WO2013172544A1 - 새로운 이광자 흡수 형광체 및 이를 이용한 기질 감지 방법 - Google Patents

새로운 이광자 흡수 형광체 및 이를 이용한 기질 감지 방법 Download PDF

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WO2013172544A1
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안교한
김도경
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Definitions

  • the present invention relates to a compound which is a novel two-photon absorbing phosphor, a method for preparing the compound, a fluorescence sensor and a molecular probe capable of detecting a substrate and an enzyme activity specific to the same, and a method for detecting enzyme activity using the same. More specifically, it has a high light stability of acedan, which is a two-photon absorbing phosphor, and a large two-photon absorption cross-sectional value, while having a high fluorescence efficiency of coumarin, which is a one-photon absorbing phosphor, The present invention relates to a novel two-photon absorbing phosphor that exhibits absorption and emission properties and has advantages for in vivo imaging.
  • Two-photon (TP) absorbing phosphors have the property of receiving energy at a wavelength corresponding to half of one-photon (OP) absorbing phosphors to be excited in an excited state. Due to this, high cell permeability, low cell disruption, and less quenching effect by materials such as hemoglobin in vivo, and only the focal region is excited, it has the characteristics of achieving a very high resolution: (a) Denk. W. et al., Science, 1990, 248, 73; (b) Zipfel, W. R. et al., Nat. Biotechnol, 2003, 21, 1369; (c) Helmchen. F. et al., Nat. Methods, 2005, 2, 932.
  • Acedan (2-acyl-6-dimethylamino-naphthalene) is a representative two-photon absorbing phosphor with high photo-stability, large two-photon cross-section values, and two-photon microscopy.
  • -photon microscopy has the advantage of providing bright images: (a) Kim. H. M. et al., Angew. Chem. Int. Ed, 2007, 46, 3460; (b) Kim. H. M. et al., Angew. Che ,. Int. Ed. 2007, 46, 7445; (c) Lee. J. H. et al., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1216.
  • Coumarin is a photon absorbing phosphor widely used due to high quantum yield, light stability, brightness, and the like.
  • studies on the development of two-photon absorbing phosphors using coumarin derivatives have been insignificant.
  • Methods of analyzing or sensing specific substrates include electrical, electrochemical, thermal, magnetic, and fluorimetric sensing methods.
  • the fluorescence detection method has advantages such as high sensitivity and resolution, low cost, and portability.
  • reaction-based fluorescent probes which react with a substrate and chemically react with each other, have attracted attention. This is because reactive half-fluorescence probes are irreversible and sensitive to substrates to be selectively analyzed even in complex ambient or in vivo conditions (Jun. ME et al., Chem. Commun. 2011, 47, 7583). .
  • few studies based on two-photon absorbing phosphors among reactor-based fluorescent probes have been reported.
  • Fluorescence is a representative method of sensing substrates such as enzymes having biological properties. Accordingly, a variety of enzyme-sensing fluorescent probes have been developed: (a) Takeuchi. M. et al., Acc. Chem. Res. 2001, 34, 865; (b) Peczuh. M. W. et al., Chem. Rev. 2000, 100, 2479. However, most of these enzyme-sensing fluorescent probes are based on one-photon absorbing phosphors: (a) Chen. G. et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4544; (b) Zhou. W. et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 3122; (c) Alber. A. E. et al., Chem. Commun. 2007, 4647; (d) Aw. J. et al., Chem. Asian. J. 2010, 5, 1317.
  • MAO Monoamine oxidase
  • the present invention has been made to solve the above-mentioned problems in the prior art, and provides a compound of formula (1), a precursor of formula (2), (3), (4), (5), and a preparation method thereof, which is a new two-photon absorbing phosphor. It aims to do it.
  • Another object of the present invention is to provide a detection probe capable of detecting monoamine oxidase (MAO) using a compound of Formula 3 or Formula 4.
  • MAO monoamine oxidase
  • Another object of the present invention is to provide a method for measuring MAO enzyme activity using a compound of Formula 3 or Formula 4 and a method for screening MAO enzyme inhibitor.
  • an object of the present invention is to provide a detection probe capable of detecting a substrate specific to each by introducing the following R groups to the compound of formula (5).
  • the substrate specific for each of the six R groups is as follows.
  • Vinyl ether-Mercury Hg ion
  • Propargyl ether-Palladium Pd ion
  • 4-boronato-benzyl ether- Hydrogen peroxide H 2 O 2
  • tert-butyldimethylsilyl ether-Fluoride ion F ion
  • Homoallyl ether-Ozone O 3
  • Phosphate-phosphatease enzyme Phosphatases
  • the present invention also provides a method for preparing a compound in which vinyl ether is introduced as a R group into a compound of Formula 5, and a method for preparing a compound in which tertiary butyl dimethyl salyl ether is introduced as a R group in a compound of Formula 5.
  • the present invention provides a compound of formula (1) and provides a process for its preparation.
  • the compound of formula 1 is characterized in that the one-photon or two-photon absorbing phosphor.
  • the compound of formula (2) which is a precursor of the compound of formula (1), reacts with the substrate to break off the branch, and the intramolecular cyclization reaction occurs to generate the compound of formula (1) having fluorescence properties.
  • the present invention provides a compound of Formula 2 and a method for preparing the same, and provides a detection probe including the same.
  • the present invention also provides a compound of formula (5) and a method of preparing the same.
  • the introduced R group is hydrolyzed selectively in response to a specific substrate.
  • R groups which can be introduced into the compound of the formula (4) and the substrate of each introduced compound are as follows; Vinyl ether-Mercury (Hg ion), Propargyl ether-Palladium (Pd ion), 4-boronato-benzyl ether- Hydrogen peroxide (H 2 O 2 ) tert-butyldimethylsilyl ether-Fluoride ion (F ion), Homoallyl ether-Ozone (O 3 ) , Phosphate-phosphatease enzyme (Phosphatases). Also provided are detection probes for each specific substrate, including compounds that incorporate each R group.
