BRPI0608584B1 - Methods of recovering a purified product - Google Patents

Abstract

métodos de recuperar um produto e um anticorpo purificado de um fluido de carregamento. esta invenção refere-se aos métodos de uso de cromatografia de partição fraca para a purificação de um produto de um fluido de carregamento contendo uma ou mais impurezas. em adição, a invenção refere-se aos métodos de cromatografia de partição fraca definidos pelas condições de operação que fazem com que um meio ligue pelo menos 1 mg de produto por ml de meio, ou alternativamente, definidos por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1.

Description

(54) Título: MÉTODOS DE RECUPERAR UM PRODUTO PURIFICADO (51) Int.CI.: C07K 1/00; C07K 14/00; C07K 16/00 (30) Prioridade Unionista: 11/03/2005 US 60/660,437 (73) Titular(es): WYETH (72) Inventor(es): PAUL BROWN; JON COFFMAN; RANGANATHAN GODAVARTI; TIM ISKRA; BRIAN D. KELLEY; SURESH VUNNUM; SHUJUN SUN; TIANNING YU; JAMES EDWARD BOOTH; MARY BETH SWITZER

MÉTODOS DE RECUPERAR UM PRODUTO PURIFICADO

Campo da invenção

A invenção refere-se aos métodos de recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas. Em certas modalidades da invenção, os métodos compreendem passar o fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por ml de meio, e recuperar o produto purificado do meio no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática. Em outras modalidades da invenção, os métodos compreendem passar o carregamento através de um meio em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1.

Fundamentos da invenção

Dentro da indústria de biotecnologia, a purificação de proteínas em uma escala comercial é um desafio importante para o desenvolvimento de proteínas recombinantes para propósitos terapêuticos e diagnósticos. Problemas relacionados com rendimento, pureza, e taxa de transferência incomodam o setor de manufatura. Com o advento de tecnologia de proteína recombinante, uma proteína de interesse pode ser produzida usando linhagens de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas engenhadas para expressarem um gene codificador da proteína. O que resulta do processo de cultua de célula hospedeira, contudo, é uma mistura da proteína desejada juntamente com impurezas que são quer derivadas da própria proteína, tais como variantes de proteína, quer da célula hospedeira, tais como as proteínas da célula hospedeira. O uso da proteína recombinante

Petição 870170084984, de 06/11/2017, pág. 16/21

desejada em aplicações farmacêuticas e dependente da capacidade de recuperação segura de níveis adequados da proteína destas impurezas.

Métodos de purificação de proteína convencionais são projetados para separarem a proteína de interesse das impurezas baseado em diferenças de tamanho, carga, solubilidade, e grau de hidrofobicidade. Tais métodos incluem métodos cromatográficos tais como cromatografia de afinidade, cromatografia de troca iônica, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade de metal imobilizado, e cromatografia de hidroxiapatita. Estes métodos muitas vezes empregam um meio de separação que pode ser projetado para seletivamente aderir quer a proteína de interesse quer as impurezas. No modo de ligação-eluição, a proteína desejada liga-se seletivamente no meio de separação e é diferentemente eluída do meio por solventes diferentes. No modo de fluxo transpassante, as impurezas especificamente se ligam no meio de separação enquanto que a proteína de interesse não, permitindo assim a recuperação da proteína desejada no “fluxo transpassante”.

Métodos correntes para a purificação de proteínas, tais como anticorpos, incluem duas ou mais etapas cromatográficas. Por exemplo, a primeira etapa no protocolo de purificação de proteína muitas vezes envolve uma etapa de cromatografia de afinidade que utiliza urna interação específica entre a proteína e interesse e um reagente de captura imobilizado. Absorventes de Proteína A são particularmente úteis para a captura de afinidade de proteínas, tais como anticorpos, que contêm uma região Fc. Contudo, desvantagens do uso de cromatografia de Proteína A para a purificação de proteína incluem vazamento do agente de captura de Proteína A, acarretando contaminação do produto de proteína eluído. Adicionalmente, captura de afinidade não separa variantes de proteína, tais como formas agregadas da proteína, da proteína de interesse.

Pesquisadores têm usado os métodos de ligação-eluição,

C ί

métodos de fluxo transpassante, e métodos de deslocamento em esforços para recuperar proteínas livres de impurezas resultantes tanto do processo de cultura e quanto das possíveis tapas anteriores no próprio processo de purificação. Exemplos de grupos usando uma etapa de ligação-eluição como uma típica segunda etapa para purificar proteínas após uma etapa de captura de afinidade incluem: Patente U.S. 4.983.722, descrevendo um método de troca iônica de ligação-eluição de reduzir Proteína A de uma mistura; Patente U.S. 5.429.746, descrevendo um método de cromatografia de interação hidrofóbica de ligação-eluição para purificar anticorpo IgG de uma mistura incluindo impurezas de Proteína A; e Patente U.S. 5.644.036, descrevendo um processo de três etapas para obter uma preparação de anticorpo IgG purificado compreendendo uma etapa de Proteína A, uma etapa de troca iônica de ligação-eluição, e uma etapa de exclusão de tamanho. Outros grupos têm usado uma etapa de fluxo transpassante após a etapa de cromatografia de afinidade. Por exemplo, Publicação PCT de número WO 04/076485 descreve um método para remover Proteína A vazada de um anticorpo purificado por uma etapa de cromatografia de Proteína A seguida por uma etapa de troca iônica de fluxo transpassante. Publicação PCT de número WO 03/059935 descreve um método para purificar uma proteína em uma amostra compreendendo submeter a amostra a uma etapa de cromatografia de hidroxiapatita de fluxo transpassante após uma etapa de cromatografia de afinidade.

Outros grupos têm usado um esquema de purificação de única etapa de acabamento para se evitarem os problemas associados com as etapas de purificação anteriores. Por exemplo, Patente U.S. 6.177.548 descreve um método de troca iônica de fluxo transpassante de etapa única para remover agregados de uma amostra biológica onde o pH da amostra é ajustado para 0,2 logs abaixo do ponto isocrático da amostra biológica. Patente U.S. 5.451,662 descreve um método de troca iônica de ligação-eluição de etapa única onde o

pll da mistura de proteína bruta é ajustado para um ponto entre as faixas de pontos isoelétricos das frações de proteína a serem separadas Publicação PCT de número WO 05/044856 descreve um método de deslocamento de etapa única para remoção de agregados de peso molecular alto de preparações de anticorpo usando cromatografia de hidroxiapatita.

Nenhum dos métodos convencionais de ligação-eluição ou de fluxo transpassante na técnica anterior, contudo, é capaz de atender às necessidades da indústria de biotecnologia em termos de todos os requerimentos de taxa de transferência, rendimento, e pureza de produto.

Métodos de ligação-eluição e métodos de deslocamento são limitados, dentre outros fatores, pelo limite de capacidade do meio de separação para a proteína desejada. Os métodos de fluxo transpassante, por outro lado, permitem desafios de carregamento maior do que os métodos de ligação-eluição mas são limitados pela capacidade do meio de separação para as impurezas. Com os métodos de fluxo transpassante, não ocorre qualquer ligação substancial do produto na coluna; qualquer ligação de produto substancial é vista como influenciando negativamente a recuperação de produto. Ainda há uma necessidade de métodos de recuperação de proteínas purificadas em taxa de transferência alta que atendam aos requerimentos de pureza e de rendimento necessários para as aplicações terapêuticas e diagnosticas. Em adição, processos de manufatura comerciais adicionam as necessidades de esquemas de purificação confiáveis, robustos, e efetivos em termos de custo.

Sumário da invenção

A presente invenção refere-se aos métodos de recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas pela passagem do fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio e recuperação do produto purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente

isocrática. Em outras modalidades, as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 5 mg de produto por ml de meio Em outra modalidade, as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 10 mg de produto por mL de meio. Em outras modalidades, as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 20. 30, 40, 50, ou 60 mg de produto por mL de meio.

A presente invenção também se refere aos métodos de recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas pela passagem do fluido de carregamento através de um meio em condições de operação definida por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1 e recuperação do produto purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática. Em uma modalidade, o coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,2 a cerca de 20,0. Em outra modalidade, o coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,2 a cerca de 10,0. Em outra modalidade, o coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 1,0 a cerca de 5,0. Em outra modalidade, o coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 5,0. Em uma modalidade adicional, o coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 1,5.

A presente invenção também se refere aos métodos de recuperação de um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas pela passagem do fluido de carregamento através de um meio em condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 a cerca de 70 mg de produto por mL e definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20, recuperação do produto purificado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.

A invenção também proporciona a identificação, em uma etapa de triagem, das condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo

menos 1 mg de produto por mL de meio ou alternativamente, são definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0.1. A etapa de triagem pode empregar estudos de ligação em batelada ou estudos de ligação em coluna, tais como estudos de eluição em gradiente ou estudos de eluição isocrática.

As condições de operação incluem níveis de pH, forças iônicas, concentrações de sal, concentrações de excipiente (tais como concentrações de fosfato, concentrações de cálcio, concentrações de arginina, concentrações de glicina, e concentrações de HEPES), e níveis de contraligante (tais como concentrações de imidazol), dependendo da seleção do meio.

O meio pode ser qualquer tipo de meio de separação ou resina cromatográfica, tal como um meio de troca aniônica ou um meio de troca catiônica, uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica, uma resina de hidroxiapatita, ou uma resina de cromatografia de afinidade de metal imobilizado.

Produtos purificados que podem ser purificados usando a invenção incluem proteínas de fusão, proteína contendo Fc, imunoconjugados, citocinas, interleucinas, hormônios, e enzimas terapêuticas.

Impurezas que podem ser removidas usando a invenção 20 incluem proteínas de célula hospedeira, ácidos nucléicos, variantes de produto, endotoxinas, Proteína A, e vírus.

Em uma modalidade, o meio remove pelo menos 99,9% das impurezas no fluido de carregamento incluindo proteínas de célula hospedeira, ácidos nucléicos, variantes de produto, endotoxinas, Proteína A.

Em outra modalidade, a concentração de variantes de produto no produto purificado é não maior do que cerca de 2%.

Em modalidades adicionais, o carregamento no meio pode ser em um desafio de carregamento de pelo menos 500 mg ou de pelo menos 1.000 mg de produto por mL de meio.

/0

Em um aspecto da invenção, um produto purificado é recuperado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas pela passagem do fluido de carregamento através de um meio de troca iônica carregado em condições de operação compreendendo níveis de pH e forças iônicas que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio ou alternativamente, em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1.

Em outro aspecto da invenção, um produto purificado é recuperado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas pela passagem do fluido de carregamento através de uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica em condições de operação compreendendo níveis de pH, forças iônicas, e concentrações de sal que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio ou alternativamente, em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0, J.

Em outro aspecto da invenção, um produto purificado é recuperado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas pela passagem do fluido de carregamento através de uma resina de cromatografia de hidroxiapatita em condições de operação compreendendo níveis de pH, forças iônicas, concentrações de fosfato, concentrações de cálcio, concentrações de arginina, concentrações de glicina, concentrações de HEPES, e concentrações de imidazol que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio ou alternativamente, em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,L

Em outro aspecto da invenção, um produto purificado é recuperado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas pela passagem do fluido de carregamento através de uma resina de cromatografia de afinidade de metal imobilizado em condições de operação compreendendo níveis de contra-ligante e níveis de pH que fazem com que o

meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio ou altemativamente, em condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1.

Os métodos da invenção podem ser opcionalmente combinados com uma ou mais etapas de purificação. A(s) etapa(s) opcional(ais) pode(m) ser realizada(s) quer antes da quer após a prática do método da invenção. Por exemplo, os métodos da invenção podem ser opcionalmente combinados com uma etapa de cromatografia de Proteína A como uma etapa inicial.

Em uma modalidade da invenção, um fluido contendo produto é eluído de uma coluna de Proteína A usando um tampão de eluição de força iônica baixa; o pH e a condutividade do fluido contendo produto sao ajustados usando um tampão de neutralização que resulta em não mais do que 200 mM da força iônica do fluido contendo produto, resultando no fluido de carregamento; a o fluido de carregamento é passado através de um meio de troca aniônica sob condições de operação da invenção.

Em algumas modalidades, o tampão de eluição compreende moléculas com um grupo catiônico carregado com um pKa de 6,5-10. Em outras modalidades, o tampão de eluição adicionalmente compreende moléculas com um grupo aniônico carregado com um pKa de 2-5. Em certas modalidades, o tampão de eluição compreende moléculas que são zwitteríons em pHs entre 7 e 9.

A invenção também proporciona produtos purificados, incluindo proteínas purificadas e anticorpos purificados, preparados pelos métodos da invenção.

Objetivos e vantagens adicionais da invenção serão descritos em parte na descrição que segue, e em parte serão óbvios a partir da descrição, ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os objetivos e vantagens da invenção serão realizados e alcançados por meio dos elementos

e das combinações particularmente realçados nas reivindicações apendidas.

É para ser entendido que tanto a descrição gerai acima quanto a descrição detalhada seguinte são apenas exemplares e explanatórias e não são restritivas da invenção, como reivindicada.

Os desenhos acompanhantes, que são aqui incorporados e constituem parte deste relatório descritivo, e juntos com a descrição, servem para explicar os princípios da invenção.

Breve descrição das figuras

Figura 1 mostra (A) a relação entre um coeficiente de partição 10 e uma isoterma de adsorção de produto; e (B) isotermas de adsorção para ligação de produto em resina, para três modos de operação: modo de ligaçãoeluição; modo de partição fraca, e modo de fluxo transpassante.

Figura 2 mostra (A) as regiões de partição para três modos de operação em cromatografia de troca iônica: modo de ligação-eluição, modo de partição fraca, e modo de fluxo transpassante; e (B) as regiões de partição para três modos de operação em hidroxiapatita.

Figura 3 mostra cromatogramas esquemáticos para três modos de operação: modo de ligação-eluição, modo de partição fraca, e modo de fluxo transpassante.

Figura 4 mostra uma comparação entre cromatogramas de partição fraca e de fluxo transpassante

Figura 5 mostra (A) perfil de remoção de contaminantes típicos como uma função de Kp; e (B) recuperação como uma função de desafio de carregamento e Kp.

Figura 6 mostra progressão típica do desenvolvimento de etapa de cromatografia de partição fraca, incluindo 1) triagem de taxa de transferência alta para determinar Kp, 2) corridas de desafio de carregamento baixo, 3) corridas de capacidade de desafio alto, e 4) corridas de cromatografia de partição fraca ótima.

Figura 7 mostra uma plotagem de contorno de Kp versus pFl e a concentrações de cloreto total do conjunto de dados de concentração baixa, como descrito em Experimento 1.1.

Figura 8 mostra remoção de Proteína A como uma função do 5 coeficiente de partição, Kp, como descrito em Experimento 1,1. O log de valor de remoção aumenta com Kp. Modo de fluxo transpassante é indicado pelo retângulo tracejado com “FT”, enquanto que o modo de partição fraca é indicado por retângulo tracejado com “WP”.

Figura 9 mostra uma plotagem de contorno de log₁₀Kp versus 10 pH e o log da concentração de cloreto total, como descrito em Experimento

2.1.

Figura 10 mostra (A) para Mab-AAB, perfis de aparecimento de proteína de célula hospedeira como uma função de Kp em cromatografia de troca iônica; e (B) para Mab-AAB, aparecimento de Proteína A como uma função de Kp em cromatografia de troca iônica.

Figura 11 mostra para Mab-MYA, a janela de operação ótima para cromatografia de partição fraca em hídroxiapatita. O Kp ótimo neste exemplo está entre 1,5 e 20.

Figura 12 mostra para Mab-A5T4, a janela de operação ótima 20 para cromatografia de partição fraca em hídroxiapatita. O Kp ótimo neste exemplo está entre 2 e 20.

Figura 13 mostra para Mab-MYO, a janela de operação ótima para cromatografia de partição fraca em hídroxiapatita. O Kp ótimo neste exemplo está entre 5 e 20.

Descrição detalhada da invenção

A. Definições

Com o objetivo de que a presente invenção possa ser mais prontamente entendida, certos termos são primeiro definidos. Definições adicionais são descritas em toda a descrição detalhada.

O termo “modo de fluxo transpassante refere-se a uma técnica de separação de produto na qual pelo menos um produto contido na preparação é intencionado para fluir através de um meio ou de uma resina cromatográfica, enquanto que pelo menos uma impureza ou um contaminante potencial se liga no meio ou na resina cromatográfica. Geralmente, o coeficiente de partição de produto para o modo de fluxo transpassante é menor do que 0,1 e a concentração de produto ligado é < 1 mg/mL. O “modo de fluxo transpassante” é uma operação isocrática.

O termo “modo de ligação-eluição” refere-se a uma técnica de 10 separação de preparação de produto na qual pelo menos um produto contido na preparação se liga em um meio ou uma resina cromatográfica. Geralmente, o coeficiente de partição de produto para o modo de ligação-eluição é maior do que 20 e as concentrações de produto ligado estão entre 1 e 20 mg/mL. O produto ligado neste modo é eluído durante a fase de eluição.

O termo “modo de partição fraca” refere-se a uma técnica de separação de preparação de produto na qual pelo menos um produto contido na preparação, e pelo menos um contaminante ou uma impureza, ambos se ligam em um meio ou uma resina cromatográfica. A ligação de produto em modo de partição fraca é pelo menos 1 mg de produto por mL de meio ou resina cromatográfica. Geralmente, o coeficiente de partição de produto para modo de partição fraca é pelo menos 0,1. O “modo de partição fraca” é uma operação isocrática.

O termo “coeficiente de partição” (Kp) refere-se à razão de equilíbrio da concentração de produto absorvido na resina (Q) para a concentração de produto na solução (c), sob condições especificadas de pH e de concentração de solução. O coeficiente de partição Kp também está relacionado com as isotermas de adsorção de produto como mostrado na Figura 1. O coeficiente de partição Kp corresponde à inclinação da isoterma de adsorção de produto em concentrações de solução muito baixas. Está

relacionado com a capacidade máxima como segue:

onde Q_max é a capacidade máxima da resina para o produto, e k_d é a constante de dissociação para interação de ‘resina-produto’. O coeficiente de partição é tipicamente medido com uma técnica de ligação em batelada, mas outras técnicas, tal como cromatografia isocrática, podem ser usadas.

O termo “produto ligado’’ (Q) refere-se à quantidade de produto que se liga na resina quando em equilíbrio com uma corrente de alimentação.

O termo “anticorpo” refere-se a qualquer imunoglobulina ou seu fragmento, e inclui qualquer polipeptídeo compreendendo um sítio de ligação de antígeno. O termo inclui, mas não é limitado a, anticorpos policlonais, monoclonais, monoespecíficos, poliespecíficos, não-específicos, humanizados, de humano, de cadeia única, quiméricos, sintéticos, recombinantes, híbridos, mutados, enxertados, e gerados in vitro. O termo “anticorpo” também inclui fragmentos de anticorpo tais como Fab, F(ab’)₂, Fv, scFv, dAb, e outros fragmentos de anticorpo que retêm a função de ligação de antígeno. Tipicamente, tais fragmentos compreenderíam um domínio de ligação de antígeno.

