CN110646558A - 检测血液中艾司西酞普兰的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的检测血液中艾司西酞普兰的方法包括：制备艾司西酞普兰标准储备液、制备艾司西酞普兰的标准中间液、制备内标工作液、制备标准溶液和利用液相色谱‑质谱联用仪检测标准溶液，拟合得到艾司西酞普兰对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b；对待测血液进行处理，利用液相色谱‑质谱联用仪检测对待测血液，计算出待测血液中的艾司西酞普兰浓度。在本发明中，对待测血液样品的处理方法以及内标物的选择，使得艾司西酞普兰的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、灵敏度高，同时，回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。

Description

检测血液中艾司西酞普兰的方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及一种检测血液中艾司西酞普兰的方法。
背景技术
艾司西酞普兰为外消旋西酞普兰的左旋对映体，属选择性5-羟色胺再摄取抑制剂，其作用机制是增进中枢神经系统5-羟色胺(5-HT)能的作用，抑制5-HT的再摄取。临床上广泛用于重症抑郁症(MDD)和广泛性焦虑的治疗，故对艾司西酞普兰的监测具有重要的临床意义。
目前，检测服用艾司西酞普兰的患者的血液样本时，通常采用高效液相色谱法进行测试。但是，通过上述方法检测血液样本中的艾司西酞普兰含量时，需要对血液样本进行前处理，例如，萃取。由于萃取处理的时间通常较长，从而使得检测时间长，导致血液样本的检测效率低。
发明内容
本申请的发明目的是提供了一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，能够提高血液样本的检测效率。
为了完成本申请的发明目的，本申请采用以下技术方案：
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，其中：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)制备艾司西酞普兰标准储备液
精确称取艾司西酞普兰标准品10mg置于10mL容量瓶，用含水量为0％-40％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10mL，得到艾司西酞普兰标准储备液，在-80℃条件下保存；
(b)制备艾司西酞普兰的标准中间液
用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述艾司西酞普兰标准储备液，制成含有浓度为25ng/mL-1500ng/mL的艾司西酞普兰的至少三种艾司西酞普兰的标准中间液，并在-80℃条件下保存；
(c)制备内标工作液
用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释1mg/mL的艾司西酞普兰-d6储备液，得到一种含有100～400ng/mL艾司西酞普兰-d6的内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(d)制备标准溶液
分别移取10μL上述至少三种浓度的艾司西酞普兰标准中间液，在上述每一种艾司西酞普兰标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和390μL含水量为10％～80％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；
(e)拟合标准曲线方程
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到艾司西酞普兰的色谱峰峰面积和艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的艾司西酞普兰的色谱峰峰面积与艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的艾司西酞普兰的浓度与艾司西酞普兰-d6的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到艾司西酞普兰对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，并且得到权重系数a和b；
(二)待测血液样本的处理
取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
移取步骤(c)的艾司西酞普兰-d6的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后再在上述离心管中加入上述待测血液上清液体积的1～3倍沉淀蛋白试剂乙腈，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合3min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液即为待测血液样本；
(三)待测血液样本的检测