  • R is a detection probe of mercury (Hg ion), including a compound that is a vinyl ether (Veryl ether), in formula (5), P is a palladium containing a compound that is a propargyl ether (Propargyl ether) Detection probe of Palladium, Pd ion, in the formula 5, R is a 4-boronato-benzyl ether, a detection probe of hydrogen peroxide (H 2 O 2 ),
  • R is a detection probe of a fluoride ion (F ion) including a compound which is tert-butyldimethylsilyl ether, wherein in Formula 5, R is a homoallyl ether
  • R is a detection probe of ozone (Ozone, O 3 ), including a compound that is ether), in the formula (5)
  • R is a detection probe of phosphatease enzyme (Phosphatases) comprising a compound that is a phosphate.
  • the compounds of Formula 3 and Formula 4 are propylamine reactive branches introduced into the compound of Formula 5, and the MAO enzyme breaks down the propylamine reactive branches to generate the compound of Formula 1, and thus may be used as a detection probe for MAO. have.
  • the present invention provides a compound of Formula 3 and Formula 4 and a method for preparing the same, and provides a detection probe for detecting MAO activity.
  • the inventors have confirmed the activity of monoamine oxidase (MAO) and the effect of an enzyme inhibitor using a fluorescent sensor comprising a compound of formula (3). In addition, it was confirmed whether the cells express MAO by using the fluorescent sensor.
  • MAO monoamine oxidase
  • the present invention provides a method for measuring MAO enzyme activity using the compound and a method for screening MAO enzyme inhibitors.
  • the present invention provides a cell imaging method using the compound of Formula 1 to Formula 5.
  • the two-photon absorbing phosphor (Formula 1, designated as IminoPOS) introduced in the present invention has a high two-photon absorption cross section, quantum efficiency, light stability, and the like. It is also useful in bioimaging studies as it absorbs and emits at longer wavelengths than conventional acedans and coumarins. In addition to two-photon microscopy, one-photon microscopy showed significantly higher fluorescence sensitivity. Therefore, it is expected that the precursor of the compound of Formula 1 (Formula 2 to 5) can be used as a detection probe having high sensitivity and selectivity for each substrate. In particular, it is expected that the compounds of Formula 3 or Formula 4 may be used for the activity and search for inhibitors of MAO enzymes, and may be used for research and treatment of diseases related to MAO enzymes such as Parkinson's disease and depression.
  • Figure 1 shows the structure of the two-photon absorbing phosphor (Compound 1, IminoPOS) introduced in this study.
  • Figure 2 compares the optical properties of acedan, coumarin 153, compound 1 (IminoPOS).
  • Figure 3 shows the absorption (left) and release (right) graphs of acedan, coumarin 153, compound 1.
  • Figure 4 shows the structure of the precursor of Compound 1 (Formula 2) and the compound production reaction mechanism of Formula (1).
  • Figure 5 shows the structure of the compound of formula 5 and the compound production reaction mechanism of formula (1).
  • Figure 6 shows the reaction mechanism (mechanism) for the MAO enzyme of the MAO activity-sensing two-photon fluorescent probe (compounds 3 and 4).
  • FIG. 7 shows absorption (up) and emission (down) spectra, respectively, under buffer solutions of compounds of Formulas 1, 3, and 4.
  • FIG. 7 shows absorption (up) and emission (down) spectra, respectively, under buffer solutions of compounds of Formulas 1, 3, and 4.
  • FIG. 9 is a graph showing the intensity of fluorescence signals generated by reacting compounds of Formulas 3 and 4 with MAO A and B, respectively.
  • FIG. 10 is a graph showing fluorescence signal intensities when mocolobemide and pargyline, which are MAO enzyme inhibitors, are added.
  • FIG. 11 is a photon electron microscope result of C6 glioma cell and Chromaffin cell treated with compound 3 and inhibitor.
  • the inventors have developed a new two-photon absorbing phosphor and invented a MAO enzyme activity sensing two photon fluorescent probe using the precursor. This study completed the invention by confirming the optical properties of phosphors and identifying the MAO enzyme activity in cells.
  • Compound 1 (IminoPOS) is a newly developed two-photon phosphor, and has a skeletal structure that hybridizes the structure of acedan and coumarin. This has a high fluorescence efficiency and a large two-photon absorption cross section. In addition, compared to the conventional acedan or coumarin, it shows the absorption and release characteristics of long wavelengths has advantages in in vivo imaging (see FIG. 1).
  • the compound of formula 2 and compound of formula 5 are the precursor structures of compound 1.
  • reactive sites that are broken by a specific substrate after reaction with the substrate, an irreversible intramolecular cyclization reaction occurs to generate a two-photon phosphor, IminoPOS. Therefore, these compounds will be usefully used as fluorescent molecular probes for specific substrates by themselves, and can also be developed as other fluorescent probes by introducing a reactive branch suitable for the substrate to be analyzed as the R group of the compound of formula (5).
  • reaction branches that can be introduced and substrates that can be analyzed are as follows.
  • Formulas 3 and 4 are two-photon probes in which a propylamine reaction branch is introduced to detect a MAO enzyme.
  • the MAO enzyme reacts with the propylamine reactive branch to break the branch ((a) Chen. G. et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4544; (b) Zhou. W. et al , J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 3122; (c) Alber. AE et al., Chem. Commun. 2007, 4647), followed by intramolecular cyclization to produce IminoPOS.
  • the activity of the MAO enzyme was confirmed by measuring the fluorescence intensity of IminoPOS through a two-photon optical microscope (see Fig. 2).
  • the compound of the present invention can be used as a fluorescence sensor having high sensitivity and selectivity.
  • the vessel was opened and dichloromethane (100 mL), water (100 mL) and saturated brine (30 mL) were added, and the organic layer was extracted using a separatory funnel. .
