ES2603396T3 - Purificación en tándem de proteínas - Google Patents

Abstract

Un procedimiento de recuperación de un producto de proteína purificada a partir de un fluido de carga, comprendiendo el procedimiento: a) exponer un fluido de carga que comprende un producto proteico a una columna que comprende una primera resina en condiciones en las que el producto se une a la resina; b) recuperar fluido que comprende el producto de la primera resina para producir un primer eluato; c) valorar el primer eluato con un reactivo de valoración a medida que pasa a la segunda resina, en el que el reactivo de valoración altera una o más condiciones del primer eluato tal cuando la relación volumétrica del eluato al reactivo de valoración varía hasta en un 40 %, el cambio en el coeficiente de reparto del producto de la segunda resina es menor del 10 %; d) exponer el eluato valorado a una columna que comprende la segunda resina en condiciones en las que el producto se une a la segunda resina, en el que la columna que comprende la primera resina está dispuesta en tándem con la columna que comprende la segunda resina; y e) recuperar fluido que comprende el producto de la segunda resina para producir un segundo eluato, recuperando de esta manera un producto de proteína purificada a partir de un fluido de carga.

Description

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DESCRIPCION

Purificacion en tandem de protemas Antecedentes

Las protemas deben tener un cierto grado de pureza para aplicaciones comerciales tales como usos terapeuticos y de diagnostico. Las protemas recombinantes se producen ffpicamente en celulas eucariotas o procariotas cultivadas manipuladas mediante ingeniena genetica para expresar un gen que codifica la protema. Las protemas expresadas se separan de las impurezas tales como protemas de la celula huesped no relacionadas, otros componentes de la celula huesped (por ejemplo, ADN, membranas celulares, etc.) y componentes de medios. Las tecnicas de purificacion tales como cromatograffa de afinidad, cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa de exclusion por tamano, cromatograffa de interaccion hidrofoba, cromatograffa de afinidad por metales inmovilizados y cromatograffa de hidroxiapatita, separan las impurezas en base a diferencias en el tamano, carga, solubilidad, hidrofobicidad, y/o afinidad por un ligando. Es una prueba para las empresas en el campo de los productos farmaceuticos desarrollar procedimientos de purificacion que cumplen con las exigentes normas reguladoras de una manera rentable.

Sumario

Con el fin de alcanzar el grado apropiado de pureza para el uso comercial de protemas terapeuticas y de diagnostico, los protocolos de purificacion a menudo requieren el uso de dos o mas etapas de purificacion. Los retos se presentan por los esquemas de purificacion mas complejos. Por ejemplo, grupos de productos procesados por un modo de purificacion deben ser compatibles para su procesamiento en un segundo modo de purificacion. Ademas, grupos de productos parcialmente procesados deben ser almacenados correctamente cuando los sistemas de purificacion aguas abajo no estan inmediatamente disponibles para su uso. Multiples sistemas requieren multiples etapas de muestreo y validacion para garantizar un funcionamiento coherente y correcto. Los sistemas que integran multiples modos de purificacion reducinan potencialmente la complejidad de los esquemas de purificacion actuales, mejorando asf la eficiencia y reduciendo el coste de la manipulacion de protemas manufacturadas.

La presente divulgacion proporciona, entre otras cosas, procedimientos de purificacion de protemas utilizando sistemas en los que las unidades de purificacion estan unidas en tandem y que permiten el funcionamiento robusto de unidades de purificacion. Los procedimientos que mantienen la robustez sobre las variaciones en los parametros de funcionamiento (por ejemplo, velocidad de la bomba, adicion volumetrica de reactivos de valoracion, etc.) requieren menos control de realimentacion y son mas rentables, de ese modo, en la practica, lo que reduce el coste de produccion de las protemas purificadas. La integracion de unidades de purificacion elimina la necesidad de almacenar reservas de productos parcialmente procesados entre ejecuciones. El producto puede procesarse en un solo turno, reduciendo el tiempo de purificacion. La integracion tambien reduce los requisitos de muestreo, validacion y documentacion (por ejemplo, el muestreo de la carga biologica, documentacion registro de lotes, etc.). Las variaciones en parametros tales como caudales, presion de retorno y mezcla del reactivo de valoracion y el eluato entre columnas pueden alterar la union del producto y comprometer la recuperacion y la calidad del producto. Las caractensticas de los presentes procedimientos proporcionan una alta tolerancia a tales variaciones.

De acuerdo con ello, en un aspecto, la presente divulgacion proporciona procedimientos de recuperacion de un producto purificado (por ejemplo, un producto de protema, por ejemplo, un anticuerpo) de un fluido. En algunas formas de realizacion, un procedimiento incluye: a) exponer un fluido de carga que comprende un producto de protema a una columna que comprende una primera resina en condiciones en las que el producto se une a la resina; b) recuperar fluido que comprende el producto de la primera resina para producir un primer eluato; c) valorar el primer eluato con un reactivo de valoracion a medida que pasa a la segunda resina, d) exponer el eluato valorado a una columna que comprende la segunda resina en condiciones en las que el producto se une a la segunda resina, en el que la columna que comprende la primera resina esta dispuesta en tandem con la columna que comprende la segunda resina; y e) recuperar fluido que comprende el producto de la segunda resina para producir un segundo eluato, recuperando de esta manera un producto de protema purificada a partir de un fluido de carga.

En algunas realizaciones, un reactivo de valoracion altera una o mas condiciones del primer eluato tal, cuando la relacion volumetrica del eluato frente al reactivo de valoracion vana hasta el 40 %, el cambio en el coeficiente de reparto (Kp) del producto para la segunda resina es menos del 10 %.

Un primer eluato se puede valorar con un reactivo de valoracion en una diversidad de proporciones volumetricas. En algunas realizaciones, un primer eluato se valora con el reactivo de valoracion en una proporcion volumetrica de entre aproximadamente 95:5 a 80:20. En algunas realizaciones, un eluato se valora con una proporcion volumetrica fija del reactivo de valoracion.

En algunas realizaciones, el flujo de fluidos a traves de un sistema en tandem de unidades de purificacion se facilita por una o mas bombas. Por ejemplo, en algunas realizaciones, una primera bomba suministra un fluido de carga a una primera resina, una segunda bomba suministra un reactivo de valoracion para el primer eluato. Las bombas pueden hacerse funcionar en una proporcion de caudales que vana en menos del 30 %, 20 %, o 10 %. En algunas realizaciones, un eluato y reactivo de valoracion se hacen pasar a traves de un mezclador antes de la exposicion a una unidad de purificacion posterior. Un funcionamiento en tandem puede incluir opcionalmente un monitor de pH para la

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deteccion de pH en una fase dada de la purificacion (por ejemplo, antes de una unidad de purificacion, la operacion de la cual se ve afectada por el pH).

En algunas realizaciones, los procedimientos de purificacion incluyen hacer pasar un fluido a traves de uno o mas filtros (por ejemplo, un filtro de 0,2 pm). En algunas realizaciones de un procedimiento de purificacion en tandem, se coloca un filtro entre dos columnas.

Ademas de, o como alternativa a los filtros, los solidos se pueden eliminar de los fluidos por precipitacion. En algunas realizaciones, los solidos se precipitan a partir de un fluido usando un floculante polimerico. En algunas realizaciones, los solidos se precipitan a partir de un fluido usando un cation y anion que forman una sal que tiene solubilidad baja (por ejemplo, en el que la constante de producto de solubilidad de una sal que tiene el cation y el anion es menos de aproximadamente 10-4 M 2; por ejemplo, usando calcio y fosfato).

En algunas formas de realizacion, un fluido de carga expuesto a una serie de unidades de purificacion incluye un medio de cultivo celular. Un medio de cultivo celular puede ser uno en el que se han eliminado las celulas (por ejemplo, por centrifugacion). En algunas formas de realizacion, un medio de cultivo celular puede estar libre de suero (por ejemplo, carente de protemas anadidas y/o de productos animales anadidos).

Los procedimientos proporcionados en este documento pueden utilizarse para recuperar los diversos tipos de productos de interes. En muchas realizaciones, un producto es una protema tal como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, fragmento de anticuerpo, anticuerpo de cadena unica, etc.), la protema de fusion Fc, o un producto inmunofarmaceutico modular pequeno (SMIP™). La purificacion de los anticuerpos, protemas de fusion Fc y/o productos inmunofarmaceuticos modulares puede incluir el uso de una resina que se une selectivamente a las inmunoglobulinas, tales como la protema A (proA).

En diversas realizaciones de los procedimientos proporcionados en este documento, un reactivo de valoracion altera una o mas condiciones del primer eluato de tal manera que el producto en el eluato valorado se une a la segunda resina en un modo de particion debil. Por ejemplo, las condiciones de un eluato valorado y una resina puede ser tales que el coeficiente de reparto (Kp) del producto para la resina es 0,1 a 20 (por ejemplo, 0,2 a 10, o 0,5 a 5). En algunas realizaciones, un reactivo de valoracion altera una o mas condiciones del primer eluato de tal manera que la segunda resina se une a al menos 1 mg de producto por ml de la resina (por ejemplo, al menos 5 mg, 10 mg, 20 mg, 40 mg, 50 mg, o 60 mg de producto por ml).

En los procedimientos proporcionados en el presente documento, el pH de un eluato valorado expuesto a una segunda resina puede ser variable.

Los procedimientos establecidos en el presente documento pueden incluir el uso de una resina de intercambio ionico. En algunas realizaciones, la resina de intercambio ionico es una resina de intercambio anionico. En algunas realizaciones, el reactivo de valoracion tiene un pH que esta 0,5 unidades por encima de un pH en el que la resina de intercambio anionico se une al producto en el eluato valorado en un modo de particion debil.

En algunas realizaciones, un reactivo de valoracion comprende una sal. Se puede utilizar un reactivo de valoracion que aumenta la fuerza ionica de un eluato de una primera resina de manera que un producto tal mantiene la union a una segunda resina (por ejemplo, una resina de intercambio ionico) en un intervalo de adiciones de volumen de reactivo de valoracion. En algunas realizaciones, un reactivo de valoracion tiene una concentracion de sal de al menos 50 mM (por ejemplo, al menos 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 1 M, o mas).

En algunas realizaciones, una resina de intercambio ionico utilizada en un procedimiento proporcionado en el presente documento es una resina de intercambio cationico.

Los fluidos procesados por procedimientos proporcionados pueden ser tratados con uno o mas tratamientos de reduccion de virus, tales como la inactivacion por acido, la inactivacion por detergente, el paso a traves de un filtro de reduccion de virus, o una combinacion de los mismos. En algunas realizaciones, un tratamiento de inactivacion de virus usado en un procedimiento no incluye la inactivacion por acido. En algunas formas de realizacion, un procedimiento incluye el tratamiento de un fluido de carga con un detergente antes de exponer el fluido de carga a una primera resina en un sistema en tandem. En algunas realizaciones en las que se usa un filtro de reduccion de virus, una bomba suministra fluido al filtro.

Los procedimientos que pueden incluir los tratamientos de reduccion de viscosidad se pueden incluir, por ejemplo, el calor, la adicion de sal, la alteracion del pH, o una combinacion de los mismos.

En ciertas realizaciones, una primera resina es una resina de protema A, una segunda resina es una resina de intercambio ionico y un producto se recupera de la primera resina en un fluido que comprende un tampon que tiene una pKa que esta cerca de las condiciones en las que el producto eluye a partir de la primera resina y un tampon que tiene una pKa cerca de condiciones en las que el producto se une a la segunda resina en un modo de particion debil. En algunas realizaciones, un producto se recupera a partir de una primera resina en un fluido que comprende un tampon que tiene una pKa mayor que 5,5 (por ejemplo, Tris).

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En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona procedimientos de preparacion de un fluido de carga para la exposicion a una resina de intercambio ionico. Un procedimiento incluye, por ejemplo: a) proporcionar un fluido de carga que comprende un producto de protema que se une a la resina de intercambio ionico y b) anadir un reactivo de valoracion para el fluido de carga, en el que el reactivo de valoracion aumenta la fuerza ionica del fluido de carga de tal manera que el producto mantiene la union a la resina de intercambio ionico en un intervalo de adiciones de volumen de reactivo de valoracion.

En algunas realizaciones, el fluido de carga es un eluato de una resina de protema A.

En algunas realizaciones, un procedimiento incluye exponer el eluato valorado a la resina de intercambio ionico en condiciones en las que el producto se une a la resina.

En algunas realizaciones, la resina de intercambio ionico es una resina de intercambio anionico.

Los procedimientos pueden incluir exponer un fluido de carga (por ejemplo, un segundo eluato) a una o mas resinas adicionales y recuperar fluido que comprende el producto a partir de la(s) resina(s). En algunas formas de realizacion, un fluido de carga se expone a una resina de hidroxiapatita (por ejemplo, una resina de ceramica de hidroxiapatita), una resina de interaccion hidrofoba, una resina de afinidad de metal, una resina de intercambio ionico, o a una combinacion de las mismas.

En otro aspecto, la presente divulgacion proporciona procedimientos de preparacion de un fluido de carga para la exposicion a una resina de intercambio ionico. Un procedimiento incluye, por ejemplo: a) proporcionar un fluido de carga que comprende un producto proteico que se une a la resina de intercambio ionico; y b) anadir un reactivo de valoracion para el fluido de carga, en el que el reactivo de valoracion tiene una concentracion de sal de al menos 50 mM (por ejemplo, al menos 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 1 M, o mas).

En algunas realizaciones, el fluido de carga es un eluato de una resina de protema A.

En algunas realizaciones, un procedimiento incluye exponer el eluato valorado a la resina de intercambio ionico en condiciones en las que el producto se une a la resina.

En algunas realizaciones, la resina de intercambio ionico es una resina de intercambio anionico.

