CN111830179A - 5-磷酸吡哆醛的检测方法 - Google Patents

5-磷酸吡哆醛的检测方法 Download PDF

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CN111830179A CN202010723606.3A CN202010723606A CN111830179A CN 111830179 A CN111830179 A CN 111830179A CN 202010723606 A CN202010723606 A CN 202010723606A CN 111830179 A CN111830179 A CN 111830179A
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贾永娟
杨缓缓
倪君君
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Abstract

本发明提供了5‑磷酸吡哆醛的检测方法，包括：制备具有5‑磷酸吡哆醛和内标物的至少三种浓度的标准溶液，每种标准溶液中的内标物的量相同；利用液质联用仪分别检测每一种标准溶液获得对应的第一检测结果；根据第一检测结果、标准溶液中5‑磷酸吡哆醛和内标物的浓度拟合5‑磷酸吡哆醛的标准曲线方程；取待处理样品离心后的第一上清液；向第一上清液内加入沉淀蛋白试剂和含有内标物的内标工作液，涡旋混合，离心，取离心后的第二上清液作为待测样品；利用液质联用仪在检测条件下检测待测样品，获得待测样品的第二检测结果；基于标准曲线方程和第二检测结果，得到待测样品中5‑磷酸吡哆醛的浓度。本方案能够缩短样品检测时间。

Description

5-磷酸吡哆醛的检测方法
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，特别涉及5-磷酸吡哆醛的检测方法。
背景技术
5-磷酸吡哆醛是维生素B6的生物活性形式，在许多酶促反应中起辅助作 用。
目前，检测样品中5-磷酸吡哆醛含量通常采用的方法为高效液相色谱法。 而高效液相色谱法检测5-磷酸吡哆醛通常需要对待测样品进行较复杂的前处 理，耗费时间较多，从而导致样品检测时间较长。
发明内容
本发明提供了5-磷酸吡哆醛的检测方法，能够缩短样品检测时间。
为了解决上述问题，本发明实施例提供了5-磷酸吡哆醛的检测方法，包 括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有5-磷酸吡哆 醛和内标物的溶液，且所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获 得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中5-磷酸吡哆醛和内标物的 浓度，拟合5-磷酸吡哆醛的标准曲线方程；
对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
向所述第一上清液内加入沉淀蛋白试剂和含有内标物的内标工作液，涡 旋混合，并高速离心，取离心后的第二上清液作为待测样品；
利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样 品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中5-磷 酸吡哆醛的浓度。
需要说明的是，第一上清液为血清或血浆。
优选地，
所述检测条件，包括：
长度为150mm、内径为2.1mm以及填料粒径为5μm的色谱柱；
洗脱流动相为1mmol/L乙酸铵的水溶液和甲醇，其中，乙酸铵的水溶液 中含有体积比为0.01％-0.2％的甲酸；
柱温为20℃-45℃；
流速为0.25-0.65mL/min。
具体地，色谱柱包括Waters的Atlantis@T3色谱柱(2.1×150mm 5μm)。
针对乙酸铵水溶液中的甲酸来说，0.01％-0.2％是指0.01％到0.2％范围内 的任一值，比如，0.01％、0.05％、0.1％、0.15％以及0.2％。
针对柱温来说，20℃-45℃是指20℃到40℃范围内的任一值，比如，20℃、 25℃、30℃、35℃、40℃以及45℃。
针对流速来说，0.25-0.65mL/min是指0.25mL/min到0.65mL/min范围 内的任一值，比如，0.25mL/min、0.3mL/min、0.35mL/min、0.4mL/min、 0.45mL/min、0.5mL/min、0.55mL/min以及0.65mL/min。
优选地，
分了分离出目标物，所述洗脱流动相采用等度洗脱；
1mmol/L乙酸铵的水溶液与甲醇的体积比为：98:2。
优选地，
所述检测条件中的质谱条件包括：