Em certas modalidades da invenção, o anticorpo é um que compreende uma região C_H2/C_H3 e portanto é sujeitável à purificação por cromatografia de Proteína A. O termo “região C_H2/C_H3” refere-se àqueles resíduos de aminoácido na região Fc de uma molécula de imunoglobulina que interage com a Proteína A. Em algumas modalidades, a região Ch2/Ch3 compreende uma região Ch2 intacta seguida por uma região Ch3 intacta, e em outras modalidades, compreende uma região Fc de uma imunoglobulina. Exemplos de proteínas contendo região C_h2/Ch3 incluem anticorpos, imunoadesões e proteínas de fusão compreendendo uma proteína de interesse

fusionada em, ou conjugada com, uma região C_h2/Ch3.

O termo '‘carregamento refere-se a qualquer material de carregamento contendo o produto, quer derivado de cultura celular clarificada ou de meio condicionado de fermentação, quer de um intermediário parcialmente purificado derivado de uma etapa de cromatografia. O termo “fluido de carregamento¹' refere-se a um líquido contendo o material de carregamento, passando através de um meio sob as condições de operação da invenção.

O termo “impureza” refere-se a qualquer molécula estranha ou 10 objetável, incluindo uma macromolécula biológica tal como um DNA, um RNA, ou uma proteína, diferente da proteína de interesse sendo purificada que também está presente em uma amostra da proteína de interesse sendo purificada. Impurezas incluem, por exemplo, variantes de proteína, tais como proteínas agregadas, espécies de peso molecular alto, espécies de peso molecular baixo e fragmentos, e espécies desamidadas; outras proteínas das células hospedeiras que secretam a proteína sendo purificada (proteínas de célula hospedeira); proteínas que são parte de um absorvente usado em cromatografia de afinidade que podem vazar para dentro de uma amostra durante as etapas de purificação, tal como Proteína A; endotoxinas; e vírus.

O termo “lavagem essencialmente isocrática” refere-se a uma solução que varia apenas ligeiramente do fluido de carregamento em termos de composição e pH.

O termo “efluente da coluna” refere-se ao líquido saindo do meio ou da coluna durante o ciclo de carregamento, ou no período que o carregamento está sendo aplicado.

O termo “desafio de carregamento” refere-se à massa total de produto carregada na coluna no ciclo de carregamento de uma etapa de cromatografia ou aplicada na resina em ligação em batelada, medida em termos de massa de produto por volume unitário de resina.

O termo '‘log de valor de remoção” (LRV) refere-se ao logfbase 10) da razão da massa de impureza no carregamento de uma etapa de purificação para a massa de impureza na reunião de produto.

O termo “cromatografia isocrática” refere-se à operação de 5 uma coluna cromatográfica com um solvente que não muda a concentração durante o período de interesse.

B. Descrição do método

A presente invenção proporciona métodos para recuperação de produtos purificados de um fluido de carregamento contendo uma ou mais impurezas. A invenção possui aplicação em preparação em grande escala de proteínas para propósitos terapêuticos e diagnósticos.

1. Modo de partição fraca

Requerentes têm verificado de modo surpreendente que pela operação em um modo cromatográfico residindo na região entre os modos cromatográficos de ligação-eluição e de fluxo transpassante, um grau alto de redução de impureza, bem como desafio de carregamento de produto alto e recuperação de produto alta, podem ser obtidos. Requerentes têm nomeado este modo de ligação de produto intermediário, como o “modo de partição fraca”.

No modo de partição fraca, um fluido de carregamento contendo um produto de interesse e uma ou mais impurezas é passado através de um meio cromatográfico, com ambos o produto e as impurezas se ligando no meio. Contudo, as impurezas se ligam mais fortemente no meio do que o produto e à medida que o carregamento continua, produto não ligado passa através do meio e é recuperado do efluente da coluna. O meio é opcionalmente subseqüentemente lavado sob condições isocráticas para recuperar produto fracamente ligado adicional do meio e o produto purificado de qualquer lavagem essencialmente isocrática é reunido com o produto purificado do efluente da coluna durante o ciclo de carregamento.

De acordo com a invenção, o modo de partição fraca é definido pelas condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio. Em uma modalidade, as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 5 mg de produto por mL de meio. Em outra modalidade, as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 10 mg de produto por mL de meio. Em outra modalidade, as condições de operação fazem com que o meio ligue pelo menos 20 mg de produto por mL de meio.

Em certas modalidades da invenção, a massa de produto total 10 ligada no meio é pelo menos 10% da massa de produto total carregada no meio. Em algumas modalidades da invenção, a massa de produto total ligada no meio é pelo menos 20% da massa de produto total carregada no meio. Em outras modalidades da invenção, a massa de produto total ligada no meio é pelo menos 30% da massa de produto total carregada no meio.

De acordo com a invenção, o modo de partição fraca é também definido por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1. Em algumas modalidades, operação em modo de partição fraca compreende operação sob condições definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 0,2 a cerca de 20,0. Em algumas modalidades, operação em modo de partição fraca compreende operação sob condições definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 0,2 a cerca de 10,0. Em outras modalidades, operação em modo de partição fraca compreende operação sob condições definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 1,0 a cerca de 5,0. Em outras modalidades, operação em modo de partição fraca compreende operação sob condições definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 5,0. Em ainda outras modalidades, operação em modo de partição fraca compreende operação sob condições definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 1,5.

Pelo menos uma modalidade da presente invenção proporciona condições de operação de modo de partição fraca que fazem com que o meio ligue de pelo menos 1 a cerca de 70 mg de produto por ml de meio, e que são definidas por um coeficiente de partição de 0,3 a 20.

Figura 1 mostra as isotermas de adsorção de produto para os 5 modos de ligação-eluição, fluxo transpassante, e de partição fraca, com ligação de produto para modo de partição fraca sendo claramente intermediária em comparação com os modos de ligação-eluição e de fluxo transpassante. Devido ao fato de o valor de coeficiente de partição de produto (Kp) ser a razão da concentração de produto adsorvido para a concentração de produto em solução, os valores de Kp para o modo de partição fraca também são os valores para os modos de ligação-eluição e de fluxo transpassante.

Figura 2A mostra as regiões de partição para os modos de ligação-eluição, de partição fraca, e de fluxo transpassante como uma função da força iônica, mostrando que K_inip é maior em modo de partição fraca do que em modo de fluxo transpassante. Sob condições de ligação mais estringentes do modo de partição fraca, uma capacidade de produto maior pode ser alcançada - maior do que o modo de fluxo transpassante, porque as impurezas são mais fortemente ligadas, e maior do que o modo de ligaçãoeluição, porque o produto se liga muito fracamente em comparação com as impurezas e não aproveita da maior parte da capacidade da resina. O coeficiente de partição de impureza (K_imp) é maior nas condições de ligação mais estringentes, resultando em concentrações menores de impurezas residuais na reunião de produto de modo de partição fraca comparado com a reunião de produto do modo de fluxo transpassante. As regiões de fluxo transpassante, de partição fraca e de ligação-eluição em hidroxiapatita, como uma função de concentração de fosfato e de NaCl, são mostradas na Figura 2B.

Tabela A sumaria as diferenças em características entre os três modos de ligação: ligação-eluição (B-E), partição fraca (WP), e fluxo transpassante (FT).

Tabela A: Características de modos FT/WP/B-E

	FT	WP	B-F
kp	< 0.1	0 1-20	-20
Limitação de desafio de carregamento	Impurezas 10-50 mg de Produto ml, (típico) mas realmente dependente da pureza de carregamento	Impurezas 50-500 mg de ProdutomL (típico) mas realmente dependente da pureza de carregamento	Produto ~ impurezas 100 mg de Produto mL
Volume de carregamento	Moderado. para impurezas diluídas 10-20 CVs	Muito alto. para impurezas diluídas até . 50 CVs	Menor. porque o produto se liga em adição às impurezas 520 CVs
[Produto] em eluato de carregamento	Igual à concentração de carregamento durante a maior parte do carregamento	Retardo inicial, então igual à concentração de carregamento durante a maior parte do carregamento	^5% de concentração de carregamento
[impureza] residual	Baixa	Muito baixa	Dependente das condições de eluição, volume de reunião e capacidade
Produto ligado (Q)	< 1 mg-'mL	< 10-20 mg/mL	> 10-20 mg/mL
Região de operação	Faixa relativamente larga de condições	Janela modesta de operação entre os modos FT e E-B	Condições de ligação estringentes para carregamento, faixa de carregamento de condições de eluição
Fase(s) móveis	Isocrática(s)	Isocrática(s)	Mudança em composição de tampão após carregamento que causa eluição

Modo de partição fraca também pode ser distinguido dos modos de ligação-eluição e de fluxo transpassante por seus cromatogramas, como mostrado na Figura 3. Primeiro, os cromatogramas dos modos de fluxo transpassante e de partição fraca podem se parecer bastante similares - o produto é recuperado no efluente da coluna e nas frações de lavagem, sob condições isocráticas. Contudo, há distinções sutis mas significativas nos cromatogramas que podem ser usadas para distinguir estes modos, como mostrado na Figura 4. Há um atraso no perfil de aparecimento inicial (> 0,1 volume de coluna ou CV) para o modo de partição fraca comparado com o modo de fluxo transpassante. Há um perfil de lavagem mais lento no modo de partição fraca. Um pico de extração pequeno contendo produto pode estar presente (que corresponde à resina ainda ligando 10-50% da concentração de produto de carregamento após o estágio de lavagem), que pode ser recuperado da resina por aplicação de 1-5 CV após o carregamento sob condições

ísocráticas subseqüente à recuperação, do efluente de coluna durante o ciclo de carregamento.

Figura 5Λ mostra as tendências gerais em LRV dc contaminante para vários níveis de valores de coeficiente de partição de produto. LRVs de contaminante são relativamente baixos em condições de Kp correspondendo às operações de fluxo transpassante. Operação sob condições de aumento de Kp aumenta signifi cativam ente LRVs nas frações de efluente da coluna antes do aparecimento do contaminante. Como mostrado nos exemplos, operação em valores de Kp maiores melhora os LRVs de contaminante em tanto quanto 2 logs daqueles correspondentes às condições de fluxo transpassante padrão.

Kp crescente tipicamente aumenta a ligação na resina de ambos o produto e o contaminante. A ligação mais forte do contaminante em Kp maior acarreta um LRV mais alto nas frações de efluente da coluna antes do aparecimento do contaminante. Contudo, o desafio de carregamento no ponto da aparecimento de contaminante diminui com o Kp crescente porque o produto começa a competir com o contaminante pelos sítios de ligação sobre a resina, como representado esquematicamente na Figura 5A pela curva de Kp alto. A região de partição fraca portanto corresponde a uma janela de operação que equilibra a melhoria em LRV de contaminante com os requerimentos de capacidade da coluna para uma separação dada.

O limite superior de Kp para cromatografia de partição fraca também é dependente do desafio de carregamento da coluna como mostrado em Figura 5B. O coeficiente de partição não tem impacto sobre a recuperação de produto em valores margeando as condições de fluxo transpassante. A recuperação de produto começa a cair em valores de Kp altos onde as condições de lavagem isocrática não são efetivas na lavagem do produto ligado da coluna em um número razoável de volumes de lavagem. A extensão de perda de produto devido à lavagem ineficiente é sensível ao desafio de carregamento, bem como à natureza e a proporção de contaminante no carregamento. Assim, o limite inferior da região WP é definido pelos requerimentos de remoção de contaminante, enquanto que o limite superior para um dado desafio de carregamento é definido pelas restrições de capacidade ou recuperação de produto.

Em uma ou mais modalidades da invenção, condições de partição fraca ótimas podem ser identificadas usando a seguinte seqüência de experimentos, como mostrada na Figura 6:

(i) Realizar uma triagem de HTS (ou experimentos de ligação 10 em batelada padrão) para determinar os coeficientes de partição de produto

Kp como uma função de condições de operação. Janela de operação de identidade correspondendo à região de partição fraca (0,1 < Kp < 20) destes experimentos.

(ii) Preferivelmente, após identificação da região de partição 15 fraca, pode-se realizar corridas de observação em uma coluna de escala pequena em um desafio de carregamento similar àqueles usados para a operação de fluxo transpassante padrão (aproximadamente 50 mg/mL). Podese adicionalmente ajustar finamente a janela de operação de partição fraca baseado em valores de recuperação de produto e de remoção de contaminante destes experimentos.

(iii) Mais preferivelmente, pode-se então gerar dados de aparecimento de contaminante para umas poucas condições de Kp dentro da região de partição fraca. Baseado nestes resultados, seleciona-se o coeficiente de partição ótimo na região de partição fraca que proporciona a remoção mais alta de contaminantes em um desafio de carregamento aceitável.

(iv) Pode-se então mais preferivelmente realizar corridas de cromatografia de partição fraca sob condições de Kp ótimas e adicionalmente ajustar finamente o desafio de carregamento e os volumes de lavagem conforme a necessidade para se obterem ótimas remoção de contaminante e recuperação.

Uma pessoa experiente na técnica poderia usar estas diretrizes ou uma sua variação para facilmente definir uma etapa de cromatografia de partição fraca que proporciona remoção de contaminante intensificada em desafios de carregamento comparáveis ou maiores do que os dos modos padrão de fluxo transpassante ou ligação-eluição da operação da coluna, O sistema gerai discutido acima pode, com ajustes menores se houver, ser aplicado para desenvolver uma etapa de purificação em um sistema de troca iônica, de interação hidrofóbica, de hidroxiapatita, ou de multi-modos que combina elementos de qualquer uma das ou de todas estas interações.

2. Técnicas de separação

Modo de partição fraca pode ser usado conjuntamente com qualquer meio ou resina cromatográfica para separação de um produto das impurezas. Em uma modalidade, o meio é um meio de troca iônica carregado.

Troca iônica é uma forma de cromatografia que separa de acordo com a carga efetiva. Separação de moléculas ocorre como um resultado da competição entre o produto carregado de interesse e os contra-íons por grupos ligantes opostamente carregados sobre o meio de troca iônica. Interações de ligação entre o produto e o meio de troca iônica dependem da carga efetiva do produto. Carga efetiva é dependente do pH e da força iônica do meio, que afeta as características de carga diferentes de aminoácidos e de outros componentes sobre a superfície exposta da(s) molécula(s) de produto de interesse.

Resinas de troca iônica que podem ser usadas na invenção incluem resinas de troca aniônica e resinas de troca catiônica. Resinas de troca aniônica podem empregar substituintes tais como grupos dietil-aminoetila (DEAE), trimetil-amino-etila (TMAE), amino-etila quaternário (QAE) e amina quaternária (Q). Troca catiônica pode empregar substituintes tais como carbóxi-metila (CM), sulfo-etila (SE), sulfo-propila (SP), fosfato (P) e

sulfonato (S). Resinas de troca íònica celulósicas tais como DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32 e CM-52 estào comercialmente disponíveis na Whatman Ltd. Maidstone, Kent, EJ.K. trocadores de íons reticulados e baseados em Sephadex também sâo conhecidos. Por exemplo, DEAE-, QAE-,

CM-, e SP-Sephadex, e DEAE-, Q-, CM- e S-Sepharose, e Sepharose estão todas disponíveis na Amersham Biosciences, Piscataway, NJ. Em adição, copolímeros de etileno-glicol-metacrilato derivados tanto com DEAE quanto com CM tais como TOYOPEARL™ DEAE-650S ou M e TOYOPEARL™ CM-650S ou M estão disponíveis na Toso Haas Co., Philadelphia, PA.

Em certas modalidades da invenção, modo de partição fraca é usado com uma resina de cromatografia de interação hidrofóbica (HIC) para purificação de produto. HIC é uma técnica para separar moléculas baseada em hidrofobicidade. Geralmente, moléculas da amostra em um tampão alto em sal são carregadas na resina de HIC. O sal no tampão interage com as moléculas de água para reduzir a solvatação das moléculas em solução, expondo deste modo regiões hidrofóbicas nas moléculas de amostra que sao conseqüentemente absorvidas pelo meio de HIC. Quanto mais hidrofóbica a molécula, menos sal será necessário para promover a ligação. Interações de ligação entre as moléculas de produto e um meio de HIC portanto dependem de condições tais como pH, força iônica, e concentrações de sal do meio.

Várias resinas de HIC comercialmente disponíveis que podem ser usadas na invenção incluem resinas compreendendo uma matriz de base (e.g., material de copolímero sintético ou agarose reticulada) na qual ligantes hidrofóbicos (e.g., grupos alquila ou arila) estão copulados. Exemplos incluem e Phenyl SEPHAROSE™ 6 FAST FLOW™ (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); Phenyl SEPHAROSE™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); Octyl SEPHAROSE™ High τ'ΚΛ

Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); Fractogel EMD Propyl ou FRACTOGEL™ EMD Phenyl (E. Merck, Alemanha);

MACRO-PREPTM Methyl ou MACRO-PREPTM t-Butyl Supports (BioRad, CA); WP HI-Propyl (C3)TM (J. T. Baker. NJ): e TOYOPFARl ^IM ether phenyl ou butyl (TosoHaas, PA).

Em outras modalidades da invenção, o modo de partição fraca é usado com cromatografia de hidroxiapatita para purificação de produto. Cromatografia de hidroxiapatita é uma técnica que utiliza um fosfato de cálcio hidroxilado insolúvel de fórmula [Cai₀(PO4)₆(OH)₂], tanto como a matriz quanto como o ligante. Grupos funcionais consistem de íons cálcio positivamente carregados (sítios-C) e agrupamentos de grupos fosfato negativamente carregados (sítios-P). Interações de ligação entre o produto e o meio de hidroxiapatita dependem de condições tais como o pH, a força iônica, e as concentrações de excipiente, tais como concentrações de fosfato, concentrações de cálcio, concentrações de arginina, concentrações de glicina, e concentrações de HEPES do meio. Várias resinas cromatográficas de hidroxiapatita estão comercialmente disponíveis e podem ser usadas na invenção.

Em outras modalidades da invenção, o modo de partição fraca é usado com uma resina de cromatografia de afinidade de metal imobilizado (IMAC) para purificação de produto. IMAC é baseado na interação entre os íons de metal de transição quelados imobilizados sobre a resina e as cadeias laterais de imidazol de resíduos de histidina sobre o produto selecionado de interesse. Separação das moléculas ocorre como um resultado de competição entre o produto selecionado de interesse e os contra-ligantes para grupos metal sobre a resina de IMAC. Interações de ligação entre o produto e o meio de IMAC carregado de metal dependem de condições tais como níveis de contra-ligante, tais como concentrações de imidazol, e força iônica do meio. Várias resinas de IMAC estão comercialmente disponíveis e podem ser usadas na invenção.