  • the organic layer was dried over anhydrous sodium sulfate (Na 2 SO 4 , 5 g), and concentrated using an aspirator (25 ° C., 20 to 500 mmHg).
  • the pale brown solid compound thus obtained was separated by column chromatography (silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh) (column chromatograph, diameter 6 cm, height 15 cm) (developing solution: 20% EtOAc / Hexane) afforded a white solid compound 5 (2.10 g, 60%).
  • the inventors performed the synthesis of 7- (methoxymethoxy) -N, N-dimethylnaphthalen-2-amine (7- (methoxymethoxy) -N, N-dimethylnaphthalen-2-amine).
  • chloromethyl methyl ether (0.4 mL, 5.34 mmol) was slowly added dropwise for about 5 minutes.
  • the temperature was changed to room temperature (25 ° C.), and stirred for 6 hours.
  • water 100 mL was added, and extraction was performed using ethyl acetate (EtOAc, 200 mL).
  • EtOAc ethyl acetate
  • the extracted organic layer was dried with anhydrous sodium sulfate (10 g) and water present in the organic layer.
  • the dried ethyl acetate organic layer was concentrated using an inhaler.
  • the pale brown liquid compound thus obtained was separated by column chromatography using silica gel (diameter 6 cm, height 15 cm) (developing solution: 5% EtOAc / Hexane), and a white solid compound 6 (988 mg, 80 %) Was obtained.
  • the light yellow solid compound thus obtained was separated by column chromatography using silica gel (6 cm in diameter and 15 cm in height), and then separated (developing solution: 20% EtOAc / Hexane) to give light yellow solid 7 (1.27 g, 50%).
  • the compound of formula 2 (27 mg, 0.125 mmol), malononitrile (Malononitrile, 66 mg, 0.125 mmol) and ethanol (EtOH, 2 mL) were added to a 10 mL round bottom flask. Subsequently, at room temperature, piperidine (124 uL, 1.25 mmol) was added thereto, followed by stirring for 1 hour. After 1 hour, ethanol was removed using an intake air. The red solid compound thus obtained was separated by column chromatography using silica gel (diameter 2 cm, height 15 cm) (developing solution: 40% EtOAc / Hexane) to give a red solid compound of formula 1 (29.7 mg, 90%).
  • the inventors confirmed the optical properties of compound 1, which is shown in FIGS. 1, 2 and 3.
  • acedan has an excitation wavelength of 365 nm and an emission wavelength of 501 nm
  • coumarin 153 has an excitation wavelength of 425 nm and an emission wavelength of 548 nm.
  • Figure 2 summarizes the respective optical properties
  • Figure 3 shows the respective absorption and emission graphs.
  • Absorption and emission graphs were measured using an HP 8453 UV / Vis spectrophotometer and Photon Technical International Fluorescence System, respectively, and 1 cm quartz cells were used.
  • the GM value was measured using a cavity-dumped Ti: sapphire oscillator pumped 5.0 W output frequency doubled Nd: YV04 laser (Verdi, Coherent) instrument.
  • the reference excitation wavelength is 800 nm
  • the output pulse is 40 nJ
  • the repetition rate is 380 kHz.
  • the data processing method is TPACS (two-photon induced fluorescence) method
  • 1 GM is based on 10 -50 cm 4 s photon -1 molecules -1 .
  • the inventors have indicated that 6-dimethylamino-3- ⁇ 3- [ene, en-bis (tertarybutyloxycarbonyl) amino] propyloxy ⁇ naphthylene-2-carboaldehyde (6-dimethylamino-3- ⁇ Synthesis of 3- [N, N-bis (tert-butyloxycarbonyl) amino] propyloxy ⁇ naphthalene-2-carbaldehyde) was performed.
  • the compound of formula 2 (176.6 mg, 0.82 mmol) and en-tert-butyloxycarbonyl-3- (chloropropyl) carbamic acid tert-butyl ester (N-tert-butyloxycarbonyl -3- (chloropropyl) carbamic acid tert-butyl ester, 242 mg, 0.82 mmol), and potassium carbonate (227 mg, 1.64 mmol) were dissolved in DMF (5 mL). The mixture was stirred at 50 ° C. for 27 hours.
  • the inventors have described 2- ⁇ 3- [ene, ene-bis (tertiarybutyloxycarbonyl) amino] propyloxy ⁇ -3- (2,2-dicyano) vinyl-7- (dimethylamino) naphthalene ( Synthesis of 2- ⁇ 3- [N, N-bis (tert-butyloxycarbonyl) amino] propyloxy ⁇ -3- (2,2-dicyano) vinyl-7- (dimethylamino) naphthalene) was performed.
  • the product has a development value of R f : 0.30 (30% EtOAc-one run) when analyzed by thin layer chromatography.
  • 1 H NMR (CDCl 3, 300 MHz, 293K): ⁇ 8.71 (s, 1H), 8.37 (s, 1H), 7.72-7.70 (d, 1H), 7.01-7.00 (d, 1H), 6.87 (s, 1H) , 6.68-6.67 (s, 1H), 4.16-4.14 (t, 2H), 3.87-3.84 (t, 2H), 3.16 (s, 6H), 2.20 (t, 2H), 1.52 (s, 18H).
  • the inventors have described 2- ⁇ 3- [ene-methyl-ene- (tertiarybutyloxycarbonyl) amino] propyloxy ⁇ -3- (2,2-dicyano) vinyl-7- (dimethylamino) naphthalene Synthesis of (2- ⁇ 3- [N-methyl-N- (tert-butyloxycarbonyl) amino] propyloxy ⁇ -3- (2,2-dicyano) vinyl-7- (dimethylamino) naphthalene) was performed.