采用大气压化学电离源ESI，正离子扫描模式，反应监测模式，加热气 流速：10L/min；加热气温度：350℃；雾化电压：30psi；毛细管电压4000psi； 电子倍增器上的电压(+)：300V。
优选地，
所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述第一检测结果中5-磷酸吡哆 醛的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中5-磷酸 吡哆醛的浓度与所述标准溶液中的内标物的浓度的比值。
可以理解的是，当第一检测结果中5-磷酸吡哆醛的色谱峰面积与内标物 的色谱峰面积的比值作为标准曲线方程的纵坐标y时，标准溶液中5-磷酸吡 哆醛的浓度与所述标准溶液中的内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横 坐标x。
若第一检测结果中5-磷酸吡哆醛的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的 比值作为标准曲线方程的横坐标x时，标准溶液中5-磷酸吡哆醛的浓度与所 述标准溶液中的内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的纵坐标y。
优选地，
所述沉淀蛋白试剂包括：4％-8％的三氯乙酸。
采用三氯乙酸作为沉淀蛋白试剂可以为5-磷酸吡哆醛提供酸性环境，使 得5-磷酸吡哆醛及其内标相对更稳定，防止降解。
该浓度的沉淀蛋白试剂不仅可以去除待处理样品中的蛋白等杂质，还可 以避免沉淀蛋白试剂浓度过高导致色谱柱损坏或引出更多杂质。
具体地，针对三氯乙酸的浓度来说，4％-8％是指4％到8％范围内的任一 值，比如，4％、5％、5.5％、6％、7％以及8％。
优选地，由于沉淀蛋白试剂与第一上清液的体积比低于1:1时，第一上 清液的用量较少，不便于操作人员移取。随着两者比例增加，内标处杂质与 待测物分离度变差，直到比例为1:4时基本能保证分离。沉淀蛋白试剂与第 一上清液的体积比包括：1:1-1:4，即，沉淀蛋白试剂与第一上清液的体积比 可以是1:1、1:2、1:3或者是1:4。
比如，当取50μl的第一上清液时，沉淀蛋白试剂的用量可以是50μl、100μl、 150μl或者是200μl。
优选地，
所述标准溶液中的稀释液包括：30％-70％甲醇的水溶液。
具体地，采用该浓度的甲醇水溶液可以在能够实现对标准品进行充分溶 解，同时还可以避免对标准溶液进行低温存储时结冰现象。
针对甲醇水溶液中甲醇的浓度来说，30％-70％是指30％到70％范围内的 任一值，比如，30％、40％、50％、60％以及70％。
优选地，
所述内标物为5-磷酸吡哆醛-d3。即5-磷酸吡哆醛的同位素。
优选地，
所述制备至少三种浓度的标准溶液，包括：
向至少三种浓度的标准工作液中加入目标量的内标工作液，顺次分别加 入蒸馏水和沉淀蛋白试剂，在1500-2500rpm转速下涡旋混匀1-2min后移取 上清液作为标准溶液；
其中，所述标准工作液为含有5-磷酸吡哆醛标准品的溶液，所述内标工 作液为含有内标物的溶液。
具体地，向标准工作液中加入蒸馏水可以将标准工作液定容至目标体积， 然后加入沉淀蛋白试剂，使得体系内的物质与对待处理样品中进行前处理操 作时的物质相同，避免沉淀蛋白试剂影响待测样品的测试。
针对涡旋转速来说，1500-2500rpm是指1500rpm至2500rpm范围内的任 一值，比如，1500rpm、1600rpm、1700rpm、1800rpm、1900rpm、2000rpm、 2100rpm、2200rpm、2300rpm、2400rpm以及2500rpm。
针对涡旋时间来说，1-2min是指1min到2min范围内的任一时间，比如， 1.1min、1.2min、1.3min、1.4min、1.5min、1.6min、1.7min、1.8min、1.9min 以及2min。
本发明提供了5-磷酸吡哆醛的检测方法，通过液质联用仪对含有不同浓 度的5-磷酸吡哆醛的标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应 的第一检测结果，然后基于各种浓度标准溶液中的5-磷酸吡哆醛的浓度、内 标物的浓度和多个检测结果拟合得到5-磷酸吡哆醛的标准曲线方程，再待处 理样品进行高速离心处理，可以得到离心后的血清或血浆，顺次加入沉淀蛋 白试剂和内标物进行蛋白沉淀，即可得到能够检测的待测样品，利用与标准 溶液相同的检测方法对待测样品进行检测，可以得到待测样品的第二检测结 果，基于标准曲线方程和第二检测结果即可得到待测样品中5-磷酸吡哆醛的 含量。通过对待处理样品进行离心、蛋白沉淀后得到进行测试待测样品，前 处理相对简单，耗费时间较少，从而可以实现缩短样品检测时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面 描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不 付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明一实施例提供的5-磷酸吡哆醛的检测方法的流程图；