3. Produtos de purificação

A invenção pode ser usada para a purificação em escala comercial de vários produtos de interesse, incluindo proteínas naturalmente ocorrentes, proteínas de fusão, proteínas contendo Fc. imunoconjugados, citocinas, interleucinas, hormônios, e enzimas terapêuticas. Em uma modalidade, a proteína sofrendo purificação pode compreender um ou mais domínios de imunoglobulina de anticorpo constantes. Em uma modalidade, a proteína também pode compreender um único ou múltiplos domínio(s) variável(eis) de imunoglobulina de anticorpo. Em outra modalidade, a proteína contendo Fc pode compreender um anticorpo. As proteínas podem ser derivadas de várias fontes, incluindo linhagens de células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas recombinantes cultivadas.

As preparações de anticorpo da invenção podem ser isoladas de numerosas fontes incluindo, mas não limitadas a, soro de animais imunizados, fluido de ascite, sobrenadantes de míeloma ou de hibridoma, meios condicionados derivados de cultura de uma linhagem de célula recombinante que expressa a molécula de anticorpo e de todos os extratos celulares de células produtoras de anticorpo. Em uma modalidade da invenção, são purificados anticorpos de meio de cultura de célula condicionada de uma variedade de linhagens de células recombinantes produtoras de anticorpo. Embora possa-se esperar alguma variação de linhagem celular para linhagem celular e dentre os vários produtos de anticorpo, baseado na descrição aqui, está bem dentro da competência de uma pessoa ordinariamente experiente na técnica adaptar a invenção aqui a uma combinação particular de proteína de anticorpo e linhagem de célula produtora.

Para apenas propósitos de ilustração, esta invenção foi aplicada para a purificação de vários anticorpos do ísótipo IgG. Mais especificamente, esta invenção foi aplicada para a purificação de um anticorpo monoclonal beta anti-A, humanizado, um anticorpo anti-GDF8, e um anticorpo monoclonal anti-IL-3, humanizado.

4. Condições de carregamento e capacidades

Antes do carregamento do fluido contendo o produto e as impurezas no meio, pode ser necessário identificar a região de partição fraca pela descoberta das condições operacionais que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 mg de produto por mL de meio. Em uma modalidade, as condições de operação encontradas fazem com que o meio ligue pelo menos 5 mg de produto por mL de meio. Em outra modalidade, as condições de operação encontradas fazem com que o meio ligue pelo menos 10 mg de produto por mL de meio. Em outras modalidades, as condições de operação encontradas fazem com que o meio ligue pelo menos 20 mg de produto por mL de meio. Alternativamente, a região de partição fraca é identificada pela descoberta das condições de operação definidas por um coeficiente de partição de pelo menos 0,1. Em certas modalidades, as condições de operação descobertas são definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 0,2 a cerca de 20,0. Em outras modalidades, as condições de operação descobertas são definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 0,2 a cerca de 10,0. Em ainda outras modalidades, as condições de operação descobertas são definidas por um coeficiente de partição dentro da faixa de cerca de 1,0 a cerca de 5,0, dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 5,0, ou dentro da faixa de cerca de 0,5 a cerca de 1,5. Em modalidades adicionais, a região de partição é identificada pela descoberta de condições de operação que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 a cerca de 70 mg de produto por mL de meio, e que é definida por um coeficiente de partição de 0,3 a 20.

Uma pessoa experiente na técnica reconhecerá que as condições de operação adequadas dependerão da escolha do meio selecionado para a purificação de produto. Em certas modalidades, as condições de operação compreendem níveis de pH e forças iônicas. Em outras modalidades, as condições de operação compreendem adicionalmente

concentrações de sal. Em ainda outras modalidades, as condições de operação compreendem adicionalmente níveis de excipiente. tais como concentrações de fosfato e concentrações de cálcio. Em algumas modalidades, as condições de operação compreendem níveis de contra-ligante, tais como concentrações de imidazol, e níveis de pH.

Uma etapa de triagem pode ser usada para identificar as condições de operação para modo de partição fraca. Uma tal etapa de triagem podería incluir estudos de ligação em batelada ou estudos de ligação em coluna. Estudos de ligação em coluna poderíam incluir estudos de eluição em gradiente ou estudos de eluição isocrática. Por exemplo, uma pessoa experiente na técnica pode determinar qual tampão ou sal é apropriado para a proteína particular sendo purificada e para as condições de operação que estão sendo identificadas. A concentração ótima do tampão ou sal selecionado pode ser então determinada, por exemplo, por corrida de um gradiente de tampão ou sal selecionado através de uma coluna à qual tem sido aplicado um fluido de carregamento compreendendo o produto a ser purificado e as impurezas. Frações do efluente da coluna podem ser coletadas e analisadas para determinar a concentração de tampão ou sal na qual a ligação de produto é de pelo menos 1 mg de produto por mL de meio ou alternativamente, na qual o coeficiente de partição para o produto é de pelo menos 0,1. Em certas modalidades da invenção, o coeficiente de partição é medido entre 1 e 10 mg/mL de desafio de carregamento com uma razão de fases (volume de líquido para volume de resina) de três a seis em um experimento de ligação em batelada.

Uma vez determinada as condições de operação, as condições do meio e/ou fluido de carregamento podem ser conseqüentemente ajustadas. Por exemplo, o meio pode ser equilibrado por sua lavagem com uma solução que o trará para as condições de operação necessárias de modo de partição fraca. O fluido de carregamento também pode ser tampão trocado por um tampão apropriado ou tampão de carregamento na preparação para o modo de partição fraca, O tampão de carregamento pode ser um tampão igual ou um tampão diferente do tampão de equilíbrio.

Em uma modalidade, a força iônica do fluido de carregamento 5 é não maior do que 100 mM. Em outra modalidade, a força iônica do fluido de carregamento é não maior do que 50 mM. Em outra modalidade, a força iônica do fluido de carregamento é não maior do que 25 mM, Em ainda outra modalidade, a força iônica do fluido de carregamento é nao maior do que 10 mM.

O fluido de carregamento pode ser passado através de um meio de separação que está empacotado dentro de uma coluna de leito, empacotado dentro de uma coluna de leito expandido / fluidizado contendo a matriz de fase sólida, e/ou em um formato em batelada onde a matriz de fase sólida é misturada com o fluido de carregamento por um certo tempo. Após o fluido de carregamento ter sido passado através do meio, o meio é opcionalmente lavado com um volume de lavagem essencialmente isocrática. O produto purificado pode ser obtido de qualquer lavagem essencialmente isocrática e reunido com o produto purificado do efluente da coluna durante o ciclo de carregamento. Após a etapa de lavagem opcional, o meio pode ser opcionalmente extraído e regenerado, Este procedimento é tipicamente realizado regularmente para minimizar o acúmulo de impurezas sobre a superfície da fase sólida e/ou para esterilizar o meio para evitar a contaminação do produto com microorganismos.

Concentrações de carregamento altas e volumes de carregamento altos são possíveis com o modo de partição fraca. Em uma modalidade, a concentração de produto no fluido de carregamento é de pelo menos 1 mg de produto por mL de fluido de carregamento, em outra modalidade, a concentração de produto no fluido de carregamento é de pelo menos 5 mg de produto por mL de fluido de carregamento, em outra modalidade, de pelo menos 50 mg de produto por mL de fluido de carregamento, e em outra modalidade, de pelo menos 100 mg de produto por mL de fluido de carregamento. Produto purificado pode ser recuperado de até 50 CVs de fluido de carregamento passado através do meio.

Desafios de carregamento altos também sâo possíveis com o modo de partição fraca. Em uma modalidade, o carregamento no meio pode ser de um desafio de carregamento de pelo menos 10 mg de produto por mL de meio. Em outra modalidade, o carregamento de produto no meio é de pelo menos 50 mg de produto por mL de meio. Ent certas modalidades, o carregamento de produto no meio é de pelo menos 100 mg de produto por mL de meio. Em outras modalidades, o carregamento de produto no meio é de pelo menos 500 mg de produto por mL de meio. Em ainda outras modalidades, o carregamento de produto no meio é de pelo menos 1.000 mg de produto por mL de meio.

5. Remoção de impurezas

Tem sido mostrado que o modo de partição fraca é útil para remover todos os tipos de impurezas de preparações de produto, incluindo proteínas de célula hospedeira, ácidos nucléicos, variantes de produto, incluindo produto agregado e espécies de peso molecular alto, endotoxinas, vírus, e contaminantes de Proteína A de etapas de purificação anteriores.

Em uma modalidade da invenção, a concentração de proteínas de célula hospedeira presentes no produto purificado é não maior do que cerca de 500 ng de proteínas de célula hospedeira por mg de produto. Em outras modalidades, a concentração de proteínas de célula hospedeira pode ser reduzida para não mais do que 250 ng por mg de produto, e em outras modalidades, para não mais do que 100 ng por mg de produto. Em certas modalidades, o log do valor de remoção de proteínas de célula hospedeira é pelo menos 1,0, em outras modalidades, o log do valor de remoção de proteínas de célula hospedeira é pelo menos 2,0, e em outras modalidades, o

log do valor de remoção de proteínas de célula hospedeira é pelo menos 3,0.

Em uma modalidade da invenção, a concentração de Proteína

A presente no produto purificado é não maior do que cerca de 500 ng de Proteína A por mg de produto. Em algumas modalidades, a concentração de

Proteína A pode ser reduzida para não mais do que 50 ng por mg de produto, e em outras modalidades, para não mais do que 10 ng por mg de produto. Em certas modalidades, o log do valor de remoção de Proteína A é pelo menos 1,0, em outras modalidades, o log do valor de remoção de Proteína A é pelo menos 2,0, e em outras modalidades, o log do valor de remoção de Proteína A é pelo menos 3,0.

Em uma modalidade da invenção, impurezas virais são removidas do produto purificado. Em certas modalidades, o log de valor de remoção de vírus é maior do que 1,0, em outras modalidades, maior do que 2,0, e em outras modalidades, maior do que 3,0.

Em algumas modalidades da invenção, impurezas de ácido nucleico codificador são removidas do produto purificado. Em certas modalidades, a quantidade de ácido nucleico presente no produto purificado pode ser reduzida para não mais do que 1 ng de ácidos nucleicos por mg de produto.

Em modalidades adicionais, a concentração de variantes de proteína no produto purificado é não maior do que cerca de 10%. Em algumas modalidades, a concentração de variantes de proteína pode ser reduzida para não mais do que cerca de 5%, em algumas modalidades, para não mais do que 2%, e em algumas modalidades, para não maior do que 0,5%.

Sob as condições de ligação estringentes do modo de partição fraca, o meio de separação remove pelo menos 90% de proteína de célula hospedeira, de ácido nucleico, de variante de proteína, e de endotoxina, de impurezas de Proteína A. Em algumas modalidades, o meio remove pelo menos 99% das impurezas, e em outras modalidades, o meio remove pelo

Oi menos 99,9% das impurezas.

6. Etapas opcionais adicionais

O método de purificação da invenção pode ser usado em combinação com outras etapas de purificação de proteína. Em uma modalidade da invenção, uma ou mais etapas precedendo a etapa de partição fraca podem ser desejáveis para reduzir o desafio de carregamento. Em outra modalidade da invenção, uma ou mais etapas de purificação após a etapa de partição fraca podem ser desejáveis para remover as impurezas ou os contaminantes adicionais.

O procedimento de purificação de partição fraca descrito pode ser opcionalmente combinado com outras etapas de purificação, incluindo mas não limitadas a, cromatografia de Proteína A, cromatografia de afinidade, cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de afinidade de metal imobilizado, cromatografia de exclusão de tamanho, diafiltração, ultrafiltração, filtração de remoção viral, e/ou cromatografia de troca iônica. As etapas de purificação opcionais precedendo e/ou posteriores à etapa de partição fraca também podem ser operadas no modo de partição fraca, ou em outros modos, tais como o modo de ligação-eluiçâo ou o modo de fluxo transpassante.

Em uma modalidade, antes da etapa de purificação de partição fraca, o meio de colheita pode ser opcionalmente inicialmente purificado por uma etapa de cromatografia de Proteína A. Por exemplo, pode ser empregado PROSEP-A™ (Millipore, U.K.),: que consiste de Proteína A coval entemente copulada em vidro de porosídade controlada. Outras formulações de Proteína

A úteis incluem as colunas Protein A Sepharose FAST FLOW™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), TOYOPEARL™ 650M Protein A (TosoHaas Co., Philadelphia, PA), e MABSELECT™ (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

7. Tampões zwitteriônicos usados em tandem com cromatografia de

Proteína A e cromatografia de troca iônica

Em certas modalidades, um fluido contendo produto é eluído de uma coluna de Proteína A usando um tampão de eluição de força iônica baixa. O pH e a condutividade do fluido contendo produto são então ajustados usando um tampão de neutralização, que resulta em não mais do que 20 mM de força iônica do fluido contendo produto. O fluido de carregamento resultante é então passado através de um meio de troca aniônica ou meio de hidroxiapatita sob condições de modo de partição fraca. Em certas modalidades, o pH e a condutividade do fluido contendo produto são ajustados usando um tampão de neutralização que resulta em não mais do que 40 mM de força iônica do fluido contendo produto. Em outras modalidades, o pH e a condutividade do fluido contendo produto são ajustados usando um tampão de neutralização que resulta em não mais do que 60 mM de força iônica do fluido contendo produto. Em ainda outras modalidades, o pH e a condutividade do fluido contendo produto são ajustados usando um tampão de neutralização que resulta em nao mais do que 80 mM de força iônica do fluido contendo produto.

Tampões que podem ser usados para eluição da coluna de Proteína A incluem tampões compreendendo moléculas com um grupo aniônico carregado com um pKa de 2-5. Tais tampões de eluição poderíam compreender adicionalmente moléculas com um grupo catiônico carregado com um pKa de 6,5-10. Em uma modalidade, o tampão de eluição compreende moléculas que são zwitteríons em pHs entre 4 e 9, tais como glicina; ácido l,4-piperazina-bis-(etano-sulfônico); glicil-glicina; ácido ciclo25 pentano-tetra-l,2,3,4-carboxílico; ácido N,N-bis(2-hidróxi-etil)-2-aminoetano-sulfônico; ácido 2-(N-morfolino)-propano-sulfônico; ácido Ntris(hidróxi-metil)-metil-2-amino-etano-sulfônico; ácido Ν-2-hidróxi-etilpiperazina-N'-2-etano-sulfônico; ácido 4-(2-hidróxi-etil)-1 -piperazinapropano-sulfônico; N-tris(hidróxi-metil)metil-glicina; glicinamida; N,N-bis(231 hidróxi-eui)glicina; ácido N-tns(hídróxi-inetil)metil-2-amino-propanosulfônico; ou N-glici 1-glicina.

A eluiçâo de uma coluna de Proteína A com um tampão zwitteriônico proporciona a vantagem de força iônica baixa sob algum grau de neutralização. A força iônica baixa do tampão não afeta adversamente a operação das colunas de troca iônica subseqüentes, incluindo as colunas de hidroxiapatita. Níveis altos de força iônica diminuirão a ligação de impurezas nas colunas de troca iônica, que pode diminuir a eficiência total da purificação. Soluções de força iônica menor são preferidas para carregamentos em colunas de troca iônica, porque a força iônica pode ser elevada facilmente com a adição de soluções concentradas de sal; diminuição da força iônica de soluções não é fácil. Surpreendentemente, há tampões que possuem um pKa baixo que permite o uso em níveis de pH baixo úteis em etapas de eluição de Proteína A, mas que também possuem um segundo pKa que permite o uso em níveis de pH maiores úteis em cromatografia de troca iônica; estes tampões, se usados em um segundo pH apropriado, possuem pouca carga efetiva durante a operação da etapa de troca iônica subseqüente à etapa de Proteína A.

Um tampão zwitteriônico que possui um pKa próximo àquele do pH de eluição preferido para Proteína A (entre pH 2 e 5, preferivelmente entre 2,5 e 4,0) permite que o tampão seja usado para manter o pH próximo do pi do tampão e para eluir a coluna. Tampões zwitteriônicos que também possuem um pKa próximo daquele da operação de uma subseqüente coluna de troca iônica (pH 5,5 a 11) permitiría que o tampão controlasse o pH nesta faixa de pH bem como na faixa de pH de eluição de Proteína A. O uso de um composto único para ambos a eluição da coluna de Proteína A em tampão baixo e para a manutenção do pH maior útil em cromatografia de troca iônica simplifica a operação de ambas as etapas, e também simplifica a composição da reunião de produto após a neutralização.

Em uma outra modalidade da invenção, um tampão zwitteriônico com pKal e pKa2 pode eluir uma coluna de Proteína A em nível de pH dentro de uma unidade de pH de pKal. Em adição, se a reunião de Proteína A for neutralizada com uma solução básica do tampão zwitteriônico para um segundo pH dentro de uma unidade de pH de pKa2, o tampão zwitteriônico será capaz de manter o pH da solução. Se o segundo pH estiver abaixo de pKa2, o tampão permanece zwitteriônico e contribui pouco para a força iônica total da solução. Por exemplo, um tampão zwitteriônico com concentração x em um pH igual ao pKa2 contribuirá para a força iônica total apenas x/2. Um tampão zwitteriônico com concentração x em 1 unidade de pH abaixo de pKa2 do tampão terá uma força iônica de um décimo de x. Esta redução em força iônica é significativamente útil para operação de cromatografia de troca iônica.

A existência de tampões que possuem um pKal útil para eluição de colunas de Proteína A e um pKa2 útil para operação de cromatografia de troca iônica não é óbvia, pelo fato de que o pKal destes tampões não é comumente relatado. Tampões são comumente usados em níveis de pH próximos daquele de pKa2, e não são conhecidos por aquelas pessoas experientes na técnica de cromatografia como sendo úteis para eluição de uma coluna de Proteína A. Em adição, embora a utilidade destes tampões para eluição de colunas cromatográficas de Proteína A não seja geralmente realizada, também não é realizado o fato de que estes tampões zwitteriônicos possuiriam utilidade adicional como tampões para colunas de troca iônica subseqüentes às colunas de Proteína A porque eles contribuem menos para a força iônica para a reunião de Proteína A neutralizada.

C. Exemplos

Os seguintes exemplos são oferecidos apenas para propósitos ilustrativos.

Exemplos são proporcionados para três modos de

-> η JJ cromatografia (troca iônica, interação hidrofóbica, e hidroxiapatita ), usando três anticorpos monoclonais diferentes. Quatro séries separadas de experimentos são descritas, cada uma representando um pareamento diferente do modo de cromatografia e o anticorpo monocíonal a ser purificado. Os estudos de triagem iniciais são apresentados primeiro, o que determina o coeficiente de partição e/ou a concentração de produto ligado na resina sob várias condições de solução, definindo assim as regiões de operação de modos de partição fraca (WP) e de fluxo transpassante (FT). Vários estudos de coluna são então sumariados, com dados sobre remoção de impureza e recuperação de produto. As recuperações de produto são excelentes para as corridas de coluna WP, e os níveis de impureza são menores do que nos estudos FT correspondentes. As corridas WP foram conduzidas com desafios de carregamento maiores para a resina do que os estudos FT.