Los procedimientos pueden incluir ademas la exposicion de un fluido de carga (por ejemplo, eluato de una resina de intercambio anionico) a una o mas resinas adicionales y la recuperacion de fluido que comprende el producto de la(s) resina(s). En algunas formas de realizacion, un fluido de carga se expone a una resina de hidroxiapatita (por ejemplo, una resina de ceramica de hidroxiapatita), una resina de interaccion hidrofoba, una resina de afinidad de metal, una resina de intercambio ionico, o a una combinacion de las mismas.

En otro aspecto mas, la presente divulgacion proporciona procedimientos para la recuperacion de un producto de proteico purificado a partir de un fluido de carga. Un procedimiento incluye, por ejemplo: a) exponer un fluido de carga que comprende un producto de protema a una columna que comprende una primera resina en condiciones en las que el producto se une a la resina, en el que la primera resina es una resina de Protema A; b) eluir fluido que comprende el producto de la primera resina para producir un primer eluato, en el que el producto se eluye a partir de la primera resina en un fluido de elucion que comprende un tampon que tiene una pKa que esta cerca de condiciones en las que el producto se eluye de la resina y un tampon que tiene una pKa cerca de condiciones en las que el producto se une a la segunda resina en un modo de particion debil; c) exponer el eluato valorado con un reactivo de valoracion a medida que pasa a la segunda resina; d) exponer el eluato valorado a una columna que comprende la segunda resina en condiciones en las que el producto se une a la segunda resina; y e) recuperar fluido que comprende el producto de la segunda resina para producir un segundo eluato, recuperando de esta manera un producto de protema purificada a partir de un fluido de carga.

En algunas realizaciones, la columna que comprende la primera resina esta dispuesta en paralelo con la columna que comprende la segunda resina. En algunas realizaciones, la segunda resina es una resina de intercambio ionico (por ejemplo, una resina de intercambio anionico, o una resina de intercambio cationico).

Los procedimientos pueden incluir exponer un fluido de carga (por ejemplo, un segundo eluato) a una o mas resinas adicionales y recuperar fluido que comprende el producto a partir de la(s) resina(s). En algunas formas de realizacion, un fluido de carga se expone a una resina de hidroxiapatita (por ejemplo, una resina de ceramica de hidroxiapatita), una resina de interaccion hidrofoba, una resina de afinidad de metal, una resina de intercambio ionico, o a una combinacion de las mismas.

En otro aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos de recuperacion de un producto proteico purificado a partir de un fluido de carga. Un procedimiento incluye, por ejemplo: a) exponer un fluido de carga que comprende un producto de protema a una columna que comprende una primera resina en condiciones en las que el producto se une a la resina, en el que la primera resina es una resina de protema A; b) eluir fluido que comprende el producto de la primera resina para producir un primer eluato, en el que el producto se eluye de la primera resina en un fluido de elucion que comprende un tampon que tiene una pKa mayor que 5,5; c) valorar el primer eluato con un reactivo de

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valoracion a medida que pasa a la segunda resina; d) exponer el eluato valorado a una columna que comprende la segunda resina en condiciones en las que el producto se une a la segunda resina; y e) recuperar fluido que comprende el producto de la segunda resina para producir un segundo eluato, recuperando de esta manera un producto de protema purificada a partir de un fluido de carga.

En algunas realizaciones, la columna que comprende la primera resina esta dispuesta en paralelo con la columna que comprende la segunda resina. En algunas realizaciones, la segunda resina es una resina de intercambio ionico (por ejemplo, una resina de intercambio anionico, o una resina de intercambio cationico).

Los procedimientos pueden incluir exponer un fluido de carga (por ejemplo, un segundo eluato) a una o mas resinas adicionales y recuperar fluido que comprende el producto a partir de la(s) resina(s). En algunas formas de realizacion, un fluido de carga se expone a una resina de hidroxiapatita (por ejemplo, una resina de ceramica de hidroxiapatita), una resina de interaccion hidrofoba, una resina de afinidad de metal, una resina de intercambio ionico, o a una combinacion de las mismas.

En otro aspecto mas, la presente divulgacion proporciona procedimientos para la recuperacion de un producto proteico purificado a partir de un fluido de carga. Un procedimiento incluye, por ejemplo: a) exponer un fluido de carga que comprende un producto proteico a una columna de protema A que comprende condiciones en las que el producto se une a la protema A; b) eluir fluido que comprende el producto de la columna de protema A para producir un primer eluato, en el que el producto se eluye de la primera resina en un fluido de elucion que comprende un tampon que tiene una pKa que esta cerca de condiciones en las que el producto se eluye de la resina y un tampon que tiene una pKa cerca de condiciones en las que el producto se une a la segunda resina en un modo de particion debil; y c) valorar el primer eluato con un reactivo de valoracion a medida que eluye de la columna de protema A, en el que el reactivo de valoracion altera una o mas condiciones del primer eluato de tal manera que el producto en el eluato valorado se une a una resina de intercambio anionico en un modo de particion debil, en el que el reactivo de valoracion altera una o mas condiciones del primer eluato de tal forma que cuando la proporcion volumetrica del eluato al reactivo de valoracion vana hasta el 40 %, el cambio en el coeficiente de reparto del producto para la segunda resina es menos del 10 % y en el que el reactivo de valoracion aumenta la fuerza ionica del eluato de la primera resina de manera que el producto mantiene la union a la segunda resina en un intervalo de adiciones de volumen de reactivo de valoracion; d) exponer el material elrndo a una columna que comprende la resina de intercambio anionico en condiciones en las que el producto se une a la resina de intercambio anionico, en el que la columna de protema A esta dispuesta en tandem con la columna que comprende la resina de intercambio anionico; y e) la recuperacion de fluido que comprende el producto de la resina de intercambio anionico para producir un segundo eluato, recuperando de esta manera un producto proteico purificado a partir de un fluido de carga.

En algunas realizaciones, un primer eluato se valora con el reactivo de valoracion en una proporcion volumetrica de entre aproximadamente 95:5 a 80:20.

En algunas realizaciones, el flujo de fluidos a traves de un sistema en tandem de unidades de purificacion se facilita por una o mas bombas. Las bombas pueden hacerse funcionar en una proporcion de caudales que vana en menos del 30 %, 20 %, o 10 %.

En algunas formas de realizacion, un fluido de carga expuesto incluye un medio de cultivo celular, por ejemplo, un medio de cultivo celular del que se han eliminado las celulas (por ejemplo, mediante centrifugacion).

En algunas formas de realizacion, un producto es una protema tal como un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal, un fragmento de anticuerpo, un anticuerpo de cadena unica, etc.), una protema de fusion Fc, o un producto inmunofarmaceutico modular pequeno (SMIP ™).

En algunas formas de realizacion, las condiciones de un eluato valorado y de una resina pueden ser tales que el coeficiente de reparto (Kp) del producto de la resina es 0,1 a. 20 (por ejemplo, 0,2 a 10, o 0,5 a 5). En algunas realizaciones, un reactivo de valoracion altera una o mas condiciones del primer eluato de tal manera que la segunda resina se une a al menos 1 mg de producto por ml de la resina (por ejemplo, al menos 5 mg, 10 mg, 20 mg, 40 mg, 50 mg, o 60 mg de producto por ml).

En algunas realizaciones, el reactivo de valoracion tiene un pH que esta 0,5 unidades por encima de un pH en el que la resina de intercambio anionico se une al producto en el eluato valorado en un modo de particion debil.

En algunas realizaciones, un reactivo de valoracion comprende una sal. En algunas realizaciones, un reactivo de valoracion tiene una concentracion salina de al menos 50 mM (por ejemplo, al menos 100 mM, 150 mM, 200 mM, 250 mM, 500 mM, 750 mM, 1 M, o mas). Los procedimientos pueden incluir, ademas, la exposicion de un fluido de carga (por ejemplo, un segundo eluato) a una o mas resinas adicionales y a fluido recuperacion adicional que comprende el producto de la(s) resina(s). En algunas formas de realizacion, un fluido de carga se expone a una resina de hidroxiapatita (por ejemplo, una resina de ceramica de hidroxiapatita), una resina de interaccion hidrofoba, una resina de afinidad de metal, una resina de intercambio ionico, o a una combinacion de las mismas.

Tambien se proporcionan sistemas para llevar a la practica los procedimientos proporcionados.

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Breve descripcion de las figuras

La FIG. 1 es una representacion esquematica de un funcionamiento en tandem ejemplar de una columna de protema A (ProA), una columna de intercambio anionico (AEX) y un filtro de reduccion de virus (VRF).

La FIG. 2 muestra una parte de un cromatograma proA-AEX-VRF en tandem en proceso obtenido en un sistema AKTA FPLC, que muestra el pico de elucion y la region de cinta de AEX. Se muestran senal de UV a 280 nm (mAU); presion total del sistema (Pa (psi)); pH del efluente proA neutralizado; y conductividad de efluente de AEX. Las lecturas de pH y presion en cada fase del procedimiento se obtuvieron con sensores en lmea y pueden no ser exactas.

La FIG. La figura 3 muestra un cromatograma proA-AEX-VRF en tandem obtenido a partir de un analisis fuera de lmea de las fracciones pico (volumen de cada fraccion = 1/2 de AEX CV). Cuadrados-concentracion proteica. Cmculos-presion a traves del dispositivo de VRF.

Las FIG. 4A y 4B son graficos que muestran la turbidez en las fracciones pico proA (-0,2 CV) antes y despues de la neutralizacion. La FIG. 4A. Carga floculada y filtrada en lecho corto. La FIG. 4b. Carga filtrada en lecho corto, sin floculacion. Fraccion A5 corresponde a un apice del pico, con la concentracion de protema de 55 mg/ml.

La FIG. 5 es un grafico que muestra el analisis fuera de lmea de la concentracion de protema y el pH de un pico proA fraccionado neutralizado en lmea con un volumen constante de reactivo de valoracion al 12 %.

Las FIG. 6A y 6B son graficos que muestran ejemplos de pH, [Cl-] y Kp como funciones de la relacion de neutralizacion (v). La FIG. 6a. En un modo control (estado actual de la tecnica) de neutralizacion en tandem, donde no se anade sal alguna al tampon de neutralizacion. La FIG. 6B. En un modo robusto (de la invencion) de neutralizacion en tandem, donde se anade la sal al tampon de neutralizacion.

Las FIG. 7A y 7B son graficos que muestran bocetos de funcionales de iso-Kp y pH = f([Cl-]). La FIG. 7A. Modo Control (estado actual de la tecnica). La FIG. 7B. Un modo Robusto (la invencion), que muestra la region de solapamiento.

La FIG. 8 es un grafico que muestra Kp = f(v) simulado para los modos de purificacion de proA-trimetialaminoetilo (TMAE) en tandem Control (cuadrados) y Robusto (cruces) de un MAb de control terapeutico. El grafico muestra tres condiciones ensayadas experimentalmente.

La FIG. 9 es un grafico que muestra la funcion de cambio relativa de Kp, k, para los modos de funcionamiento en tandem Control (cruces) y Robusto (cuadrados). El area resaltada muestra la ventana de funcionamiento robusto.

La FIG. 10 es un grafico que muestra las trazas UV superpuestas obtenidas a diferentes proporciones de neutralizacion, v, en los modos de neutralizacion Control y Robusto.

Las FIG. 11A-11F son graficos que muestran el analisis fuera de lmea de producto en tandem proA-TMAE recogido en fracciones de 1 TMAE CV. Los graficos estan dispuestos de la siguiente manera: lado izquierdo (fig. 11A, 11C, 11E)-modo Control; lado derecho (FIG.11B, 11D, 11F)-modo Robusto; panel superior (Fig. 11A, 11B)-situacion sub-valorada (v = 6,5%); Panel medio (fig. 11C, 11D) -centro punto (v = 11,5 %); panel inferior (fig. 11E, 11F) -situacion sobre-valorada (v = 16,5 %);

Las FIG. 12A y 12B son bocetos de cromatogramas proA-AEX en tandem que muestran concentraciones de componentes de tampon basicos (pKa alta) y acidos (pKa baja) suministrados por las bombas A y B tras la neutralizacion: La FIG. 12A. Estado actual de la tecnica: pH se somete a una fase de expansion debido a la sobre-valoracion. FIG. 12B. Condiciones de la invencion: El tampon tampon basico esta presente en el tampon de elucion en un estado completamente protonado, que proporciona resistencia contra el cambio de pH en la neutralizacion. Las FIG. 13A y 13B son graficos que muestran ejemplos de pH, [Cl-] y Kp como funciones de v para la neutralizacion por lotes. La FIG. 13A. En un modo Control (estado actual de la tecnica), donde no se anade sal alguna al tampon de neutralizacion. La FIG. 13B. En un modo Robusto (proporcionado en el presente documento), donde se anade la sal al tampon de neutralizacion.

Las FIG. 14A y 14B son graficos que muestran ejemplos de los modos Control y Robusto de neutralizacion por lotes. La FIG. 14A. Kp = f (v) grafico que muestra tres situaciones de valoracion; FIG. 14B. Funcion de cambio de Kp relativa, k. El area resaltada muestra la ventana de funcionamiento robusto.

Las FIG. 15A, 15B y 15C son graficos que muestran procedimientos de comparacion de purificacion de productos inmunofarmaceuticos modulares pequenos. La FIG. 15A muestra los resultados de una purificacion AEX control (por lotes). Las FIG. 15B y 15C muestran los resultados de la cromatograffa proA-AEX en tandem a Kp = 1,5 sin Tris en el tampon de elucion de protema A (FIG. 15B) y con Tris en el tampon de elucion (FIG. 15C). Medidas fuera de lmea de pH (diamantes), concentracion proteica (cuadrados) y especies de peso molecular alto (triangulos, cffculos) se representan graficamente.