图2是本发明一实施例提供的标准溶液中的5-磷酸吡哆醛的色谱图；
图3是本发明一实施例提供的标准溶液中的5-磷酸吡哆醛内标的色谱图；
图4是本发明一实施例提供的待测样品中的5-磷酸吡哆醛的色谱图；
图5是本发明一实施例提供的待测样品中的5-磷酸吡哆醛内标的色谱图；
图6是本发明一实施例提供的4％TCA浓度下待测样品的色谱图；
图7是本发明一实施例提供的6％TCA浓度下待测样品的色谱图；
图8是本发明一实施例提供的8％TCA浓度下待测样品的色谱图；
图9是本发明一实施例提供的10％TCA浓度下的待测样品色谱图；
图10是本发明一实施例提供的第一上清液与沉淀蛋白试剂比例为1:1时 的色谱图；
图11是本发明一实施例提供的第一上清液与沉淀蛋白试剂比例为1:2时 的色谱图；
图12是本发明一实施例提供的第一上清液与沉淀蛋白试剂比例为1:3时 的色谱图；
图13是本发明一实施例提供的第一上清液与沉淀蛋白试剂比例为1:4时 的色谱图；
图14是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.2mL/min、柱温20℃ 时的色谱图；
图15是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.25mL/min、柱温20℃ 时的色谱图；
图16是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.25mL/min、柱温30℃ 时的色谱图；
图17是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.3mL/min、柱温18℃时 的色谱图；
图18是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.3mL/min、柱温20℃时 的色谱图；
图19是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.3mL/min、柱温30℃时 的色谱图；
图20是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.3mL/min、柱温40℃时 的色谱图；
图21是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.4mL/min、柱温30℃时 的色谱图；
图22是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.4mL/min、柱温40℃时 的色谱图；
图23是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.5mL/min、柱温40℃时 的色谱图；
图24是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.45mL/min、柱温30℃ 时的色谱图；
图25是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.6mL/min、柱温40℃时 的色谱图；
图26是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.6mL/min、柱温45℃时 的色谱图；
图27是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.7mL/min、柱温45℃时 的色谱图；
图28是本发明一实施例提供的待测样品在流速0.65mL/min、柱温45℃ 时的色谱图；
图29是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为甲醇时待测样品中5-磷 酸吡哆醛的色谱图；
图30是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为甲醇时待测样品中5-磷 酸吡哆醛-d3的色谱图；
图31是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为乙腈时待测样品中5-磷 酸吡哆醛的色谱图；
图32是本发明一实施例提供的沉淀蛋白试剂为乙腈时待测样品中5-磷 酸吡哆醛-d3的色谱图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发 明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于 本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所 获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
目前，检测待测样品中5-磷酸吡哆醛通常采用衍生化法，利用衍生化试 剂与5-磷酸吡哆醛结构中的目标官能团反应生成衍生物，基于衍生物与5- 磷酸吡哆醛的质量比来判断待测样品中5-磷酸吡哆醛的含量。但是，衍生化 试剂通常稳定性较差，这样就增加了衍生化试剂的存储难度，从而增加检测 待测样品中5-磷酸吡哆醛的难度。并且衍生化试剂与待测样品中5-磷酸吡哆 醛反应需要在一定温度、PH值等条件下进行，这就进一步增加待测样品中 5-磷酸吡哆醛的检测难度，并且衍生化反应需要的时间较长，这就增加了待 测样品中5-磷酸吡哆醛整体的检测时长。
基于上述问题，本发明实施例提供了5-磷酸吡哆醛的检测方法，如图1 所示，包括：
步骤101：制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有 5-磷酸吡哆醛和内标物的溶液，且所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物 的量相同；
步骤102：利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标 准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
步骤103：根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中5-磷酸吡哆醛 和内标物的浓度，拟合5-磷酸吡哆醛的标准曲线方程；
步骤104：对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
步骤105：向所述第一上清液内加入沉淀蛋白试剂和含有内标物的内标 工作液，涡旋混合，并高速离心，取离心后的第二上清液作为待测样品；
步骤106：利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得 所述待测样品的第二检测结果；
步骤107：基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测 样品中5-磷酸吡哆醛的浓度。
在本发明实施例中，通过液质联用仪对含有不同浓度的5-磷酸吡哆醛的 标准溶液进行检测，可以得到每种浓度的标准溶液对应的第一检测结果，然 后基于各种浓度标准溶液中的5-磷酸吡哆醛的浓度、内标物的浓度和多个检 测结果拟合得到5-磷酸吡哆醛的标准曲线方程，再待处理样品进行高速离心 处理，可以得到离心后的血清或血浆，顺次加入沉淀蛋白试剂和内标物进行 蛋白沉淀，即可得到能够检测的待测样品，利用与标准溶液相同的检测方法 对待测样品进行检测，可以得到待测样品的第二检测结果，基于标准曲线方 程和第二检测结果即可得到待测样品中5-磷酸吡哆醛的含量。通过对待处理 样品进行离心、蛋白沉淀后得到进行测试待测样品，前处理相对简单，耗费 时间较少，从而可以实现缩短样品检测时间。
下面以几个实施例对5-磷酸吡哆醛的检测方法进行详细说明。
实施例1：制备系列浓度的标准溶液
(a)标准储备液的配制
标准储备液A：精确称取5-磷酸吡哆醛标准品5mg置于5mL容量瓶， 用甲醇：水＝3：7溶解进行溶解，并定容于5mL，得到标准储备液A，并在 -80℃条件下保存，有效期为12个月。
(b)标准工作液的配制
标准工作液B：取适量步骤(a)中标准储备液A，用甲醇：水＝3：7的 溶液进行稀释混合，得到分别含有20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、 500ng/mL、1000ng/mL以及2000ng/mL的5-磷酸吡哆醛的系列标准工作液 B，并在-80℃条件下保存，有效期为3个月；
(c)内标储备液的配制
内标储备液C：精密称取5-磷酸吡哆醛-d3标准品5mg置于5mL容量瓶， 用甲醇：水＝3：7进行溶解，并定容至5mL，得到内标储备液C，并在-80℃ 条件下保存，有效期为1年；
(d)内标工作液的配制
取适量步骤(c)中内标储备液C，用甲醇：水＝3：7溶液进行稀释，得 到含5-磷酸吡哆醛-d3 250ng/mL的内标工作液，-80℃保存，有效期1年。
(e)标准溶液的配制
用移液器移取10μL七种不同浓度的标准工作液B和10μL内标工作液置 于不同的离心管中，移取加入90μL纯水，再移取加入100μL 5％的三氯乙酸 TCA，在1500rpm下涡旋混匀1min后移取上清液，将该上清液作为标准溶 液。
实施例2：拟合标准曲线方程
利用液质联用仪对实施例1中七种浓度的标准溶液分别进行检测，得到 七种不同浓度的5-磷酸吡哆醛的标准溶液的色谱图。
从上述5-磷酸吡哆醛的标准溶液色谱图中分别得到七种标准溶液中5- 磷酸吡哆醛的色谱峰面积和内标物的色谱峰面积，以上述每种浓度的标准溶 液的色谱图中得到的5-磷酸吡哆醛的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比 值作为标准曲线方程的纵坐标y，以上述标准溶液中的5-磷酸吡哆醛的浓度 与内标物的浓度的比值作为标准曲线方程的横坐标x，将以上检测所得的七 种不同浓度的数据进行线性归回，拟合得到标准曲线方程y＝a*x+b，其中，a 和b为权重系数，a为标准曲线方程的斜率，b为标准曲线方程的截距。
上述检测条件包括：
色谱柱：Waters公司的Atlantis@T3色谱柱(2.1×150mm，5μm)，色谱柱 pH范围为2-8。
洗脱条件：1mM乙酸铵的水溶液和甲醇，其中，乙酸铵的水溶液中含体 积比为0.1％甲酸，乙酸铵的水溶液与甲醇的体积比为98:2，其中，流动相的 pH范围为3.0；
柱温：30℃，进样量：10μl，流速：0.3mL/min。
采用大气压化学电离源ESI，正离子扫描模式，选择反应监测模式，加 热气流速：10L/min；加热气温度：350℃；雾化电压：30psi；毛细管电压 4000psi；Delta EMV(+)：300V。
其中，液质联用仪中的质谱仪的相关检测参数如下表1所示：
表1
Figure BDA0002600898800000091
具体地，在制备不同浓度的标准溶液后，按照处理待处理样品时的前处 理操作，对不同浓度的标准溶液进行前处理，即，标准溶液中的涡旋转速时 间、沉淀蛋白试剂、加入沉淀蛋白试剂后的涡旋时间和转速以及离心转速和 时间均与待处理样品的前处理保持一致，可以消除系统误差，提高检测结果 的准确度。
实施例3：待测样品的处理
3.1取待处理样品至少5ml，在离心速度为3500rpm下离心10min，取上 清液得血清或血浆，将上述血清或血浆置于-20℃冷冻下保存至分析前备用；
3.2用移液枪移取10μL实施例1步骤(d)的内标工作液于1.5mL的离心管 中，然后加入100μL3.1中的上清液，在1500rpm的转速下涡旋混合1min后， 加入100μL 5％的TCA，在2000rpm的转速下涡旋混合3min后，并在12000rpm 的转速下高速离心10min，移取100μL上清液至干净的内插管中，移取的上 清液即为待测样品。
实施例4：待测样品的检测
利用液质联用仪采用实施例2中的检测条件对待测样品进行检测，得到 待测样品的色谱图。
从待测样品的色谱图中可以得到待测样品中5-磷酸吡哆醛和内标物的色 谱峰面积，将待测样品中的5-磷酸吡哆醛的色谱峰面积与内标物的色谱峰面 积的比值作为纵坐标y1，代入到实施例2的标准曲线方程为y＝a*x+b中， 由于权重系数a和b已知，所以可以得出待测样品中5-磷酸吡哆醛的浓度与 内标物的浓度的比值，由于待测样品中的内标物的浓度已知，由此可以计算 得到待测样品中的5-磷酸吡哆醛的浓度。
实施例5：5-磷酸吡哆醛的检测方法的线性关系和定量限
选取含较低浓度的5-磷酸吡哆醛的样本，根据所选取的样本的已知浓度， 用生理盐水做不同程度的稀释，从而制备得到不同浓度的样本稀释液，加入 10μl内标工作液，按本实施例前处理即检测条件进行测定，以定量例子色谱 峰面积-浓度作图，得到标准曲线，结果表明5-磷酸吡哆醛的线性范围和定量 限如下：
(1)检测限(LOD)：0.5ng/mL。
(2)定量限(LOQ)：1ng/mL。
(3)线性范围：5-磷酸吡哆醛在2ng/mL到200ng/mL范围内，线性良 好，相关系数R2﹥0.9900。
实施例6：5-磷酸吡哆醛的检测方法的回收率和精密度
取实施例1步骤(b)5-磷酸吡哆醛标准工作液配置成高、中、低3种浓 度进行加样回收率和精密度实验，按本实施例的检测方法进行测定，重复分 析测定3批次，5-磷酸吡哆醛的回收率如表2。5-磷酸吡哆醛在低、中、高的 3个添加水平范围内的平均回收率为93.5％～98.8％，结果见表2。
表2
Figure BDA0002600898800000101
综合上述验证试验，本实施例的回收率，检测限和精密度等各项技术指 标均符合要求，该方法检测人血液中5-磷酸吡哆醛，重现性良好，且加样回 收率良好，从而提高检测结果的准确度，消除系统误差。
在本实施例中，标准溶液中的5-磷酸吡哆醛的色谱图如图2所示，标准 溶液中的5-磷酸吡哆醛-d3的色谱图如图3所示，待测样品中的5-磷酸吡哆 醛的色谱图如图4所示，待测样品中的5-磷酸吡哆醛-d3的色谱图如图5所 示。图2和图4中的5-磷酸吡哆醛的保留时间均为3.995min，图3和图5中 的5-磷酸吡哆醛-d3的保留时间均为4.012min。由图2至图5可知本实施例 方法分析时间短、干扰杂质少，特异性强。