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的艾司西酞普兰的色谱峰峰面积和艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的艾司西酞普兰的色谱峰峰面积与艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积的比值作为y1，代入步骤(e)得到的y1＝a*x1+b公式中，计算得到待测血液样本中的艾司西酞普兰的浓度与艾司西酞普兰-d6的浓度的比值x1，由于上述待测血液样本中，艾司西酞普兰-d6的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的艾司西酞普兰浓度。
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，其中：在步骤(b)中，制备七种含有不同浓度艾司西酞普兰的标准中间液，它们分别是含有25、50、100、250、500、1000、1500ng/mL艾司西酞普兰浓度的标准中间液。
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，其中：在步骤(b)和步骤(d)中，所述甲醇稀释液为含水量30％甲醇溶液，在步骤(a)中，用纯甲醇溶解艾司西酞普兰标准品。
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，其中：在步骤(二)中，所加入的沉淀蛋白试剂乙腈为上述待测血液的上清液体积的3倍。
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，其中：在步骤(c)中，用含水量为30％甲醇稀释液稀释艾司西酞普兰-d6储备液，得到一种含有300ng/mL艾司西酞普兰-d6的内标工作液。
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C8反向色谱柱；柱温为20～40℃；流动相为：含10mM乙酸铵的水溶液和甲醇溶液，上述乙酸铵的水溶液与甲醇溶液的体积比为4∶6，上述乙酸铵的水溶液与上述甲醇溶液的等度洗脱时间不小于2.0min；流动相的流速为0.2～0.8mL/min。
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为3000～4000V。
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，其中：所述C8反向色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C8。
本发明的一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，其中：所述液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。
本发明具有如下有益效果：
1、在本发明中，利用液相色谱-质谱联用仪分别检测至少三种浓度的标准溶液，其中，标准溶液为具有内标物的艾司西酞普兰的标准溶液，且至少三种浓度标准溶液中内标物浓度一致；根据至少三种浓度标准溶液的检测结果，分别拟合艾司西酞普兰的标准曲线方程；对待检测血液进行高速离心处理，并向离心后的上清液中加入与标准溶液中相同量的内标物工作液，在高转速下涡旋振荡混合，再加入沉淀蛋白试剂，并再次进行高速涡旋振荡混合以及高速离心处理，以使溶液混合均匀获得去除干扰物后的上清液。利用液相色谱-质谱联用仪检测该上清液，基于艾司西酞普兰的第一检测结果和艾司西酞普兰的标准曲线方程，得到待测血液样本中艾司西酞普兰的浓度，实现了检测血液中的艾司西酞普兰，有效地缩短了检测时间。
2、在本发明中，对待测血液样品的处理方法以及内标物的选择，使得艾司西酞普兰的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、灵敏度高，同时，回收率，检测限和精密度等各项技术指标均符合要求，同时，该检测血液中艾司西酞普兰的方法，重现性良好，且加样回收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明艾司西酞普兰ESC的化学结构式；
图2是本发明的标准溶液中艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的色谱图；
图3是本发明的标准溶液中艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的质谱图；
图4是本发明的待测血液样本中的艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的色谱图；
图5是本发明的待测血液样本中的艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的质谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明的检测血液中艾司西酞普兰的方法包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)制备艾司西酞普兰标准储备液
精确称取艾司西酞普兰标准品10mg置于10mL容量瓶，用纯甲醇溶液进行溶解，并定容于10mL，得到艾司西酞普兰标准储备液，在-80℃条件下保存；
(b)制备艾司西酞普兰的标准中间液
用含水量为30％甲醇稀释液稀释上述艾司西酞普兰标准储备液，制成含有浓度为25ng/mL-1500ng/mL的艾司西酞普兰的七种艾司西酞普兰的标准中间液，在七种艾司西酞普兰的标准中间液中，分别含有25、50、100、250、500、1000、1500ng/mL艾司西酞普兰浓度，并在-80℃条件下保存；