  • the inventors have described 2- ⁇ [3- [3-aminopropoxy) -6- (dimethylamino) naphthlen-2-yl] methylene ⁇ malononitrile (2- ⁇ [3- (3-aminopropoxy)- Synthesis of 6- (dimethyamino) naphthalene-2-yl] methylene ⁇ malononitrile was performed.
  • compound 10a (51.1 mg, 0.1 mmol) and triisopropylsilane (3 ⁇ L) were mixed in dichloromethane (3 mL) and trifluoroacetic acid (3) in a 25 mL round bottom flask. mL). The argon balloon was plugged in, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 1 hour, and then concentrated using an inhaler. The resulting dark red solid compound (Compound 3) was used without further purification.
  • the inventors have described 2-( ⁇ 6-dimethylamino-3-[(3-methylamino) propoxy] -naphthalen-2-yl ⁇ methylene) malonitrile (2-( ⁇ 6-dimethylamino-3-[( 3-methylamino) propoxy] -naphthalen-2-yl ⁇ methylene) malononitrile) was carried out.
  • the present inventors confirmed the optical properties of the compounds 1, 3, 4, it is shown in FIG.
  • the inventors performed absorption and fluorescence emission experiments of compounds 1, 3 and 4 under buffer solutions (100 mM HEPES, pH 7.4 with 5% glycerol and 1% DMSO) at concentrations of 10 ⁇ M, respectively.
  • Absorption spectra were HP 8453 UV / Vis spectrophotometer and Photon Technical International Fluorescence System.
  • As a cell for fluorescence measurement a quartz cell of 1 cm was used. Fluorescence graphs were measured with an excitation wavelength of 448 nm.
  • the upper part of FIG. 3 is an absorption graph and the lower part is an emission graph.
  • the present inventors analyzed the activity of the MAO enzyme using the compounds of Formula 3 and Formula 4, which are shown in FIG. 8.
  • the inventors performed enzyme kinetic assays using 96-well fluorescence assay plates.
  • the concentration of the compound of Formula 3 was used from 0 ⁇ M to 800 ⁇ M, and the MAO A and B enzymes used 10 ⁇ g / mL.
  • the buffer solution was the same as in Example 4, 96-well fluorescence assay plate was stored for 3 hours at 37 °C. After 3 hours, the fluorescence intensity was observed using a microplate spectrofluorometer (VICTOR 3 VTM multilabel counter, Perkin Elmer-Wellesley, MA, USA).
  • the excitation wavelength is 465 nm and the emission wavelength is recorded at 600 nm.
  • Michaelis-Menten constants were calculated from the enzyme activity graph, using the Origin program.
  • the present inventors observed the fluorescence change by the reaction with the MAO enzyme using the compounds of Formulas 3 and 4, it is shown in Figure 9.
  • the inventors have determined that the compound is at a concentration corresponding to each Michaelis-Menten constant value (Formula 3 / MAO A; 70 ⁇ M, Formula 4 / MAO B; 252 ⁇ M, Formula 3 / MAO B; 75 ⁇ M, Formula 4 / MAO B). ; 210 ⁇ M) and 50 ⁇ g / mL of MAO enzyme was performed under fluorescence emission experiments in buffer solution (100 mM HEPES, pH 7.4 with 5% glycerol and 1% DMSO). Photon Technical International Fluorescence system was used for fluorescence graph measurement. The cell for fluorescence measurement was a standard quartz cell of 1 cm width. The fluorescence graph was measured by excitation wavelength of 448 nm after 3 hours storage at 37 °C.
  • the present inventors observed the effect of the MAO enzyme inhibitor while observing the activity of the MAO enzyme using the compound of Formula 3, which is shown in FIG. 10.
  • the inventors performed the enzyme activity measurement and enzyme inhibitor experiment using a 96-well fluorescence assay plate.
  • MAO A (10 ⁇ g / mL) and MAO B (10 ⁇ g / mL) enzymes were stored at 37 ° C. for 2 hours with inhibitors of moclobemide (70 ⁇ M) and parziline (70 ⁇ M), respectively. .
  • the compound of Formula 3 (70 ⁇ M) was treated and fluorescence was observed in 10 minute increments over 3 hours.
  • the buffer solution and the fluorescence observation method are the same as in Example 4.
  • Moclobemide is known to be an inhibitor of MAO A enzyme and Pargyline is known to be an inhibitor of MAO B enzyme.
  • Moclobemide was treated with MAO A, the increase in fluorescence signal was smaller than that of Pargyline. Thus, MAO A was effectively inhibited by Moclobemide.
  • Pargyline was treated with MAO B, the increase in fluorescence signal was smaller than that of Moclobemide, indicating that MAO B was inhibited by Pargyline.
  • Example 8 Measurement of one-photon electron microscope of C6 glioma cell and Chromaffin cell treated with compound of formula 3 and inhibitor
  • the present inventors observed the fluorescence change treated with Compound 1 and Formula 3 in C6 glioma cell and Chromaffin cell, respectively, and the fluorescence change treated with MAO enzyme inhibitor through a photon electron microscope.
  • C6 glioma cells are representative of cells without MAO enzyme expression (Aw. J. et al., Chem. Asian. J. 2010, 5, 1317.) and Chromaffin cells are overexpressed with MAO B. Cells known to be present (Youdim. MBH et al., Science 1984, 224, 619.).
  • C6 glioma cells and Chromaffin cells were prepared with a density of 2 ⁇ 10 6 cells in a 60 mm dish (Park. Y. et al., Endocrinology 2006, 147, 1349). Each cell was stored in solvent conditions of DMEM (Hyclone), 10% fetal bovine serum (Hyclone) and 1% antibiotics (WelGENE), 5% CO 2 -95% air and 37 ° C.