Las FIG. 16A, 16B y 16C son graficos que muestran una comparacion de los procedimientos para la purificacion de productos inmunofarmaceuticos modulares pequenos. La FIG. 16A muestra los resultados de una purificacion AEX control (por lotes). Las FIG. 16B y 16C muestran los resultados de la cromatograffa proA-AEX en tandem a Kp = 3,0 sin

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Tris en el tampon de elucion de la la protema A (FIG. 16B) y con Tris en el tampon de elucion (FIG. 16C). Medidas fuera de lmea de pH (diamantes), concentracion proteica (cuadrados) y especies de peso molecular alto (HMW) (triangulos, drculos) se representan graficamente.

Definiciones

El termino "anticuerpo", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier inmunoglobulina o fragmento de la misma y abarca cualquier polipeptido que comprende un sitio de union al anffgeno. El termino incluye, pero no se limita a, anticuerpos policlonales, monoclonales, monoespedficos, poliespedficos, no espedficos, humanizados, humanos, de cadena sencilla, quimericos, sinteticos, recombinantes, hffbridos, mutados, injertados y en generados in vitro. El termino «anticuerpo» tambien incluye fragmentos de anticuerpos tales como Fab, F(ab ')2,, Fv, scFv, Fd, dAb, nanocuerpos, receceptores de anffgenos nuevos de inmunoglobulinas (IgNARS), maxicuerpos, minicuerpos, intracuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y otras moleculas que conservan la funcion de union al anffgeno. ^picamente, tales fragmentos comprendeffan un dominio de union a anffgeno.

En ciertas realizaciones, un anticuerpo es uno que comprende una region Ch2/Ch3 y por lo tanto es susceptible de purificacion por cromatograffa de protema A. El termino "region CH2/CH3" se refiere a aquellos residuos aminoaddicos en la region Fc de una molecula de inmunoglobulina que interaccionan con la protema A. En algunas formas de realizacion, una region Ch2/Ch3 comprende una region Ch2 intacta seguida de una region Ch3 intacta y en otras formas de realizacion, comprende una region Fc de una inmunoglobulina. Los ejemplos de protemas que contienen region Ch2/Ch3 incluyen anticuerpos, protemas de inmunoadhesion y protemas de fusion que comprenden una protema de interes fusionada a, o conjugada con, una region Ch2/Ch3.

Un "producto unido" (O), como se usa en el presente documento, se refiere a la cantidad de producto que se une a una resina cuando esta en equilibrio con una corriente de alimentacion.

Un "eluato", como se usa en el presente documento, se refiere a un fluido que ha sido expuesto a una resina. Un eluato puede ser un fluido que incluye un fluido de carga que ha sido expuesto a una resina (por ejemplo, fluido "de circulacion"); un fluido de lavado (por ejemplo, un tampon de lavado) que se ha expuesto a una resina; un fluido de lavado isocratico que ha sido expuesto a una resina; un fluido de elucion que ha sido expuesto a una resina; y combinaciones de los mismos. "Eluatos" incluyen fluidos recuperados a partir de resinas que funcionan en circulacion, en particion debil y en modos cromatograficos de elucion de union.

Una "impureza", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molecula que no sea una protema de interes purificandose que tambien esta presente en una muestra de la protema de interes purificandose. Las impurezas incluyen macromoleculas biologicas tales como un ADN, un ARN, protemas, variantes de protemas, tales como protemas agregadas, especies de alto peso molecular, especies de bajo peso molecular y fragmentos y especies desamidadas; otras protemas de celulas huesped que secretan la protema que se purifica (protemas de celulas huesped); moleculas que son parte de un absorbente utilizado para la cromatograffa que pueden filtrarse en una muestra durante las etapas de purificacion anteriores, tales como la protema A; endotoxinas; restos celulares; y virus.

"Cromatograffa isocratica", como se usa en el presente documento, se refiere a la operacion de una columna cromatografica con un disolvente que no cambia la fuerza durante el peffodo de interes.

Un "lavado esencialmente isocratico", como se usa en el presente documento, se refiere a una solucion que vaffa solo ligeramente a partir de un fluido de carga en la composicion y/o el pH.

Una "carga", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier material que contiene un producto de interes. Un "fluido de carga" se refiere a cualquier lfquido que contiene la carga. En algunas realizaciones, un "fluido de carga" se expone a una resina de purificacion. En algunas formas de realizacion, un fluido de carga es un medio de cultivo celular. Un medio de cultivo celular puede ser aclarado (por ejemplo, para eliminar las celulas o restos celulares).

Un "coeficiente de reparto" (Kp), como se usa en el presente documento, se refiere a la proporcion de equilibrio de la concentracion de producto absorbido a la resina (O) a la concentracion de producto en la solucion (c), en condiciones espedficas de pH de la composicion y a la composicion de solucion. El coeficiente de reparto Kp tambien esta relacionado con las isotermas de adsorcion del producto. El coeficiente de reparto Kp corresponde a la pendiente de la isoterma de adsorcion del producto a concentraciones muy bajas de solucion. Se relaciona con la capacidad maxima de la siguiente manera: Kp = Q/C = Qmax/kd donde Qmaxes la capacidad maxima de la resina para el producto y kd es la constante de disociacion para interaccion «resina-producto». En algunas realizaciones, un coeficiente de reparto se mide con una tecnica de union por lotes. Otras tecnicas, tales como la cromatograffa isocratica, tambien se pueden utilizar.

Una "protema" o "polipeptido", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molecula que comprende una cadena secuencial de aminoacidos unidos entre sf a traves de enlaces pepffdicos. El termino se utiliza para referirse a una cadena de aminoacidos de cualquier longitud, pero un experto en la tecnica entendera que el termino no se limita a cadenas largas y se puede referir a una cadena minima que comprenda dos aminoacidos unidos entre sf a

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traves de un enlace peptfdico. En algunas realizaciones, una protema tiene una cadena que comprende mas de 5, 10, 20, 50, 100, o 200 aminoacidos. Una protema puede incluir una o mas cadenas de aminoacidos distintas. Las protemas incluyen protemas producidas de forma natural o protemas recombinantes producidas en celulas procariotas o eucariotas (por ejemplo, celulas primarias o lmeas celulares).

Una "unidad de purificacion", como se usa en el presente documento, se refiere a una unidad ffsica que se puede utilizar para llevar a cabo un modo de purificacion, por ejemplo, en un sistema de purificacion en tandem. En algunas realizaciones, una unidad de purificacion es un recipiente (por ejemplo, una columna) que comprende una resina. En algunas realizaciones, una unidad de purificacion es un filtro. Las tecnicas de purificacion en la presente memoria se pueden practicar en la columna, membrana, y/o formatos de adsorcion de lechos expandidos, por ejemplo.

Una "resina", como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier sustancia que se puede utilizar para la separacion de un producto de una impureza. En algunas realizaciones, una resina es una resina que se une a inmunoglobulinas, (por ejemplo, una resina de protema A). En algunas realizaciones, una resina es una resina de intercambio ionico (por ejemplo, una resina de intercambio anionico, o una resina de intercambio cationico).

Un "producto inmunofarmaceutico modular pequeno" o "SMIP™", se refiere a un dominio de union-protema de fusion de inmunoglobulina que tiene un dominio de union para una estructura afm tal como un antigeno, a una region bisagra de inmunoglobulina (que puede o no puede incluir sustituciones aminoaddicas relativas a una secuencia de tipo salvaje) y a dominios Ch2 y Ch3 de inmunoglobulinas. Productos inmunofarmaceuticos modulares pequenos se describen, por ejemplo, en las Publicaciones de Patentes de los EE.UU. 2003/133939, 2003/0118592, 2005/0136049 y WO 02/056910, WO 2005/037989 y WO 2005/017148.

Un "modo de particion debil", como se usa en el presente documento, se refiere a una tecnica de separacion de preparacion de productos en la que al menos un producto contenido en la preparacion y al menos un contaminante o impureza, se unen ambos a una resina cromatografica. La union de producto en el modo de particion debil es de al menos 1 mg de producto por ml de resina cromatografica o medio cromatografico. En general, el coeficiente de reparto de productos para el modo de particion debil es al menos 0,1. Un "modo de particion debil" es un funcionamiento isocratico. La separacion usando un modo de particion debil se describe en la Publicacion de los EE.UU. N.°: 2007/0060741.

Descripcion detallada de ciertas realizaciones Procedimientos y sistemas en tandem

La presente descripcion proporciona procedimientos y sistemas en los que dos o mas unidades de purificacion se realizan en tandem, es decir, de tal forma que un fluido de carga puede estar expuesto a multiples unidades de purificacion en serie. En algunas realizaciones, un sistema de purificacion incluye una primera resina y una segunda resina, en el que la segunda resina es una que puede funcionar en un modo de particion debil (por ejemplo, una resina de intercambio ionico). Un sistema en tandem ejemplar se muestra en la Figura 1. En este sistema ejemplar, una columna de protema A, una columna de AEX y un filtro VRF estan vinculados.

Las valvulas en un sistema en tandem pueden colocarse a fin de permitir cualquier combinacion de unidades de purificacion para operar en lmea. Por ejemplo, las valvulas colocadas aguas abajo de una primera resina pueden permanecer cerradas mientras que un fluido de carga se aplica a la primera resina y se abre despues de que la primera resina se lava. Un fluido que pasa a traves de una unidad de purificacion puede dirigirse a las unidades de purificacion posteriores (por ejemplo, para lavar, equilibrar, cargar, o eluir a partir de una unidad de purificacion posterior) o descartarse, como se desee. Las unidades de purificacion se pueden lavar y/o regenerar por separado (por ejemplo, con un fluido dirigido solamente a traves de la unidad individual, o con un fluido desde una unidad aguas arriba), segun sea necesario y/o segun se desee por el medico. En algunas realizaciones, un sistema proporcionado en este documento es un sistema de lecho movil simulado.

El funcionamiento de multiples unidades de purificacion en serie puede producir niveles indeseables de presion o cambios en la presion dentro del sistema. La acumulacion de presion puede ser aliviada por varios enfoques. Las bombas pueden colocarse para promover el flujo antes, entre, y/o despues de una o mas unidades de purificacion. Los fluidos pueden tratarse para reducir la viscosidad y/o eliminar las impurezas que puedan precipitar, interferir con el flujo y provocar un aumento de la presion en el sistema. En algunas realizaciones, un fluido en el sistema se calienta para reducir la viscosidad. En algunas realizaciones, un eluato de la primera unidad de purificacion se calienta para reducir la viscosidad.

Para eliminar las impurezas que pueden precipitar durante la operacion de un sistema en tandem, un fluido de carga o fluido aguas abajo se puede tratar para separar las sustancias del fluido. En algunas realizaciones, se utiliza un floculante polimerico. Los ejemplos de floculantes polimericos incluyen sulfato de protamina, quitosano, DEAE-dextrano, polfmeros basadosen acrilamida, polietilenimina y amina de polietileno. En algunas realizaciones, una combinacion de un cation y un anion que forma una sal insoluble se utiliza para eliminar las impurezas de un fluido, por ejemplo, un cation y el anion que forma una sal que tiene una constante de producto de solubilidad de menos de 1 x 10 -4 (por ejemplo, CaPO4). Los procedimientos de eliminacion de impurezas se describen, por ejemplo, en la Publicacion de los Estados Unidos N.°: 2007/0066806. La eliminacion de solidos tambien se puede lograr mediante filtracion. Se

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puede utilizar uno cualquiera de los procedimientos o combinacion de los mismos para la eliminacion de impurezas precipitantes. En algunas formas de realizacion, un fluido de carga (por ejemplo, medio de cultivo) se trata para eliminar las impurezas que pueden precipitar, antes de la exposicion a una primera resina.

Muchas implementaciones de procedimientos de purificacion de protemas utilizan inactivacion de virus o etapas de eliminacion. Un procedimiento para la inactivacion de los virus es bajar el pH de un fluido. En algunas realizaciones, por ejemplo, realizaciones en las que el pH bajo no es compatible con una etapa de purificacion vecina, se eliminan los virus haciendo pasar un fluido a traves de un filtro de reduccion de virus y/o por inactivacion por detergente. Cualquiera de una variedad de detergentes se puede utilizar para la inactivacion de virus, por ejemplo, Tween o Triton X-100. En algunas formas de realizacion, un fluido de carga (por ejemplo, medio de cultivo) se trata para eliminar o inactivar los virus antes de la exposicion a una primera resina.

Particion debil

En diversas realizaciones de los procedimientos proporcionados en este documento, una o mas etapas de purificacion utilizan cromatograffa en un modo de particion debil. En el modo de particion debil, un fluido que contiene el producto se hace pasar a traves de una resina, con tanto el producto como las impurezas uniendose a la resina. Sin embargo, las impurezas se unen mas estrechamente que el producto. Segun continua la carga, el producto no unido pasa a traves de la resina y se recupera en el efluente de la columna. En algunas realizaciones, se lava una resina (por ejemplo, con un lavado isocratico) para recuperar producto adicional debilmente unido.

Un modo de particion debil se define por las condiciones en las que se une una resina de al menos 1 mg de producto por ml de resina (por ejemplo, al menos 5, 10, 20, 30, 40, 50, o 60 mg por ml). Un modo de particion debil tambien se define por un coeficiente de reparto (Kp) de al menos 0,1. En algunas realizaciones, la operacion en un modo de particion debil comprende operar en condiciones definidas por una Kp en el intervalo de aproximadamente 0,2 a 20 (por ejemplo, 0,2-10, o 0,5 a 5). En contraste con la particion debil, un modo de union-elucion se define tfpicamente por una Kp por encima de 20 y emplea un cambio en la composicion del tampon despues de causar la elucion del producto. Un modo de circulacion se define tfpicamente por un Kp < 0,1 y emplea un lavado isocratico para recuperar el producto.