实施例7：针对沉淀蛋白试剂浓度的说明
图6至图9分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的待测样品相对 应的平行试验，本实施例的试验与实施例3和实施例4的区别为沉淀蛋白试 剂的浓度不同；图6至图9中箭头所指示的均为目标峰，且除了目标峰外均 为杂质峰，并且色谱图中位于上方的均为5-磷酸吡哆醛的色谱图，位于下方 的均为内标物5-磷酸吡哆醛-d3的色谱图。
图6为4％TCA浓度下的待测样品的色谱图，图6中的横坐标的单位长 度为0.2，纵坐标的单位长度为0.2×102；
图7为6％TCA浓度下的待测样品的色谱图，图7的横坐标的单位长度 为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的色谱 图的纵坐标的单位长度为0.1×103；
图8为8％TCA浓度下的待测样品的色谱图，图8的横坐标的单位长度 为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的色谱 图的纵坐标的单位长度为0.1×103；
图9为10％TCA浓度下的待测样品的色谱图，图9的横坐标的单位长度 为0.1，纵坐标的单位长度为0.2×102。
通过图6至图9可以看出，当TCA的浓度为4％时，目标峰的峰型出现 轻微的拖尾现象，但不影响样品检测，但是当TCA的浓度小于4％时，目标 峰的峰型拖尾严重，且样品的蛋白沉淀效果差，不能完全沉淀蛋白。随着TCA 浓度的增加，内标处的杂质与内标物的分离度变差，当TCA的浓度大于8％ 时，杂质与内标物不能完全分离，并且此时待测样品的pH较低，超过色谱 柱所能承受的pH，如果将该待测样品上样会对色谱柱造成不可逆的损伤。
实施例8：针对第一上清液与沉淀蛋白试剂的比例的说明
图10至图13分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的待测样品相 对应的平行试验，本实施例的试验与实施例3和实施例4的区别为沉淀蛋白 试剂的浓度不同；图10至图13箭头所指示的均为目标峰，且除了目标峰外 均为杂质峰，色谱图中位于上方的均为5-磷酸吡哆醛的色谱图，位于下方的 均为内标物5-磷酸吡哆醛-d3的色谱图。
图10为第一上清液与沉淀蛋白试剂比例为1:1时的色谱图，图10的横 坐标的单位长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102， 位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图11为第一上清液与沉淀蛋白试剂比例为1:2时的色谱图，图11的横 坐标的单位长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102， 位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×103；
图12为第一上清液与沉淀蛋白试剂比例为1:3时的色谱图，图12的横 坐标的单位长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102， 位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图13为第一上清液与沉淀蛋白试剂比例为1:4时的色谱图，图13的横 坐标的单位长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102， 位于下方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×103；
通过图10至图13可见，当第一上清液与TCA的体积比小于1:1时，TCA 不能将待测样品中的蛋白完全沉淀，但是，随着TCA用量逐渐增加，内标处 的杂质与内标物的分离度逐渐变差，使得杂质与内标物不能完全分离，并且 当第一上清液与TCA的体积比大于1:4时，此时待测样品的pH较低，超过 色谱柱所能承受的pH，如果将该待测样品上样会对色谱柱造成不可逆的损伤。
实施例9：针对流速的说明
图14至图28分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的待测样品相 对应的平行试验，与实施例3和实施例4中待测样品区别是流速和柱温不同， 其中，图14至图28中箭头所指示的均为目标峰，且除了目标峰外均为杂质 峰，并且色谱图中位于上方的均为5-磷酸吡哆醛的色谱图，位于下方的均为 内标物5-磷酸吡哆醛-d3的色谱图。
图14为流速0.2mL/min、柱温20℃时的色谱图，图14的横坐标的单位 长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×103；