Os níveis de resíduos de Proteína A nas amostras de teste foram medidos usando um ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA) de Proteína A. A quantidade de agregado de peso molecular alto foi medida usando uma cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) analítica. Os níveis de proteínas de célula hospedeira (HCPs) foram medidos usando um HCP ELISA. Todos os estudos de triagem e de coluna foram conduzidos na temperatura ambiente.

Série 1 - Troca aniônica usando TMAE-HiCap (M) e Mab-AAB

Experimento 1.1 — Triagem de taxa de transferência alta para estabelecer condições de WP e de FT

Uma triagem de taxa de transferência alta (HTS) foi realizada para identificar as condições de partição fraca e de fluxo transpassante para o meio Mab-AAB e TMAE-HiCap (M). Esta triagem variou a concentração de cloreto de sódio e o pH para determinar seu efeito sobre a extensão de ligação de Mab-AAB e as impurezas relacionadas com o processo (Proteína A e HCP) para o meio TMAE.

4« pL de meio ΓΜΑΕ HiCap foram adicionados em cada cavidade de ama placa de filtro de 96 cavidades Cada cavidade foi equilibrada em soluções compostas de glicina 50 mM e uma quantidade variável de tampão Tris (dependendo da quantidade necessária de neutralização para o pH especificado na Tabela 1,1.1) e de cloreto de sódio (especificado na Tabela 1.1.2). O pH variou de 7,6 a 9,0 e o cloreto de sódio variou de 0 mM a 80 mM.

As soluções de tampão usadas em cada fileira foram diluídas em sistema de pipetação automática (Tecan 100 RST). A solução de estoque para os tampões foram preparadas de glicina 50 mM acidulada com HCI para pH 3,0, e subseqüentemente neutralizada com Base Tris 2 M para os níveis de pH indicados na Tabela 1.1.1. Esta titulação resultou em um nível de Tris que dependeu do pH do tampão. O pH do tampão foi medido em uma diluição de 1 para 10 da concentração de tampão de estoque, que correspondeu à diluição feita pelo sistema de pipetação automática. Como um resultado da acidulação de glicina para pH 3,0, o tampão contribui com cerca de 10 mM de força iônica para a solução final. Dois desafios de carregamento foram feitos para a resina: 5 mg/mL para medir o coeficiente de partição, K, e 122 mg/mL, para medir a capacidade da resina para remover as impurezas e o produto ligado,

Q, em equilíbrio com uma solução de proteína em uma concentração aproximadamente igual à concentração de carregamento da coluna.

Tabela 1.1.1: Tipo de tampão e alvo de pH em cada cavidade

	Todas as colunas
A	Glicina 50 mM, Tris 8,8mM, pH 7.6
B	Glicina 50 mM, Tris 13,6 mM, pH 7,8
C	Glicina 50 mM, Tris 16.0 mM, pH 8,0
D	Glicina 50 mM, Tris 19,6 mM, pH 8,2
E	Glicina 50 mM, Tris 28,4 mM, pH 8,4
F	Glicina 50 mM, Tris 37.2 mM, pH 8,6
G	Glicina 50 mM, Tris 64,0 mM, pH 8,8
H	Glicina 50 mM, Tris 100 mM, pH 9,0

Tabela 1.1.2: Níveis de NaCl (em mM) e desafios de proteína (mg/mL) em cada cavidade //

j Todas as | 1 íileiras	2 1	3 1	4 !	i S	7 1 1	7	8	9	10	1 1
NaCl (mM)	0 1	10 I	20	40	60	80	i 0 i	10	20	40	60	80
MAB- AAB (mg'mL)	5	5	5	5	5	5	132	132	132	132	132	132

No primeiro estágio do experimento HTS, cada cavidade foi equilibrada nas condições de NaCl e de pH como descritas nas Tabelas 1.1.1 e 1.1.2 uma razão volumar de fases de 6:1 (300 pL de solução: 50 pL de resina). A placa foi agitada por 20 minutos, permitindo que o equilíbrio fosse alcançado. A solução foi então removida por centrifugação da placa de filtro. Este ciclo de equilíbrio foi repetido três vezes.

No segundo estágio, a resina em cada cavidade foi desafiada com uma solução concentrada de MAb-AAB para 5 mg/mL de resina com uma razão volumar de 6:1 (300 uL de solução: 50 pL de resina) em concentração de NaCl e em pH apropriados. Uma solução de Mab-AAB a 36mg/mL em HEPES 1 mM, NaCl 10 mM, pH 7,0 semeada com 300 ppm de Proteína A foi usada como solução de estoque. A placa carregada foi agitada por 20 minutos, permitindo que a resina e a solução se equilibrassem. O sobrenadante foi removido da placa de filtro por centrifugação e coletado em uma placa de coleta. A concentração de proteína no sobrenadante em cada cavidade foi determinada por absorbância a A280nm.

No terceiro estágio, a resina foi lavada por adição de soluções de condições especificadas de NaCl e de pH listadas na Tabela 1.1.2. O sobrenadante foi removido após agitação por 20 minutos. No quarto estágio, NaCl 2 M foi adicionado para remover a proteína restante que estava ligada na resina. Os coeficientes de partição foram calculados para cada cavidade usando a massa eluída de estágios 3 e 4 e a concentração de produto do estágio 2, e são mostrados na Tabela 1.1.3. Uma plotagem de contorno do log do coeficiente de partição como uma função do pH e de cloreto é mostrada na Figura 7.

Tabela 1.1.3: Coeficientes de partição (K) para a triagem HTS de 96

L, cavidades para MAB-AAB

	1	7	3	4	5	6	7	8	9	10	1 1	12
	0,22	0.32	0.35	0.17	0.24	0.23	0.21	0.24	0.21	0.19	0.17	0.16
B	0.3 7	0.36	6.38	0.25	0.24	0.08	0.28	0.26	0.22	0.24	0.18	0.16
c	0.63	0.48	0.47	0.27	0.15	0.20	0.31	0.28	0.26	0.20	0.23	0.16
D	1.24	1.12	0.68	0.36	0.30	0.17	0.42	0.39	0.34	0.23	0.23	0.18
E	3.24	1.89	1.05	0,59	0.35	0.15	0.68	0.58	0.41	0.29	0.21	0.18
F	8.37	3.37	1.56	0.61	0.31	0.32	0.87	0.74	0.51	0.32	0.25	0.21
G	18.36	9.49	3.16	0.82	0.49	0.34	0.91	0.88	0.69	0.39	0.24	0.20
H	125.73	23.79	6.58	1.23	0,58	0.43	1.18	1.02	0.78	0.42	0.27	0.24

Como mostrado na Tabela 1.1.3, o valor de Kp pode ser usado para descrever as regiões onüde MAB-AAB se liga no meio TMAE com forças diferentes. Estas regiões são mais claramente visualizadas na Figura 7. A força da ligação de MAB-AAB no meio TMAE pode ser manipulada pela variação das condições de pH e de concentração de cloreto em fluxo transpassante (K^<0,l), partição fraca (0,l<K<20), e zonas de ligação (K=>20).

Os sobrenadantes do estágio de carregamento de todas as cavidades de cada zona foram amostrados e submetidos à análise de Proteína A. Os resultados de ensaio destas amostras estão sumariados na Tabela 1.1.4.

Há uma região de pH e de condutividade onde a etapa de cromatografia de TMAE proporciona remoção significativa de Proteína A com perda de proteína limitada para a resina. Foi verificado que esta região está intimamente correlacionada com o valor de coeficiente de partição, Kp, e não com qualquer um de pH ou concentração de cloreto especificado (veja a Figura 8).

Tabela 1.1.4: log de valores de remoção (LRV) de Proteína A para dados de ligação de MAB-AAB de triagem HTS

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	2.11	1.89	2.12	1.85	1.22	1.00	1.63	1.02	1.00	0.92	0.85	1.02
B	2.79	2.37	2.42	1.96	1.23	1.13	1.77	1.81	1.22	0.85	0.94	1.52
C	>3.05	>3.03	2,74	2.16	1,37	1.1!	2,25	2.15	1,96	1.16	1.06	0.95
D	>3.41	>2,98	>3.06	2.50	1,94	1,18	3.39	3.11	2.57	1.41	1.02	0.89
E	>2.87	>2,93	>3.01	>2.95	2.13	1.75	>3.09	3.27	3.09	1.66	1.89	0.99
F	>2.64	>2.89	>2.99	>3.11	2.29	1.82	>3.07	>3.11	>3.15	2.19	1.24	0.84
G	>2.33	>2.58	>2.89	>3.07	2.41	2.14	>3.09	>3.11	>3.14	2.80	1.46	0,85
H	>1.63	>2.36	>2.76	>3.01	2.86	2.37	>2.98	>3.05	>3,15	3.16	3.45	0.85

Experimento 1.2 — Corridas em coluna sob condições de fluxo transpassante O seguinte experimento foi realizado no modo de fluxo transpassante (FT), onde o Mab-AAB interage apenas muito fracamente com

a coluna. Duas corridas foram realizadas com desafios de carregamento de 110 mg/mL e 200 mg/ml de resina.

Para todas as corridas de cromatografia de troca iônica de TMAE (HiVapM) descritas na Série 1 de experimentos, as seguintes condições foram usadas (exceções são anotadas nas descrições experimentais individuais).

Vazão operacional - 150-300 cm/h.

Equilíbrio 1 - Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 (5 volumes de coluna).

Equilíbrio 2 - como especificado, aproximadamente equivalente ao pH e ao contendo de cloreto do carregamento.

Lavagem após carregamento - como especificada, aproximadamente equivalente ao pH e ao contendo de cloreto do carregamento.

Tampão de extração - Tris 50 mM, NaCl 2,0 m, pH 7,5 (5 volumes de coluna).

Cromatografia em Mabselect Protein A

A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi purificada em escala piloto usando uma coluna Mabselect (2.389 mL) conectada em um sistema de cromatografia Millipore K-prime 400. Uma coluna Mabselect Protein A foi equilibrada com 5 volumes de coluna de Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 em uma vazão de 300 cm/h. A coluna foi então carregada com um carregamento de aproximadamente 40 mg de produto / mL de resina. Isto foi seguido por uma lavagem de 5CV em NaCl 1 M, Tris 50 mM, pH 7,5 e uma lavagem de 5CV contendo Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5. A coluna foi então eluída usando glicina 50 mM, NaCl 75 mM, pH 3,0. A reunião de produto foi neutralizada para pH 7,6 usando Tris 2 M pH 8,5. O pico neutralizado teve uma concentração de cloreto de aproximadamente 90 mM. Cromatografia de TMAE HiCap (M)

A reunião de Proteína A neutralizada foi adicionalmente purificada sobre a etapa TMAE com as soluções de equilíbrio, de carregamento, e de lavagem em pH 7,5 com Tris 50 mM e cloreto de sódio 75 mM. 5 Volumes de coluna de lavagem foram usados. As dimensões da coluna e os desafios de carregamento para estes dois estudos foram: Corrida 1: 7,0 cm de diâmetro x 20,6 cm de altura de leito (volume - 793 mL) com uma concentração de carregamento de 11,9 mg/mL, e Corrida 2: 7,0 cm de diâmetro x 13 cm de altura de leito (volume - 500 mL) com uma concentração de carregamento de 17,6 mg/mL.

Estas condições de carregamento foram na região de fluxo transpassante (FT) (Tabela 1.2.1). Estudos de ligação em batelada foram usados para medir o coeficiente de partição (Kp) e o produto ligado foi determinado por proteína na extração de coluna pelo uso de absorbância em UV. Este método de determinação de produto ligado tipicamente subestima a quantidade de produto ligado durante o carregamento devido à eluição isocrática do produto durante a lavagem. Os níveis de Proteína A, HCP e HMW no carregamento e na reunião de produto foram medidos, e a extensão de remoção foi calculada. Os resultados são apresentados na Tabela 1.2.1. Elá remoção insatisfatória de Proteína A e de HMW, e redução modesta em níveis de HCP.

Tabela 1.2.1: Remoção de HCP, Proteína A, e HMW sob condições de fluxo transpassante

Corrida	Desafio dc carregamento (mg/mL)	Coeficiente de partição (Kp)	Produto ligado (mg/ml. resina)	HCP (LRV)	Proteína A (LRV)	BMW (vezes)	Recuperaç âo (%)
1	110	0.17	1.4	2.3	0.1	-	96
2	200	0.17	3,3	2.0	<0.1	1.5	96

*Níveis de impureza foram 38,5 ppm de ProA e 51,943 ppm de HCP (Corrida 1), 8,8 ppm de ProA e 25,398 de ppm HCP (Corrida 2).

Experimento 1.3 — Corridas em coluna sob condições de partição fraca (desafio de produto alto)

Cromatografia de troca aniônica em TMAE (HiCap M)

Várias corridas em Mabselect Protein A foram realizadas essencialmente como descrito no Experimento 1.2 para gerar o material de carregamento para estas corridas. A reunião de anticorpo parcíalmente purificado da etapa de Proteína A foi adicionalmente purificada sobre a coluna TMAE. O carregamento para a coluna TMAE foi em Tris 50mM, pH

8,2. O diâmetro da coluna foi 0,5 cm e a altura do leito foi 10 cm (volume ~

2,0 mL). A coluna foi desafiada para um carregamento de 500 mg/mL de resina, com uma concentração de carregamento de 27,7 mg/mL.

A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de uma solução contendo Tris 50 mM, NaCl 2 M pH 7,5 seguida por outra etapa de equilíbrio compreendendo solução de Tris 50 mM Tris, pH 8,2. A coluna foi então carregada para 500 mg de produto/mL de resina com pico de Proteína A neutralizada das várias etapas anteriores e o produto foi recuperado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e alguns volumes de coluna da fração de lavagem.

Estas condições de carregamento estão na região de partição fraca. Estudos de ligação em batelada foram usados para medir o coeficiente de partição (Kp), e a ligação de produto em concentrações de proteína altas. Em pH 8,2, e em um conteúdo de cloreto aproximado de 12 mM, o coeficiente de partição, Kp, estimado é de 1,9 (da interpolação do conjunto de dados da triagem HTS).

Os níveis de HCP e de Proteína A foram medidos em três frações durante o estágio de carregamento representando desafios de carregamento de aproximadamente 250, 375, e 500 mg/mL de resina. Os resultados do experimento 1.3 são apresentados na Tabela 1.3.1. Estes resultados demonstram que desafios de produto muito altos podem ser alcançados no modo de partição fraca, sem aparecimento de impurezas. Reduções excelentes em ambas HCP e Proteína A foram alcançadas, juntamente com redução de 50% em conteúdo de HMW. Em comparação aos resultados para operação no modo de fluxo transpassante na Tabela 1.2.1, a

remoção de impurezas foi muito melhor no modo de partição fraca.

Tabela 13.1: Remoção de HCP, Proteína A e HMW para um desafio de carregamento de TMAE de 500 mg/mL

	Fração inicial (250 mg/mL)	Fração intermediária (375 mg/mL)	Fração tardia (500 mg/mL)	Reunião de produto final (ppm)
ppm de HCP residual (ng/mg de produto)	7.6	< 7.6	<76	< 7.6
Log de valor de remoção (LRV)de HCP	-3,5	> 3.5	> 3.5	-=- 3.5
ppm de Proteína A residual (ng/mg de produto)	0.3	Não determinado	0.1	0.6
Log de valor de remoção (LRV) de ProA	2.9	Não determinado	2.3	2.5
HMW	Não determinado	Não determinado	Não determinado	remoção de 2 vezes

* As impurezas no carregamento foram 24.398 ppm de HCP, 99.5 ppm de Proteína A, e 5 2.3% de HMW.

Experimento 1.4 — Corridas em coluna sob condições de partição fraca (estudos de robustez)

Para adicionalmente confirmar o desempenho da coluna TMAE na região de partição fraca, várias corridas foram planejadas variando o pH e a concentração de NaCI no carregamento para testar a robustez do processo. Todas as corridas foram realizadas em um desafio de carregamento de 250 mg/mL de resina. Várias corridas em Mabselect Protein A foram realizada essencialmente como descrito em Experimento 1.2 para gerar o material de carregamento para estas corridas. O único fator variado naquelas corridas foi a concentração de cloreto de sódio na eluição de Proteína A, que foi variada para igualar à concentração de NaCI no carregamento de TMAE para um experimento particular. As colunas foram equilibradas com tampões Equil 2 e lavadas com tampões de Lavagem que tinham aproximadamente o mesmo pH e o mesmo conteúdo de NaCI do carregamento.

Estas condições de carregamento estão na região de partição fraca. Estudos de ligação em batelada foram usados para medir o coeficiente de partição (Kp). As corridas são classificadas pelos coeficientes de partição listados na Tabela 1.4.1. O produto ligado foi determinado pela medição da proteína na extração de coluna usando absorbância em UV, e varia de 7,825 25,3 mg/mL. Resultados de Proteína A, HCP e HMW destes experimentos também são apresentados na Tabela 1.4.1. Foi verificado que a remoção de

todas as impurezas é robusta nas faixas de operação que cobrem 13,5-38,8 mM de cloreto total e pH 7.8-8.4,

Tabela 1.4.1: Estudos de robustez de processo sobre remoção de HCP,

Proteína A e HMW no modo de partição fraca

Concentração de NaCl tmM)	Kp	Produto ligado (mg/mL)	pH	HCP em carrega mento (ppm)	Proteína Λ em carrega mento (ppm)	HCP (LRV)	Proteína A (LRV)	HMW (Vezes)	Recuperação (%)
3 8. έί	0.26	9.4	7.8	26.391	493.5	3.7	1.8	2.0	92
13.5	0.41	7.9	7.8	12.821	69.2	3.3	>1.9	1.8	87
27.4	0.50	8	8.0	23.465	252	3.6	2.2	3.2	91
18.5	0.73	7.8	8.0	21.626	308	3.7	>3.2	2.9	90
23.5	0.80	9.5	8.1	18.004	343	3.2	>3.2	3.5	94
27.7	0.86	9.5	8.2	24.821	280	3.6	>3.2	2.6	99
18.5	1.48	10	8.2	17.669	252	3.7	>3.1	3.9	95
22.0	5.35	25.3	8.4	29,293	533	3.6	>2.9	2.3	90

*Níveis de impureza foram 38,5 ppm de ProA e 51.943 ppm de HCP (Corrida 1), 8,8 ppm de ProA e 25.398 ppm de HCP (Corrida 2).