Kp se calcula a partir de experimentos de union por lotes como la proporcion de la concentracion proteica adsorbida frente a las concentraciones proteicas libres en el equilibrio. Kp es una funcion del pH y la concentracion de iones en tampones de equilibrado, carga y lavado. En algunas realizaciones, para un modo de particion debil, una etapa AEX se hace funcionar entre Kp = 1 y Kp = 3 (vease la Publicacion de los Estados Unidos. N.°: 2007/0060741 y Kelley BD, Tobler SA, Brown P, Coffman JL, Godavarti R, Iskra T, Switzer M, Vunnum S. Biotechnol Bioeng. 15 de octubre 2008;101(3): 553-66).

Condiciones de funcionamiento adecuadas para la particion debil dependen de la eleccion de la resina seleccionada para la purificacion del producto. Las condiciones pueden incluir los niveles de pH y las fuerzas ionicas, las concentraciones de sales y/o los niveles de excipientes.

En algunas formas de realizacion, las condiciones para la particion debil se identifican mediante cribado. El cribado puede incluir estudios de union por lotes o estudios de union a columnas. Los estudios de union a columnas podnan incluir estudios de elucion de gradiente o estudios de elucion isocratica. Por ejemplo, un experto en la tecnica puede determinar que tampon o sal es apropiado para la protema particular que se esta purificando y para las condiciones de funcionamiento que se estan identificando. Una concentracion optima del tampon seleccionado o la sal seleccionada se puede determinar a continuacion, por ejemplo, corriendo un gradiente del tampon seleccionado o de la sal seleccionada a traves de una columna a la que se ha aplicado un fluido de carga que comprende el producto a purificarse y las impurezas. Las fracciones del efluente de la columna pueden recogerse y analizarse para determinar la concentracion del tampon o sal en la que la union del producto es de al menos 1 mg de producto por ml de resina o, alternativamente, en la que el coeficiente de reparto para el producto es de al menos 0,1. En algunas formas de realizacion, el coeficiente de reparto se mide entre 1 y 10 mg/ml de prueba de carga con una proporcion de fase (volumen de lfquido frente a volumen de resina) de tres a seis en un experimento de union por lotes.

Una vez que se determinan las condiciones de funcionamiento, las condiciones del fluido a aplicarse a una resina en condiciones de particion debiles (por ejemplo, un eluato de una resina anterior tal como la protema A) se pueden ajustar de acuerdo con ello como se describe en el presente documento. Despues de que el fluido se hace pasar a traves de la resina, la resina se lava opcionalmente con un volumen de lavado esencialmente isocratico. El producto purificado se puede obtener de cualquier lavado esencialmente isocratico y se agrupo con el producto purificado a partir de efluente de la columna durante el ciclo de carga. Despues de la etapa de lavado opcional, la resina opcionalmente se puede retirar y regenerar, por ejemplo, para minimizar la acumulacion de impurezas en la superficie de la fase solida y/o para esterilizar la resina para evitar la contaminacion del producto con microorganismos.

Altas concentraciones de carga y altos volumenes de carga son posibles con el modo de particion debil. En una realizacion, la concentracion de producto en el fluido de carga es de al menos 1 mg de producto por ml de fluido de carga, en otra realizacion, la concentracion de producto en el fluido de carga es de al menos 5 mg de producto por ml de fluido de carga, en otra realizacion, de al menos 50 mg de producto por ml de fluido de carga y en otra realizacion,

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de al menos 100 mg de producto por ml de fluido de carga. El producto purificado se puede recuperar de hasta 50 CV de fluido de carga pasado a traves de la resina.

Con el fin de obtener la formulacion precisa en los modos de cromatograffa por lotes tradicionales, la valoracion de un eluato de una primera resina (por ejemplo, una resina de proA) puede requerir el uso de bombas controladas por retroalimentacion de pH o por bombas de entrega de proporciones de tampones programadas. Los procedimientos proporcionados en el presente documento anaden robustez a procedimientos de purificacion y pueden eliminar la necesidad de mecanismos de control mas complejos.

En ciertas realizaciones de procedimientos de purificacion en tandem proporcionados en este documento, el producto se recupera de una primera resina en un fluido que comprende un tampon. En algunas realizaciones, un cambio de pH se produce a medida que fracciones anteriores de un eluato de la primera resina se mezclan con un reactivo de valoracion. Se ha descubierto que las condiciones pueden ser tales que, aunque el eluato valorado presenta una oscilacion de pH, el tampon en las fracciones posteriores del eluato mitiga los efectos negativos de una oscilacion de pH en la realizacion de la segunda resina.

Por ejemplo, se encontro que el pH al final de una elucion proA determina la calidad del producto y la recuperacion de la reserva en tandem, siempre y cuando el pH disminuya consistentemente en el transcurso de la elucion. A la inversa, pH superior al optimo en el comienzo de una elucion proA tendna efecto mmimo en la calidad y la recuperacion del producto. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente divulgacion, se proporcionan procedimientos que incluyen el funcionamiento de un procedimiento de proA-AEX en tandem a pesar del pH variable. En algunas realizaciones, las velocidades de bombeo en tales procedimientos no necesitan variar.

Como se senalo anteriormente, un coeficiente de reparto, Kp, esta relacionado con el pH y la composicion de solucion (por ejemplo, la fuerza ionica y la composicion del tampon). Se ha descubierto que anadir sal a un reactivo de valoracion que se utiliza para preparar un fluido para la exposicion a una resina de intercambio ionico incrementa la robustez de la de la purificacion manteniendo un grado constante de fuerza de union a lo largo de un intervalo de proporciones de valoracion. Este principio es aplicable a los procedimientos en tandem y no en tandem.

En realizaciones adicionales, una purificacion en tandem (por ejemplo, proA-AEX) se puede disenar en un intervalo de proporciones de neutralizacion (v) de eluato frente a reactivo de valoracion que da como resultado un cambio en Kp (k) hasta ser menos que una cierta cantidad. Una ventana de funcionamiento robusto independiente de Kp y v se puede describir como una funcion de k como sigue:

k = ABS[Kp (v + A v) -Kp (v - Av)]/Kp (v),%, que mide un cambio de % absoluto en Kp dentro de un intervalo de funcionamiento dado (v± Av).

Por ejemplo, en algunas formas de realizacion, se lleva a cabo proA-AEX en tandem en un intervalo de proporciones de neutralizacion (V) y una combinacion de parametros que dan como resultado el cambio relativo en Kp(k) por debajo del 100 % cuando v se vario del 50 % al 150 % de la meta. En algunas formas de realizacion, se lleva a cabo proA-AEX en tandem en condiciones donde k < 50 %, en el intervalo del 75 % al 125 % del objetivo v. En algunas realizaciones, las condiciones dan como resultado k < 20 %, en el intervalo del 90 % al 110 % del objetivo v.

Otro aspecto para mejorar procedimientos de purificacion proporcionados en el presente documento se refiere a condiciones en las que las protemas se eluyen a partir de proA. Se ha descubierto que la adicion de un tampon que tiene una pKa alta (por ejemplo, 5,5 o mas) a un tampon de elucion proA acido proporciona resistencia a las variaciones en el pH durante la neutralizacion posterior con un reactivo de valoracion, por ejemplo, en la preparacion para aplicacion a una resina de intercambio anionico. Los tampones que tienen una pKa de 5,5 o mas se enumeran en la Tabla A. Cualquiera de estos puede utilizarse en un tampon de elucion de protema A.

Tabla

Tabla A. Valores de pKa de bases

Acido o base libre Peso pKa a 25 °C molecular

Bencenohexacarboxflico (mellttico)

342,17 5,50 (pKa5)

2,2-dimetilglutarico

160,17 5,51 (pKa2)

Itaconico

130,1 5,55 (pKa2)

Ciclopentanotetra-1,2,3,4-carboxflico

246,17 5,57 (pKa3)

Succmico

118,09 5,57 (pKa2)

Benceno-1,2,4,5-tetracarboxflico (piromellttico)

254,15 5,61 (pKa4)

Acido o base libre Peso pKa a 25 °C molecular

Benceno-1,2,3-t^carbox^lico (hemimellttico)

246,18 5,87 (pKa3)

Dimetilmalonico

132,12 5,98 (pKa2)

Histidina

156,16 6,00 (pKa2)

Hidroxilamina

34,0 6,03

Carbonico (H2CO3 + CO2)

62 (CO2) 6,10 (pKa1)

Malonico

104,06 6,10 (pKa2)

Acido 2-(N-morfolino)etanosulfonico "MES"

195,2 6,15 (pKa2)

Glicerofosf6rico

172,08 6,19 (pKa2)

Propano-1,2,3-t^carbox^lico (tricarbaKlico)

176,12 6,20 (pKa3)

Bencenopentacarbox^lico

298,16 6,25 (pKa5)

Maleico

116,07 6,26 (pKa2)

2,2-dimetilsuccmico

146,14 6,29 (pKa2)

EDTA

292,24 6,30 (pKa3)

3,3-dimetilglutarico

160,17 6,31 (pKa2)

Bis(2-hidroxietil)imino-tris(hidroximetil)metano "BIS-TRIS"

209,24 6,46

Bencenohexacarboxflico (mellttico)

342,17 6,59 (pKa6)

Acido N-(2-acetamido)imino-diacetico "ADA"

190,17 6,60 (pKa3)

Butano-1,2,3,4-tetracarboxflico

234,12 6,63 (pKa4)

Pirofosforico

177,98 6,68 (pKa3)

1,1-ciclopentanodiacetico (acido 3,3-tetrametilenglutarico)

186,21 6,70 (pKa2)

1,4-piperazina-bis-(acido etanosulfonico) "PIPES"

302,37 6,8 (pKa4)

Acido N-(2-acetamido)-2-aminoetanosulfonico "ACES"

182,20 6,9 (pKa2)

1,1 -ciclohexanodiacetico

200,18 6,94 (pKa2)

3,6-endometileno-1,2,3,6-tetrahidroftalico "EMTA"

183,62 7,00 (pK2)

Imidazol

68,08 7,00

2-(aminoetil)trimetilamonio "COLAMINA"

156,69 7,10

Acido N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfonico "BES"

213,25 7,15 (pKa2)

2-metilpropano-1,2,3-t^scarbox^lico

190,15 7,20 (pKa3)

Acido 2-(N-morfolino)propano-sulfonico "MOPS"

209,27 7,20 (pKa2)

Fosforico

98,0 7,21 (pKa2)

Acido N-tris(hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfonico "TES"

229,28 7,50 (pKa2)

N-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-etanosulfonico "HEPES"

238,31 7,55 (pKa2)

2-hidroxietilimino-tris(hidroximetil)metano "MONO-TRIS"

165,18 7,83

Tetrahidrato de brucina

466,53 7,95 (pKa2)

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Acido o base libre Peso pKa a 25 °C molecular

Acido 4-(2-hidroxietil)sulfonico-1-piperazinapropano "EPPS"

252,23 8,00

Tris(hidroximetil)aminometano "TRIS"

121,14 8,10

N-tris(hidroximetil)metilglicina "TRICINA"

180,18 8,15

Glicinamida

74,04 8,20

N,N-bis(2-hidroxietil)glicina "BICINA"

163,18 8,35

Acido N-tris(hidroximetil)metil-2-aminopropanosulfonico "TAPS"

243,3 8,40 (pKa2)

N-glicil-glicina

132,12 8,40

Histidina

155,16 9,17 (pKa3)

Borico

43,82 9,24

Pirofosforico

177,98 9,39 (pKa4)

Etanolamina

61,08 9,44

Glicina

75,07 9,60 (pKa2)

Resinas

Diversas combinaciones de resinas se pueden utilizar en los procedimientos (por ejemplo, procedimientos de purificacion en tandem) proporcionados en el presente documento, incluyendo resinas de union-elucion, resinas de intercambio anionico, resinas de exclusion por tamano, resinas de interaccion hidrofoba, resinas de afinidad por metales inmovilizados y resinas de hidroxiapatita.

Resinas de intercambio anionico que se pueden utilizar incluyen resinas que tienen sustituyentes tales como dietilaminoetilo (DEAE), trimethilaminoetilo (TMAE), aminoetilo cuaternario (qAe) y grupos de aminas cuaternarias (O).

Resinas de intercambio cationico que se pueden utilizar incluyen resinas que tienen sustituyentes tales como carboximetilo (CM), sulfoetilo (SE), sulfopropilo (SP), fosfato (P) y sulfonato (S).

En algunas realizaciones, se utiliza una resina de intercambio ionico celulosica (por ejemplo, DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 o CM-52, disponible de Whatman Ltd. Maidstone, Kent, Reino Unido). Intercambiadores ionicos basados en Sephadex y reticulados utilizados para la purificacion incluyen, por ejemplo, DEAE-, QAE-, CM- y SP-Sephadex y DEAE, Q-, CM y S-Sefarosa y Sefarosa (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Copoffmeros de etilenglicol-metacrilato derivatizado de DEAE y CM tales como TOYOPEARL™ DEAE-650S o M y TOYOPEARL™ CM-650S o M estan disponibles de Toso Haas Co., Filadelfia, Pa.

