CN104804724A - 一种比率型变型受体汞离子荧光探针、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

一种比率型变型受体汞离子荧光探针、其制备方法及应用，其合成步骤简单，光稳定性好，最大发射波长在550nm，在中性条件下具有很好的化学稳定性。酰胺官能团的互变异构使得受体具有变型能力，即以亚胺酸的异构体结合汞离子，而以酰胺异构体的结构结合其他金属离子，表现为对汞离子的专一结合选择性。探针结合汞离子后荧光光谱红移致633nm并有9倍的增强；与其他金属离子特别是同族元素锌离子、镉离子结合后没有明显的荧光变化，表现为对汞离子的专一荧光信号选择性。本发明实现了探针对汞离子的专一性的比率识别，能够用于细胞中汞离子的检测，对于其他生物和环境中汞离子的检测具有广阔的应用前景。

Description

一种比率型变型受体汞离子荧光探针、其制备方法及应用

技术领域

本发明属于化学分析检测领域，具体涉及一种比率型变型受体汞离子荧光探针、其制备方法及应用。

背景技术

汞是一种对人体和环境最有威胁和毒害作用的金属之一。在自然界中，汞离子被各种动植物吸收并通过食物链富集而进入人体，对身体健康造成一系列有害影响，特别是对大脑、骨骼、肾脏以及中枢系统、免疫以及内分泌系统等都有不同程度的毒害作用。尽管汞离子对环境以及人体健康造成不良影响，但是它仍然被广泛应用于工业生产过程中。因此寻求快速、高效的汞离子检测方法，使其应用于医药、环境、食品等领域是十分必要的。荧光检测法方法简便，而且在灵敏度、选择性、响应时间以及生物应用等方面具有突出优点。近年来，得到广泛应用。

目前，大多数已报道的汞离子荧光探针主要分为两类：一类是基于汞离子反应型探针，主要为脱硫、乙烯醚基水解、罗丹明开环等反应[(a)Li,H.B.;Yan,H.J.J.Phys.Chem.C.2009,113,7526.Ma,W.H.;Xu,Q.;Du,J.J.;Song,B.;Peng,X.J.;Wang,Z.;Li,G.D.;Wang,X.F.Spectrochim.Acta,PartA,2010,76,248.(c)Tsukamoto,K.;Shinohara,Y.;Iwasaki,S.;Maeda,H.Chem.Commun.2011,47,5073.(d)Santra,M.;Roy,B.;Ahn,K.H.Org.Lett.2011,13,3422.(e)Lee,M.H.;Wu,J.S.;Lee,J.W.;Jung,J.H.;Kim,J.S.Org.Lett.2007,9,2501.(f)Ahamed,B.N.;Ghosh,P.Inorg.Chim.Acta2011,372,100.]。但是这类探针与汞离子反应后，汞离子仍会以硫化汞或者有机汞的形式存在，依然存在较大的毒性。此类探针通常需要较长的反应时间以及较苛刻的反应条件，使用范围受到限制。另一类探针是利用汞离子与一些杂原子的配位络合作用[(a)Chen,T.;Zhu,W.P.;Xu,Y.F.;Zhang,S.Y.;Zhang,X.J.;Qian,X.H.Dalton Trans.,2010,39,1316.(b)Fan,J.L.;Guo,K.X.;Peng,X.J.;Du.J.J.;Wang,J.Y.;Sun,S.G.;Li,H.L.Sensors andActuators B:Chemical.2009,142,191.(c)Zhao,Y.;Lv,X.;Liu,Y.;Liu,J.;Zhang,Y.;Shi,H.;Guo,W.J.Mater.Chem.,2012,22,11475.(d)Yuan,M.;Li,Y.;Li,J.;Li,C.;Liu,X.;Lv,J.Xu,J.;Liu,H.;Wang,S.;Zhu,D.,Org.Lett.,2007,9,2313.]。这类汞离子探针通常具有较好的灵敏度以及快速的响应时间，研究的最为广泛但是这类探针对汞离子的结合选择性比较差，容易受到其他金属离子特别是同族金属锌、镉的干扰。本发明涉及的这类变型受体探针很好的解决了选择性问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种比率型变型受体汞离子荧光探针、其制备方法及应用，该探针对汞离子具有专一的选择性和较高的灵敏度，制备方法简单，适合放大合成和实际应用。

本发明提供了一种比率型变型受体汞离子荧光探针，该荧光探针结构如下：

本发明提供比率型变型受体汞离子荧光探针的制备方法，该方法具体步骤如下：

1）苯并吡喃腈的合成：100mL单口瓶中加入12.5mmol的2-甲基苯并吡喃酮，加入40mL的醋酸酐作为溶剂，再加入15.15mmol的丙二腈，回流反应12小时，旋转蒸发掉醋酸酐，加入30mL去离子水，并回流反应半小时，过滤，得到滤饼用无水乙醇重结晶得到黄色固体；产率14%。

2）4-叠氮苯乙烯基苯并吡喃腈的合成：氩气保护下，25mL烧瓶内加入等摩尔的4-叠氮苯甲醛以及苯并吡喃腈，加入6mL的乙腈作为溶剂，随后加入5滴哌啶作为催化剂，回流反应24小时，得到黄色沉淀，过滤得到滤饼并用甲醇重结晶得到最终黄色固体；产率44%。

3）4-氨基苯乙烯基苯并吡喃腈的合成：氩气保护下，在25mL烧瓶内加入0.89mmol4-叠氮苯乙烯基苯并吡喃腈以及50mL的的乙腈作为溶剂，随后加入17.8mmol NaHS水溶液（浓度为3mmol/mL），室温反应20小时，过滤得到红棕色固体；产率44%。

4）4-（2-氯乙酰）氨基苯乙烯基苯并吡喃腈的合成：氩气保护下，50mL烧瓶内加入1.0mmol4-氨基苯乙烯基苯并吡喃腈以及1.4mmol对二甲氨基吡啶(DMAP)，加入20mL的的干燥的二氯甲烷，随后在冰浴下滴加1.3mmol氯乙酰氯的二氯甲烷溶液5mL（0.22mmol/mL），室温反应2小时，旋干溶剂，柱层析分离得到黄色固体，洗脱剂为二氯甲烷；产率69%。

5）探针分子的合成：氩气保护下，烧瓶内加入0.4mmol4-（2-氯乙酰）氨基苯乙烯基苯并吡喃腈和0.39mmol二甲基吡啶氨，0.8mmol碳酸钾，50mg碘化钾。加30mL的的干燥乙腈，60℃反应10小时，旋干溶剂，柱层析分离得到棕色固体，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇=100：1；产率：42%。

本发明提供的荧光探针应用于在环境保护中检测水溶液中的汞离子及生物医药中检测细胞中的汞离子。

本发明具有以下具体特征：

探针分子原料易得，合成路线简单、反应条件温和、后处理简单方便，对汞离子识别能力专一，响应速度较快，酰胺-DPA受体存在变型功能，受体与汞离子的结合方式为亚胺酸形式，导致波长红移。探针在DMF和HEPES（pH=7.4）混合溶液中（体积比5:5）溶解性较好，最大发射波长在550nm，荧光信号较弱，随着汞离子的加入，探针分子在633nm出现较强的发射峰。因此可以用于检测水溶液中的汞离子，可应用在环境当中汞离子的检测。此外这种探针能有效的检测活细胞中的汞离子，可应用在生物医药领域当中。

附图说明

图1为该荧光探针的结构式；

图2为该荧光探针的合成路线示意图；

图3为该荧光探针的¹HNMR谱图

图4为比率型荧光探针与不同浓度的汞离子作用后的荧光光谱图，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度，荧光探针的浓度为10μm，汞离子浓度为0，2，4，6，8，10，15，20，30μm；

图5为荧光探针（10μm）加入不同金属离子（30μm）：Ag⁺,Al³⁺,Ba²⁺,Ca²⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Cr³⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Hg²⁺,K⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Na⁺,Ni²⁺,Pb²⁺,Pd²⁺,Pt²⁺,Rb⁺,Sr²⁺,Zn²后的荧光变化情况，横坐标为波长，纵坐标为荧光强度；

图6为荧光探针（10μm）加入不同金属离子（30μm）：Ag⁺,Al³⁺,Ba²⁺,Ca²⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Cr³⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,Hg²⁺,K⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Na⁺,Ni²⁺,Pb²⁺,Pd²⁺,Pt²⁺,Rb⁺,Sr²⁺,Zn²后的柱形图，横坐标为金属种类，纵坐标为荧光强度；

图7为J-P曲线，探针与汞离子的浓度总和为10μm，横坐标为探针的浓度从0μm-10μm，纵坐标为荧光强度；

图8为荧光探针（10μm）加入不同金属离子（30μm）后再加入汞离子（30μm）的竞争柱状图，横坐标为金属种类，纵坐标为荧光强度；表明大部分金属离子可以被置换出来，只有Co²⁺,Cu²⁺等有干扰；

图9为Hela细胞的荧光共聚焦成像结果，其中，a为细胞的亮场图，b为加入探针培养30分钟后的细胞成像，c为加入汞离子培养30分钟后的细胞成像，d为a和c的叠加图。

具体实施方式

下面的实施例将对本发明予以进一步的说明，但并不因此而限制本发明。

实施例1：变型受体比率型汞离子的荧光探针的制备，基本合成过程如下：

苯并吡喃腈的合成：100mL单口瓶内加入苯并吡喃酮(2g,12.5mmol)，再加入醋酸酐40mL，随后加入丙二腈(1g,15.15mmol)，回流搅拌反应12小时，旋转蒸发掉醋酸酐，加入30mL去离子水并回流反应半小时，过滤，得到滤饼用无水乙醇重结晶得到黄色固体0.35g。苯并吡喃腈的产率14%。苯并吡喃腈的氢谱数据如下：¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ8.92(d,J=9Hz1H),7.72(t,J=7.5Hz,1H),7.46(d,J=8Hz,2H),6.72(s,1H),2.44(s,3H)。

4-叠氮苯乙烯基苯并吡喃腈的合成：氩气保护下，25mL烧瓶内加入4-叠氮苯甲醛（155mg，0.75mmol）以及苯并吡喃腈（110mg,0.75mmol），加入新蒸乙腈（6mL）作为溶剂，随后加入5滴哌啶作为催化剂，回流反应24小时得到黄色沉淀，过滤得到滤饼并用甲醇重结晶得到最终黄色固体。4-叠氮苯乙烯基苯并吡喃腈的产率44%。4-叠氮苯乙烯基苯并吡喃腈的氢谱和碳谱数据如下：¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ8.92(d,J=8Hz,1H),7.75(t,J=8Hz,1H),7.60-7.55(m,4H,Ar-H),7.46(t,J=7.5Hz,1H),7.10(d,J=8.5Hz,2H),6.87(s,1H),6.77(d,J=16Hz,1H).¹³C NMR(CDCl₃,500MHz)δ157.3,152.7,152.3,142.2,137.6,134.7,131.4,129.5,126.0,125.9,119.8,118.6,118.3,117.8,116.7,115.6,106.9,63.0。

4-氨基苯乙烯基苯并吡喃腈的合成：氩气保护下在25mL烧瓶内加入4-叠氮苯乙烯基苯并吡喃腈（300mg,0.89mmol），然后加入干燥的乙腈(50mL)，随后加入NaHS(996.8mg,17.8mmol)的水溶液（5mL），室温反应20小时，过滤得到170mg红棕色固体。4-氨基苯乙烯基苯并吡喃腈的产率62%。4-氨基苯乙烯基苯并吡喃腈的氢谱和碳谱数据如下：¹H NMR(CDCl₃,500MHz)δ8.92（d,J=8.5Hz,1H）,7.72(t,J=8Hz,1H),7.57-7.53(m,2H),7.47-7.42(m,3H),6.81(s,1H),6.70(d,J=8.5Hz,2H),6.62(d,J=16Hz,1H),4.05(s,2H).¹³C NMR(CDCl₃,500MHz)δ160.2,153.0,152.6,152.5,141.1,135.5,131.2,126.4,125.0,122.8,119.4,118.3,117.7,116.9,114.3,112.9,105.2,57.8。