  • DMEM Hyclone
  • 10% fetal bovine serum Hyclone
  • WelGENE 1% antibiotics
  • Cell fluorescence imaging was performed by treating each cell dish with 100 ⁇ M of Compound 1 and Formula 3, respectively, and storing for 1 hour under the same storage conditions, followed by fluorescence imaging microspcope (Axiovert 200M, Carl Zeiss). ) was measured. Compounds that did not penetrate into cells prior to fluorescence measurement were removed by pipette suction, phosphate buffer saline (PBS) buffer was added and fluorescence was observed. The excitation wavelength is 435-455 nm and the emission wavelength is recorded at 555-575 nm.
  • PBS phosphate buffer saline
  • each cell dish was treated with 100 ⁇ M of inhibitor, and the storage process under the same conditions was performed. Subsequently, 100 ⁇ M of the compound of Formula 3 was treated, and fluorescence was measured after 1 hour storage under the same conditions.
  • the present inventors observed the fluorescence changes treated with Compounds 1 and 3 in C6 glioma cells and Chromaffin cells, respectively, and the fluorescence changes treated with MAO enzyme inhibitors through a two-photon electron microscope, and are shown in FIG. 12.
  • Cell preparation and fluorescence measurement method were the same as in Example 8, two-photon electron microscope was used for fluorescence observation.
  • the two-photon electron microscope consists of an Upright microscope (BX51, Olympus) and a 20x objective lens (XLUMPLFLN-W, NA 1.0 water immersion, Olympus), and a Ti: Sapphire laser (Chameleon Ultra, Coherent).
  • BX51, Olympus Upright microscope
  • XLUMPLFLN-W NA 1.0 water immersion, Olympus
  • Ti: Sapphire laser Chameleon Ultra, Coherent
  • Compound 1 also provided bright two-photon cell images ( Figure 12, a, c).
  • fluorescence of IminoPOS was not observed in the C6 glioma cells treated with the compound of Formula 3 (FIG. 12, b), and IminoPOS was generated in the Chromaffin cell (FIG. 12, d).
  • Inhibitor treated cells showed the same results as in the photon experiment.
  • the production of IminoPOS was observed when Moclobemide was treated in Chromaffin cells (Fig. 12, e), but not when Pargyline was treated (Fig. 12, f).
  • the present inventors confirmed the fluorescence change characteristic of the mercury ion (Hg ion) of the compound 13, it is shown in FIG.
  • Dissolve Compound 2 (300 mg, 1.394 mmol) in DCM (10 mL), add 4-dimethylaminopyridine (DMAP, 5 mg, 0.0187 mmol), and Et 3 N (0.2ml, 1.394 mmol) in that order. The temperature was lowered to °C. After checking the temperature, t-butyldimethylsilyl chloride (252.1 mg, 1.6725 mmol) was dissolved in 5 mL of DCM and slowly added thereto. This mixture was gradually changed to room temperature and stirred for 12 hours. After 12 hours, extraction was performed using 10 mL of saturated NaHCO 3 aqueous solution and 60 mL of DCM.
  • DMAP 4-dimethylaminopyridine
  • Et 3 N 0.2ml, 1.394 mmol
  • the present inventors confirmed the fluorescence change characteristic of the compound 15 of the fluoride ion (F ion), which is shown in FIG.
  • the two-photon absorbing phosphor of the present invention absorbs and emits at a longer wavelength than the conventional phosphor, it can be used for bioimaging research. It is expected to be utilized as a detection probe with selectivity. In addition, it is expected that the compounds of formula (3) or formula (4) of the present invention may be used for research and treatment of diseases related to MAO enzymes.

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Abstract

본 발명은 새로운 이광자 흡수 형광체인 화합물, 화합물의 제조방법, 이를 이용하여 각 기질 또는 효소 활성 등을 감지할 수 있는 형광 센서 및 분자 프로브, 및 이를 이용하여 효소 활성 등을 감지하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 이광자 흡수 형광체인 아세단의 높은 광안정성과 큰 이광자 흡수 단면 값을 가지고, 일광자 흡수 형광체인 쿠마린의 높은 형광 효율을 가지면서, 기존의 아세단이나 쿠마린에 비해 장파장의 흡수와 방출 특성을 보여 생체 내 영상화에 장점을 가진 새로운 이광자 흡수 형광체에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화합물을 이용하여 각 기질에 대한 높은 민감도 및 선택성을 가지는 형광 센서로 활용할 수 있고, 특히 MAO 효소의 활성 및 억제제 탐색에 이용하여 기분장애 등 MAO 효소가 관계된 질환 연구 및 치료에 이용할 수 있다.

Description

새로운 이광자 흡수 형광체 및 이를 이용한 기질 감지 방법
본 발명은 새로운 이광자 흡수 형광체인 화합물, 화합물의 제조방법, 이를 이용하여 각각에 특이적인 기질 및 효소 활성 등을 감지할 수 있는 형광 센서 및 분자 프로브, 및 이를 이용하여 효소 활성 등을 감지하는 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 이광자 흡수 형광체인 아세단의 높은 광안정성과 큰 이광자 흡수 단면 값을 가지고, 일광자 흡수 형광체인 쿠마린의 높은 형광 효율을 가지면서, 기존의 아세단이나 쿠마린에 비해 장파장의 흡수와 방출 특성을 보여 생체 내 영상화에 장점을 가진 새로운 이광자 흡수 형광체에 관한 것이다.
이광자(two-photon, TP) 흡수 형광체는 일광자(one-photon, OP) 흡수 형광체의 절반에 해당하는 파장의 에너지를 받아 들뜬상태(excited state)로 여기(excitation)되는 특성을 가진다. 이로 인하여 높은 세포 투과성, 낮은 세포 파괴성, 생체 내 헤모글로빈 등의 물질에 의한 소광(quenching) 영향을 적게 받는 장점과 함께 초점 부위만 여기 되므로 매우 높은 해상도를 구현할 수 있는 특징을 가진다: (a) Denk. W. et al., Science, 1990, 248, 73; (b) Zipfel, W. R. et al., Nat. Biotechnol, 2003, 21, 1369; (c) Helmchen. F. et al., Nat. Methods, 2005, 2, 932.