Las columnas de cromatograffa de protema A comercialmente disponibles incluyen, por ejemplo, PROSEP-A™ (Millipore, Reino Unido), FAST FLOW™ de Protema A Sefarosa (GE Healthcare, Piscataway, NJ), TOYOPEARL 650M™ Protema A (TosoHass Co., Filadelfia, Pa.) y columnas MabSelect ™ (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

En algunas realizaciones, una resina de cromatograffa de interaccion hidrofoba (HIC) se utiliza para purificacion. HIC separa moleculas en base a la hidrofobicidad. Generalmente, las moleculas de muestras en un tampon salino alto estan cargadas en la resina de HIC. La sal en el tampon interacciona con las moleculas de agua para reducir la solucion de las moleculas en solucion, exponiendo de esta manera las regiones hidrofobas en las moleculas de la muestra que consecuentemente se absorben por el medio de HIC. Cuanto mas hidrofoba es la molecula, menos sal se necesita para promover la union. Las interacciones de union entre las moleculas de producto y un medio de HIC por lo tanto dependen de condiciones tales como pH, fuerza ionica y concentraciones salinas del medio. Resinas de HIC disponibles comercialmente que se pueden utilizar incluyen resinas que comprenden una matriz base (por ejemplo, agarosa reticulada o material copolimerico sintetico) a la que se acoplan ligandos hidrofobos (por ejemplo, grupos, alquilo o arilo). Los ejemplos incluyen FENILSEFAROSA™, 6 FAST FLO™ (Pharmacia LkB Biotechnology, AB, Suecia); FENILSEFAROSA™ de alta resolucion (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suecia); OCTILSEFArOsA™ de alta resolucion (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suecia); Fractogel™ EMD Propilo o FRACTOGEL™ EMD Fenilo (E. Merck, Alemania); Soportes de Metilo MACRO PREPT™ o de t-butilo MACRO-PREP™ (Bio-Rad, CA); WP HI-Propilo (C3)™ (JT Baker, NJ); y eter, fenilo o butilo de TOYOPEARL™ (TosoHaas, Pa.). HIC se puede realizar en un modo de particion debil.

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En algunas realizaciones la cromatograffa de hidroxiapatita se utiliza para la purificacion. La cromatograffa de hidroxiapatita utiliza un fosfato de calcio hidroxilado insoluble de la formula [Ca-i0(PO4)a(OH)2], tanto la matriz como el ligando. Los grupos funcionales consisten en pares de iones de calcio cargados positivamente (sitios C) y racimos de grupos fosfato cargados negativamente (sitios P). Las interacciones de union entre un producto y un medio de hidroxiapatita dependen de las condiciones tales como el pH, la fuerza ionica y las concentraciones de excipientes, tales como concentraciones de fosfato, las concentraciones de calcio, las concentraciones de arginina, las concentraciones de glicina y las concentraciones de HEPES del medio. Diversas resinas cromatograficas de hidroxiapatita estan disponibles comercialmente. La cromatograffa de hidroxiapatita se puede realizar en un modo de particion debil.

En algunas realizaciones, se usa una resina de cromatograffa de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) para purificacion. IMAC se basa en la interaccion entre iones de metales de transicion quelados inmovilizados en una resina y cadenas laterales de imidazol de residuos de histidina sobre un producto marcado de interes. La separacion de las moleculas se produce como resultado de la competicion entre el producto marcado de interes y contraligandos para grupos metalicos en la resina de IMAC. Las interacciones de union entre un producto y medio IMAC cargado de metal dependen de las condiciones, tales como los niveles de contraligandos, tales como las concentraciones de imidazol y la fuerza ionica del medio. Diversas resinas de IMAC estan disponibles comercialmente. IMAC puede realizarse en un modo de particion debil.

La purificacion usando cualquiera de las resinas anteriores puede ocurrir en condiciones conocidas por los expertos en la tecnica y en combinacion con procedimientos de la invencion proporcionados en este documento.

Por ejemplo, una resina de proA puede hacerse funcionar en una diversidad de condiciones. En algunas realizaciones, una columna de proA se lava y se equilibra con una o mas soluciones antes del contacto con un fluido de carga. Tales soluciones pueden incluir, por ejemplo, un tampon (por ejemplo, Tris, MES, HEPES, histidina, o fosfato, por ejemplo, entre 1-500 mM, 25-100 mM, o 50 mM), y/o una sal (por ejemplo, NaCl, NaPO4, acetato de sodio, o CaCl2, por ejemplo, entre 0-2 M, o 5-250 mM). El pH de una solucion de equilibrado esta generalmente entre 3,5-10 (por ejemplo, pH entre

a,0-8,0).

Despues de poner en contacto una resina de proA con un fluido de carga, la resina unida se puede lavar. Las soluciones de lavado pueden incluir un tampon (por ejemplo, Tris, MES, HEPES, fosfato, o histidina, por ejemplo, entre 1 y 500 mM), y/o sal (por ejemplo, NaCl, CaCl2, NaPO4 o acetato de sodio, por ejemplo, entre 0 y 2 M), y/o un aditivo (por ejemplo, guanidina, urea, sacarosa, arginina, o un derivado de arginina), y/o un disolvente (por ejemplo, etanol, acetonitrilo, o polietilenglicol). Las soluciones de lavado generalmente tienen un pH entre 3,5 y 10 (por ejemplo, un pH entre 4,5-8,0). En algunas realizaciones, una resina se lava con la misma solucion que se utiliza para equilibrar la resina.

Los polipeptidos se pueden eluir a partir de una resina proA utilizando una etapa o el cambio de gradiente de pH, tipo de sal, concentracion de sal, tipo de disolvente, concentracion de disolvente, tipo de desplazador, concentracion de desplazador, o una combinacion de los mismos. En general, para eluir un producto de una resina proA, la resina se pone en contacto con un tampon de elucion. En algunas realizaciones, un tampon de elucion contiene una sal (por ejemplo, NaCl o CaCl2, por ejemplo, 1 a 100 mM). En algunas realizaciones, un tampon de elucion puede contener glicina, acido acetico, o acido dtrico (por ejemplo, 20 mM-250 mM). Un tampon de elucion tambien puede contener un tampon (por ejemplo, HEPES, por ejemplo, 10-100 mM). Un tampon de elucion puede contener tambien acido acetico (por ejemplo, 20 mM a aproximadamente 50 mM), un aditivo (por ejemplo, guanidina, urea, o sacarosa), y/o un disolvente (por ejemplo, etanol, acetonitrilo, polietilenglicol, por ejemplo, disolvente al 1-10%, por ejemplo, disolvente al 5 %). El pH del tampon de elucion puede variar de aproximadamente 2,0 a aproximadamente 4,0. En algunas formas de realizacion, el pH se puede cambiar (por ejemplo, gradualmente) para producir una elucion de gradiente (por ejemplo, un gradiente de elucion de pH 5,0 a pH 3,0). En un modo de realizacion preferente, el pH del tampon de elucion es de aproximadamente 3,0. Un eluato se puede neutralizar, por ejemplo, mediante el ajuste de pH a 6,0-8,0 (en los casos en los que se usa un pH bajo para la elucion), anadiendo un reactivo de valoracion tal como se describe en este documento, despues de recuperar a partir de la resina.

Productos para purificacion

Los procedimientos y sistemas proporcionados en este documento pueden usarse para la purificacion (por ejemplo, purificacion a escala comercial) de diversos productos de interes, incluyendo protemas que se dan en la naturaleza, protemas de fusion, protemas que contienen Fc, immunoconjugados, citocinas, factores de crecimiento, receptores acoplados a protemas G, interleucinas, hormonas y enzimas. En algunas realizaciones, una protema que sufre purificacion puede comprender uno o mas dominio(s) de inmunoglobulina(s) de anticuerpo(s). En algunas realizaciones, la protema tambien puede comprender un unico dominio o multiples dominios de inmunoglobulina(s) de anticuerpo(s) variable(s). Una protema que contiene Fc puede comprender un anticuerpo. Las protemas se pueden derivar de diversas fuentes, incluyendo lmeas de celulas huesped procariotas o eucariotas recombinantes cultivadas.

Las protemas (por ejemplo, anticuerpos) para la purificacion de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento pueden ser de un numero de fuentes, incluyendo, pero no limitadas a, suero de animales inmunizados, fluido de ascitis, sobrenadantes de hibridomas o de mielomas, medios acondicionados derivados de

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cultivar una lmea celular recombinante que expresa la molecula de protema y de extractos celulares de las celulas productoras de protemas. En algunas realizaciones, se purifican protemas de medios de cultivo celular condicionados de una diversidad de lmeas celulares recombinantes de produccion de protemas. En algunas realizaciones, las protemas son a partir de preparaciones disponibles comercialmente. En algunas realizaciones, el anticuerpo debe purificarse.

En algunas realizaciones, una protema para la purificacion de acuerdo con un procedimiento descrito en el presente documento se produce por expresion en una celula recombinante. Una amplia diversidad de celulas pueden utilizarse para producir una protema recombinante. Cualquier celula que se pueda transformar con ADN recombinante para expresar una protema de interes (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal), se puede utilizar en los procedimientos de la presente divulgacion. Las celulas pueden ser de una diversidad de especies, por ejemplo, especies eucariotas, incluyendo fuente de plantas, levaduras, nematodos, gusanos, insectos, anfibios, o mairnferos, por ejemplo, seres humanos, primates, ovinos, bovinos, porcinos, equinos, felinos, caninos, o roedores. En realizaciones particulares, las celulas son de ser humano o de roedor. En realizaciones particulares, las celulas son de hamster (por ejemplo, celulas ovaricas de hamster chino). Ejemplos de celulas de mamffero que pueden usarse incluyen lmea BALB/c lmea de mieloma de raton (NSO/I, Numero de ECACC: 85110503); SP2/0; Balb/c3T3; retinoblastos humanos (PER.C6 (Crucell, Leiden, Pafses Bajos)); lmea CV1 de rinon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); lmea de rinon embrionario humano (celulas 293 o celulas 293 subclonadas para el crecimiento en cultivo en suspension, Graham et al, J. Gen Virol, 36:59 (1977); celulas de rinon de hamster bebe (BHK, ATCC CCL 10); celulas ovaricas de hamster chino +/- DHFR (CHO, Urlaub y Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU., 77: 4216 (1980); GS-CHO, CHO-K1, CHO-K1SV, CHO-DG44, CHO-DUKX, CHO-DUXB11, CHO-S); celulas de Sertoli de raton (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23: 243-251 (1980)). hibridoma de rata YB2/0 (Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3.466 a 3.473, 2003); celulas de rinon de mono (Cv1 ATCC CCL 70); celulas de rinon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); celulas de carcinoma cervical humano (HeLa, ATCC CCL 2); celulas de rinon canino (MDCK, ATCC CCL 34); celulas hepaticas de rata bufalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); celulas de pulmon humano (W138, ATCC CCL 75); celulas hepaticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamario de raton (MMT 060562, AtCC CCL51); celulas TRI (Mather et al., Annals NY Acad. Sci., 383: 44-68 (1982)); celulas MRC 5; celulas FS4; y una lmea de hepatoma humano (Hep G2). Un numero de lmeas celulares adecuadas se puede obtener de depositarios tales como la Coleccion de Cultivos Tipo de EE.UU. (ATCC), Manassas, Va. Ejemplos de celulas de plantas que pueden usarse incluyen celulas de Lemmna minor (lenteja de agua), Arabidopsis thaliana y Physcomitrella patens (musgo). Ejemplos de celulas de insectos que se pueden usar incluyen celulas de Spodoptera frugiperda (Sf9 y Sf21), Trichoplusia ni (Tni y BTI-Tn 5B1-4) y Mamestra brassicae (Mb). Celulas de hongos utiles incluyen celulas de Pichia pastoris y celulas de Saccharomyces cerevisiae.

Ejemplificacion

Ejemplo 1. Funcionamiento en tandem de una etapa de protema A, una etapa cromatografica de intercambio anionico (AEX) y un filtro de reduccion de virus (VRF)

Un funcionamiento en tandem (Figura 1) de una columna de protema A, una columna de AEX (hecha funcionar en modo de particion debil) y un filtro de reduccion de virus (VRF) se llevo a cabo a escala de laboratorio para la purificacion de anticuerpos monoclonales y productos inmunofarmaceuticos modulares pequenos. Bombas Ay B funcionan a una proporcion constante de caudales. Un mezclador asegura una mezcla minuciosa del efluente de ProA suministrado por la bomba A con 5 al 20 % v/v de reactivo de valoracion entregado por la bomba B. Las valvulas 1-3 permiten cualquier combinacion de funcionamientos unitarios para estar en lmea durante el procedimiento. Por ejemplo, durante la carga de proA y las etapas de lavado, solamente la columna de Proa esta en lmea y la bomba B esta inactiva. Despues de un volumen de columna proA (CV) del lavado de proA de pH alto/sales bajas final, las valvulas 2 y 3 se abren y la bomba B comienza a anadir un tampon de neutralizacion (reactivo de valoracion) al efluente proA, que se utiliza para equilibrar el AEX y VRF. Las tres operaciones unitarias permanecen en lmea durante la elucion a pH bajo y una parte de lavado proA post-elucion, tal como el efluente proA esta neutralizandose y se usa como un lavado TMAE. Alternativamente, el lavado de post-elucion de la columna de proA puede dirigirse a los residuos y TMAE puede lavarse con un tampon dedicado. Las columnas de proA y de AEX se regeneran por separado. Sin embargo, el tampon de almacenamiento que contiene etanol se puede aplicar a ambas columnas en tandem.

Un ejemplo de un cromatograma de proA-AEX-VRF en tandem, que representa UV, pH y trazas de presion durante la elucion, se muestra en la Figura 2. Los cambios bruscos en la presion se debieron a la conmutacion de los componentes del sistema de encendido y apagado. El aumento gradual de la presion durante la elucion correlaciono con el apice del pico que pasa a traves de la membrana de VRF, como se muestra en la Figura 3. Despues de la elucion, la presion a traves del VRF volvio a casi el nivel de pre-elucion, lo que sugiere que el aumento de presion se habfa debido a la viscosidad del pico del producto y no a obstruccion de la membrana.