(c)制备内标工作液
用含水量为30％甲醇稀释液稀释艾司西酞普兰-d6储备液，得到一种含有300ng/mL艾司西酞普兰-d6的内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(d)制备标准溶液
分别移取10μL上述七种浓度的艾司西酞普兰标准中间液，在上述每一种艾司西酞普兰标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和390μL含水量为30％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成七种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；
(e)拟合标准曲线方程
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到七种不同浓度的标准溶液的艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到艾司西酞普兰的色谱峰峰面积和艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积，分别以上述七种不同浓度的标准溶液中的艾司西酞普兰的色谱峰峰面积与艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上上述七种不同浓度的标准溶液中的艾司西酞普兰的浓度与艾司西酞普兰-d6的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，将上述检测所得的七种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到艾司西酞普兰对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，并且得到权重系数a和b；
(二)待测血液样本的处理
取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
移取步骤(c)的艾司西酞普兰-d6的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后再在上述离心管中加入上述待测血液上清液体积的3倍沉淀蛋白试剂乙腈，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合3min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液即为待测血液样本；
(三)待测血液样本的检测
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的艾司西酞普兰的色谱峰峰面积和艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的艾司西酞普兰的色谱峰峰面积与艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积的比值作为y1，代入步骤(e)得到的y1＝a*x1+b公式中，计算得到待测血液样本中的艾司西酞普兰的浓度与艾司西酞普兰-d6的浓度的比值x1，由于上述待测血液样本中，艾司西酞普兰-d6的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的艾司西酞普兰浓度。
所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C8反向色谱柱，例如：AgilentZorbax XDB-C8；柱温为20～40℃；流动相为：含10mM乙酸铵的水溶液和甲醇溶液，上述乙酸铵的水溶液与甲醇溶液的体积比为4∶6，上述乙酸铵的水溶液与上述甲醇溶液的等度洗脱时间不小于2.0min；流动相的流速为0.2～0.8mL/min。
所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数包括：气流量为12L/min，喷雾量为30L/min，气体温度为350℃，毛细管电压为3500V。
上面已知体积待测血液样本的处理方式也会影响最终的检测结果，本发明实施例通过向待测血液样本中加入与所述标准溶液中相同量的内标物和沉淀蛋白试剂，并进行高速离心处理，取离心处理后的上清液，能够最大程度的保留待测血液样本中的艾司西酞普兰，同时去除干扰物，由于离心处理的时间短，因此可以缩短血液样本前处理的时间，进而缩短检测时长，提高血液样本的检测效率。
可以理解的是，进样量可以是0.1μL到30μL范围内的任一体积，比如，0.1μL，0.2μL，0.5μL，1μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL以及30μL。
针对柱温来说，20～40℃是指在20℃到40℃的任一温度，比如，20℃，21℃，22.5℃，23℃，24℃，25℃，27.5℃，29℃，30.5℃，33℃，34℃，35℃，37℃，38.5℃，39℃以及40℃等，在该范围内任一温度下，检测出来的结果大体一致。
针对气流量来说，8～50L/min是指在8L/min到50L/min的任一流速，比如，8L/min，8.5L/min，9L/min，11L/min，14L/min，19L/min，24L/min，28.5L/min，35L/min，38.5L/min，42L/min，44L/min，47.5L/min，49L/min以及50L/min等。