아세단(Acedan, 2-acyl-6-dimethylamino-naphthalene)은 대표적인 이광자 흡수 형광체로서 높은 광안정성(photo-stability) 및 큰 이광자 흡수 단면(two-photon cross-section) 값을 가지며, 이광자 현미경(two-photon microscopy)에서 밝은 영상을 제공해 주는 장점을 가진다: (a) Kim. H. M. et al., Angew. Chem. Int. Ed, 2007, 46, 3460; (b) Kim. H. M. et al., Angew. Che,. Int. Ed. 2007, 46, 7445; (c) Lee. J. H. et al., J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 1216.
쿠마린(coumarin)은 높은 형광효율(quantum yield) 및 광 안정성, 밝기(brightness) 등으로 인하여 널리 사용되는 일광자 흡수 형광체이다. 하지만 현재까지 쿠마린 유도체를 이용한 이광자 흡수 형광체의 개발 연구는 미미한 실정이다.
특정 기질을 분석하거나 감지하는 방법에는 전기적(electrical), 전기화학적(electrochemical), 열적(thermal), 자기적(magnetic), 형광(fluorimetric) 감지 방법 등이 있다. 그 중 형광감지 방법은 높은 민감도 및 분해능, 저렴한 가격, 휴대성 등의 장점을 가진다. 최근 형광감지 프로브의 연구 동향으로서 기질(substrate)과 감응해 화학적으로 반응을 동반하는 반응기반 형광 프로브(reaction-based fluorescent probe)가 주목 받고 있다. 그 이유는 반응기반 형광 프로브는 그 반응이 비가역적이고 복잡한 주변 환경이나 생체 내 조건에서도 선택적으로 분석하고자 하는 기질과 감응하기 때문이다(Jun. M. E. et al., Chem. Commun. 2011, 47, 7583). 현재까지 반응기반 형광 프로브 중 이광자 흡수 형광체를 바탕으로 한 연구는 별로 보고되지 않았다.
생물학적 특성을 가지는 효소 등과 같은 기질을 감지하는 방법 중 대표적인 것은 형광감지 방법이다. 이에 따라 다양한 종류의 효소 감지 형광 프로브가 개발되었다: (a) Takeuchi. M. et al., Acc. Chem. Res. 2001, 34, 865; (b) Peczuh. M. W. et al., Chem. Rev. 2000, 100, 2479. 하지만 이러한 효소 감지 형광 프로브는 그 대부분이 일광자 흡수 형광체를 바탕으로 하고 있다: (a) Chen. G. et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4544; (b) Zhou. W. et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 3122; (c) Alber. A. E. et al., Chem. Commun. 2007, 4647; (d) Aw. J. et al., Chem. Asian. J. 2010, 5, 1317.
모노아민 옥시데이즈 (MAO, monoamine oxidase) 효소는 신경전달물질인 아드레날린(adrenaline), 세로토닌(serotonin), 도파민(dopamine) 등의 항상성(homeostasis)을 유지시켜주는 중요한 요소이다. 파킨슨 병이나 우울증 등의 신경계 질환의 경우 MAO의 활성이 통제되지 못하는 것에 의해 발생되는데, 이러한 질병의 치료에 있어 효소의 활성을 감지하는 것은 중요한 연구 가치를 가진다(Chen. G. et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4544). MAO 효소는 구조 및 특성에 따라 MAO A와 MAO B로 구분된다.
본 발명은 상기와 같은 종래 기술상의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 새로운 이광자 흡수 형광체인 화학식 1의 화합물 및 그 전구체인 화학식 2, 화학식 3, 화학식 4, 화학식 5의 화합물 및 그 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물을 이용한 모노아민 옥시데이즈(MAO)를 감지할 수 있는 검출 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물을 이용한 MAO 효소 활성(enzyme activity) 측정방법 및 MAO 효소 저해제(inhibitor) 탐색 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 화학식 1 내지 화학식 5의 화합물을 이용한 세포 영상화(imaging) 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한 본 발명은 화학식 5의 화합물에 각각 다음과 같은 R기를 도입하여 각각에 특이적인 기질을 감지할 수 있는 검출 프로브를 제공하는 것을 목적으로 한다. 여기서 6개의 R기와 각각에 특이적인 기질은 다음과 같다.
바이닐 이써(Vinyl ether) - 수은 이온(Mercury, Hg ion), 프로파질 이써(Propargyl ether) - 팔라듐 이온(Palladium, Pd ion), 4-보로네이토-벤질 이써(4-boronato-benzyl ether) - 과산화수소수(H2O2) 터셔리부틸-다이메틸-실릴 이써(t-butyldimethylsilyl ether) - 플로라이드 이온(Fluoride ion, F ion), 호모알릴 이써 (Homoallyl ether) - 오존 (Ozone, O3), 포스페이트 (Phosphate) - 포스페테이즈 효소 (Phosphatases)이다.
또한 본 발명은 화학식 5의 화합물에 R기로서 바이닐 이써를 도입한 화합물의 제조 방법 및 화학식 5의 화합물에 R기로서 터셔리부틸 다이메틸 살릴 이써를 도입한 화합물의 제조방법을 제공한다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 화학식 1의 화합물을 제공하고, 그 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 화학식 1의 화합물은 일광자 또는 이광자 흡수 형광체인 것을 특징으로 한다.
또한, 화학식 1의 화합물의 전구체인 화학식 2의 화합물은 기질과 반응하면 반응 가지가 끊어지며 분자 내 고리화 반응이 일어나 형광 특성을 갖는 화학식 1의 화합물이 생성되므로, 이를 이용하여 검출 프로브로 활용할 수 있다.
이에 본 발명은 화학식 2의 화합물 및 그 제조 방법을 제공하고, 이를 포함하는 검출 프로브를 제공한다.