+ inclui a contribuição de íon Cl’ de NaCl, tampões e titulantes Sumário

Deste estudo, pode ser visto que a remoção (LRV) de Proteína 10 A varia fortemente com Kp, enquanto que LRV de HCP é excelente em todos os valores de Kp em ou acima de 0,26, mas muito reduzido em Kp = 0,17 (sob condições de fluxo transpassante). Remoção de proteína de célula hospedeira é mais do um log mais baixo para as condições de fluxo transpassante comparadas com condições de partição fraca, até mesmo para um desafio de carregamento reduzido. O produto ligado varia de 7,8 - 25 mg/mL para estas condições de partição fraca sobre esta combinação de resina e anticorpo monoclonal. O coeficiente de partição parece ser ótimo em 0,41<Kp<5,4. Não parece ser ótimo em Kp=0,17 e um produto ligado de 1,4 3,3mg/mL, as condições de Experimento L2.

Série 2 - Troca aniônica usando TMAE-HiCapM e Mab-IMA

Experimento 2.1- Triagem de taxa de transferência alta para estabelecer as condições de WP e de FT

Uma triagem de taxa de transferência alta (HTS) foi realizada para identificar as condições de fluxo transpassante para Mab-IMA com o meio TMAE-HiCap (M). Esta triagem variou a concentração de cloreto de

sódio e o pH para determinar seus efeitos sobre a extensão de ligação de MAB-IMA e as impurezas relacionadas com o processo (Proteína A e HCP) para o meio TMAE. 100 μΤ de meio TMAE HiCap foram adicionados em cada cavidade de uma placa de filtro de 96 cavidades. Cada cavidade foi equilibrada em soluções compostas de tampão 25 mM não mais do que 1 unidade de pH afastada do pKa de tampão (Tabela 2.1.1) e o nível apropriado de cloreto de sódio (Table 2.1.2). O pH variou de 7,00 a 8,75 e a concentração de cloreto de sódio variou de 1 mM 190 mM.

Todos os tampões foram titulados para o pH alvo usando HCI

12 M. Como um resultado de que espécies tampão diferentes requereram níveis diferentes de titulante, a concentração de cloreto variou de cavidade para cavidade dependendo de qual tampão foi usado para aquela cavidade. A quantidade de Cf necessária para titular o tampão para o pH alvo foi calculada usando a equação de Henderson-Hasselbach e adicionada ao C1‘ total contribuído de ambos o NaCl e a quantidade no material de carregamento, O nível de Cf calculado para cada cavidade no experimento está listado na Tabela 2.1.3

Tabela 2.1.1: Tipo de tampão e pH alvo em cada cavidade

	Todas as colunas
A	Etanol-amina (pH = 8,75)
B	Tris (PH = 8,5)
C	Tris {pH = 8.25)
D	Tris (pH = 8,0)
E	Tris (pH = 7.75)
F	Tris (pH = 7.5)
G	Bis-Tris (pH = 7,25)
H	Bis-Tris (pH = 7,0)

Tabela 2.1.2: Níveis de NaCl em cada cavidade (em mM)

	I	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
Todas as fileiras	1	5	10	15	25	35	50	75	100	125	150	190

Tabela 2.1.3: Níveis de Cf em cada cavidade (em mM)

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	22	26	31	36	46	56	71	96	121	146	171	211
B	8	12	17	22	32	42	57	82	107	132	157	197
C	11	15	20	25	35	45	60	85	110	135	160	200
D	15	19	24	29	39	49	64	89	114	139	164	204
E	18	22	27	32	42	52	67	92	117	142	167	207
F	21	25	30	35	45	55	70	95	120	145	170	210
G	8	12	17	22	32	42	57	82	107	132	157	197
H	11	15	20	25	35	45	60	85	110	135	160	200

No primeiro estágio do experimento de HTS, cada cavidade foi equilibrada nas condições de NaCl e de pH como descritas nas Tabelas

2.1.1 e 2.1.2 em uma razão volumar de fases de 3:1 (300 μΕ de solução: 100 pL de resina). A placa foi agitada por 20 minutos, permitindo que o equilíbrio fosse alcançado. A solução foi então removida por centrifugação da placa de filtro. Este ciclo de equilíbrio foi repetido três vezes.

No segundo estágio, a resina em cada cavidade foi desafiada com uma solução concentrada de MAb-IMA para 3 mg/mL de resina com uma razão volumar de 3:1 (300 pL de solução: 100 uL de resina) na concentração de NaCl e em pH apropriados. Uma solução de Mab-IMA a 30 mg/mL em Mes 1 mM, NaCl 15 mM, pH 6,5 com 300 ppm de Proteína A foi usada como solução de estoque. A placa carregada foi por 20 minutos, permitindo que a resina e a solução equilibrassem. O sobrenadante foi removido da placa de filtro por centrifugação em uma placa de coleta. A concentração de proteína no sobrenadante em cada cavidade foi determinada por absorbância em A280 nm. Qualquer decréscimo em níveis de Proteína A e/ou de HCP indica uma condição que conduz à purificação.

No terceiro estágio, a resina foi lavada por adição de soluções de NaCl e em pH nas condições especificadas listadas na Tabela 2.1.2. O sobrenadante foi removido após agitação por 20 minutos. No quarto estágio, NaCl 2 M foi adicionado para remover a proteína restante que estava ligada na resina. Os coeficientes de partição foram calculados para cada cavidade usando a massa eluída dos estágios 3 & 4 e a concentração de produto do estágio 2, e são mostrados na Tabela 2.1.4. Uma plotagem de contorno do log de coeficiente de partição como uma íunção de pH e de cloreto é mostrada na Figura 9.

Tabela 2.1.4: Coeficientes de partição (Kp) para a triagem THS de 96 cavidades para MAB-IMA

	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
A	34.5	20.2	11.4	7.2	3,5	1.8	0.8	0,4	0.3	0.3	0.2	0.2
B	97.1	42.4	19.3	9.9	4.3	2.2	1.0	0.4	0.3	0.2	0.2	0.2
C	14,8	9.4	5.8	4.2	2.0	1.1	0.5	0,3	0.3	0.2	0.2	0.2
D	1.8	1.6	1.3	1.0	0.7	0.5	0.4	0.2	0.2	0.2	0.2	0,2
E	0.7	0.7	0.7	0.6	0.4	0.3	0.3	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
F	0.4	0.4	0.4	0.4	0.3	0.3	0.3	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
G	0.2	0.2	0.3	0.2	0,2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2
H	0.2	0.2	0.3	0,2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0.2	0,2

Como mostrado na tabela 2.1.4, o valor de Kp pode ser usado para descrever as regiões onde MAB-IMA se liga no meio TMAE com forças diferentes. Estas regiões sào mais claramente visualizadas na Figura 9. A força de ligação de MAb-IMA no meio TMAE pode ser manipulada pela variação das condições de pH e de concentração de cloreto nas zonas de fluxo transpassante (Kp<0,l), de partição fraca (0,l<Kp<20), e de ligação (Kp>20).

Os sobrenadantes do estágio de carregamento de várias cavidades de cada zona foram amostrados e submetidos às análises de Proteína A. O carregamento teve 300 ppm de Proteína A. Os resultados de ensaio destas amostras estão sumariados na Tabela 2.1.5. Há uma região de pH e de condutividade onde a etapa de cromatografia em TMAE proporciona remoção muito significativa de Proteína A com perda de proteína limitada para a resina. É verificado que esta região está intimamente relacionada com o valor do coeficiente de partição, Kp, e não com qualquer concentração de cloreto ou pH específico.

Tabela 2.1.5: Níveis residuais de Proteína A e dados de ligação de MABIMA da triagem THS

PH	cr (niMl	Kp (predito)	Proteína A (ppm)
8.5	12	42,4	<28 -BLOQ
8.5	32	4.3	<7 - BLOQ
8.25	35	2.0	<5 - BLOQ
8.25	45	1.13	<4 -BLOQ
8,0	39	0.7	<4 - BLOQ
8,25	60	0.5	<4 - BLOQ
7.75	42	0.4	<4 - BLOQ
7.5	45	0.3	35
8.0	64	0.3	63
8.25	110	0.3	190
7,25	32	0.2	90
8,0	89	0.2	177
8.75	121	0.3	217
7.75	92	0,2	187
7.5	120	0.2	219
7.25	107	0.2	224

Valores de Kp preditos são derivados de um ajuste de superfície de resposta à triagem de HTS, e predição subseqüente do Kp baseado neste modelo de regressão.

Experimento 2.2 - Corridas em coluna sob condições FT usando TMAEHiCapM e Mab-IMA

O seguinte experimento foi realizado no modo de fluxo transpassante (FT), onde Mab-IMA interage apenas muito fracamente com a coluna. Quatro corridas foram conduzidas, com desafios de produto de 109 275 mg/mL de resina.

Cromatografia de troca aniônica em TMAE (HiCap M)

Para todas as etapas de cromatografia de troca aniônica em TMAE (HiCapM) descritas na série de Experimento 2, as seguintes condições foram usadas (exceções sâo anotadas nas descrições experimentais individuais).

Vazão operacional -150-300 cm/hr

Equilíbrio 1- Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 ou 8,0 (5 volumes de coluna)

Equilíbrio 2 - NaCl 75 mM, Tris 50 mM, pFí 7,5 (corridas 3 e 4 continham Glicina 50 mM)

Lavagem após carregamento - NaC17 5mM, Tris 50 mM, pH

7,5 (corridas 3 e 4 continham Glicina 50 mM)

Tampão de extração - Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 ou 8,0 (5 volumes de coluna).

Várias corridas em Mabselect Protein A foram realizadas 20 essencialmente como descrito em Experimento 1.2 para gerar o material de carregamento para estas corridas. As reuniões de anticorpo parcialmente purificado da etapa de Proteína A previamente descritas foram adicionalmente purificadas na etapa de extração de ânions em um modo de fluxo transpassante (FT). Diâmetros de coluna variaram de 1,0 - 3,2 cm e as alturas de coluna foram 7,2 - 8,5 cm.

As colunas foram equilibradas com 5 volumes de coluna de uma solução contendo Tris 50 mM, NaCl 2M pH 7,5 seguida por outra etapa de equilíbrio compreendendo uma solução de Tris 50 mM, pH 7,5. As colunas foram então carregadas para entre 109 mg/mL e 275 mg/mL com o pico de <2

Proteína A pareialmente purificada e o produto foi recuperado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e em alguns volumes de lavagem da fração de lavagem.

Estas condições de carregamento estavam na região de fluxo transpassante (FT). A triagem de taxa de transferência alta descrita em Experimento 2.1 proporciona o valor do coeficiente de partição (Kp) sob estas condições de pH e de concentração de cloreto. As corridas foram classificadas pelos coeficientes de partição listados na Tabela 2.2.1. O produto ligado foi determinado pela medição da proteína na extração de coluna usando absorbância em UV. Este método de detenninação da quantidade de produto ligado tipicamente subestima a quantidade total de produto ligado devido à eluição isocrática de produto na lavagem. Resultados de remoção de Proteína A, HCP, HMW e LMW destes experimentos também são apresentados na Tabela 2.2.1. Há uma remoção relativamente insatisfatória e variável de HCP, e nenhuma remoção de Proteína A de variantes de produto (espécies HMW e LMW).

Tabela 2.2.1: Remoção de HCP, Proteína A e HMW e LMW no modo FT

Kp	Produto ligado (mg/mL)	PH	cr (mM)	Desafio de carregament o (mg/mL)	ProA em carregamen to (ppm)	HCP em carregam ento (ppm)	HCP (LR V)	ProA (LRV)	HMW (vezes)	LMW (vezes)	Recup eração
0.1	0.5	6.5	83	150	ND	4166	1.8	ND	i	1.1	>95%
0.2	0.8	7.0	83	275	25	1575	0.6	<0.1	1	1	>95%
0.2	ND	7.3	83	109	24	3117	2.4	<0.1	1	1	>95%
0.3	0.3	7.5	83	167	ND	4572	1.8	ND	1	1	>95%

ND = Não determinado

Experimento 2.3 - Corridas em colunas sob condições de partição fraca para

Mab-IMA

Os seguintes experimentos em coluna foram realizados no modo de partição fraca sob condições identificadas para a triagem HTS (Experimento 2.1). Sete corridas foram realizadas sobre a coluna de TMAE a partir das reuniões de Proteína A particularmente purificada.

Cromatografia em TMAE HÍCap

O anticorpo parcialmente purificado de uma etapa de Proteína A corrida essencialmente igual como previamente descrito foi adicionalmente purificado na etapa TMAE sob condições de partição fraca (WP) de pH e de conteúdo de cloreto como descrito abaixo. Diâmetros de coluna variaram de 0,5 a 3,2 cm e as alturas de coluna foram de 9,4-9,5 cm.

As colunas foram equilibradas com 5 volumes de coluna de uma solução contendo Tris 50 mM, NaCl 2 M, pH 7,5 ou 8,0 seguido por outra etapa de equilíbrio compreendendo solução de glicina 50 mM, Tris 50 mM, pH 7,5 ou 8.0. As colunas foram então carregadas para entre 124 mg/mL e 303 mg/mL com o pico de Proteína A parcialmente purificada e o produto foi recuperado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e em alguns volumes de coluna da fração de lavagem. Os resultados deste experimento são apresentados na Tabela 2.3.1

As condições de carregamento na região de partição fraca (WP). A triagem de taxa de transferência alta descrita em Experimento 2.1 proporciona o valor do coeficiente de partição (Kp). As corridas foram classificadas pelos coeficientes de partição listados na Tabela 2.3.1. O produto ligado foi determinado pela medição da proteína na extração de coluna usando absorbância em UV. Este método de determinação da quantidade de produto ligado tipicamente subestima a quantidade total de produto ligado devido à eluição isocrática de produto na lavagem. Resultados de remoção de Proteína A, HCP, HMW e LMW destes experimentos também são apresentados na Tabela 2.2.1. Há uma remoção alta e consistente de HCP, e excelente remoção de Proteína A, e redução valiosa de variantes de produto (espécies HMW e LMW).

Uma comparação de dados apresentados nas Tabelas 2.2.1 e

2.3.1 confirma que a remoção de HCP, Proteína A, HMW, e LMW sob condições de um modo de fluxo transpassante (valores de Kp de < 0,3) é muito menor do que aquela que pode ser conseguida sob condições de partição fraca (valores de Kp > 0,3), até mesmo quando o desafio de carregamento ultrapassa 300 mg/mL.

Tabela 2.3.1: Remoção de HCP, Proteína A e HMW e LMW sob condições de partição fraca

ND - não determinado

Kp	Produio ligado (mg/m L)	pH	Cl (mM ΐ	Desafio de carregame nto (mg'mLi	ProA em carregam ento (ppm)	HCP em carregam enio (ppiii)	HCP íl.R V)	ProA (LRV)	HMW (vezes)	LMW (vezes)	Recupera çâo
0.6	ND	7.5	14	303	72	754	1.9	1.6	1.3	1.5	>95%
0.7	ND	8.0	55	303	72	754	2.0	1.5	1.0	1.2	>95%
0.7	4	7.9	45	307	213	1852	2.6	2.4	ND	ND	>95%
1.0	5	8.1	45	302	222	1852	2.6	3.0	ND	ND	>95%
1.2	30	8.0	35	124	52	3320	2.8	>2.1	1.4	1.1	89%
1.7	ND	8.0	26	303	72	754	2,3	>2.6	1.1	1.8	>95%
L7	9	8.1	31	310	ND	ND	ND	ND	ND	ND	90%
1.8	25	7.8	14	169	23	2462	3.0	>1.8	1.9	2.1	86%
5.2	9	8.0	17	303	72	754	2.0	>2.6	1.7	1.6	>95%
8.9	59	8.2	12	284	ND	ND	ND	ND	1.5	2.1	75%

Experimento 2,4: Desempenho de corridas em coluna de partição fraca em escala de manufatura piloto e clínica

A etapa de processo TMAE para a purificação de Mab-IMA operado na zona de partição fraca foi aumentada em escala para a manufatura clínica e em instalação Piloto. A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi primeiro purificada usando uma coluna MabSelect de 3 L ou 5 L em Piloto e uma coluna MabSelect de 28 L durante manufatura clínica. A coluna MabSelect foi essencialmente operada como descrito em Experimento 1.2. As reuniões de pico de Proteína A neutralizada destas corridas foram adicionalmente purificadas em uma coluna TMAE de 1,5 L em Piloto e uma coluna TMAE de 7 L na instalação de manufatura clínica. Os resultados das três corridas Piloto e das nove corridas de manufatura clínica estão sumariados nas Tabelas 2.4.1 e 2.4.2, respectivamente, O desempenho de etapa foi consistente através das corridas, com redução excelente de HCP, Proteína A, e remoção boa de espécies HMW e LMW relacionadas com o produto. Recuperação de produto foi > 87% em todas as corridas. Uma estimativa de produto ligado na resina durante as corridas Piloto foi obtida do produto na extração de coluna, que variou de 6-14 mg/mL de resina.

Tabela 2.4.1: Desempenho de corridas em escala Piloto sob condições de partição fraca

	Kp	Produto ligado (mg/m L}	pll	ClímM)	Desafio de carregamento (mg/m LI	HCP íl.R V)	ProA (LRV)	HMR (vezes'	! MW	Recupera çàc !3
Com da 1	1.7	14	8.1	31	253	3.4	--2.6	2.0	2.0	90
C orr i da 2	1.7	13	8.1	3)	)84	>3.6	>2.6	1.0	3.0	88
Corrí da 3	1.7	6	g.l	31	150		-•2.8	1.3	1.2	88

ND = não determinado

Tabela 2.4.2: Desempenho de corridas em escala de manufatura sob condições de partição fraca

	kp	Desafio de carregamento ímg/mLl	cr (mM )	pH	HCP* (LRV)	ProA*(L RV)	HMR (vezes)	LMW (vezes)	Recuperação (%)
Corrida 1	3.2	90	30	8.1	>2.2	>0.8	2.5	3.0	90
Corrida 2	2.5	180	29	8.0	>2.2	>0.0	1.9	1.5	93
Corrida 3	2.6	133	28	8.0	>2.3	>1.0	2.5	1.8	95
Corrida 4	2.6	174	29	8.0	>2,2	>1.0	2.5	1.2	94
Corrida 5	2.2	136	31	8.0	>2.0	>0.9	2.3	1,7	102
Corrida 6	3.8	146	27	8.1	>2.2	>0.8	2.5	1,8	91
Corrida 7	2.0	118	28	7.9	>2,2	>1.0	1.6	1.6	96

* Os níveis de HCP e de Proteína A na reunião de pico de TMAE ficaram abaixo do limite de quantificação.