Un procedimiento en tandem con tres operaciones unitarias se ejecuto con exito para una serie de anticuerpos monoclonales (MAb) y productos inmunofarmaceuticos modulares pequenos (SMIP™), lo que demuestra la viabilidad de la neutralizacion en lmea. Sorprendentemente, el sistema no experimento contrapresiones inaceptablemente altas debidas a precipitacion de pico de proA. No se observo ningun aumento de presion con reutilizacion, lo que apunta a la ausencia de ensuciamiento.

Ejemplo 2. Un procedimiento de proA-AEX en tandem con una carga de proA floculada

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La precipitacion del producto, HMW y otras impurezas a menudo se produce durante la elucion de pico de proA y neutralizacion. Este procedimiento es diffcil de controlar. Los solidos deben retirarse de la corriente del procedimiento, ya que su presencia provoca el ensuciamiento de la resina de AEX. En algunas formas de realizacion, la eliminacion se lleva a cabo por filtracion a traves de un filtro de 0,2 pm.

La nucleacion y el crecimiento de parffculas solidas es un proceso controlado cineticamente que a veces lleva horas para proseguir hasta su finalizacion. La duracion de la nucleacion no afecta a una cromatograffa por lotes regulares, ya que hay un lapso de tiempo significativo entre neutralizacion de reserva pico de proA y cargado de AEX. Sin embargo, en un funcionamiento en tandem (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1), la precipitacion se puede producir aguas abajo del filtro de 0,2 pm, lo que seffa perjudicial para la columna de AEX y/o el VRF. Ademas, se espera que la neutralizacion del apice del pico de proA segun se mueve a traves del mezclador produzca una banda concentrada de material precipitado, que pueda conectar el filtro u otros componentes aguas abajo. Por lo tanto, ciertas etapas pueden introducirse aguas arriba de la columna de proA que minimizana la precipitacion del pico proA neutralizado.

Se descubrio que la floculacion de medios acondicionados por separado, o en combinacion con la filtracion de la almohadilla de concentrado, redujo significativamente la turbidez en el apice del pico de proA tras la neutralizacion. Aunque la turbidez por sf misma no es un indicador preciso de taponamiento, sirve como una medida indicadora adecuada de concentracion de solidos. Reducir la turbidez, la floculacion y la filtracion podna haber permitido la neutralizacion en lmea, ya que era posible procesar el material floculado sin una contrapresion excesiva. En el experimento descrito a continuacion, el medio condicionado previamente filtrado en lecho corto se floculo mezclando con CaCl2 30 mM. K2HPO4 30 nM, HEPES 40 mM pH 7,5 durante 1 hora seguido de centrifugacion para eliminar los solidos formados. En comparacion con un control, el material floculado produjo fracciones de pico proA mucho mas limpias (Figuras 4A y 4B). Todos los experimentos en tandem descritos en los presentes ejemplos usaron CM floculado de esta manera. Otros procedimientos de floculacion, tales como el uso de polietilenimina (PEI) u otros floculantes tambien se pueden utilizar. Alguien puede especular que tanto la floculacion como la filtracion en lecho corto son procedimientos ortogonales de eliminacion de los componentes del medio acondicionado hidrofobos, tales como ffpidos, que son propensos a la agregacion a concentracion elevada y durante un cambio de pH.

Ejemplo 3. Un funcionamiento en tandem en el que la carga de proA se trata con la mezcla de disolvente-detergente para inactivar virus con cubierta

En algunas realizaciones de los procedimientos de purificacion en tandem proporcionados en este documento, mantener a pH bajo para la inactivacion vmca no se utiliza, ya que, en algunas realizaciones, un efluente proA se neutraliza continuamente a medida que se mueve a traves de un mezclador. Por lo tanto, puede ser necesaria una etapa de reemplazo para la inactivacion de virus con cubierta. La presente divulgacion aporta que una etapa de inactivacion vmca por disolvente/detergente pueda incorporarse despues de la eliminacion celular por centrifugacion, pero antes de pasar a traves de una columna proA. Tal colocacion de la etapa es beneficiosa porque la proA es una etapa de union y elucion que es capaz de eliminar detergentes en la circulacion y en los lavados. No se espera que una etapa de AEX de particion debil elimine detergentes por absorcion preferencial. La eliminacion del detergente por etapa de UF/DF tambien sera ineficaz, ya que las grandes micelas (> 70 kDa de Triton X-100) seran retenidas por la membrana. Al mismo tiempo, el detergente no se debe anadir antes de la eliminacion de celulas, ya que causa lisis celular y libera ADN viscoso y otras impurezas.

En todos los experimentos descritos en los presentes ejemplos, se anadio Triton X-100 al 0,5 % p/v o al 0,25 % p/v a medio acondicionado floculado. La presencia de detergente no tuvo impacto en el rendimiento de las etapas cromatograficas. La concentracion de Triton X-100 en las fracciones de los picos en tandem se midio mediante HPLC en fase reversa. El detergente se elimino en gran parte a traves del funcionamiento en tandem: desde el 0,5 % p/v en la carga hasta el 0,0135 % p/v en el apice del pico, una reduccion logafftmica de 1,5.

Ejemplo 4. Funcionamiento en tandem de proA y una cromatograffa de AEX con valoracion de la corriente de producto desde el pico de proA

Este ejemplo describe una valoracion de la corriente de producto desde el pico proA segun este eluye a partir de la columna con una relacion volumetrica fija de una solucion de pH alto. Esto lleva a la corriente del proceso resultante a un intervalo espedfico de los niveles de pH y de los niveles de concentracion de sales que promueve cromatograffa de particion debil en el AEX.

La cromatograffa de AEX de particion debil requiere una fase movil formulada con precision para lograr la retencion de impurezas de union mas fuerte, tales como especies de alto peso molecular (HMW) y protemas de la celula huesped (HCP) a expensas de un producto de union mas debil. La fuerza de union se determina por un coeficiente de reparto termodinamico, Kp, que se calcula a partir de experimentos de union por lotes como la proporcion de la concentracion de protema libre para liberar concentraciones de protemas en el equilibrio. Kp es una funcion del pH y la concentracion de aniones (ffpicamente, [Cl']) en los tampones de equilibrado de AEX, de carga y de lavado. La funcion Kp = f(pH, [Cl']) se deriva empfficamente a partir de experimentos de union por lotes.

En el modo de cromatograffa tradicional por lotes, un pico proA se eluye con un tampon de pH bajo, que contiene glicina como un agente tamponante y la sal (NaCl), que es una fuente de iones cloruro principal que controlan la fuerza

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de union a AEX aguas abajo. El pico agrupado se valora con un agente neutralizante concentrado (tampon Tris de pH alto) hasta que se alcanza el pH deseado. Por lo tanto, el Kp de la carga de AEX esta controlado por la formulacion exacta y la valoracion del tampon de elucion de proA. En una disposicion en tandem tal como el mostrado en la Figura 1, las bombas de A y B pueden sincronizarse para entregar una proporcion variable preprogramada de tampones. Alternativamente, la bomba B puede controlarse por una retroalimentacion a partir de un medidor de pH despues del mezclador. Estas realizaciones pueden generar un pH constante por toda la carga de AEX, pero pueden ser muy costosas de implementar y validar en una planta de fabricacion.

En un ejemplo de un procedimiento en tandem proporcionado por la presente divulgacion, las bombas funcionan a una proporcion constante o cerca de la constante de caudales. El pH de la corriente de elucion es variable, dado que el tampon de lavado de proA final de pH alto esta reemplazandose con un tampon de elucion de pH bajo segun este surge de la columna de proA. Ademas, tanto los ligandos de proA como el producto adsorbido tienen residuos valorables, que captan acido en el tampon de elucion. Esto hace que el pH de la elucion de proA disminuya detras del pico del producto. Por lo tanto, la composicion de la corriente de elucion de proA cambia a partir del tampon de lavado 2 de proA para el tampon de elucion sin ninguna capacidad tamponadora en el borde delantero del pico al tampon de elucion no modificado en el extremo de final del pico. Como consecuencia, cuando el efluente proA se mezcla con una proporcion constante de tampon de neutralizacion de pH alto, la senal de pH muestra una oscilacion de pH. La Figura 5 es un analisis fuera de lmea de la concentracion y el pH de un pico de proA fraccionado que muestra esta oscilacion de pH. Si las bombas proporcionan caudales constantes, el pH resultante cambiara a lo largo del curso de la elucion de proA.

Como se muestra en la Figura 5, un experimento de valoracion de tampon fuera de lmea predijo correctamente que el pH final del tampon de elucion valorado se estabilizana en ~ pH 7,9. Las primeras fracciones del tampon de elucion estaban casi desprovistas de acido y como consecuencia, llegaron a sobre-valorarse con el tampon de neutralizacion. La desviacion de pH resultante a pH 8,3 se produjo durante el apice del pico. Esta desviacion del pH causana una union mas estrecha de las fracciones pico de proA afectadas a la columna de AEX que funciona en un modo de particion debil, afectando de este modo negativamente a la recuperacion del producto. Sorprendentemente, las fracciones posteriores del tampon de elucion conteman suficiente capacidad de tamponamiento y por lo tanto se neutralizaron al nivel de pH esperado, causando desorcion de producto adicional unido antes y dando como resultado rendimiento aceptable. La columna de AEX funciono exitosamente en la eliminacion de hCp y filtro protema A a niveles aceptables, a pesar de que el pH vario significativamente. Por lo tanto, el tandem proA/TMAE permitio el uso de cromatograffa de particion debil, a pesar de que el pH oscilo ampliamente durante la operacion de la TMAE.

Se encontro que solo el pH al final de la elucion proA determina la calidad del producto y la recuperacion de la reserva en tandem, siempre y cuando el pH disminuya consistentemente en el transcurso de la elucion. A la inversa, pH por encima del optimo en el comienzo de la elucion proA tendna un efecto mmimo en la calidad y la recuperacion del producto. Por consiguiente, en algunas realizaciones de la presente divulgacion, se proporcionan procedimientos que incluyen el funcionamiento de un procedimiento de proA-AEX en tandem a pesar del pH variable. En algunas realizaciones, las tasas de bombeo en tales procedimientos son constantes.

Ejemplo 5. El uso de un reactivo de valoracion que es basico y contiene sal para la operacion en tandem de cromatografia de ProA y cromatografia de AEX

El uso de un reactivo de valoracion para el funcionamiento en tandem de la protema A y AEX, que tanto es basico (niveles de pH de aproximadamente 0,5 unidades de pH por encima del funcionamiento de la etapa de AEX y los niveles de concentracion de tampon entre 100 mM y 2 M) como contiene sal, se examino. Las condiciones se disenaron de tal forma que la adicion del reactivo de valoracion tanto aumento el pH del proceso intermedio como aumento de la fuerza ionica del procedimiento intermedio de una manera tal como para mantener constante (o casi constante) la union (medida por metricas como Kp, el coeficiente de reparto) como una funcion de un amplio intervalo de adiciones de volumen de reactivo de valoracion.

Con el fin de establecer la proporcion volumetrica de caudales de las bombas A y B (por ejemplo, como se muestra en la Figura 1), denominada en adelante como porcentaje de neutralizacion (v), el efecto de v en el pH y la concentracion de cloruro, [Cl-] y por lo tanto en Kp, debe determinarse primero. El pH es una funcion de v, pH = f (v), que puede calcularse a partir de una ecuacion de Henderson-Hasselbach y verificarse por valoracion del tampon de elucion. La concentracion de ion cloruro como una funcion de v, [[Cl-] = f(v), podna tambien calcularse en cualquier proporcion de tampones. Las funciones de pH y [Cl-] resultantes de v pueden estar sustituidas en una funcion derivada empmcamente Kp = f (pH, [Cl"]) y representarse graficamente como se muestra en la Figura 6A. El objetivo de la operacion v se elige en base a la funcion deseada Kp. Esta forma de Kp = f (v) refleja el estado actual de la tecnica. Por lo tanto, la combinacion de parametros que da lugar a esta forma de la funcion se conoce como un modo de control de operacion.

En el ejemplo mostrado en la Figura 6A, el tampon de elucion proA de pH bajo contiene NaCl, mientras que el tampon de neutralizacion no contiene nada de sal. Por lo tanto, el pH se eleva mientras [Cl-] cae con el incremento de v, lo que resulta en incrementar de manera constante Kp. Este modo de funcionamiento presenta un reto, ya que llega a ser cntico para mantener una relacion de neutralizacion precisa y constante con el fin de asegurar el rendimiento de AEX deseado. Esta precision puede ser diffcil de lograr en la escala de fabricacion, ya que el rendimiento de la bomba puede ser variable. Se encontro que mediante la incorporacion de sal en el tampon de neutralizacion, alguien podna

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cambiar significativamente la forma de la funcion Kp, como se muestra en la Figura 6B. Este comportamiento de la funcion Kp se debe al aumento simultaneo de pH y [Cl-] con el volumen de reactivo de valoracion anadido. El pH mas alto hace la union a AEX mas fuerte, mientras que una mayor [Cl-] tiene el efecto contrario. La suma de estos dos efectos produce una region de resistencia de union constante en un amplio intervalo de la adicion de reactivo de valoracion. Una combinacion de la invencion de parametros que da lugar a esta forma de funcion Kp = f(v) se proporciona por la presente divulgacion y se refiere como modo Robusto de funcionamiento. Los ejemplos mostrados en las figuras 6A y 6B demuestran que la adicion de sal al reactivo de valoracion hana al proceso de tandem mas robusto con respecto a la exactitud de la mezcla de tampon en lmea despues de la columna proA.