또한 본 발명은 화학식 5의 화합물 및 그 제조방법을 제공한다. 다이메틸 이써와 터셔리부틸 다이메틸-살릴 이써를 도입한 화합물을 제조하는 방법을 제공한다. 도입된 R기는 특정 기질과 선택적으로 감응하여 가수분해 된다. 화학식 4의 화합물에 도입 가능한 R기 및 각 도입된 화합물의 기질은 다음과 같다; 바이닐 이써(Vinyl ether) - 수은 이온(Mercury, Hg ion), 프로파질 이써(Propargyl ether) - 팔라듐 이온(Palladium, Pd ion), 4-보로네이토-벤질 이써(4-boronato-benzyl ether) - 과산화수소수(H2O2) 터셔리부틸-다이메틸-실릴 이써(t-butyldimethylsilyl ether) - 플로라이드 이온(Fluoride ion, F ion), 호모알릴 이써 (Homoallyl ether) - 오존 (Ozone, O3), 포스페이트 (Phosphate) - 포스페테이즈 효소 (Phosphatases)이다. 또한 각각의 R기를 도입한 화합물을 포함하는, 각각의 특이적인 기질에 대한 검출 프로브를 제공한다. 즉, 화학식 5에서 R은 바이닐 이써(Vinyl ether)인 화합물을 포함하는, 수은 이온(Mercury, Hg ion)의 검출 프로브, 화학식 5에서 R은 프로파질 이써(Propargyl ether)인 화합물을 포함하는, 팔라듐 이온(Palladium, Pd ion)의 검출 프로브, 화학식 5에서 R은 4-보로네이토-벤질 이써(4-boronato-benzyl ether)인 화합물을 포함하는, 과산화수소수(H2O2)의 검출 프로브, 화학식 5에서 R은 터셔리부틸-다이메틸-실릴 이써(t-butyldimethylsilyl ether)인 화합물을 포함하는, 플로라이드 이온(Fluoride ion, F ion)의 검출 프로브, 화학식 5에서 R은 호모알릴 이써 (Homoallyl ether)인 화합물을 포함하는, 오존 (Ozone, O3)의 검출 프로브, 화학식 5에서 R은 포스페이트 (Phosphate)인 화합물을 포함하는, 포스페테이즈 효소 (Phosphatases)의 검출 프로브를 제공한다.
한편, 화학식 3 및 화학식 4의 화합물은 화학식 5의 화합물에 프로필아민 반응가지를 도입한 것으로서, MAO 효소는 프로필아민 반응가지를 끊어내어 화학식 1의 화합물을 생성하므로, MAO에 대한 검출 프로브로 활용할 수 있다.
이에 본 발명은 화학식 3 및 화학식 4의 화합물 및 그 제조방법을 제공하고, 이를 포함하는 MAO 활성 감지용 검출 프로브를 제공한다.
본 발명자들은 모노아민 옥시데이즈(MAO)의 활성 및 효소 저해제의 효과를 화학식 3의 화합물을 포함하는 형광 센서를 이용해 확인하였다. 또한 세포가 MAO를 발현하는지 여부를 상기 형광 센서를 이용해 확인하였다.
따라서 본 발명은 상기 화합물을 이용한 MAO 효소 활성(enzyme kinetics) 측정, MAO 효소 저해제(inhibitor) 탐색 방법을 제공한다.
본 발명자들은 화학식 1의 화합물의 형광 특성을 세포 이미징에 사용할 수 있음을 확인하였다. 따라서 본 발명은 화학식 1 내지 화학식 5의 화합물을 이용한 세포 이미징 방법을 제공한다.
본 발명에 소개된 이광자 흡수 형광체(화학식 1, IminoPOS라 명명)는 높은 이광자 흡수 단면 및 양자 효율, 광 안정성 등을 가진다. 또한 기존의 형광체인 아세단과 쿠마린에 비해 장파장에서 흡수 및 방출을 함에 따라 생체 영상화 연구에 있어서 유용하다. 이광자 현미경 뿐 아니라 일광자 현미경에서도 상당히 높은 형광 감도를 보였다. 따라서, 화학식 1의 화합물의 전구체(화학식 2 내지 5)를 이용하여 각 기질에 대한 높은 민감도 및 선택성을 가지는 검출 프로브로 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 특히, 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물을 MAO 효소의 활성 및 억제제 탐색에 이용하여 파킨슨 병, 우울증 등 MAO 효소가 관계된 질환 연구 및 치료에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 본 연구에 소개된 이광자 흡수 형광체(화합물 1, IminoPOS)의 구조를 나타낸 것이다.
도 2는 아세단, 쿠마린 153, 화합물 1(IminoPOS)의 광학적 특성을 비교한 것이다.
도 3은 아세단, 쿠마린 153, 화합물 1의 흡수(좌) 및 방출(우) 그래프를 나타낸 것이다.
도 4는 화합물 1의 전구체(precursor, 화학식 2)의 구조 및 화학식 1의 화합물 생성 반응기작을 나타낸 것이다.
도 5는 화학식 5의 화합물의 구조 및 화학식 1의 화합물 생성 반응기작을 나타낸 것이다.
도 6은 MAO 활성감지 이광자 형광 프로브(화학식 3 및 4의 화합물)의 MAO 효소에 대한 반응 기작(mechanism)을 나타낸 것이다.
도 7은 화학식 1, 3, 4의 화합물의 완충용액 (buffer solution) 하에서 흡수(absorption)(상) 및 방출(emission)(하) 스펙트럼을 각각 나타낸 것이다.
도 8은 MAO A, B 효소와 화학식 3, 4의 화합물을 완충용액에 첨가하여 효소의 활성을 형광 세기로 관측한 결과이다. 표는 효소 활성 그래프로 부터 마이컬리스- 멘턴(Michaelis-Menten) 상수를 계산한 값이다.