针对喷雾量来说，20～50L/min是指在20L/min到50L/min的任一流速，比如，20L/min，22.5L/min，26L/min，30L/min，32L/min，35.5L/min，36L/min，40L/min，43L/min，46.5L/min以及50L/min等。
针对气体温度来说，300～400℃是指300℃到400℃的任一温度，比如，300℃，320℃，350℃，380℃以及400℃等。
针对毛细管电压来说，3000～4000V是指3000V到4000V的任一电压，比如，3000V，3100V，3300V，3500V，3900V以及4000V等。
进一步地，液相色谱-质谱联用仪的质谱参数可进一步如下表1所示：
表1
物质名称 母离子 子离子 Dwell Fragmcntor CE CAV
艾司西酞普兰 325.2 262.1 200 125 18 7
艾司西酞普兰 325.2 109.0 200 125 26 7
艾司西酞普兰-d6 331.2 262.1 200 125 18 7
上述表中，Dwell表征扫描时间，Fragmentor表征裂解电压，CE表征碰撞电压，CAV表征碰撞池加速电压。艾司西酞普兰325.2-262.1离子对作为定量使用，325.2-109.0离子对作为定性使用。
一般来说，混合标准溶液的配制方式将直接影响检测的准确性，本发明实施例所选用的标准溶液的制备方式能够保证检测结果的准确性。
上述实施例中的一种浓度的标准溶液中艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的色谱图如图2所示，质谱图如图3所示。其中，图2中的数字标识1从上到下依次为标准溶液中艾司西酞普兰定性离子对325.2-109.0和定量离子对325.2-262.1的色谱图，数字标识2为标准溶液中艾司西酞普兰-d6的色谱图；图3中的数字标识1从上到下依次为标准溶液中艾司西酞普兰定性离子对325.2-109.0和定量离子对325.2-262.1的质谱图，数字标识2为标准溶液中艾司西酞普兰-d6的质谱图。标准溶液中的艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的保留时间分别为1.093min、1.070min。
进一步地，液相色谱-质谱联用仪所使用的在线过滤器为：SI COL PRE-FILTERWATER 1/16 0.5M。
上述实施例中的待测血液样本中的艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的色谱图如图4所示，质谱图如图5所示；图4中的数字标识1从上到下依次为待测血液样本中艾司西酞普兰定性离子对325.2-109.0和定量离子对325.2-262.1的色谱图，数字标识2为待测血液样本中艾司西酞普兰-d6的色谱图；图5中的数字标识1从上到下依次为待测血液样本中艾司西酞普兰定性离子对325.2-109.0和定量离子对325.2-262.1的质谱图，数字标识2为待测血液样本中艾司西酞普兰-d6的质谱图。待测血液样本中的艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的保留时间分别为1.095min、1.060min。
由图2、图3、图4和图5对比可见，待测血液样本中的艾司西酞普兰的保留时间与标注溶液中的艾司西酞普兰的保留时间已知，以艾司西酞普兰-d6为内标物，使得艾司西酞普兰的识别更为准确，分析时间短、干扰小，内标定量适宜特异性强、准确度和灵敏度高。
为了证明本申请溶液中含有一定浓度艾司西酞普兰所存在的线性关系，特作以下实验：将上述配制的各个浓度的艾司西酞普兰的标准工作液，加入10μL内标工作液，并加入乙腈300μL混匀进样，按实施例2的处理及检测条件进行检测，以定量离子色谱峰峰面积与浓度作图，得到标准曲线，结果表明艾司西酞普兰的线性范围和定量限如下：
艾司西酞普兰
(1)检测线(LOD)：0.033ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：0.1ng/mL。
(3)线性范围：25ng/L到1500ng/L范围内，线性良好，相关系数R2＞0.998。
分别取含艾司西酞普兰的标准中间液配制成高、中、低3种浓度进行加样回收率实验和精密度实验，在相同检测条件进行检测，重复分析测定3批次，艾司西酞普兰的回收率和精密度如下表2所示：
表2
加标量 5ng/mL 25ng/mL 100ng/mL
平均回收率 100.4％ 100.12％ 102.71％
精密度RSD 2.92％ 1.39％ 1.99％
由表2可知，艾司西酞普兰在低、中、高的3个添加水平范围内的平均回收率为100.12％～102.71％，相对标准偏差为1.39％～2.92％。
综合上述验证试验，本实施例的检测限、回收率和精密度等各项技术指标均符合要求，方法检测血液中艾司西酞普兰浓度，重现性良好，加样回收率高，提高了检测结果的准确度。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种检测血液中艾司西酞普兰的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(一)标准溶液的标定
(a)制备艾司西酞普兰标准储备液
精确称取艾司西酞普兰标准品10mg置于10mL容量瓶，用含水量为0％-40％的甲醇溶液进行溶解，并定容于10mL，得到艾司西酞普兰标准储备液，在-80℃条件下保存；