Sumário

Condições identificadas com HTS para operação WP e FT. O modo FT proporcionou uma redução modesta em espécies HCP e LMW, e nenhuma redução em resíduos de Proteína A ou espécies HMW. Operação no modo WP melhora a remoção de todas as impurezas sem prejudicar o rendimento de produto.A etapa de processo foi aumentada em escala para a instalação Piloto e operada consistentemente para três corridas, com LRVs muito altos para HCP e Proteína A, e reduções boas em espécies HMW e

LMW.

Série 3 — Troca aniônica usando TMAE-HiCapM e Mab-AAB

Experimento 3.1— Triagem de taxa de transferência alta para estabelecer condições de WP e FT

Experimento 3.1 foi realizado usando os procedimentos como descritos em Experimento 1.1.

Experimento 3.2 — Corridas de capacidade de coluna sob condições correspondendo a coeficientes de partição variados

Cinco experimentos de cromatografia foram realizados sob

condições correspondendo a uma faixa de coeficientes de partição identificados peia triagem HTS (Experimento 3.1). As colunas TMAE foram carregadas para um desafio de carregamento muito alto (>1.000 g/L) para especificamente realçar o desempenho superior da etapa AEX sob condições de partição fraca.

As seguintes condições foram usadas para as corridas AEX realizadas em Série 3 (exceções estão anotadas nas descrições experimentais individuais).

Vazão operacional - 150 -300 cm/h.

Equilíbrio 1-Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 (5 volumes de coluna).

Equilíbrio 2 - como especificado, aproximadamente equivalente ao pH e ao conteúdo de cloreto de carregamento.

Lavagem após carregamento - como especificado, 15 aproximadamente equivalente ao pH e ao conteúdo de cloreto de carregamento.

Tampão de extração - Tris 50 mM, NaCl 2,0 M, pH 7,5 (5 volumes de coluna)

A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão 20 1 de equilíbrio seguidos por 5 volumes de coluna de etapa de equilíbrio 2. A coluna foi então carregada para entre 940 e 2.144 mg de produto / mL de resina com a reunião de pico de Proteína A (refere-se à Série 1, Experimento

1.1) ajustada para o tampão de equilíbrio 2 apropriado.

As frações de efluente da coluna foram coletadas e 25 subseqüentemente ensaiadas para níveis de HCP e de Proteína A residual. As condições de carregamento usadas nestes experimentos correspondem aos coeficientes de partição progressivamente crescentes que incluem as regiões de partição fraca (WT) e de fluxo transpassante. A triagem de taxa de transferência alta descrita em Experimento 3.1 proporcionou estimativas para υ valor do coeficiente de partição (Kp). Os valores de produto ligado neste exemplo foram calculados baseados no produto eluído na extração. Os resultados destes experimentos estão listados na Tabela 3.2.1 e nas Figuras lOAe 10B.

Tabela 3.2.1 - Sumário dos resultados de experimentos de desafio de carregamento muito alto no modo WP

	Coeficiente de partição Kp	Condições de operação	Desafio de carregamento mg/ml	Produto ligado nig/mL*	Recuperação*
Conida 1	0.1	Fluxo transpassante	1754	0	100
Corrida 2	0.23	Partição fraca	940	14.2	98.5
Corrida 3	0.8	Partição fraca	940	12.0	98.7
Corrida 4	0.8	Partição fraca	2144	23.0	98.9
Corrida 5	2.73	Partição fraca	960	12.6	98.7
Corrida 6	7	Partição fraca	1130	71.7	93.7

*Baseado em cálculo de balanço de massa.

O valor de produto ligado para a corrida correspondendo a um Kp de 0,1 foi próximo de zero, como é esperado para uma típica operação de fluxo transpassante. Os valores de produto ligado para experimentos realizados na região de partição fraca foram > 12,0 mg/mL em todos os caso. De fato, o valor de produto ligado para a corrida correspondendo ao Kp de 7 foi tão alto quanto 71 mg/mL. A recuperação de produto no eluato de carregamento combinado e nas frações de lavagem em todos os casos foi, contudo, > 93%.

Remoção de HCP e de Proteína A, como uma função de desafio de carregamento, é apresentada nas Figuras 10A e 10B. Como discutido no início, a remoção de HCP aumenta significativamente à medida que as condições se movem de fluxo transpassante para partição fraca.

Operação sob condições de fluxo transpassante proporciona aproximadamente logs de depuração de HCP de 1,5, enquanto que os logs de valores de remoção de HCP foram tão altos quanto logs de 3,8 em desafios de carregamento < 450 mg /mL de resina quando operados em um Kp de 7 na região de partição fraca. Em um Kp de 0,8 na região de partição fraca, logs de depuração de HCP de 2,8 foram obtidos para desafios de carregamento de até 1.000 mg/mL de resina, e logs de depuração de HCP > 3 para um desafio de carregamento de 800 mg/mL de resina em um Kp de 2,7 na região de partição fraca.

Como no caso de HCP, remoção de Proteína A aumenta significativamente à medida que inovemos as condições de fluxo transpassante para condições de partição fraca. Os resultados apresentados nas Figuras 10A e 10B também realçam o fato de que o aumento de Kp de operação da região de fluxo transpassante para região de partição fraca aumenta o log de valores de depuração de HCP e de Proteína A obtidos antes do aparecimento do contaminante, bem como o desafio de carregamento até o ponto de aparecimento. Um aumento adicional em Kp continua a aumentar o LRV de HCP e de Proteína A antes da passagem do contaminante. Contudo, o ponto de aparecimento ocorre em desafios de carregamento relativamente menores porque o produto ligado agora compete com os contaminantes pelos sítios de ligação. Todavia, as capacidades da coluna para as corridas aqui apresentadas foram muito altas até mesmo em corrida de Kp elevado.

Sumário

Neste exemplo foi mostrado que remoção de HCP e Proteína A pode ser significativamente melhorada pela operação da etapa AEX sob condições de partição fraca e em desafios de carregamento acima de 1.000 mg/mL de resina. Este exemplo realça uma diferença fundamental entre cromatografia de partição fraca e as operações padrão sob condições de ligação. As condições de partição fraca empurram os limites de ligação de produto apenas até um ponto onde a depuração de contaminante é significativamente melhorada, enquanto que a recuperação de produto e os desafios de carregamento permanecem altos. Os valores de Kp correspondendo às condições de ligação são > 20 em AEX; sob estas condições os efeitos competitivos entre o produto e o contaminante são muito fortes acarretando capacidade reduzida em comparação com a cromatografia de partição fraca.

Série 4 - Interação hidrofóbica utilizando Phenyl Toyopearl e Mab-AAB

Experimento 4.1 — Estudos de ligaçào em batelada para estabelecer as condições WP e ET

Estudos de ligação em batelada foram conduzidos para 5 identificar as condições de partição fraca e de fluxo transpassante para MabAAB com meio Phenyl Toyopearl da Tosoh Biosciences. O sal modulando a força da interação de produto com a resina é Na₂SO₄, que foi variado de 0,20 M a 0,90 M. As soluções foram tamponadas para controle em pH 7,5. Placas de filtro de 45 pm foram usadas para incubar a resina com líquido e para decantar o sobrenadante através de centrifugação. Oito tampões Tris/ Na₂SO₄ foram preparados com

Na₂SO₄ em concentrações diferentes (0,2 M a 0,9 M), MabAAB que foi parcialmente purificado por cromatografia de Proteína A foi diluído em solução de Tris/ Na₂SO₄ para uma concentração final de 0,87 mg/mL. 50 pL de resina foram equilibrados com 300 pL de tampão e então o sobrenadante foi decantado para cada uma das condições de Tris/ Na₂SO₄; este equilíbrio foi repetido três vezes. Após o equilíbrio, a resina decantada foi misturada com o produto na mesma concentração de sal e no mesmo pH e incubada por 30 minutos com agitação suave. O desafio de carregamento foi de 5,2 mg de produto / mL de resina para todas as condições. Uma placa de UV foi então empilhada no fundo da placa de filtro para coletar o sobrenadante sob centrifugação. Subsequentemente, 300 pL de tampão Tris 50 mM, pH 7,5 foram aplicados na resina para extrair o produto ligado. Após uma incubação de 20 minutos, a extração foi coletada em uma placa de UV separada por meio de centrifugação. A concentração do produto em cada fração foi medida por absorbância em UV e o coeficiente de extinção para este MAb. Os cálculos foram ajustados para um alcance de estágio-para-estágio sobre volume de 29 pL que foi determinado por um conjunto separado de experimentos. O experimento foi repetido quatro vezes sob cada condição de sal e um coeficiente de partição médio é relatado.

Tabela 4.2.1 sumaria os coeficientes de partição deste experimento. As concentrações mais altas de Na₂SO₄ causaram forte ligação de produto, enquanto que concentrações de sal dentro da faixa de 0,40-0,55 M representam condições de partição fraca.

Experimento 4.2 - Corridas em coluna sob condições de partição fraca, de fluxo transpassante e de ligação (estudos de desafio de produto alto)

Corridas em coluna foram realizadas sob condições de partição 10 fraca, de fluxo transpassante e de ligação forte, Para todas as corridas de cromatografia de interação em Phenyl Toyopearl descritas nos experimentos de Série 4, as seguintes condições foram usadas (exceções são anotadas nas descrições experimentais individuais).

Dimensão de coluna: diâmetro 0,5 cm, altura de leito 9,5-10,5 cm

Equilíbrio - Tris 50 mM, pH 7,5 com [Na₂SO₄] aproximadamente equivalente à do carregamento.

Carregamento - [Na₂SO₄] como especificado abaixo.

Lavagem - [Na₂SO₄] igual à do carregamento (exceções 20 anotadas abaixo).

Extração - Tris 50 mM, pH 7,5.

Dois carregamentos diferentes foram usados: i) reuniões de anticorpo particularmente purificado de uma etapa de Proteína A corrida essencialmente na mesma maneira que aquelas previamente descritas ou ii) reuniões de produto de TMAE Q Sepharose EF mais puro da operação de modo FT.

Experimento 4.2.1 - Corridas em coluna usando reunião de pico de Proteína Λ como carregamento

Os experimentos aqui discutidos foram realizados para realçar o desempenho superior de H1C sob condições de partição fraca. Corridas em coluna foram realizadas sob concentrações de sal variadas para cobrir uma faixa de coeficientes de partição que corresponde às condições de partição fraca, de fluxo transpassante e de ligação forte. A triagem de ligação em batelada descrita em Experimento 4.1 proporciona estimativas para o valor do coeficiente de partição(Kp). As colunas foram equilibradas com 5 volumes de coluna de uma solução contendo Tris 50 mM, pH 7,5 e [Na₂SO₄] apropriada em concentração específica. O pico de Proteína A foi primeiro concentrado 10 vezes, e subseqüentemente diluído para 14,77 mg/mL na concentração de sal apropriada. Níveis de proteína de célula hospedeira (HCP) e de Proteína A residual no material de carregamento foram 30.911 ppm e 17,1 ppm, respectivamente. Todas as corridas em colunas foram realizadas em um desafio de carregamento de 100 mg/mL de resina. O produto foi coletado no efluente da coluna durante a fração de ciclo de carregamento. Após o fluxo transpassante de produto, dez volumes de coluna de tampão de lavagem na mesma concentração de sal como carregamento foram aplicados na coluna, seguidos por cinco volumes de coluna de um tampão de extração contendo Tris 50 mM, pH 7,5. Conteúdos de HCP e Proteína A no eluato de carregamento e nas amostras de lavagem foram subseqüentemente analisados por ELISA. O nível de impureza combinada em ambos o eluato de carregamento e as frações de lavagem é relatado na Tabela 4.2.1.

As corridas são classificadas pelos coeficientes de partição. O produto ligado foi determinado por medição da proteína na extração de coluna usando absorbância em UV. Este método de determinação de produto ligado tipicamente subestima a quantidade de produto ligado durante o carregamento devido à dessorção gradual do produto durante a lavagem.

Tabela 4.2.1.: Remoção de impurezas em condições de fluxo

transpassante, de partição fraca e de ligação forte

	Cone de Na;SCb	Coeficien te de partição Kp	Janela de operação	Produto ligado ím/ml.)	Recuperaçã o de produto (%)	! Remoção de 1 Proteína 4 (vezes)	Remoção [ de HC» l (Log)
Corrida 1	0.10M	<0.1	Fluxo transpassante	0.0	94	0.9	0.3
Corrida 2	0.20 M	<0.1	Fluxo transpassante	1.3	93	0.8	0.4
Corrida 3	0.40 M	0.9	Partição fraca	2.8	94	1.7	1.0
Conida 4	0.4 S M	2.0	Partição fraca	3.0	93	1.5	0.9
Corrida 5	0.50 M	4.3	Partição fraca	3.8	92	2.5	N/A
Corrida 6	0.55 M	9.9	Partição fraca	5.0	93	3.4	1.1
Corrida 7	0.80 M	>100	Ligação forte	25	72	2.2	0.7
Corrida 8	0.90 M	>100	Ligação forte	34	67	1.1	0.4

(0 coeficiente de partição Kp considera a razão volumar de fases de 6 a 50 micro!itros de resina e 300 microlitros de solução)

Como é evidenciado dos dados apresentados na Tabela 4.2.1, o 5 desempenho da etapa HIC melhora significativamente com respeito à redução de contaminantes à medida que movemos das condições de fluxo transpassante para as condições de partição fraca, enquanto que a recuperação de produto é comparável. Um aumento adicional na concentração de sal operacional acarreta coeficientes de partição que correspondem às condições de ligação forte. Mais uma vez está de novo claro dos dados apresentados na Tabela 4.2.1 que o desempenho da etapa HIC deteriora com respeito tanto à redução de contaminantes quanto à recuperação de produto, à medida que movemos das condições de partição fraca para as condições de ligação forte. A janela de operação ótima para esta separação portanto corresponde àquela de cromatografia de partição fraca. Sob condições de partição fraca, a etapa HIC proporciona log de redução de HCP de 1 e redução de 3,4 vezes de Proteína A. Os níveis de produto ligado sob as condições de partição fraca, neste exemplo, estiveram entre 2,8 e 5 mg/mL de resina.

Experimento 4.2.2 — Corridas em coluna usando reunião de pico de Q20 Sepharose como carregamento

A reunião de pico de Q Sepharose FF foi usada nestes conjuntos de experimentos para realçar o fato de que o desempenho da etapa HIC sob as condições ótimas de cromatografia de partição fraca pode ser adicionalmente melhorado com uma alimentação mais limpa. O material de carregamento neste caso continha 2.880 ppm de HCP e foi gerado por

purificação de reunião de pico de Proteína A em uma coluna Q Sepharose FL, Dois experimentos, um sob condições de partição fraca e outro sob condições de fluxo transpassante, foram conduzidos para comparar o desempenho da coluna com respeito à remoção de impurezas. O pico de Q-Sepharose foi diluído para 3,27 mg/mL em Na^SCL 550 mM e carregado na coluna em um desafio de carregamento de 100 mg/mL de resina para operação sob condições de partição fraca. A coluna foi subseqüentemente lavada com 10 CVs de um tampão contendo a mesma concentração de sal como a do carregamento e extraída com 6 CV de tampão Tris 50 mM, pH 7,5. O segundo experimento foi conduzido sob condições de fluxo transpassante. O carregamento foi ajustado para 3,03 mg/mL em Na₂SO₄ 200 mM e carregado na coluna em um desafio de carregamento de 90 mg/mL de resina. A coluna foi então lavada com 6 CV de um tampão contendo a mesma concentração de sal que a do carregamento, e subseqüentemente extraída com 6 CV de tampão

Tris 50 mM, pH 7,5. Em ambas as corridas, as frações de fluxo transpassante e de lavagem foram coletadas para análise de impurezas e de recuperação. Os resultados destas corridas estão relatados na Tabela 4.2.2.

Tabela 4.2.2: Comparação de resultados de partição fraca de HIC com resultados de fluxo transpassante

Corrida	Concentração de Na^SOj	Coeficiente de partição (Kp)	Modo de operação	Desafio de carregamento (mg/mL)	Produto lieado (mg/mL)	Recuperação de produto	LRV HCP	de
1	0.55 M	9.9	Partição fraca	100	3.0	94%	>2
	0,20 M	<0.1	Fluxo transpassante	90	0.1	99%	<0.5

Os valores de recuperação de produto sob as condições de partição fraca foram comparáveis com os das operações de fluxo transpassante e também foram independentes da alimentação usada nestes experimentos. O desempenho das etapas com respeito à remoção de HCP é significativamente maior sob condições de partição fraca em comparação com a operação de fluxo transpassante.

LRV de HCP através da etapa HIC com qualquer alimentação foi comparável sob condições de fluxo transpassante (LRV -- 0,4-0,5).

S ί

6//

Contudo, os valores LRV de HCP para os experimentos realizados sob condições de partição fraca aumentaram de 1 RV de 1 com o material de carregamento de Proteína A para LRV maior do que 2 com material de carregamento purificado através de colunas de Proteína A e Q Sepharose FF. Sumário

Foi mostrado que outro modo de cromatografia (HIC) opera com sucesso em um modo de partição fraca. Foi mostrado que o desempenho da etapa HIC sob condições de partição fraca é superior em ambas as condições de fluxo transpassante e operações sob condições de ligação mais forte, com respeito à recuperação de produto e remoção de HCP/Proteína A. Uma capacidade de desafio de carregamento alto de 100 mg/mL de resina foi processada com sucesso sob condições de partição fraca, onde > 3 mg/mL de produto ligado na resina (embora as condições ótimas de partição fraca parecem ser ligeiramente melhores do que aquelas para cromatografia de troca aniônica).

Série 5: Hidroxiapatita usando hidroxiapatita de tipo I e Mab-MYA

Experimento 5.1 - Triagem de taxa de transferência alta para estabelecer condições WP e FT

Uma triagem de taxa de transferência alta (HTS) foi realizada para identificar as condições de partição fraca e de fluxo transpassante para Mab-MYA com meio de hidroxiapatita cerâmica. Esta triagem variou a concentração de cloreto de sódio e de fosfato de sódio para determinar seu efeito sobre a extensão de ligação de MAB-MYA no meio de hidroxiapatita, pL de meio de hidroxiapatita cerâmica foram carregados em 30 cavidades de uma placa de filtro de 96 cavidades. Cada cavidade foi equilibrada em soluções compostas de concentrações apropriadas de cloreto de sódio e de fosfato de sódio em tampão HEPES 100 mM contendo arginina 100 mM em pH 7,2. As concentrações de cada um dos dois sais na solução são mostradas nas Tabelas 5.1.1 e 5.1.2. Cada condição foi realizada em

duplicata. O desafio de carregamento de MAB-MYA em cada uma destas cavidades foi de 5,0 mg/mL de resina.

