições de operação adicionalmente compreendem concentrações de sal.

7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que as condições de operação adicionalmente compreendem concentrações de excipiente.

8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelofato de que as condições de operação adicionalmente compreendem concentrações de fosfato, concentrações de cálcio, concentrações de arginina, concentrações de glicina, e concentrações de HEPES.

9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 3, caracterizado pelo fato de que as condições de operação compreendem níveis de contra-ligante e níveis de pH.

10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que as condições de operação adicionalmente compreendem concentrações de imidazol.

11. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizadopelo fato de que a etapa de triagem usa estudos de ligação em batelada.

12. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que a etapa de triagem usa estudos de ligação em coluna.

13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os estudos de ligação em coluna são estudos de eluição em gradiente.

14. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que os estudos de ligação em coluna são estudos de eluição isocrática

15. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 5 mg de produto por mL de meio.

16. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 10 mg de produto por mL de meio.

17. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 20 mg de produto por mL de meio.

18. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 30 mg de produto por mL de meio.

19. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 40 mg de produto por mL de meio.

20. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 50 mg de produto por mL de meio.

21. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 60 mg de produto por mL de meio.

22. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o valor do coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,2 a cerca de 20,0.

23. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o valor do coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,2 a cerca de 10,0.

24. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o valor do coeficiente de partição está dentro da faixa decerca de 1,0 a cerca de 5,0.

25. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o valor do coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 5,0. 5

26. Método de acordo com a reivindicação 2, caracterizadopelo fato de que o valor do coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 1,5.

27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o produto é uma proteína selecionada do grupo consistindo de proteínas de fusão, proteínas contendo Fc, imunoconjugados, citocinas, interleucinas, hormônios, e enzimas terapêuticas.

28. Método de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que a proteína contendo Fc é um anticorpo.

29. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15 3, caracterizado pelo fato de que o meio é um meio de troca iônica carregado.

30. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que o meio de troca iônica carregado é uma resina de troca aniônica.

31. Método de acordo com a reivindicação 29, caracterizado 20 pelo fato de que o meio de troca iônica carregado é uma resina de trocacatiônica.

32. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o meio é uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica.

33. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o meio é uma resina de hidroxiapatita.

34. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o meio é uma resina de cromatografia de afinidade de metal imobilizado.

35. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que as uma ou mais impurezas são selecionadas do grupo consistindo de proteínas de célula hospedeira, ácidos nucleicos, variantes de produto, endotoxinas, e Proteína A.

36. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que as impurezas adicionalmente compreendem vírus.

37. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que as impurezas compreendem proteínas de célula hospedeira com uma concentração no produto purificado de não maior do que cerca de 100 ng de proteínas de célula hospedeira por mg de produto.

38. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que as impurezas compreendem proteínas de célula hospedeira com uma concentração no produto purificado de não maior do que cerca de 250 ng de proteínas de célula hospedeira por mg de produto.

39. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que as impurezas compreendem proteínas de célula hospedeira com uma concentração no produto purificado de não maior do que cerca de 500 ng de proteínas de célula hospedeira por mg de produto.

40. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado 20 pelo fato de que as impurezas compreendem Proteína A com umaconcentração no produto purificado de não maior do que cerca de 100 ng de Proteína A por mg de produto.

41. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que as impurezas compreendem Proteína A com uma concentração no produto purificado de não maior do que cerca de 50 ng de Proteína A por mg de produto.

42. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que as impurezas compreendem Proteína A com uma concentração no produto purificado de não maior do que cerca de 10 ng de

43. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que as impurezas compreendem ácidos nucleicos com uma concentração no produto purificado de não maior do que cerca de 1 ng de ácidos nucleicos por mg de produto.

44. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a concentração de variantes de produto no produto purificado é não maior do que cerca de 0,5%.

45. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado 10 pelo fato de que a concentração de variantes de produto no produto purificadoé não maior do que cerca de 2%.

46. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que a concentração de variantes de produto no produto purificado é não maior do que cerca de 5%.

47. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizadopelo fato de que a concentração de variantes de produto no produto purificadoé não maior do que cerca de 10%.

48. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o log de valor de remoção do vírus é maior do que 1,0.

49. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizadopelo fato de que o log de valor de remoção do vírus é maior do que 2,0.

50. Método de acordo com a reivindicação 36, caracterizado pelo fato de que o log de valor de remoção do vírus é maior do que 3,0.

51. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado 25 pelo fato de que o log de valor de remoção das proteínas de célula hospedeiraé pelo menos 1,0.

52. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o log de valor de remoção das proteínas de célula hospedeira é pelo menos 2,0.

53. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o log de valor de remoção das proteínas de célula hospedeira é pelo menos 3,0.

54. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o log de valor de remoção de Proteína A é pelo menos 1,0.

55. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o log de valor de remoção de Proteína A é pelo menos 2,0.

56. Método de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o log de valor de remoção de Proteína A é pelo menos 3,0.

57. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que um fluido contendo produto é eluído de uma coluna de Proteína A usando um tampão de eluição de força iônica baixa; o pH e a condutividade do fluido contendo produto são ajustados usando um tampão de neutralização que resulta em não mais do que 20 mM da força iônica do fluido contendo produto, resultando no fluido de carregamento; e no qual tal fluido de carregamento é passado através de um meio de troca iônica.

58. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o fluido de carregamento é passado através de um meio de troca aniônica sem a necessidade de diafiltração.

59. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o pH e a condutividade do fluido contendo produto são ajustados usando um tampão de neutralização que resulta em não mais do que 40 mM da força iônica do fluido contendo produto.

60. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o pH e a condutividade do fluido contendo produto são ajustados usando um tampão de neutralização que resulta em não mais do que 60 mM da força iônica do fluido contendo produto.

61. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o pH e a condutividade do fluido contendo produto sãoajustados usando um tampão de neutralização que resulta em não mais do que 80 mM da força iônica do fluido contendo produto.

62. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição compreende moléculas com um grupo aniônico carregado com um pKa de 2-5.

63. Método de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição adicionalmente compreende moléculas com um grupo catiônico carregado com um pKa de 6,5-10.

64. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado 10 pelo fato de que o tampão de eluição compreende moléculas que sãozwitteríons em pHs entre 4 e 9.

65. Método de acordo com a reivindicação 64, caracterizado pelo fato de que os zwitteríons são selecionados do grupo consistindo de glicina; ácido l,4-piperazina-bis-(etano-sulfônico); glicil-glicina; ácido ciclo- pentano-tetra-l,2,3,4-carboxílico; ácido N,N-bis(2-hidróxi-etil)-2-amino-etano-sulfônico; ácido 2-(N-morfolino)-propano-sulfônico; ácido N-tris(hidróxi-metil)-metil-2-amino-etano-sulfônico; ácido N-2-hidróxi-etil-piperazina-N'-2-etano-sulfônico; ácido 4-(2-hidróxi-etil)-1 -piperazina-propano-sulfônico; N-tris(hidróxi-metil)metil-glicina; glicinamida; N,N-bis(2- hidróxi-etil)glicina; ácido N-tris(hidróxi-metil)metil-2-amino-propano-sulfônico; ou N-glicil-glicina.

66. Método de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo fato de que os zwitteríons compreendem glicina.

67. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado 25 pelo fato de que a força iônica do fluido de carregamento é não maior do que100 mM.

68. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a força iônica do fluido de carregamento é não maior do que 50 mM.

69. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo fato de que a força iônica do fluido de carregamento é não maior do que 25 mM.

70. Método de acordo com a reivindicação 57, caracterizado 5 pelo fato de que a força iônica do fluido de carregamento é não maior do que 10 mM.

71. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o meio remove pelo menos 90% das impurezas selecionadas do grupo consistindo de proteínas de célula hospedeira, ácidos nucleicos, variantes de produto, endotoxinas, e Proteína A.

72. Método de acordo com a reivindicação 71, caracterizado pelo fato de que o meio remove pelo menos 99% das impurezas selecionadas do grupo consistindo de proteínas de célula hospedeira, ácidos nucleicos, variantes de produto, endotoxinas, e Proteína A.

73. Método de acordo com a reivindicação 72, caracterizado pelo fato de que o meio remove pelo menos 99,9% das impurezas selecionadas do grupo consistindo de proteínas de proteínas de célula hospedeira, ácidos nucleicos, variantes de produto, endotoxinas, e Proteína A.

74. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1- 3, caracterizado pelo fato de que a massa total de produto ligado no meio épelo menos 10% da massa total de produto carregada sobre o meio.

75. Método de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo fato de que a massa total de produto ligado no meio é pelo menos 20% da massa total de produto carregada sobre o meio.

76. Método de acordo com a reivindicação 75, caracterizadopelo fato de que a massa total de produto ligado no meio é pelo menos 30% da massa total de produto carregada sobre o meio.

77. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que o carregamento de produto sobre o meio épelo menos de 10 mg de produto por mL de meio.

78. Método de acordo com a reivindicação 77, caracterizado pelo fato de que o carregamento de produto sobre o meio é pelo menos de 50 mg de produto por mL de meio.

79. Método de acordo com a reivindicação 78, caracterizadopelo fato de que o carregamento de produto sobre o meio é pelo menos de 100 mg de produto por mL de meio.

80. Método de acordo com a reivindicação 79, caracterizado pelo fato de que o carregamento de produto sobre o meio é pelo menos de 500 mg de produto por mL de meio.

81. Método de acordo com a reivindicação 80, caracterizado pelo fato de que o carregamento de produto sobre o meio é pelo menos de 1.000 mg de produto por mL de meio.

82. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-3, caracterizado pelo fato de que a concentração de produto no fluido de carregamento é pelo menos de 1 mg de produto por mL de fluido de carregamento.

83. Método de acordo com a reivindicação 82, caracterizado pelo fato de que a concentração de produto no fluido de carregamento é pelo menos de 5 mg de produto por mL de fluido de carregamento.

84. Método de acordo com a reivindicação 83, caracterizado pelo fato de que a concentração de produto no fluido de carregamento é pelo menos de 10 mg de produto por mL de fluido de carregamento.

85. Método de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo fato de que a concentração de produto no fluido de carregamento é pelo menos de 50 mg de produto por mL de fluido de carregamento.

86. Método de acordo com a reivindicação 85, caracterizado pelo fato de que a concentração de produto no fluido de carregamento é pelo menos de 100 mg de produto por mL de fluido de carregamento.

87. Produto purificado, caracterizado pelo fato de ser preparado pelo método como definido na reivindicação 1.

88. Produto purificado, caracterizado pelo fato de ser preparado pelo método como definido na reivindicação 2.

89. Produto purificado, caracterizado pelo fato de serpreparado pelo método como definido na reivindicação 3.

90. Método de recuperação de uma proteína purificada de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: 10 passar o fluido de carregamento através de um meio emcondições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de proteína por mL de meio; erecuperar a proteína purificada no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

91. Método de recuperação de uma proteína purificada de umfluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo 20 menos 0,1; erecuperar a proteína purificada no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

92. Método de recuperação de uma proteína purificada de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo 25 fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de proteína por mL de meio e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; erecuperar a proteína purificada no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

93. Proteína purificada, caracterizada pelo fato de ser preparada pelo método como definido na reivindicação 90.

94. Proteína purificada, caracterizada pelo fato de serpreparada pelo método como definido na reivindicação 91.

95. Proteína purificada, caracterizada pelo fato de ser preparada pelo método como definido na reivindicação 92.

96. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de anticorpo por mL de meio; e recuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna duranteo ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

97. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: passar o fluido de carregamento através de um meio emcondições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

98. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 acerca de 70 mg de anticorpo por mL de meio e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

99. Anticorpo purificado, caracterizado pelo fato de serpreparado pelo método como definido na reivindicação 96.

100. Anticorpo purificado, caracterizado pelo fato de ser preparado pelo método como definido na reivindicação 97.

101. Anticorpo purificado, caracterizado pelo fato de ser preparado pelo método como definido na reivindicação 98.

102. Método de recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio; no qual as condições de operação são identificadas em uma etapa de triagem; erecuperar o produto purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

103. Método de recuperação de um produto purificado de umfluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1; no qual as condições de operação são identificadas em uma etapa de triagem; erecuperar o produto purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