4-（2-氯乙酰）氨基苯乙烯基苯并吡喃腈的合成：氩气保护下，50mL烧瓶内加入4-氨基苯乙烯基苯并吡喃腈(311mg,1.0mmol)以及DMAP（171mg,1.40mmol,1.4eq.），加入新蒸的二氯甲烷溶液（20mL），随后在冰浴下滴加氯乙酰氯（146mg,1.3mmol,1.3eq.）的二氯甲烷溶液（5mL）,室温反应2小时，旋干溶剂，柱层析分离得到黄色固体，洗脱剂为二氯甲烷。4-（2-氯乙酰）氨基苯乙烯基苯并吡喃腈的产率69%。4-（2-氯乙酰）氨基苯乙烯基苯并吡喃腈的氢谱和碳谱数据如下：¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ10.53(s,1H,NH),7.10(d,J=8.5Hz,1H),7.91(t,J=8.0Hz,1H),7.78(d,J=8.5Hz,1H),7.74-7.66(m,5H),7.59(t,J=8.0Hz,1H),7.55(d,J=16.0Hz,1H),6.98(s,1H),4.28(s,2H,CH₂).¹³C NMR(125MHz,DMSO-d₆):δ165.4,158.8,153.4,152.5,140.8,138.7,135.9,130.9,129.6,126.6,125.1,119.9,119.5,118.8,117.7,117.6,116.4,107.0,60.4,44.1。

探针分子的合成：氩气保护下，50mL烧瓶内加入4-（2-氯乙酰）氨基苯乙烯基苯并吡喃腈(155mg,0.4mmol)、DPA(42mg,0.39mmol)、碳酸钾(110mg,0.80mmol)，以及碘化钾(50mg)。加入干燥乙腈(30mL)，60^oC反应10小时，旋干溶剂，柱层析分离得到92mg棕色固体，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇=100：1。荧光探针的产率42%。

荧光探针的氢谱如下：¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆):δ10.78(s,1H,NH),8.72(d,J=8.0Hz,1H),8.57(d,J=3.5Hz,2H),7.91(t,J=7.5Hz,1H),7.80-7.70(m,8H),7.60(t,J=7.0Hz,1H),7.44(d,J=7.5Hz,2H),7.40(d,J=16Hz,1H),7.27(t,J=5.0Hz,2H),7.00(s,1H),3.92(s,4H),3.46(s,2H)。

将该探针溶于DMF溶液中，加入到DMF:HEPES（pH=7.4）(5:5)混合溶剂中，制配成10^-6M的溶液，测试其荧光光谱变化。

实施例3：荧光探针对汞离子测定的响应情况

图4-图8中的各种数据都是在DMF和HEPES（pH=7.4）混合溶液（体积比5:5）中测试所得，激发波长为459nm。

图4中探针浓度为10μm，当汞离子的浓度为0，2，4，6，8，10，15，20，30μm依次增加时，其荧光光谱发生明显红移增强变化，红移了83nm，增强了8倍。表明与汞离子结合以后发生了变型变化。

实施例4：荧光探针对汞离子测定的选择性

相同反应条件下加入10μm探针分子，再加入其他金属离子，如：Ag⁺,Al³⁺,Ba²⁺,Ca²⁺,Cd²⁺,Co²⁺,Cr³⁺,Cu²⁺,Fe²⁺,Fe³⁺,K⁺,Mg²⁺,Mn²⁺,Na⁺,Ni²⁺,Pb²⁺,Pd²⁺,Pt²⁺,Rb⁺,Sr²⁺,Zn²⁺，浓度均为30μm。结果如图5和图6，只有汞离子发生了明显的红移增强变化，其他金属离子没有太明显变化，因此在上述干扰离子存在的条件下，探针对汞离子仍具有较好的选择性和灵敏度。实施例5：荧光探针与汞离子的络合比例