Tabela 5.1.1: Níveis de cloreto de sódio em cada cavidade (em mM)

	1	2	3	4
A	50	200	50	200
B	750	50	750	50
C	50	380	50	380
D	500	760	500	760
E	50	1140	50	1140
F	200	200	200	200
G	350	200	350	200
H	700		700

Tabela 5.1.2: Níveis de fosfato de sódio em cada cavidade (em mM)

	1	2	3	4
A	5	20	5	20
B	5	30	5	30
C	8	30	8	30
D	8	30	8	30
E	10	30	10	30
F	10	50	10	50
G	10	100	10	100
H	10		10

No primeiro estágio do experimento HTS, cada cavidade foi equilibrada nas condições de cloreto de sódio e de fosfato de sódio como descritas nas Tabelas 5.1.1 e 5.1.2, em uma razão volumar de fase 6:1 (300 pL de solução: 50 pL de resina). A placa foi agitada por 20 minutos, permitindo que o equilíbrio fosse alcançado. A solução foi então removida por centrifugação da placa de filtro. Este ciclo de equilíbrio foi repetido três vezes.

No segundo estágio, a resina em cada cavidade foi desafiada com uma solução concentrada de MAb-MYA para o desafio de carregamento de proteína apropriado com uma razão volumar de 6:1 (300 pL de solução: 50 pL de resina) na concentração apropriada de cloreto de sódio e de fosfato de potássio. Uma solução de Mab-MYA a 7,0 mg/mL em NaCl 50 mM, HEPES 100 mM, arginina 100 mM, pH 7,2 foi usada como solução de estoque. A placa carregada foi agitada por 20 minutos, permitindo que a resina e a solução equilibrassem. O sobrenadante foi removido da placa de filtro por centrifugação e coletado em uma placa de coleta. A concentração de proteína no sobrenadante em cada cavidade foi determinada em A280nm.

No terceiro estágio, a resina foi lavada por adição de soluções de cloreto de sódio e de fosfato de sódio nas condições especificadas listadas nas Tabelas 5.1.1 e 5.1.2. O sobrenadante foi removido após agitação por 20 minutos.

No quarto estágio, um tampão compreendido de fosfato de sódio 100 mM, NaCl 1 M, pH 7,2 foi adicionado para remover a proteína restante que estava ligada na resina.

Os coeficientes de partição foram calculados para cada cavidade usando a massa eluída do estágio 4 e a concentração de produto do estágio 2, e são mostrados na Tabela 5.1.3.

Tabela 5.1.3: Coeficientes de partição (Kp) para a triagem HTS de 96

cavidades	para MAB-MYO
	1	2	3	4
A	49,3	2.3	50,5	2,4
B	3.5	6,0	4,1	6,0
C	31,6	0,4	34,7	0,3
D	2,9	0,1	3,3	0,1
E	28,1	0,0	28,3	0.0
F	7,2	0,5	7,7	0,4
G	3.5	0.0	3,1	0,0
H	1,1		1,1

Como mostrado na Tabela 5.1.3, o valor de Kp pode ser usado para descrever as regiões onde MAB-MYA se liga no meio de hidroxiapatita com forças diferentes. A força de ligação de MAB-MYA em meio de hidroxiapatita cerâmica pode ser manipulada pela variação das condições de concentração de cloreto de sódio e de fosfato de sódio nas zonas de fluxo transpassante (Kp=<0,l), de partição fraca (0,l<Kp<20), e de ligação (Kp=>20).

Experimento 5.2 — Corridas em coluna sob condições WP

Os experimentos aqui discutidos foram especificamente realizados para realçarem o desempenho superior da etapa cHA sob condições de partição fraca. Os experimentos foram portanto realizados sob condições correspondendo a uma faixa de coeficientes de partição identificados pela

triagem I ITS (Experimento 5.1). Doze corridas foram conduzidas, com desafios de carregamento de produto de 100 mg/mL de resina.

Cromatografia em Mabselect Protein A

A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi purificada 5 usando uma coluna MabSelect. Uma coluna Mabselect Protein A foi equilibrada com 5 volumes de coluna de Tris 50 mM / NaCl 150 mM. pH 7,5 em uma vazão de 300 cm/h. A coluna foi então carregada com um carregamento de aproximadamente 40 mg de produto / mL de resina. Isto foi seguido por uma lavagem de 10CV em arginina 1 M, Tris 50 mM, pH 7,5 e uma lavagem de 5CV contendo Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5. A coluna foi então eluída usando arginina 100 mM, NaCl 50 mM, pH 3,0. A reunião de produto foi neutralizada para pH 7,2 usando HEPES 2 M pH 8,0.

Cromatografia em hidroxiapatita cerâmica

As reuniões de anticorpo parcialmente purificado da etapa

Proteína A foram adicionalmente purificadas sobre hidroxiapatita. O diâmetro de coluna foi de 0,5 cm e a altura de coluna foi de 10 cm.

Para todas as etapas de cromatografia de hidroxiapatita descritas na série 5 de Experimento, as seguintes condições foram usadas (exceções são anotadas nas descrições experimentais individuais).

Vazão operacional - 150-240 cm/h.

Equilíbrio 1 - fosfato de sódio 300 mM, NaCl 1,0 M, pH 6,8 (3 volumes de coluna).

Equilíbrio 2 - fosfato de sódio 5-30 mM, NaCl 50-760 mM, Arg 100 mM, HEPES 100 mM pH 7,2 (5 volumes de coluna).

Lavagem - fosfato de sódio 5-30 mM, NaCl 50-760 mM, Arg

100 mM, HEPES 100 mM pH 7,2 (5-10 volumes de coluna).

A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 seguido por outra etapa de equilíbrio 2. A coluna foi então carregada com 100 mg de produto/mL de resina com o pico de Proteína A da etapa prévia (ajustado para o tampão de equilíbrio 2 apropriado), e o produto foi recuperado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e em alguns volumes de coluna da fração de lavagem. Os resultados destes experimentos são apresentados na Tabela 5.2.1. e na Figura 11.

Estas condições de carregamento foram nas regiões de fluxo transpassante, de partição fraca (WP) e de ligação. A triagem de taxa de transferência alta descrita em Experimento 5.1 proporciona estimativas para o valor de coeficiente de partição (Kp) e o produto ligado (mg/mL de resina) sob estas condições de concentração de cloreto e de fosfato. O produto ligado foi determinado dos volumes de aparecimento de produto das corridas de coluna. Resultados de HCP e de Proteína A destes experimentos são apresentados na Tabela 5.2.1 e na Figura 11.

Tabela 5.2.1: Remoção de HCP e de Proteína A sob condições de fluxo transpassante, de partição fraca, e de ligação

	Coeficie nte de partição Kp	Modo de operação	Fosfato	NaCl	Produto ligado (mg/mL)	Recupera ção de produto (%)	Remoção de Proteína A(vezes)	Proteín a de célula hosped eira (LRV)
Corrida 1	0,0	Fluxo transpassante	30	760	0	93	0	0,58
Corrida 2	0,9	Partição fraca	30	200	3,0	96	NA '	0,57
Corrida 3	1,1	Partição fraca	10	700	3,2	94	1,7	0,9
Corrida 4	1,7	Partição fraca	20	200	3,1	94	NA	0,83
Corrida 5	3,0	Partição fraca	8	500	3,0	100	1,9	1,3
Corrida 6	3,2	Partição fraca	10	350	3,6	94	2,1	1,5
Corrida 7	3,7	Partição fraca	5	750	3,3	99	2.4	1,2
Corrida 8	5.8	Partição fraca	30	50	10,7	95	2,1	1,2
Corrida 9	7,3	Partição fraca	10	200	10.2	94	2,4	1,2
Corrida 10	27,8	Ligação forte	10	50	16,3	91	2,1	1,2
Corrida 11	32,7	Ligação forte	8	50	21,6	86	2,4	1,4
Corrida 12	49,2	Ligação forte	5	50	24,6	79	2,1	1,6

É evidente dos dados apresentados na Tabela 5.2.1 e na Figura que o desempenho da etapa cHA melhora significativamente com respeito à redução de contaminantes à medida que movemos das condições de fluxo transpassante para condições de partição fraca, enquanto que a recuperação de produto é comparável. Operação sob condições correspondentes a um aumento adicional no coeficiente de partição (i.e _; operando na região de ligação) não proporciona beneficio adicional com respeito à remoção de contaminantes. Contudo, a recuperação de produto através da etapa começa a cair sob condições de ligação forte. Assim, a janela de operação ótima para esta separação corresponde àquela de cromatografia de partição fraca. Sob estas condições, log de redução de Proteína A > 2 e log de redução de proteína de célula hospedeira > 1,2 foram obtidos em um desafio de carregamento de 100 mg de produto / mL de resina. Níveis de produto ligado sob condições de partição fraca, neste exemplo, estiveram entre 3,0 e 10,2 mg/mL de resina.

Sumário

Foi mostrado que um terceiro modo de cromatografia (hidroxiapatita ) opera com sucesso em um modo de partição fraca. Proteína

A e HCP ligam-se mais fortemente do que o anticorpo produto na resina cerâmica, e são retidos mais fortemente sob condições WP. Valores maiores de Kp ma região WP estão entre 10 e 20 em alguns casos, o que ainda proporcionará boa recuperação de produto (> 90%). Níveis menores de Kp dão recuperações correspondentemente mais altas.

Neste exemplo foi mostrado que o desempenho da etapa de coluna pode ser otimizado primariamente por intermédio da escolha do coeficiente de partição usado para correr a coluna. O coeficiente de partição em hidroxiapatita é uma função complexa do pH, do sal (concentração e tipo), do fosfato, e dos componentes do tampão, Todas estas variáveis em geral possuem um impacto sobre o desempenho da etapa de coluna. A abordagem aqui apresentada proporciona um meio simples de relacionar o impacto de mudança de qualquer uma destas variáveis sobre o desempenho da coluna. A abordagem de ‘coeficiente de partição’ unificada apresentada neste exemplo abre a possibilidade de operação em um espaço de operação mais amplo neste

modo de cromatografia do que tem sido anteriormente feito. As condições de partição fraca para desempenho ótimo podem ser facilmente identificadas usando os métodos HTS acima descritos.

Série 6 — Hidroxiapatita usando hidroxiapatita cerâmica de tipo Ϊ e MabA5T

Experimento 6.1 - Triagem de taxa de transferência alta para estabelecer condições WP e FT

Uma triagem de taxa de transferência alta (HTS) foi realizada para identificar as condições de partição fraca e de fluxo transpassante para Mab-A5T com meio de hidroxiapatita cerâmica. Esta triagem variou pH, concentrações de cloreto de sódio e de fosfato de sódio para determinar seu efeito sobre a extensão de ligação de MAB-A5T no meio de hidroxiapatita.

μΤ de meio de hidroxiapatita cerâmica foram adicionados em 36 cavidades de uma placa de filtro de 96 cavidades. Cada cavidade foi equilibrada com soluções compostas de concentrações apropriadas de cloreto de sódio e de fosfato de sódio em um tampão HEPES 50 mM contendo arginina 50 mM quer em pH 7,0 quer em pH 8,0. As concentrações dos dois sais na solução são mostradas em Tabelas 6.1.1 e 6.1.2. as condições mostradas nas colunas 1-3 foram realizadas em pH 7,0, e colunas 4-6 foram realizadas em pH 8,0. O desafio de carregamento de MAB-A5T em cada uma destas cavidades foi de 5,0 mg/mL de resina.

Tabela 6.1.1: Níveis de cloreto de sódio em cada cavidade (em mM)

	i |	2	í 3	4 |	5 1	6
	pH 7,0	pH 8,0
A	50	400	400	50	400	400
B	50	50	400	50	50	400
C	50	50		50	50
D	100	50		100	50
E	100	100		100	100
F	100	100		100	100
G	400	100		400	100
H	400	400		400	400

Tabela 6.1.2: Níveis de fosfato de sódio em cada cavidade (em mM)

	1	2	1 Ί 1 J	4	5 1	6
	pH 7.0	pH 8.0
A		32	8		32	8
B	8	2	32	8	2	32
C	32	8		32	8
D	2	32		2	32
E	8	2		8	2
F	32	8		32	8
G	2	32		2	32
H	8	2		8	2

No primeiro estágio do experimento HTS, cada cavidade foi equilibrada nas condições de cloreto de sódio, fosfato de sódio e pH como descritas em Tabelas 6.1.1 e 6.1,2 em uma razão volumar de fases de 6:1 (300 pL de solução: 50 pL de resina). A placa foi agitada por 20 minutos, permitindo que equilíbrio fosse alcançada. A solução foi então removida por centrifugação da placa de filtro. Este ciclo de equilíbrio foi repetido três vezes.

No segundo estágio, a resina em cada cavidade foi desafiada com uma solução concentrada de MAb-A5T para o desafio de carregamento de proteína apropriado com uma razão de volume de 6:1 (300 pL de solução: 50 pL de resina) em concentração de cloreto de sódio e de fosfato de sódio e em pH apropriados. Uma solução de Mab-A5T a 6,9 mg/mL em HEPES 1 mM, NaCl 100 mM, pH 7,0 foi usada como solução de estoque. A placa carregada foi agitada por 20 minutos, permitindo que a resina e a solução equilibrassem. O sobrenadante foi removido da placa de filtro por centrifugação e coletado em uma placa de coleta. A concentração de proteína no sobrenadante em cada cavidade foi determinada por absorbância em A280nm.

No terceiro estágio, resina foi lavada pela adição de soluções de cloreto de sódio, de fosfato de sódio e em pH nas condições especificadas listadas em Tabelas 6.1.1 e 6.1.2. O sobrenadante foi removido após agitação por 20 minutos.

No quarto estágio, um tampão compreendendo fosfato de

Ί

Z r

sódio 100 mM, NaCl 1 M pH 7,2 foi adicionado para remover a proteína resultante que estava ligada na resina. Os coeficientes de partição foram calculados para cada cavidade usando a massa eluída do estágio 4 e a concentração de produto do estágio 2, e são mostrados em Tabela 6.1.3.

Tabela 6.1.3: Coeficientes de partição (Kp) para a triagem HTS para Mab-A5T

	1	í 2	1 J	4..... 1		6
	pH 7.0	pH 8.0
A	142.7	0.1	1.6	50.2	0.0	0.3
B	90.6	144,3	0,1	9,9	44.7	0.0
C	12.1	84,5		1.0	13.7
D	90,5	10.4		22.2	1,1
E	27,5	94.1		4,3	21.9
F	2.5	28.0		0,3	4.3
G	15,1	2,1		2,2	0,4
H	1.2	15.1		0.4	2.0

Como mostrado em Tabela 6.1.3, o valor de Kp pode ser usado para identificar as regiões onde MAB-A5T se liga no meio de hídroxiapatita com forças diferentes. A força de ligação de MAB-A5Tem meio de hídroxiapatita cerâmica pode ser manipulada pela variação das condições de NaCl, fosfato e pH em zonas de fluxo transpassante, de partição fraca, e de ligação.

Experimento 6.2— Corridas em coluna sob condições WP

Experimentos foram realizados para realçar o desempenho superior da etapa cHA sob condições de partição fraca. Os experimentos foram portanto realizados sob condições correspondendo a uma faixa de coeficientes de partição identificados pela triagem de HTS (Experimento 6.1). Oito corridas foram conduzidas, com desafios de carregamento de produto de 110 mg/mL de resina.

Cromatografia em Mabselect Protein A

A cultura contendo o anticorpo monoclonal foi purificada usando uma coluna MabSelect. Uma coluna Mabselect Protein A foi equilibrada com 5 volumes de coluna de Tris 50 mM / NaCl 150, pH 7,5 em uma vazão de 300 cm/h. A coluna foi então carregada em um desafio de carregamento de aproximadamente 40 mg de produto/mL de resina. Isto foi seguido por uma lavagem de 5CV em NaCI 1 M, Tris ^OmM, pH 7,5 e uma lavagem de 5CV contendo Tris 10 mM, NaCI 75 mM, pH 7,5. A coluna foi então eluída usando arginina 100 mM, NaCI 50 mM, pH 3,0. A reunião de produto foi neutralizada para pH 7,2 usando HEPES 2 M pH 8,0.

Cromatografia em hidroxiapatita cerâmica

As reuniões de anticorpo particularmente purificado da etapa de Proteína A foram adicionalmente purificadas sobre hidroxiapatita. O diâmetro da coluna foi de 0,5 cm e a altura da coluna foi de 10 cm.

Para todas as etapas de cromatografia em hidroxiapatita descritas na série 6 de Experimentos, as seguintes condições foram usadas (exceções sao anotadas nas descrições experimentais individuais).

Vazão de operação — 150-240 cm/h

Equilíbrio 1 - fosfato de sódio 300 mM, NaCI 1,0 M, pH 6,8 (3 volumes de coluna)

Equilíbrio 2 — fosfato de sódio 2-32 mM, NaCI 50-400 mM, Imidazol 5 mM, glicina 50 mM, HEPES 10 mM, pH 7,0 (5 volumes de coluna)

Lavagem Mesmo que Equilíbrio 2.

A coluna foi equilibrada com 5 volumes de coluna de tampão de equilíbrio 1 seguido por outra etapa de equilíbrio 2. A coluna foi então carregada com 110 mg de produto/mL de resina com o pico de Proteína A das várias etapas anteriores (ajustado para o tampão de equilíbrio 2 apropriado), e o produto foi recuperado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e em alguns volumes de coluna da fração de lavagem. Os resultados destes experimentos são apresentados em Tabela

6.2.1 e Figura 12.

Tabela 6.2.1: Coeficientes de partição para Mab-A5T sobre resina cHA e

a janela de operação correspondente.

	Coeficiente de partição Kp.	Produto ligado mg/ml	Modo de operação	Fosfato mM	NaCl mM	PH
Corrida 1	0.1	0	Fluxo transpassante	32	400	7,0
Corrida 2	0.7	1,6	Partição fraca	32	170	7.0
Corrida 3	1,4	2,2	Partição fraca	32	120	7,0
Corrida 4	2.1	1.6	Partição fraca	2	400	7.0
Corrida 5	13.7	7,0	Partição fraca	8	50	8.0
Corrida 6	22	6,7	Partição fraca	->	100	8,0
Corrida 7	54	12,8	Ligação forte	2	60	8.0
Corrida 8	>100	16	Ligação forte	2	50	1 7,0

As condições de operação nestes experimentos correspondem às regiões de fluxo transpassante, de partição fraca (WP) e de ligação. O experimento HTS descrito em Experimento 6.1 proporciona estimativas para o valor do coeficiente de partição (Kp) sob estas condições de pH, e de concentrações de cloreto e de fosfato. As corridas em Tabela 6.2.1 são classificadas pelos coeficientes de partição. O produto ligado foi determinado pela medição da proteína na extração de coluna usando absorbância em UV. Este método de determinação do produto ligado tipicamente subestima a quantidade de produto ligado durante o carregamento devido à dessorção gradual do produto durante a lavagem. Resultados de remoção de HMW relacionado com produto e HCP, bem como resultados de recuperação de produto destes experimentos são apresentados em Figura 12.