Otra forma de visualizar un funcionamiento en tandem robusto se representa en la Figura 7. El modelo emprnco Kp = f(pH, [Cl-]) obtenido de un experimento de union de lote de alto rendimiento de lotes permite a alguien trazar una lmea de iso-Kp, que muestra la relacion entre el pH y [Cl-] produciendo una fuerza constante de union. A partir del modelo de valoracion discutido anteriormente (figuras 6A y 6B), el pH del efluente de proA neutralizado podna ser trazado como funcion de [CI-]. Segun el estado actual de la tecnica, el pH se disminuira con el aumento de [CI-] como se muestra en la figura 7A. Sin embargo, cuando el tampon de elucion de proA acido se valora con un tampon de neutralizacion basico que tambien contiene NaCl, la concentracion de iones cloruro en la mezcla aumenta linealmente con v. Por lo tanto, el pH del tampon de elucion valorada representada como una funcion del total de [Cl-] en la Figura 7B tendra la misma forma que la funcion de pH en la Figura 6B. Una porcion de la funcion de pH = f([Cl-]) se solapara con una curva de iso-Kp. En esta region de solapamiento, una pequena variacion en el volumen de reactivo de % de valoracion causara un cambio a lo largo de la lmea de iso-Kp, por lo que no afectara la fuerza de union a la resina de AEX.

Una clara diferencia entre los modos de funcionamiento sin sales en el tampon de neutralizacion (Figura 6A y Figura 7A, modo Control) y con sal (Figura 6B y Figura 7B, modo Robusto) se demostro con un MAb terapeutico. La purificacion de esta molecula por cromatograffa por lotes dio como resultado niveles altos de HMW en la reserva de proA. Estas HMW se eliminan de manera efectiva por la etapa de particion debil TMAE-cromatograffa de intercambio anionico. Por lo tanto, se uso la eliminacion de HMW como un marcador de pureza en un funcionamiento en tandem.

La combinacion de tampones utilizados en las simulaciones y experimentos se resumen en la Tabla 1. Las composiciones de tampon se eligieron de una manera tal como para producir la misma Kp = 1,25 para ambos modos de funcionamiento en v = 11,5 %. Las composiciones de tampon de elucion de control son muy similares a las empleadas en una campana de fabricacion clmica, proporcionadas en la Tabla 3.

Tabla 1. Composiciones tampon para demostracion de funcionamiento en tandem robusto.

Tampon de elucion Tampon de neutralizacion

Modo Control

Gly 49 mM, NaCl 56 mM, pH 2,8 Tris 2 M pH 9,5

Modo Robusto

Gly 50 mM, NaCl 17 mM, Tris 20 mM pH 3,7 Tris 0,2 M, NaCl 0,25 M NaCl pH 9,5

Las simulaciones de los dos modos de operacion mostrados en la Figura 6, se verificaron experimentalmente mediante la realizacion del tandem en el punto central (v = 11,5 %), en el punto sub-valorado (v = 6,5 %) y en el punto sobre-valorado (v = 16,5 %)-un total de 6 carreras.

Una superposicion de funciones Kp simuladas para los modos Control y Robusto se muestra en la Figura 8. Por definicion, se espera que ambos modos se lleven a cabo de manera similar en terminos de pureza del producto y recuperacion en el punto central. Sin embargo, sus funciones Kp divergen de manera espectacular en los dos extremos de una desviacion arbitrariamente elegida en v. Por ejemplo, en v = 6,5 % (equivalente a una disminucion del 46,5 % en la tasa de flujo de la bomba B), el Kp resultante disminuye en solo el 28 % en el modo Robusto, en comparacion con una disminucion del 91 % en el modo Control. Del mismo modo, en v = 16,5 % (equivalente a un incremento del 52 % en el caudal de la bomba B), Kp se reduce en solo el 15 % en el modo Robusto, pero se eleva en un 197 % en el modo Control. Por lo tanto, el modelo predice cambios relativamente pequenos en la calidad del producto y la recuperacion despues de un cambio absoluto de ± 5 % en proporcion de neutralizacion en el modo Robusto. Sin embargo, en el modo Control, sub-valoracion en un 5 %, probablemente causana un gran avance de HMW y HCP, mientras que la sobre-valoracion en un 5 % probablemente resultana en una perdida de recuperacion del producto.

Ejemplo 6. Funcionamiento de una etapa tandem proA-AEX en un intervalo de proporciones de neutralizacion (V) y en los parametros que da como resultado un cambio relativo en Kp (k) por debajo del 100 % cuando v se vario del 50 % al 150 % del objetivo

En este ejemplo, las etapas de tandem proA-AEX se llevaron a cabo en un intervalo de proporciones de neutralizacion (V) y a tal combinacion de parametros que dio como resultado el cambio relativo en Kp (k) por debajo del 100 % cuando v se vario del 50 % al 150 % del objetivo. De forma mas precisa, las condiciones dieron como resultado k < 20 %, en el intervalo del 90 % al 110 % de la v objetivo.

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Los parametros de funcionamiento son los siguientes: pH, concentracion de sal y pKa de los tampones de elucion y neutralizacion. Diversas realizaciones de los procedimientos descritos en este documento establecen que un proceso solido debena funcionar a una v objetivo dentro de la ventana de robustez. En algunas realizaciones, un procedimiento funciona en el centro de la ventana de robustez.

Con el fin de definir la ventana de funcionamiento robusto que es independiente de los valores de Kp y v, alguien puede emplear una funcion, k = ABS [Kp (v + A v)-Kp (v - A v)]/Kp(v) ,%, que mide un cambio en % absoluto en Kp dentro de un intervalo de operacion dado (v± Av).

or ejemplo, para las enfermedades que se describen en el Ejemplo 5, si A v se fija al 10%, la funcion de k se convierte en:

k20 = ABS[Kp(0,9v)-Kp(1,1 v)]/Kp(v), %.

%,

que se representan en la Figura 9. La ventana de funcionamiento Robusto mostrada en este grafico abarca el intervalo de v, donde k20 es < 20 %. El punto central del modo robusto de funcionamiento a v = 11,5 % corresponde a k = 0, haciendolo el punto mas preferible para funcionar. Por el contrario, el punto central del modo de control proporciona k = 61 %. Esto significa que al cambiar de una condicion sub-valorada (al 10 %) a una condicion sobre-valorada (al 10 %), el Kp de la carga de TMAE cambiara en un 61 % en el modo Control, mientras que permanece constante en un modo Robusto. Se preve que el funcionamiento de un procedimiento en tandem fuera de la ventana de funcionamiento robusto limitara significativamente la desviacion permitida de la proporcion de neutralizacion, por lo tanto el procedimiento se hace mas propenso al fracaso.

Para cualquier receta dada para un funcionamiento en tandem, incluso si la funcion Kp no se conoce, la practica de un modo robusto como se trata en el Ejemplo 5 se podna determinar experimentalmente. Por ejemplo, tanto Kp como k podnan medirse en una serie de experimentos de union de tres lotes, donde V se fija al 90 %, 100 % y 110 % del objetivo.

Una configuracion experimental se baso en un sistema en tandem de dos columnas para la purificacion de un anticuerpo anti-IL-13, de acuerdo con la Figura 1. Se compoma de 1,1 cm x 23 cm de columna proA MabSelect, seguido de uno de 10 cm2 0,2 pm unidad de filtro Sterivex 10, seguido por una columna de 1,6 cm x 14 cm AEX TMAE. El medio acondicionado se flocula con fosfato de calcio y la almohadilla de filtrado con el fin de minimizar la precipitacion post-neutralizacion. Neutralizacion pico de proA en lmea se llevo a cabo mediante la programacion de un sistema AKTA FPLC para entregar una cierta proporcion de flujo de la bomba B en el intervalo de 6,5 %-16,5 % del flujo total. La unidad VRF se evito en este experimento. Las fracciones fueron tomadas despues de la TMAE para mediciones de pH y de concentracion fuera de lmea. HMW en las fracciones se evaluaron por HPLC de exclusion por tamano. ELISA de HCP y ELISA de proA filtrada se llevaron a cabo en las reservas de las fracciones.

Una porcion de los cromatogramas de procedimiento que muestra la region de pico de elucion se muestra en la Figura 10. El orden de avance de protemas fue el esperado dentro de cada grupo representando los modos de neutralizacion Control y Robusto. El cambio significativo en el tiempo de retencion del pico entre los dos grupos se debio a diferentes pH de tampones de elucion proA. El modo de control emplea un pH mas bajo del tampon de elucion que el modo robusto (vease la Tabla 1), resultando en la elucion de la columna anterior proA y avance anterior de producto a traves de la columna de TMAE. Las mediciones fuera de lmea en fracciones post-TMAE se muestran en las figuras 11A-11F. Como se predijo, el modo Robusto de funcionamiento no se vio afectado significativamente por v. Las Figuras 11B, 11D y 11F parecen tener perfiles de pH, concentracion y HMW muy similares. Por el contrario, el modo de control exhibio tendencias definidas en los perfiles de avance hMw y la elucion de productos como los v cambia del 6,5% al 11,5% a 16,5% (Figuras 11A, 11C y 11E). Sub-valoracion (v = 6,5%, la Figura 11 A) resulto en niveles de pH que son demasiado bajos para la union eficaz de producto y las impurezas a la resina TMAE. Como consecuencia, el pico de producto era muy agudo y HMW avanzaron pronto en la elucion. Sobre-valoracion (v = 16,5%, Figura 11 E) condujo a un resultado opuesto: ningun avance HMW, pero una muy amplia elucion y recuperacion del producto baja.

Un avance HMW anteriormente en la prueba de control en el punto central (v = 11,5 %, Figura 11C) puede ser debido a un efecto de no equilibrio, tal como la oclusion de los poros, causada por la incapacidad de la resina TMAE para hacer frente a una banda altamente concentrada de protema que eluye de la columna de la proA a pH = 2,8.

Los resultados de la pureza de ejecuciones en la Figura 11 se resumen en la Tabla 2. Como se predijo, la ejecucion Control sub-valorada dio como resultado los niveles mas altos de impurezas. Sin embargo, debido a la limitada sensibilidad de los ensayos, no fue posible distinguir las otras reservas.

Tabla 2. Efecto de la v en la pureza de la reserva en tandem en los modos Robusto y Control.

Ejecucion (como en la Figura 11)

v, % Kp predicha HMW en la reserva de 3 CV,% HCP, ppm ProA de filtrado, ppm

5

10

15

20

25

30

35

40

Ejecucion (como en la Figura 11)

v, % Kp predicha HMW en la reserva de 3 CV,% HCP, ppm ProA de filtrado, ppm

A (Control, sub-valorado)

6,5 0,10 3,26 30 4,3

B (Robusto, sub-valorado)

6,5 0,90 0,14 BLOQ BLOQ

C (Control, punto medio)

11,5 1,25 0,11 BLOQ 0,11

D (robusto, punto medio)

11,5 1,25 0,04 BLOQ 0,07

E (Control, sobre-valorado)

16,5 3,70 0,14 BLOQ 0,034

F (Robusto, sobre-valorado)

16,5 1,06 0,29 BLOQ BLOQ

Los resultados experimentales confirmaron la prediccion del modelo de robustez. La realizacion en tandem mostro ser mas robusta cuando se anadio sal al tampon de neutralizacion.

Ejemplo 7. Elucion de la proteina A

Se descubrio que la elucion de la proteina A con una solucion que contiene un tampon que tiene una pKa cerca de la condicion de elucion (usualmente hecha funcionar en o cerca de las condiciones acidas) y tambien un tampon que tiene una pKa cerca de la operacion de la etapa de AEX subsiguiente (usualmente hecha funcionar en o cerca de condiciones neutras o basicas), evito desviaciones de pH durante la neutralizacion de la corriente del procedimiento y eluyo a partir de la proteina A.

En una operacion en tandem con una proporcion de neutralizacion constante, el borde delantero de la elucion de proA a veces tiene un pH mayor que el objetivo. El pH elevado esta causado por la perdida de capacidad de tamponamiento por el tampon de elucion a medida que pasa a traves de la columna de la carga proA, que contiene ligandos proA valorables proA y producto unido. Tras la adicion de tampon de neutralizacion de pH alto para el tampon de elucion de acido agotado, pH se eleva a casi el nivel del tampon de neutralizacion y se mantiene alta hasta que todos los residuos en la columna de la proA han sido valorados y el acido que contiene tampon de elucion aparece en el mezclador.

Aunque por lo general la desviacion de pH se produce justo antes de la parte delantera de protemas viene a traves de la AEX y no afecta a la calidad o la recuperacion de la reserva en tandem, se observa a veces pH elevado durante la recogida de pico. El pH elevado significa que AEX se carga en condiciones de union alta antes de que el tampon de elucion neutralizada del pH objetivo pase a traves de la columna. En algunos casos, esta desviacion de pH podna causar la union irreversible de productos o impurezas de HMW a la superficie de las perlas de resina, dando como resultado la oclusion de poros y una perdida prematura de capacidad de union a AEX.

Con el fin de mitigar la oscilacion de pH, se anadio Tris-HCl 20 mM para el tampon de elucion en el modo Robusto y el pH se ajusto al objetivo pH = 3,7, como se indica en la Tabla 1. El Tris acidificado quedo protonado a su paso por la columna de la proA y proporciono resistencia al exceso de Tris basico durante la neutralizacion.

La comparacion de las mediciones de pH fuera de lmea en fracciones en tandem, como se muestra en la Figura 11 demuestra el efecto de Tris-HCl en la extension de la oscilacion de pH. Ejecuciones de neutralizacion Robustas muestran una tendencia de pH mas superficial que las ejecuciones Control. Por ejemplo, en las ejecuciones de punto central (V = 11,5 %, Figura 11, C, D), el pH disminuyo en solo 0,1 unidades durante la elucion pico en el modo robusto, disminuyendo mientras en 0,3 unidades en el modo Control. En todas las ejecuciones Robustas el cambio de pH esta en gran parte sobreestimado cuando las concentraciones de protemas alcanzan su pico, mientras que en las ejecuciones Control el pH sigue siendo muy superior que el objetivo.