图15为流速0.25mL/min、柱温20℃时的色谱图，图15的横坐标的单 位长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×102，位于下 方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图16为流速0.25mL/min、柱温30℃时的色谱图，图16的横坐标的单 位长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方 的色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×103；
图17为流速0.3mL/min、柱温18℃时的色谱图，图17的横坐标的单位 长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×102，位于下方 的色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×102；
图18为流速0.3mL/min、柱温20℃时的色谱图，图18的横坐标的单位 长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×103；
图19为流速0.3mL/min、柱温30℃时的色谱图，图19的横坐标的单位 长度为0.2，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图20为流速0.3mL/min、柱温40℃时的色谱图，图20的横坐标的单位 长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×103；
图21为流速0.4mL/min、柱温30℃时的色谱图，图21的横坐标的单位 长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.25×102；
图22为流速0.4mL/min、柱温40℃时的色谱图，图22的横坐标的单位 长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102；
图23为流速0.5mL/min、柱温40℃时的色谱图，图23的横坐标的单位 长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图24为流速0.45mL/min、柱温30℃时的色谱图，图24的横坐标的单位 长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102；
图25为流速0.6mL/min、柱温40℃时的色谱图，图25的横坐标的单位 长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102；
图26为流速0.6mL/min、柱温45℃时的色谱图，图26的横坐标的单位 长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102；
图27为流速0.7mL/min、柱温45℃时的色谱图，图27的横坐标的单位 长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.2×102；
图28为流速0.65mL/min、柱温45℃时的色谱图，图28的横坐标的单位 长度为0.1，位于上方的色谱图的纵坐标的单位长度为0.5×102，位于下方的 色谱图的纵坐标的单位长度为0.1×103。
通过图14至图28可见，柱温20℃、流速小于0.2mL/min时，5-磷酸吡 哆醛和内标物的保留时间大于5min，这样会使得待测样品检测时间过长，影 响样品检测的时效性。而当柱温45℃、流速大于0.65mL/min时，色谱柱的 柱压会超过色谱柱所能承受的压力，在高压下长时间检测样品会对色谱柱造 成不可逆的损伤，并且随着柱温升高内标物与杂质的分离度逐渐变差，当柱 温大于45℃，内标物与杂质无法完全分离。
实施例10：针对沉淀蛋白试剂的说明
图29至图32分别对应的试验是与实施例3和实施例4中的待测样品相 对应的平行试验，区别是图29至图32的试验中的沉淀蛋白试剂不同。
图29是沉淀蛋白试剂为甲醇时待测样品中5-磷酸吡哆醛的色谱图，图 29的横坐标的单位长度为0.2，纵坐标的单位长度为0.1×101；
图30是沉淀蛋白试剂为甲醇时待测样品中5-磷酸吡哆醛-d3的色谱图， 图30的横坐标的单位长度为0.2，纵坐标的单位长度为0.2×101；
图31是沉淀蛋白试剂为乙腈时待测样品中5-磷酸吡哆醛的色谱图，图 31的横坐标的单位长度为0.2，纵坐标的单位长度为0.1×101；
图32是沉淀蛋白试剂为乙腈时待测样品中5-磷酸吡哆醛-d3的色谱图， 图32的横坐标的单位长度为0.2，纵坐标的单位长度为0.2×101。
通过图29至图32可见，通过甲醇、乙腈对待处理样品进行蛋白沉淀后 得到的待测样品进行检测，待测样品中的5-磷酸吡哆醛和内标物的色谱峰在 色谱图中出峰不明显，不利检测人员观看。
需要说明的是，图2至图32的横坐标均为采集时间，纵坐标均为离子信 号强度，且色谱图中缺失的图形不影响本方案的技术内容。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二之类的关系术语仅仅用来将 一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这 些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、 “包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系 列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明 确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有 的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个〃····〃”限定 的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另 外的相同因素。
最后需要说明的是：以上所述仅为本发明的较佳实施例，仅用于说明本 发明的技术方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原 则之内所做的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.5-磷酸吡哆醛的检测方法，其特征在于，包括：
制备至少三种浓度的标准溶液，其中，所述标准溶液为具有5-磷酸吡哆醛和内标物的溶液，且所述至少三种浓度的标准溶液中的内标物的量相同；
利用液质联用仪在预设的检测条件下分别检测每一种所述标准溶液，获得每一种所述标准溶液对应的第一检测结果；
根据各个所述第一检测结果、所述标准溶液中5-磷酸吡哆醛和内标物的浓度，拟合5-磷酸吡哆醛的标准曲线方程；
对待处理样品进行离心处理，取离心后的第一上清液；
向所述第一上清液内加入沉淀蛋白试剂和含有内标物的内标工作液，涡旋混合，并高速离心，取离心后的第二上清液作为待测样品；
利用液质联用仪在所述检测条件下检测所述待测样品，获得所述待测样品的第二检测结果；
基于所述标准曲线方程和所述第二检测结果，得到所述待测样品中5-磷酸吡哆醛的浓度。
2.根据权利要求1所述的5-磷酸吡哆醛的检测方法，其特征在于，
所述检测条件，包括：
长度为150mm、内径为2.1mm以及填料粒径为5μm的色谱柱；
洗脱流动相为1mmol/L乙酸铵的水溶液和甲醇，其中，乙酸铵的水溶液中含有体积比为0.01％-0.2％的甲酸；
柱温为20℃-45℃；
流速为0.25-0.65mL/min。
3.根据权利要求2所述的5-磷酸吡哆醛的检测方法，其特征在于，
所述洗脱流动相采用等度洗脱；
1mmol/L乙酸铵的水溶液与甲醇的体积比为：98:2。
4.根据权利要求1所述的5-磷酸吡哆醛的检测方法，其特征在于，
所述检测条件中的质谱条件包括：
采用大气压化学电离源ESI，正离子扫描模式，反应监测模式，加热气流速：10L/min；加热气温度：350℃；雾化电压：30psi；毛细管电压4000psi；电子倍增器上的电压(+)：300V。
5.根据权利要求1所述的5-磷酸吡哆醛的检测方法，其特征在于，
所述标准曲线方程的两个变量分别为：所述第一检测结果中5-磷酸吡哆醛的色谱峰面积与内标物的色谱峰面积的比值，以及所述标准溶液中5-磷酸吡哆醛的浓度与所述标准溶液中的内标物的浓度的比值。
6.根据权利要求1所述的5-磷酸吡哆醛的检测方法，其特征在于，
所述沉淀蛋白试剂包括：4％-8％的三氯乙酸。
7.根据权利要求1所述的5-磷酸吡哆醛的检测方法，其特征在于，
所述标准溶液中的稀释液包括：30％-70％甲醇的水溶液。
8.根据权利要求1所述的5-磷酸吡哆醛的检测方法，其特征在于，
所述内标物为5-磷酸吡哆醛-d3。
9.根据权利要求1至8中任一所述的5-磷酸吡哆醛的检测方法，其特征在于，
所述制备至少三种浓度的标准溶液，包括：
向至少三种浓度的标准工作液中加入目标量的内标工作液，顺次分别加入蒸馏水和沉淀蛋白试剂，在1500-2500rpm转速下涡旋混匀1-2min后移取上清液作为标准溶液；
其中，所述标准工作液为含有5-磷酸吡哆醛标准品的溶液，所述内标工作液为含有内标物的溶液。
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