104. Método de recuperação de um produto purificado de umfluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de produto por mL de meio e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; no qual as condições de operação são identificadas em uma etapa de triagem; erecuperar o produto purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

105. Método de recuperação de uma proteína purificada de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos lmg de proteína por mL de meio; no qual as condições de operação são identificadas em uma etapa de triagem; erecuperar a proteína purificada no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

106. Método de recuperação de uma proteína purificada de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1; no qual as condições de operação são identificadas em uma etapa de triagem; erecuperar a proteína purificada no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

107. Método de recuperação de uma proteína purificada de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelofato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de proteína por mL de meio e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; no qual as condições de operação são identificadas em uma etapa de triagem; erecuperar a proteína purificada no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

108. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelofato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos lmg de anticorpo por mL de meio; no qual as condições de operação são identificadas em uma etapa de triagem; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

109. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1; no qual as condições de operação são identificadas em uma etapa de triagem; e recuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna duranteo ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

110. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de anticorpo por mL de meio e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; no qual as condições de operação são identificadas em uma etapa de triagem; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

111. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio de trocaiônica carregado em condições de operação que fazem com que o meio liguepelo menos 1 mg de anticorpo por mL de meio; no qual as condições deoperação compreendem níveis de pH e forças iônicas; e 15 recuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna duranteo ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

112. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: passar o fluido de carregamento através de um meio de trocaiônica carregado em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1; no qual as condições de operação compreendem níveis de pH e forças iônicas; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

113. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de um meio de trocaiônica carregado em condições de operação que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de anticorpo por mL de meio e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; no qual as condições de operação compreendem níveis de pH e forças iônicas; e 5 recuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna duranteo ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

114. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: passar o fluido de carregamento através de uma resina decromatografia de interação hidrofóbica em condições de operação que fazem com que a resina ligue pelo menos 1 mg de anticorpo por mL de resina; no qual as condições de operação compreendem níveis de pH, forças iônicas, e concentrações de sal; e recuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna duranteo ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

115. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de: passar o fluido de carregamento através de uma resina decromatografia de interação hidrofóbica em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1; no qual as condições de operação compreendem níveis de pH, forças iônicas, e concentrações de sal; e recuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

116. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de uma resina decromatografia de interação hidrofóbica em condições de operação que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de anticorpo por mL de meio e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; no qual as condições de operação compreendem níveis de pH, forças iônicas, e 5 concentrações de sal; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

117. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de uma resina de cromatografia de hidroxiapatita em condições de operação que fazem com que a resina ligue pelo menos 1 mg de anticorpo por mL de resina; no qual as condições de operação compreendem níveis de pH, forças iônicas, 15 concentrações de fosfato, concentrações de cálcio, concentrações de arginina, concentrações de glicina, e concentrações de HEPES; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

118. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um 20 fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelofato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de uma resina de cromatografia de hidroxiapatita em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1; no qual as condições de operação 25 compreendem níveis de pH, forças iônicas, concentrações de fosfato, concentrações de cálcio, concentrações de arginina, concentrações de glicina, e concentrações de HEPES; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

119. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de uma resina de cromatografia de hidroxiapatita em condições de operação que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de anticorpo por mL de meio e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; no qual as condições de operação compreendem níveis de pH, forças iônicas, concentrações de fosfato, concentrações de cálcio, concentrações de arginina, concentrações de glicina, e concentrações de HEPES; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

120. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de uma resina de cromatografia de afinidade de metal imobilizado em condições de operação que fazem com que a resina ligue pelo menos lmg de anticorpo por mL de resina; no qual as condições de operação compreendem níveis de contra-20 ligante e níveis de pH; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

121. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de uma resina de cromatografia de afinidade de metal imobilizado em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1; no qual as condições de operação compreendem níveis de contra-ligante e níveis de pH;recuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

122. Método de recuperação de um anticorpo purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de compreender as etapas de:passar o fluido de carregamento através de uma resina de cromatografía de afinidade de metal imobilizado em condições de operação que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de anticorpo por mL de meio e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; no qual as condições de operação compreendem níveis de contra-ligante e níveis de pH; erecuperar o anticorpo purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.