保持探针与汞离子的浓度总和为10μm，调解探针与汞离子的比例关系，从10:0-0:10，结果如图7所示，5:5的时候荧光强度最强表明探针与汞离子是1:1络合的。

实施例6：荧光探针与汞离子及其他离子的竞争关系

相同条件下加入10μm探针分子，再加入30μm其他金属离子，最后加入30μm汞离子，结果如图8所示，表明汞离子能够把大部分金属从配体中置换出来，只是Cu²⁺和Co²⁺对结果稍有干扰。

实施例7：荧光探针在细胞内检测汞离子

将Hela细胞（人类宫颈癌细胞）铺在培养皿中，皿中含有10%胎牛血清的DMEM培养基，在37^oC和5%二氧化碳条件下培养48小时，向其中分别加入10μm的探针，培养30分钟，再加入10μm的汞离子继续培养30分钟，用吸管吸掉培养基，用PBS缓冲液洗涤细胞3次，加入2mL PBS缓冲液进行成像实验，结果如图9所示。

Claims (6)

1.一种比率型变型受体汞离子荧光探针，其特征在于：该荧光探针结构如下：

2.按照权利要求1所述比率型变型受体汞离子荧光探针的制备方法，其特征在于：该方法具体步骤如下：

1）苯并吡喃腈的合成：在单口瓶中加入12.5mmol的2-甲基苯并吡喃酮，加入40mL的醋酸酐作为溶剂，再加入15.15mmol的丙二腈，回流反应12小时，旋转蒸发掉醋酸酐，加入30mL去离子水，并回流反应半小时，过滤，得到滤饼进行重结晶，得到苯并吡喃腈；

2）4-叠氮苯乙烯基苯并吡喃腈的合成：氩气保护下，在烧瓶内加入等摩尔的4-叠氮苯甲醛以及苯并吡喃腈，加入6mL的乙腈作为溶剂，随后加入5滴哌啶作为催化剂，回流反应24小时，得到黄色沉淀，过滤，得到滤饼进行重结晶，得到4-叠氮苯乙烯基苯并吡喃腈；

3）4-氨基苯乙烯基苯并吡喃腈的合成：氩气保护下，在烧瓶内加入0.89mmol4-叠氮苯乙烯基苯并吡喃腈以及50mL的乙腈作为溶剂，随后加入17.8mmol的NaHS水溶液，室温反应20小时，过滤得到红棕色固体；

4）4-（2-氯乙酰）氨基苯乙烯基苯并吡喃腈的合成：氩气保护下，在烧瓶内加入1.0mmol4-氨基苯乙烯基苯并吡喃腈以及1.4mmol对二甲氨基吡啶(DMAP)，加入20mL的干燥的二氯甲烷，随后在冰浴下滴加1.3mmol氯乙酰氯的二氯甲烷溶液5mL，室温反应2小时，旋干溶剂，柱层析分离得到黄色固体；

5）探针分子的合成：氩气保护下，在烧瓶内加入0.4mmol4-（2-氯乙酰）氨基苯乙烯基苯并吡喃腈和0.39mmol二甲基吡啶氨，0.8mmol碳酸钾，50mg碘化钾；加入30mL的干燥乙腈，60℃反应10小时，旋干溶剂，柱层析分离得到棕色固体。

3.按照权利要求1所述比率型变型受体汞离子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤3）中，所述NaHS水溶液的浓度为3mmol/mL。

4.按照权利要求1所述比率型变型受体汞离子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤4）中，所述柱层析的洗脱剂为二氯甲烷。

5.按照权利要求1所述比率型变型受体汞离子荧光探针的制备方法，其特征在于：步骤5）中，所述柱层析的洗脱剂为二氯甲烷和甲醇；其中，二氯甲烷和甲醇的体积比为100：1。

6.权利要求1所述荧光探针应用于在环境保护中检测水溶液中的汞离子及生物医药中检测细胞中的汞离子。