Ejemplo 8. Funcionamiento de una cromatograffa proA por lotes seguida de una cromatograffa de AEX por lotes (no en tandem)

Se realizo cromatograffa de proA por lotes seguida de cromatograffa de AEX por lotes a las condiciones descritas en los Ejemplos 5, 6 y 7.

En una cromatograffa por lotes tradicional, el pH y la conductividad de una reserva proA neutralizada son parametros cnticos que afectan el rendimiento de la etapa de AEX y por lo tanto la calidad del producto. Despues de la etapa de inactivacion de virus de pH bajo, la reserva pico proA se neutraliza a un pH determinado con el fin de ser adecuada para la etapa de AEX de particion debil. La neutralizacion por lotes se realiza generalmente mediante la adicion gradual del 1-2 % en volumen de reactivo de valoracion, que contiene agente tampon concentrado con una pKa cerca del pH de trabajo de ejecucion de AEX. La valoracion continua hasta que el pH ha alcanzado el valor deseado. La conductividad se controla y se registra, pero no podna ajustarse independientemente del pH. Idealmente, tanto el pH como la conductividad alcanzan los valores objetivo simultaneamente. Sin embargo, debido a la mezcla incompleta y el efecto de la temperatura sobre las mediciones de pH, la lectura de pH al final de la valoracion puede ser inexacta,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

resultando en demasiado, o no suficiente, del reactivo de valoracion anadiendose a la reserva.

En una situacion de sobre-valoracion accidental, el pH real de la reserva neutralizada superara el objetivo en un grado mas alto que la conductividad, ya que el agente tampon tiene solamente un efecto moderado sobre la conductividad. El pH elevado producira un aumento general en Kp y una disminucion correspondiente en la recuperacion de producto durante la etapa de AEX. Por una razon similar, la sub-valoracion dara como resultado un pH inferior al objetivo, que no sera compensado por una disminucion de la conductividad adecuada. En este caso, la calidad del producto se vera afectada por la union debil de impurezas.

Ademas, el requisito de GMP para satisfacer dos parametros cnticos (pH y conductividad) de forma simultanea y sin la capacidad de controlarlos de forma independiente, puede incrementar el riesgo de rechazo de lotes. Por lo tanto, sena deseable tener un procedimiento de neutralizacion con un mecanismo incorporado para compensar una desviacion en un parametro afectando automaticamente al otro en la direccion apropiada. Por ejemplo, si el exceso de valoracion se produce con un aumento concomitante de [Cl-] (y conductividad), no dara lugar a ningun cambio general en Kp. Tal mecanismo eliminana la necesidad de tener dos parametros cnticos, dado que el pH estana ligado a la conductividad, siempre que las memorias intermedias se formulen con precision. En cambio, el registro de lote puede especificar solo la fraccion volumetrica del reactivo de valoracion, v, que se anade a la reserva.

Se descubrio que la incorporacion de sal concentrada en el reactivo de valoracion lograna el efecto descrito anteriormente. Los mismos modelos matematicos y ffsicos discutidos en los Ejemplos 5 y 6 para describir la neutralizacion continua se aplican aqu para un procedimiento de cromatograffa por lotes. Un modo Control, sin sal en el tampon de neutralizacion y condiciones de elucion proA agresivas se compara con un modo Robusto, donde el tampon de neutralizacion contiene NaCl concentrado y donde la elucion de proA se produce a pH relativamente suave. Las composiciones tampon ejemplares se resumen en la tabla 3. Como en el modelo en tandem, las condiciones se disenaron para producir la misma Kp = 1,25 para ambos modos de funcionamiento a la misma relacion de neutralizacion v = 1,15 %.

Los tampones de modo Control son muy similares a los empleados en una campana de fabricacion, tambien enumerados en la Tabla 3. El registro del lote especifica la valoracion de la reserva proA a pH 7,8, lo que corresponded a Kp = 0,81 en v = 1,40 %.

Ejemplos de pH, [Cl-] y Kp en funcion de v para un procedimiento por lotes que se muestran en la Figura 13 parecen ser muy similares a los de un procedimiento en tandem en la Figura 6. Tambien se puede observar que los tampones de neutralizacion son exactamente 10x las concentraciones empleadas en el funcionamiento en tandem, mientras que v es exactamente 0,1x que en el funcionamiento en tandem. Este inesperado resultado demuestra la escalabilidad de los procedimientos de la invencion proporcionados en el presente documento: lo que sugiere que el modelo para determinar las condiciones de neutralizacion Robustas es aplicable en un amplio intervalo de v.

La Figura 14A muestra diferentes efectos que una sobre-valoracion y una sub-valoracion tendnan en Kp = f (v) en los modos Robusto y Control de funcionamiento. Por ejemplo, si la valoracion se detuvo en v = 0,55 %, en lugar del objetivo v = 1,15 %, Kp en el modo Robusto sena 1,09, mientras que en el modo Control se reducina a 0,08, probablemente como resultado de un fallo de la etapa de TMAE.

Tabla 3. Composiciones tampon para operacion por lotes de realizacion de modelos

Tampon de elucion Tampon de neutralizacion

Modo de control

Gly 50 mM, NaCl 41,4 mM, pH 2,8 Tris 2 M pH 9,5

Modo robusto

Gly 50 mM, NaCl 6,8 mM, Tris 20 mM pH 3,55 2 M Tris, 2,5 M NaCl pH 9,5

Utilizado en campana

Glicina 50 mM, NaCl 37 mM, pH 2,9 Tris 2 M pH 8,5

Figura 14B define la ventana de funcionamiento fuerte reivindicada, donde la funcion de cambio de Kp relativa, k = ABS [Kp (1,1 v)-Kp (0,9V)]/Kp (v),% es < 20%. La comparacion del comportamiento k en los modos Robusto y Control demuestra que, si bien sena seguro establecer un objetivo de valoracion en cualquier lugar entre el 0,75 % y el 1,55 % (pero preferiblemente, al 1,15%) del reactivo de valoracion en el modo Robusto, el modo Control producina un cambio significativo en k en el intervalo de ± 10 % de desviacion en v.

Ejemplo 9. Purificacion en tandem a diferentes condiciones de union

Un producto inmunofarmaceutico modular pequeno se purifico por el AEX por lotes control o por proA-AEX en tandem en diversas combinaciones de condiciones. Las Figuras 15A-15C muestran una comparacion de estos esquemas de purificacion utilizando neutralizacion proA programada para proporcionar condiciones de union debiles (Kp = 1,5). Un procedimiento en tandem utiliza elucion agresiva (pH 3,5) sin Tris en el tampon de elucion. El segundo procedimiento en tandem utiliza elucion suave (pH 3,75) y Tris-HCl en el tampon de elucion. La adicion de Tris para el tampon de elucion proA elimino el aumento de pH visto despues de la valoracion. Eluir la proA con un tampon de pH mas alto mitigo la limitacion cinetica supuesta de la AEX para unir especie HMW1. La calidad del producto era excelente.

En una segunda serie de experimentos, un producto inmunofarmaceutico modular pequeno tambien se purifico AEX por lotes control o por proA-AEX en tandem en diversas combinaciones de condiciones. Las Figuras 16A-16C muestran una comparacion de estos esquemas de purificacion utilizando una neutralizacion proA programada para suministrar condiciones de union mas fuertes (Kp = 3,0) que en la primera serie de experimentos. Un procedimiento en 5 tandem utiliza elucion agresiva sin Tris en el tampon de elucion. El segundo procedimiento en tandem utiliza elucion suave y Tris-HCl en el tampon de elucion. Las condiciones de union mas fuertes reducen el nivel de HMW1 en el proceso de elucion agresiva (Figura 16B). La recuperacion estuvo por encima del 90 % en todos los casos.

Claims (23)

1. 5

   10

   15

   20

   25

   30

   35

   40

   45

   REIVINDICACIONES

   1. Un procedimiento de recuperacion de un producto de protema purificada a partir de un fluido de carga, comprendiendo el procedimiento:

   a) exponer un fluido de carga que comprende un producto proteico a una columna que comprende una primera resina en condiciones en las que el producto se une a la resina;

   b) recuperar fluido que comprende el producto de la primera resina para producir un primer eluato;

   c) valorar el primer eluato con un reactivo de valoracion a medida que pasa a la segunda resina, en el que el reactivo de valoracion altera una o mas condiciones del primer eluato tal cuando la relacion volumetrica del eluato al reactivo de valoracion vana hasta en un 40 %, el cambio en el coeficiente de reparto del producto de la segunda resina es menor del 10 %;

   d) exponer el eluato valorado a una columna que comprende la segunda resina en condiciones en las que el producto se une a la segunda resina, en el que la columna que comprende la primera resina esta dispuesta en tandem con la columna que comprende la segunda resina; y

   e) recuperar fluido que comprende el producto de la segunda resina para producir un segundo eluato, recuperando de esta manera un producto de protema purificada a partir de un fluido de carga.
2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el primer eluato se valora con el reactivo de valoracion en una relacion volumetrica de entre aproximadamente 95:5 a 80:20.
3. 3. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que una primera bomba suministra el fluido de carga a la primera resina, una segunda bomba suministra el reactivo de valoracion al primer eluato y en el que las bombas se operan a una proporcion de caudales que vana en menos del 30 %.
4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el reactivo de valoracion y el primer eluato se hacen pasar a traves de un mezclador, antes de la exposicion a la segunda resina.
5. 5. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el procedimiento comprende detectar el pH del eluato valorado, antes de la exposicion a la segunda resina.
6. 6. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el eluato valorado se hace pasar a traves de un filtro, antes de la exposicion a la segunda resina.
7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que los solidos se eliminan del fluido de carga por precipitacion.
8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el el fluido de carga comprende medio de cultivo celular.
9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la protema comprende una parte de union a antfgeno de un anticuerpo.
10. 10. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la primera resina une selectivamente inmunoglobulinas.
11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la segunda resina comprende una resina de intercambio ionico.
12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que el reactivo de valoracion altera una o mas condiciones del primer eluato de tal manera que el producto en el eluato valorado se une a la segunda resina en un modo de particion debil.
13. 13. El procedimiento de la reivindicacion 12, en el que las condiciones del eluato valorado y la resina son tales que el coeficiente de reparto del producto para la resina es 0,1-20.
14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que la resina de intercambio ionico es una resina de intercambio anionico.
15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 14, en el que el reactivo de valoracion tiene un pH que esta 0,5 unidades por encima de un pH en el que la resina de intercambio anionico se une al producto en el eluato valorado en un modo de particion debil.
16. 16. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que el reactivo de valoracion comprende una sal.
17. 17. El procedimiento de la reivindicacion 16, en el que el reactivo de valoracion aumenta la fuerza ionica del eluato de la primera resina de manera que el producto mantiene la union a la segunda resina en un intervalo de adiciones de volumen de reactivo de valoracion.
18. 18. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que la resina de intercambio ionico es una resina de intercambio

    5

    10

    15

    20

    25

    30

    cationico.
19. 19. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el procedimiento comprende tratar el fluido de carga, el primer eluato, o el segundo eluato con uno o mas tratamientos de reduccion de virus.
20. 20. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que el procedimiento comprende tratar el fluido de carga, el primer eluato, o el segundo eluato con uno o mas tratamientos de reduccion de viscosidad.
21. 21. El procedimiento de la reivindicacion 11, en el que la segunda resina es una resina de intercambio anionico y en el que el producto se recupera de la primera resina en un fluido que comprende un tampon que tiene una pKa que esta cerca de condiciones en las que el producto se eluye de la resina y un tampon que tiene una pKa cerca de condiciones en las que el producto se une a la segunda resina en un modo de particion debil.
22. 22. Un procedimiento de recuperacion de un producto de protema purificada a partir de un fluido de carga, comprendiendo el procedimiento:

    a) exponer un fluido de carga que comprende un producto de protema a una columna que comprende una primera resina en condiciones en las que el producto se une a la resina, en el que la primera resina es una resina de protema A;

    b) eluir fluido que comprende el producto de la primera resina para producir un primer eluato, en el que el producto se eluye de la primera resina en un fluido de elucion que comprende un tampon que tiene una pKa que esta cerca de condiciones en las que el producto se eluye de la resina y un tampon que tiene una pKa cerca de condiciones en las que el producto se une a la segunda resina en un modo de particion debil;

    c) valorar el primer eluato con un reactivo de valoracion a medida que pasa a la segunda resina;

    d) exponer el eluato valorado a una columna que comprende la segunda resina en condiciones en las que el producto se une a la segunda resina, en el que la columna que comprende la primera resina esta dispuesta en tandem con la columna que comprende la segunda resina; y

    e) recuperar fluido que comprende el producto de la segunda resina para producir un segundo eluato, recuperando de esta manera un producto de protema purificada a partir de un fluido de carga.
23. 23. El procedimiento de la reivindicacion 22, en el que la segunda resina es una resina de intercambio anionico, en el que el reactivo de valoracion altera una o mas condiciones del primer eluato de tal manera que el producto en el eluato valorado se une a la resina de intercambio anionico en un modo de particion debil, en el que el reactivo de valoracion altera una o mas condiciones del primer eluato tal cuando la relacion volumetrica del eluato al reactivo de valoracion vana hasta el 40 %, el cambio en el coeficiente de reparto del producto para la segunda resina es menos del 10 % y en el que el reactivo de valoracion aumenta la fuerza ionica del eluato de la primera resina de tal manera que el producto mantiene la union a la segunda resina en un intervalo de adiciones de volumen de reactivo de valoracion.