(b)制备艾司西酞普兰的标准中间液
用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释上述艾司西酞普兰标准储备液，制成含有浓度为25ng/mL-1500ng/mL的艾司西酞普兰的至少三种艾司西酞普兰的标准中间液，并在-80℃条件下保存；
(c)制备内标工作液
用含水量为10％～80％甲醇稀释液稀释1mg/mL的艾司西酞普兰-d6储备液，得到一种含有100～400ng/mL艾司西酞普兰-d6的内标工作液，并在-80℃条件下保存；
(d)制备标准溶液
分别移取10μL上述至少三种浓度的艾司西酞普兰标准中间液，在上述每一种艾司西酞普兰标准中间液中分别加入10μL的内标工作液和390μL含水量为10％～80％甲醇稀释液，并在转速为1000～2000rpm下涡旋混匀30s～1min，制成至少三种不同浓度的标准溶液，其中，每一种浓度的标准溶液中包含的内标物的浓度相同；
(e)拟合标准曲线方程
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述每一种浓度的标准溶液，得到至少三种不同浓度的标准溶液的艾司西酞普兰和艾司西酞普兰-d6的图谱；从上述每种浓度的标准溶液的图谱中分别得到艾司西酞普兰的色谱峰峰面积和艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积，分别以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的艾司西酞普兰的色谱峰峰面积与艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y1，以上述至少三种不同浓度的标准溶液中的艾司西酞普兰的浓度与艾司西酞普兰-d6的浓度的比值作为标准曲线的横坐标x1，将上述检测所得的至少三种不同浓度的数据进行线性回归，拟合得到艾司西酞普兰对应的标准曲线方程为：y1＝a*x1+b，并且得到权重系数a和b；
(二)待测血液样本的处理
取待测血液至少2mL，在离心速度3500rpm下离心10min，提取待测血液的上清液，并在-20℃条件下保存；
移取步骤(c)的艾司西酞普兰-d6的内标工作液10μL于1.5mL离心管中，再加入上述待测血液的上清液100μL，在1500rpm的转速下涡旋震荡混合30s，然后再在上述离心管中加入上述待测血液上清液体积的1～3倍沉淀蛋白试剂乙腈，在2000rpm的转速下涡旋震荡混合3min后，再在12000rpm的转速下高速离心10min，得到上清液即为待测血液样本；
(三)待测血液样本的检测
利用液相色谱-质谱联用仪检测上述待测血液样本，得到待测血液样本中的艾司西酞普兰的色谱峰峰面积和艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积；将待测血液样本中的艾司西酞普兰的色谱峰峰面积与艾司西酞普兰-d6的色谱峰峰面积的比值作为y1，代入步骤(e)得到的y1＝a*x1+b公式中，计算得到待测血液样本中的艾司西酞普兰的浓度与艾司西酞普兰-d6的浓度的比值x1，由于上述待测血液样本中艾司西酞普兰-d6的浓度为已知，由此计算出待测血液样本中的艾司西酞普兰浓度。
2.如权利要求1所述的检测血液中艾司西酞普兰的方法，其特征在于：在步骤(b)中，制备七种含有不同浓度艾司西酞普兰的标准中间液，它们分别是含有25、50、100、250、500、1000、1500ng/mL艾司西酞普兰浓度的标准中间液。
3.根据权利要求2所述的检测血液中艾司西酞普兰的方法，其特征在于：在步骤(b)和步骤(d)中，所述甲醇稀释液为含水量30％甲醇溶液，在步骤(a)中，用纯甲醇溶解艾司西酞普兰标准品。
4.根据权利要求3所述的检测血液中艾司西酞普兰的方法，其特征在于：在步骤(二)中，所加入的沉淀蛋白试剂乙腈的体积为上述待测血液的上清液体积的3倍。
5.根据权利要求4所述的检测血液中艾司西酞普兰的方法，其特征在于：在步骤(c)中，用含水量为30％甲醇稀释液稀释艾司西酞普兰-d6储备液，得到一种含有300ng/mL艾司西酞普兰-d6的内标工作液。
6.根据权利要求5所述的检测血液中艾司西酞普兰的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱联用仪的色谱条件包括：C8反向色谱柱；柱温为20～40℃；流动相为：含10mM乙酸铵的水溶液和甲醇溶液，上述乙酸铵的水溶液与甲醇溶液的体积比为4∶6，上述乙酸铵的水溶液与上述甲醇溶液的等度洗脱时间不小于2.0min；流动相的流速为0.2～0.8mL/min。
7.根据权利要求6所述的检测血液中艾司西酞普兰的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱联用仪的质谱条件包括：液相色谱-质谱联用仪的质谱检测器为ESI(+)模式；离子源参数包括：气流量为8～50L/min，喷雾量为20～50L/min，气体温度为300～400℃，毛细管电压为3000～4000V。
8.根据权利要求7所述的检测血液中艾司西酞普兰的方法，其特征在于：所述C8反向色谱柱为Agilent Zorbax XDB-C8。
9.根据权利要求8所述的检测血液中艾司西酞普兰的方法，其特征在于：所述液相色谱-质谱联用仪的在线过滤器为SSI COL PRE-FILTER WATER 1/16 0.5M。
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