Está claro dos dados apresentados em Figura 12 que o desempenho da etapa cHA melhora significativamente com respeito à redução de HCP e HMW à medida que movemos das condições de fluxo transpassante para as condições de partição fraca, enquanto que a recuperação de produto é mantida em > 80%. Operação sob condições correspondendo a um aumento adicional no coeficiente de partição (i.e., operação na região de ligação) não proporciona benefício adicional com respeito à remoção de contaminantes. Contudo, a recuperação de produto por intermédio da etapa começa a cair sob condições de ligação forte. Assim, a janela de operação ótima para esta separação corresponde àquela da cromatografia de partição fraca. Sob estas condições, uma redução de 4 vezes relacionada à espécie HMW e log de

redução de HCP 1,4 foram obtidos em um desafio de carregamento de 110 mg de produto/mL de resina. Os níveis de produto ligados sob condições de partição fraca, neste exemplo, estiveram entre 1,6 e 6,7 mg/mL de resina. Sumário

Um segundo exemplo foi apresentado em hidroxiapatita onde foi mostrado que operação sob cromatografia de partição fraca proporciona desempenho melhorado com respeito à redução de HCP e HMW e à recuperação de produto (> 80%). Como nos exemplos anteriores, o desempenho da etapa foi otimizado primariamente por intermédio da escolha de coeficientes de partição usados para correr a coluna. A abordagem aqui apresentada proporciona um meio simples de relacionar o impacto de mudança de qualquer uma das variáveis ((pH, sal fosfato, imidazol, glicina, HEPES, etc.,) no desempenho da coluna. As condições de partição fraca para desempenho ótimo podem ser facilmente identificadas usando métodos HTS descritos neste exemplo. A abordagem aqui apresentada abre a possibilidade de operar em um espaço de operação mais amplo neste modo de cromatografia do que antes tem sido feito. A região WP ótima neste exemplo corresponde aos coeficientes de partição entre 2 e 20.

Série 7 — Hidroxiapatita usando hidroxiapatita cerâmica de tipo I e

Mab-MYO

Experimento 7.1— Triagem de taxa de transferência alta para estabelecer condições de FT, de WP e de ligação forte

Uma triagem de taxa de transferência alta (HTS) foi realizada para identificar condições de fluxo transpassante, de partição fraca e de ligação para Mab-MYO com meio de hidroxiapatita cerâmica. Esta triagem variou o pH, e a concentração de arginina/glicina, HEPES, fosfato de sódio e cloreto de sódio para determinar seu efeito sobre a extensão de ligação de MAB-MYO no meio de hidroxiapatita.

Os procedimentos de HTS usados neste exemplo foram

similares àqueles descritos nas Serie 5 e Série 6 e não são discutidos aqui. Valores de Kp preditos derivados de uin ajuste de superfície de resposta aos dados de HTS foram usados para escolher condições específicas para experimentos em coluna.

Experimento 7.2 — Corridas em coluna sob condições de WP

Os experimentos aqui discutidos foram realizados sob condições correspondendo a uma faixa de coeficientes de partição identificados pelos experimentos de HTS. Estes experimentos foram especificamente realizados para realçarem o desempenho superior da etapa cHA sob condições de partição fraca para a remoção de HCP e de espécies HMW relacionadas com produto. Quatro corridas foram conduzidas com um desafio de carregamento de produto de 55 mg/mL de resina. O desafio de carregamento usado nestes experimentos é baixo para cromatografia de partição fraca, mas é típico para a operação de fluxo transpassante. Não foi feita tentativa nestes experimentos para otimizar o desafio de carregamento para cromatografia de partição fraca.

As reuniões de anticorpo pareialmente purificado da etapa de Proteína A foram usadas nestes experimentos. O diâmetro de coluna foi 0,5 cm e a altura de coluna foi 10 cm.

Para todas as etapas de cromatografia de hidroxiapatita descritas na série 7 de Experimentos, as seguintes condições foram usadas (exceções são anotadas nas descrições experimentais individuais).

Vazão de operação 50 - 240 cm/h.

Equilíbrio 1 fosfato de sódio 300 mM, NaCl l,0M, pH 6,8 (2-5 volumes de coluna).

Equilíbrio 2 fosfato de sódio 1-8 mM, NaCl 501.750 mM, Arg 12-50 mM, HEPES 20-50 mM pH 7,0 (5 volumes de coluna).

Lavagem Mesma como Equilíbrio 2

A coluna foi equilibrada com 2-5 volumes de coluna de ·9·τ tampão de equilíbrio 1 seguido por 5 volumes de coluna de equilíbrio 2. A coluna foi então carregada para 55 mg produto/ml de resina com o pico de Proteína A (ajustado para o tampão de equilíbrio 2 apropriado), c o produto foi recuperado no efluente da coluna durante o ciclo de carregamento e em alguns volumes de fração de lavagem. Os resultados destes experimentos são apresentados em Tabela 7.2.1 e Figura 13.

Tabela 7.2.1: Coeficientes de partição para Mab-MYO sobre resina de cHA e o modo de operação correspondente

	Coeficiente de partição Kp	Modo de operação	Arg mM	Hepes mM	Fosfato mM	NaCl mM	Produto ligado mg/ml
Corrida 1	3.6	Partição fraca	50	20	8	300	5,1
Corrida 2	4.2	Partição fraca	50	20	2	600	8,2
Corrida 3	8,9*	Partição fraca	12	20	I	1750	9,5
Corrida 4	>100	Ligação forte	50	50	5	50	41,6

* Condição de Kp ótimo, veja Figura 1

As condições de operação nestes experimentos correspondem às regiões de fluxo transpassante, de partição fraca (WP) e de ligação. O experimento de HTS descrito em Experimento 7.1 proporciona estimativa para o valor do coeficiente de partição (Kp) sob estas condições de pH, de concentração de cloreto, de fosfato, de glicina / arginina e HEPES. As corridas em Tabela 7.2.1 são classificadas pelos coeficientes de partição. O produto ligado foi determinado pela medição da proteína na extração de coluna usando absorbância em UV. Este método de determinação de produto ligado tipicamente subestima a quantidade de produto ligado durante o carregamento devido à dessorção gradual do produto durante a lavagem.

Também são apresentados na Figura 13 os resultados de remoção de Peso Molecular Alto (HMW) relacionado com produto e de recuperação de produto.

É evidente dos dados apresentados em Figura 13 que o desempenho da etapa de cHA melhora significativamente com respeito à redução de HMW à medida que movemos das condições de fluxo transpassante para as condições de partição fraca, enquanto que a recuperação

de produto é ^80%. Operação sob condições correspondendo a um aumento adicional em coeficiente de partição (i.e.. operação na região de ligação) não proporciona benefício adicional com respeito à remoção de contaminantes.

Contudo, a recuperação de produto por intermédio da etapa 5 começa a cair sob condições de ligação forte. Assim, a janela de operação ótima para esta separação correspondem àquela da cromatografia de partição fraca. Sob estas condições, foi obtida uma redução de 20 vezes das espécies HMW relacionadas com produto. Os níveis de produto ligados sob as condições de partição fraca, neste exemplo, estiveram entre 5,1 e 9,5 mg/mL de resina.

Sumário

Um segundo exemplo foi apresentado em hidroxiapatita onde foi mostrado que operação sob cromatografia de partição fraca proporciona desempenho melhorado com respeito à redução de HMW com boa recuperação de produto (> 80%). Espécies HMW relacionadas com produto e espécies HMW se ligam mais fortemente na resina cerâmica do que o anticorpo produto, e são retidas mais fortemente sob condições de WP. A região de WP neste exemplo corresponde aos coeficientes de partição entre 8 e 20.

Mais uma vez foi mostrado de novo que o desempenho da etapa de coluna pode ser otimizado primariamente por intermédio da escolha de coeficientes de partição usados para correr a coluna. A abordagem aqui apresentada proporciona um meio simples de relacionar o impacto da mudança de qualquer uma das várias variáveis (pH, sal, fosfato, arginina,

HEPES etc.,) no desempenho da coluna. As condições de partição fraca para desempenho ótimo podem ser facilmente identificadas usando métodos HTS descritos neste exemplo. A abordagem aqui apresentada abre a possibilidade de operar em um espaço de operação mais amplo neste modo de cromatografia do que antes tem sido feito.

Π

Também é aqui digno de nota que o conceito de cromatografia de partição fraca também funciona em sistemas que não são conduzidos apenas por interações de carga. A abordagem geral descrita neste pedido pode ser aplicada com sucesso em sistemas complexos tais como HIC e também hidroxiapatita. Por exemplo, em adição ao pH de operação ótimo, várias outras variáveis tais como sais NaCl, fosfato, arginina / glicina. espécies tampão, bem como o tipo de resina podem todas influenciar no desempenho da etapa em hidroxiapatita. Contudo, poder-se-ia facilmente identificar a janela de WP pela realização de experimentos de ligação em batelada simples com apenas o produto de interesse.

Série 8 — Tampão zwitteriônico para eluição de Proteína A e subsequentes etapas de troca iônica

Uma cultura contendo um anticorpo monoclonal foi purificada usando a resina Mabselect. Uma coluna Mabselect Protein A foi equilibrada com 5 volumes de coluna of Tris 50 mM / NaCl 150 mM, pH 7,5. A coluna foi então carregada em um carregamento de aproximadamente 40 mg de produto/mL de resina. Isto foi seguido por uma lavagem de 5CV em NaCl 1 M, Tris 50mM, pH 7,5 e uma lavagem de 5CV contendo Tris 10 mM, NaCl 75 mM, pH 7,5. A coluna foi então eluída usando HEPES 30m M, pH 3,1. A reunião de produto foi neutralizada para pH 7,2 usando HEPES 1 M pH 8,0, resultando em uma concentração de HEPES total de 55 mM. Em pH 7,2, o HEPES contribui com força iônica de 17 mM para o tampão.

Todas as referências aqui citadas são aqui incorporadas em suas totalidades e para todos os propósitos na mesma extensão se cada pedido de patente ou patente ou publicação individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado como referência em sua totalidade para todos os propósitos. A extensão na qual as publicações e patentes ou pedidos de patente incorporados como referência contradizem a descrição contida neste relatório descritivo, o relatório descritivo é intencionado para substituir e/ou preceder qualquer tal material contraditório.

Todos os números expressando quantidades de ingredientes, condições de reação, e assim por diante usados no relatório descritivo e nas reivindicações são para serem entendidos como estando modificados em todas as situações pelo termo ^k‘cerca de”. Conseqüentemente, a não ser que seja indicado ao contrário, os parâmetros numéricos descritos no relatório descritivo e nas reivindicações anexadas são aproximações que podem variar dependendo das propriedades desejadas almejadas para serem obtidas pela presente invenção. Pelo menos, e não como uma tentativa para limitar o pedido da doutrina de equivalentes ao escopo das reivindicações, cada parâmetro numérico deve ser entendido à luz do número de dígitos significativos e de abordagens de arredondamento ordinárias.

Muitas modificações e variações desta invenção podem ser feitas sem se desviarem do espírito e do escopo, como serão evidentes para aquelas pessoas experientes na técnica. As modalidades específicas aqui descritas são oferecidas apenas por meio de exemplo e em nenhum modo significam que são limitantes. E intencionado que o relatório descritivo e os exemplos sejam considerados apenas exemplares, com um escopo e um espírito verdadeiros da invenção sendo indicados pelas seguintes reivindicações.

Claims (15)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Método de recuperar um produto purificado de um fluido de carregamento incluindo uma ou mais impurezas, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:

   5 passar o fluido de carregamento através de um meio em condições operacionais que fazem com que o meio ligue pelo menos 1 a 70 mg de produto por ml de meio e definido por um coeficiente de partição de 0,3 a 20; e recuperar o produto purificado no efluente da coluna durante o

   10 ciclo de carregamento e qualquer lavagem essencialmente isocrática.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as condições operacionais são identificadas, em uma etapa de triagem.
3. 3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado 15 pelo fato de que as condições operacionais fazem com que o meio ligue pelo menos 5 mg de produto por mL de meio, pelo menos 10 mg de produto por mL de meio, pelo menos 20 mg de produto por mL de meio, pelo menos 30 mg de produto por mL de meio, pelo menos 40 mg de produto por mL de meio, pelo menos 50 mg de produto por mL de meio, pelo menos 60 mg de

   20 produto por mL de meio.
4. 4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o valor do coeficiente de partição está dentro da faixa de cerca de 0,5 a 5,0, 1,0 a 5,0 ou 0,5 a 1,5.
5. 5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   25 4, caracterizado pelo fato de que o produto purificado é uma proteína selecionada do grupo consistindo de proteínas de fusão, proteínas contendo Fc, imunoconjugados, citocinas, interleucinas, hormônios, e enzimas terapêuticas.

   Petição 870170084984, de 06/11/2017, pág. 17/21
6. 6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   5, caracterizado pelo fato de que o produto purificado é um anticorpo.
7. 7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

   6, caracterizado pelo fato de que o meio compreende um meio de troca iônica

   5 carregado, resina de cromatografia de interação hidrofóbica, uma resina de hidroxiapatita, ou uma resina de cromatografia de afinidade de metal imobilizado.
8. 8. Método de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o meio de troca iônica carregado é uma resina de troca aniônica

   10 ou uma resina de troca catiônica.
9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que uma ou mais impurezas são selecionadas do grupo consistindo de proteínas de célula hospedeira, ácidos nucleicos, variantes de produto, endotoxinas, Proteína A, e vírus.

   15 10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que um fluido contendo produto é eluído de uma coluna de Proteína A usando um tampão de eluição de baixa força iônica; o pH e a condutividade do fluido contendo produto são ajustados usando um tampão de neutralização que resulta em não mais do que 20 mM

   20 da força iônica do fluido contendo produto, resultando no fluido de carregamento, e em que tal fluido de carregamento é passado através de um meio de troca iônica

   11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição compreende moléculas com um grupo

   25 aniônico carregado com um pKa de 2 a 5.

   12. Método de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição adicionalmente compreende moléculas

   Petição 870170084984, de 06/11/2017, pág. 18/21 com um grupo catiônico carregado com um pKa de 6,5 a 10.

   13. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o tampão de eluição compreende uma molécula que é um zuiterion em pH 4 a 9.

   5 14. Método de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o zuiterion é selecionado do grupo consistindo de glicina;

   1,4-piperazina-bis-(ácido etano-sul fônico); glicil-glicina; ácido ciclopentanotetra-1,2,3 ,4-carboxílico ; ácido N,N-bis(2-hidróxi-etil)-2-aminoetanosulfônico; ácido 2-(N-morfolino)-propano-sulfônico; ácido N10 tris(hidróximetil)-metil-2-arnino-etano-sul fônico; ácido N-2-hidróxi-etilpiperazina-N'-2-etano-sulfônico; ácido 4-(2-hidróxi-etil)-piperazina-propanosulfônico; Ntris(hidróxi-metil)-metil-glicina; glicinamida; N,N-bis(2-hidróxietil)-glicina; ácido N-tris(hidróxi-metil)-metil-2-amino-propano-sulfônico; e N-glicilglicina.

   15 15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o zuiterion é glicina.

   16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que o produto é carregado sobre o meio em uma concentração de pelo menos 100 mg de produto por ml de meio, pelo

   20 menos 500 mg de produto por ml de meio ou pelo menos 1.000 mg de produto por ml de meio.

   17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a concentração de produto no fluido de carregamento é pelo menos 1 mg de produto por ml de fluido de

   25 carregamento, pelo menos 5 mg de produto por ml de fluido de carregamento, pelo menos 10 mg de produto por ml de fluido de carregamento, pelo menos 50 mg de produto por ml de fluido de carregamento ou pelo menos 100 mg de

   Petição 870170084984, de 06/11/2017, pág. 19/21 produto por ml de fluido de carregamento.

   Petição 870170084984, de 06/11/2017, pág. 20/21

   1/15

   FIGURA 1

   A

   Q (mg/mL)

   C (mg/mL)

   2/15

   Concentração de carregamento 3- 100 mg/mL

   3/15

   FIGURA 2

   O) o

   u

   Log NaCI

   Ligação/Eluição / (Kp>20) y

   Região de partição fraca

   Fluxo-através (Kp<0.1) (0.1<Kp<20)

   Μ

   4/15

   Fosfato pH 7

   2B e

   100 200 400 600 1000

   NaCl

   Λ’5

   5/15

   FIGURA 3 * Ligação-Eluição (L-E) * alto Kpmrf * > Limite de capacidade: massa de produto sobre resina (não volume carregado) * Mudança de fase móvel para eluição de produto • Fluxo-através (F-A) ► Kprodvto muito baixo . Limite de capacidade: aparecimento de impureza e volume ► Isocràtico * Cromatografia com aparecimento rápido, lavagem • Partição fraca (P-F) > Kproduto intermediário

   Capacidade melhorada sobre modo FT (ambos volume carregados) > Isocràtico > Aparecimento retardado, iavagem lenta ^arregamen|o^ Lavagem

   Tempo ou volume

   6/15

   FIGURA 4 ///

   7 <

   7/15

   FIGURA 5

   8/15

   FIGURA 6

   1. HTS para determinar Kp Medir LRV e seletividade, se possível

   2. Corridas de desafio baixo Sobrepor cromatogramas Tabela de recuperações, LRVs Estabelecer faixa útil de Kp tdni

   74/39

   74/45 fuvao &2T1S er sa

   0.01

   049

   0,4

   Impureza (ppm) rmediário

   Kp alto

   3. Corridas de capacidade de desafio alto

   Plotar capacidade em níveis de impurezas aceitáveis versus Kp

   Desafio (mg/mL de resina)

   Kp

   4. Corrida WPC ótima Capacidade alta, LRV bom, recuperação boa

   Extração

   Carregamento

   Lavagem

   SC

   FT

   9/15

   FIGURA 7

   7.5 1 I I I I I I I I I I .91.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0

   LogfCI]
10. 10/15

    FIGURA 8 ffü

    Kp
11. 11/15

    FIGURA 9

    9.0

    7.1

    7.

    8.5 ρΗβ.0

    Legenda togK «<=-0.500 «<=0.000 ^<=0.500

    1.000 «>1.000 .8 1.0 1.3 1.5 1.8 2.0 2.3 2.5
12. 12/15 'η

    FIGURA 10

    Perfis de aparecimento de HCP sob condições de Kp variado

    Aumento de Kp (condições FT para WP) aumenta LRV de HCP ♦ K = 0.1 A K = 0.8 •K = 2.73 ♦ K = 7

    250 500

    750 1000

    1250 1500

    Desafio de carregamento (mg/ml) β Perfis de aparecimento de Proteína A sob condições de Kp variadas
13. 13/15

    FIGURA 11

    Janela de operação ótima para WPC
14. 14/15

    FIGURA 12

    Janela de operação ótima de a5T4 para WRC

    Recuperação <%)
15. 15/15

    FIGURA 13

    Condições de operação ótima o

    •a o

    A

    Φ α

    O

    0) q: