CN1485434A - 氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型蛋白芯片的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨酰基转运核糖核酸(tRNA)合成酶识别型蛋白芯片的制备方法，它适用于蛋白质中基本氨基酸组分的检测。其特征在于将组成蛋白质的20种基本氨基酸对应的氨酰基转运核糖核酸合成酶(AARS)以阵列形式固定到芯片表面，再在一定条件下把20种荧光标记的转运核糖核酸固定到相应的合成酶上去，形成转运核糖核酸－氨酰基转运核糖核酸合成酶芯片。该芯片就可利用氨酰基转运核糖核酸合成酶对其相应氨基酸的特异识别作用来检测该种氨基酸在蛋白质中存在与否。最后综合20个样孔的反应情况，应用荧光扫描可检测出蛋白质中氨基酸的组成。本发明具有准确，灵敏，快速，方便的特点。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白质生物芯片，更具体涉及一种氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型蛋白芯片的制备方法，适合于对蛋白质中基本氨基酸组分进行检测分析。
技术背景
以往的氨基酸分析主要是根据氨基酸的物理性质不同来进行分离分析的，主要有薄层层析，滤纸层析，离子交换柱层析等各种层析法和高效液相色谱法。其中层析法的优点是操作简便，价格便宜，易于携带，但其检测极限较低，只能达到10nmol水平，且检测时间较长，一般需几个小时；而高效液相色谱检测极限可缩小至pmol甚至fmol水平，分离时间也可从数小时缩短到数分钟，但是由于仪器昂贵，使用费用高，不方便携带的缺点而限制了其广泛应用。蛋白芯片是继基因芯片之后新发展起来的一种生物芯片，以往的蛋白芯片都是把蛋白质组中各蛋白分子高通量的点阵到芯片表面，再通过分子间的相互作用来发现蛋白质组中新的蛋白分子或是能与目标分子相互作用的蛋白质分子。但是把蛋白芯片应用于构成蛋白质的基本单位(20种基本氨基酸)的检测还从未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型蛋白芯片的制备方法，该方法利用氨酰基转运核糖核酸合成酶对其相应氨基酸及其转运核糖核酸的特异识别活性来检测蛋白质中氨基酸组成。该方法具有快速，灵敏，准确，经济，方便的特点。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施(以在一个点样孔中精氨酰转运核糖核酸合成酶-精氨酸转运核糖核酸复合物的固定为例)：
把精氨酰转运核糖核酸合成酶基因加入strep-tag质粒中，并对其进行原核表达，提取精氨酰转运核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白，该融合蛋白可通过strep-tag与表面修饰有亲和素的芯片上的亲和素相结合，从而实现精氨酰转运核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白的固相。又由于20种氨酰基转运核糖核酸合成酶催化相应氨基酸与相应转运核糖核酸合成氨酰基转运核糖核酸的过程都是转运核糖核酸首先通过其三端接受臂及其他特异位点与氨酰基转运核糖核酸合成酶特异识别后，再通过反密码子结合到氨酰基转运核糖核酸合成酶上，形成转运核糖核酸-氨酰基转运核糖核酸合成酶复合物。在这之后才能在氨酰基转运核糖核酸合成酶的特异催化下，把相应的氨基酸加载到转运核糖核酸的3端接受臂，最终再把氨酰基转运核糖核酸从酶上释放出去。所以在固相有氨酰基转运核糖核酸合成酶的样孔中再加入荧光标记的转运核糖核酸，三磷酸腺苷，镁离子，在一定的条件下就可制成固相化的转运核糖核酸-氨酰基转运核糖核酸合成酶复合物，这时用荧光扫描样孔，可见均匀而强亮度的荧光发出。当向样孔中加入相应氨基酸时，样孔中催化反应生成氨酰基转运核糖核酸，这时与氨酰基转运核糖核酸合成酶相结合的荧光标记转运核糖核酸将大大减少，甚至不再存在。这样在清洗后再扫描样孔，样孔荧光发光强度减少，甚至不在发光，就此证明该种氨基酸存在。最后再以上述方法，在芯片上20个孔中阵列式建立组成蛋白质20种氨基酸相应的固相转运核糖核酸-氨酰基转运核糖核酸合成酶复合物，于是氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型芯片建立完毕。
本发明与现有技术相比，有以下优点和效果：氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型蛋白芯片与以往的分析方法有着本质上的不同。它结合了生物酶的特异性，高灵敏性与芯片的高通量，快速检测的两方面的优势，弥补了以往分析方法灵敏、快速与方便、廉价不能同时兼具的不足，实现了快速，灵敏，准确，经济，方便的氨基酸检测，同时也开拓了生物芯片研究、应用的新领域。
具体实施方式
具体步骤如下：
1、制备荧光物质IAEDANS标记的转运核糖核酸，并检测标记的情况。方法见J.Mo1.Biol 1982，156，(113-140)
2、精氨酰转运核糖核酸合成酶基因重组到pASK-IBA载体中去，并使合成酶基因的3撇端和strep-tag序列5撇端相连，再把建成的重组质粒导入到B系大肠杆菌宿主中，进行融合表达，并过柱回收，后用液闪计数仪来检测其活力。(方法见Biochemistry 1988，27，6343-6348)
3、向表面修饰有亲和素的芯片(nano.ARC公司提供)样孔中加入多种反应试剂，使其终浓度为精氨酰转运核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白50到100nmol/L，氯化钠为150nmol/L，乙二胺四乙酸钠为1mmol/L，，在PH8.0，20℃条件下温浴20分钟，使精氨酰基tRNA合成酶-strep-tag融合蛋白固定到芯片表面，再用无菌水清洗，4℃下晾干。
4、向固定化精氨酰转运核糖核酸合成酶的样孔中加入多种反应试剂，使其终浓度为Tris/盐酸50mmol/L，氯化镁8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L，荧光(IAEDANS)标记的精氨酸tRNA534μmol/L，在PH7.4，37℃下温浴5到7分钟，使精氨酸tRNA分子均匀而稳定的结合到精氨酰tRNA合成酶上，后用氯化镁8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片表面，4℃晾干。
5、另取一块芯片，再上取4个相邻点，以上述方法制得4个相同的精氨酰转运核糖核酸合成酶-精氨酸转运核糖核酸复合物，再向4个点中加入终浓度为50mmol/LTris/盐酸，8mmol/L氯化镁，4mmol/L三磷酸腺苷，0.1mmol/L乙二胺四乙酸钠，80mmol/L氯化钾，0.5mmol/L二硫苏糖醇，及梯度浓度的精氨酸(分别为0.2mmol/L，0.1mmol/L，0.05mmol/L，0.025mmol/L).37℃，PH7.4条件下，温浴5分钟，停止反应。用步骤4中洗液清洗芯片，后荧光扫描，观察各样孔中荧光强度。发现荧光强度随着精氨酸浓度的减少而增大，从而证明固相的精氨酰转运核糖核酸合成酶-精氨酸转运核糖核酸复合物可与精氨酸进行胺酰基化反应，而且可用于检测精氨酸的含量。证明之后向步骤4中制备的精氨酰转运核糖核酸合成酶-精氨酸转运核糖核酸复合物中加入反应试剂，使终浓度为精氨酸0.1mmol/L，乙二胺四乙酸钠为0.1mmol/L，氯化钾80mmol/L，二硫苏糖醇0.5mmol/L，在37℃，PH7.4条件下温浴5分钟后，停止反应，以氯化镁8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片。
6、把构成蛋白质的其余19种(甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，甲硫氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，天冬氨酸，谷氨酸，赖氨酸，苯丙氨酸，洛氨酸，色氨酸，组氨酸，脯氨酸)基本氨基酸相应的氨酰基转运核糖核酸合成酶基因都与strep-tag制成融合蛋白，再以上述方法在一块芯片的20个孔中阵列固相出20种不同的氨酰基转运核糖核酸合成酶转运核糖核酸-复合物，于是氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型芯片制备出来。
Claims (1)
1、一种氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型蛋白芯片的制备方法，包括下列步骤：
A、制备荧光物质IAEDANS标记的转运核糖核酸；
B、把精氨酰转运核糖核酸合成酶基因和strep-tag序列进行基因重组，并合成精氨酰转运核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白，回收后用液闪记数仪来检测其活力；
C、向表面修饰有亲和素的芯片样孔中加入反应试剂，使其终浓度为精氨酰转运核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白50到100nmol/L，氯化钠为150nmol/L，乙二胺四乙酸钠为1mmol/L，在PH8.0，20℃条件下温浴20分钟，使精氨酰转运核糖核酸合成酶-strep-tag融合蛋白固定到芯片表面，再用无菌水清洗，4℃晾干；
D、向固定化精氨酰转运核糖核酸合成酶的样孔中加入反应试剂，使其终浓度为Tris/盐酸50mmol/L，氯化镁8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L，荧光IAEDANS标记的精氨酸转运核糖核酸534μmol/L，在PH7.4，37℃下温浴5到7分钟，使精氨酸转运核糖核酸分子均匀而稳定的结合到精氨酰tRNA合成酶上，后用氯化镁8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片表面，4℃晾干；
E、向步骤D中制备的精氨酰转运核糖核酸合成酶-精氨酸转运核糖核酸复合物中加入反应试剂，使终浓度为精氨酸0.1mmol/L，乙二胺四乙酸钠为0.1mmol/L，氯化钾80mmol/L，二硫苏糖醇0.5mmol/L，在37℃，PH7.4条件下温浴5分钟后，停止反应，以氯化镁8mmol/L，三磷酸腺苷4mmol/L混合液清洗芯片；
F、把甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、洛氨酸、色氨酸、组氨酸、脯氨酸相应氨酰基转运核糖核酸合成酶的基因都与strep-tag制成融合蛋白，再重复A、B、C、D、E的步骤在一块芯片的20个孔中阵列固相出20种不同的氨酰基转运核糖核酸合成酶-转运核糖核酸复合物，制成氨酰基转运核糖核酸合成酶识别型芯片。
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