도 9는 화학식 3, 4의 화합물을 MAO A, B와 각각 반응시켜 발생되는 형광 신호의 세기를 나타낸 그래프이다.
도 10은 MAO 효소 저해제(inhibitor)인 모클로베마이드(mocolobemide)와 파질린(pargyline)을 첨가하였을 때의 형광 신호 세기를 나타낸 그래프이다.
도 11은 화합식 3의 화합물 및 저해제를 처리한 C6 glioma cell과 Chromaffin cell의 일광자 전자 현미경 결과이다.
도 12은 화학식 3의 화합물 및 저해제를 처리한 C6 glioma cell과 Chromaffin cell의 이광자 전자 현미경 결과이다.
도 13은 관측 결과 수은 이온(HgCl2)의 농도 증가에 따라 형광이 증가함을 나타낸 결과이며(좌측 그래프), 또한 3 μM의 수은이온을 첨가 후 시간에 따른 형광변화를 관찰한 결과 시간 경과에 따라 형광이 증가함을 나타낸 결과이다(우측 그래프).
도 14는 관측 결과 플로라이드 이온(NaF, 20mM)을 첨가한 후 시간에 따른 형광이 증가하는 것을 관측한 것이며(좌측 그래프), 또한 20 μM의 농도의 화합물 15와 함께 다양한 종류의 음이온을 첨가 후 형광 증가를 확인한 결과 오직 플로라이드 이온만이 선택적으로 반응하여 형광증가를 유도함을 관찰한 결과이다 (우측 그래프). 우측 그래프의 형광세기는 595 nm에서 관측된 것이다.
본 발명자들은 새로운 이광자 흡수 형광체를 개발하고, 그 전구체를 이용한 MAO 효소 활성감지 이광자 형광 프로브를 발명하였다. 본 연구는 형광체의 광학적 특성을 확인하고, 세포 내에서 MAO 효소 활성을 규명함으로서 발명을 완성하였다.
화합물 1(IminoPOS)은 새롭게 개발된 이광자 형광체로서, 아세단과 쿠마린의 구조를 혼성한 골격구조를 가지고 있다. 이에 높은 형광 효율과, 큰 이광자 흡수 단면 값을 가진다. 또한, 기존의 아세단이나 쿠마린에 비해 장파장의 흡수와 방출 특성을 보여 생체 내 영상화에 장점을 가진다 (도 1 참조).
화학식 2의 화합물 및 화학식 5의 화합물은 화합물 1의 전구체 구조이다. 특정 기질에 의해 결합이 끊어지는 반응 가지(reactive site)를 도입함에 따라 기질과 반응 후, 비가역적 분자내 고리화 반응이 일어나 이광자 형광체인 IminoPOS를 생성한다. 따라서 이 화합물들은 그 자체로서 특정 기질에 대한 형광 분자 프로브로서 유용하게 사용될 것이며, 또한 화학식 5의 화합물의 R 기로서 분석하고자 하는 기질에 적합한 반응가지를 도입함으로서 다른 형광 프로브로서 개발될 수 있다
(도 5 참조). 이에 도입할 수 있는 반응 가지와, 분석할 수 있는 기질은 다음과 같다.
괄호 안의 논문은 각 반응기가 각 기질에 선택적으로 반응할 수 있다는 내용을 담은 것으로, 각 반응기를 도입한 화합물은 모두 신규한 것이다.
표 1
화학식 5에 도입 가능한 R기 분석 가능한 기질 관련논문
바이닐 이써(Vinyl ether) 수은 이온(Mercury, Hg ion) (Santra. M. et al. Chem. Commun. 2009, 2115)
프로파질 이써(Propargyl ether) 팔라듐 이온(Palladium, Pd ion) (Santra. M. et al. Chem. Commun. 2010, 46, 3964)
4-보로네이토-벤질 이써(4-boronato-benzyl ether) 과산화수소수(H2O2) (Chang. M. et al. J. Am. Chem. Soc. 2004, 126, 15392)
터셔리부틸-다이메틸-실릴 이써(t-butyldimethylsilyl eter) 플로라이드 이온(Fluoride ion, F ion) (Kim. T. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2003, 42, 4803)
호모알릴 이써 (Homoallyl ether) 오존 (Ozone, O3) (Garner. A. L. et al. Nat. Chem. 2009, 1, 316)
포스페이트 (Phosphate) 포스페테이즈 효소 (Phosphatases) (Kim. T. et al. Chem. Commun. 2011, 47, 9825)
수은 프로브와 플로라이드 프로브의 합성 방법 및 NMR 데이터는 실시예 10 및 실시예　11에 기재되어 있다.
화학식 3 및 4는 MAO 효소를 감지하기 위해 프로필아민(propylamine) 반응가지가 도입된 이광자 프로브이다. MAO 효소는 프로필아민 반응가지와 반응해 가지를 끊어내게 되며 ((a) Chen. G. et al., J. Am. Chem. Soc. 2005, 127, 4544; (b) Zhou. W. et al., J. Am. Chem. Soc. 2006, 128, 3122; (c) Alber. A. E. et al., Chem. Commun. 2007, 4647), 이어서 분자내 고리화 반응을 통해 IminoPOS를 생성하게 된다. MAO 효소의 활성은 이광자 광학 현미경을 통해 IminoPOS의 형광세기를 측정함으로서 확인된다(도 2참조).
화합물 1, 3, 4의 형광 특성은 완충용액 (buffer solution)에서 측정되었으며, 형광 켜짐(turn-on) 특성을 나타낸다(도 3, 4, 6 참조). 그리고 MAO 효소의 저해제인 모클로베마이드(moclobemide와 파질린(pargyline)을 첨가한 실험을 통해 효소 저해제의 활성 실험도 수행되었다(도 10 참조). 최종적으로 화합물 3을 이용하여, C6 glioma cell과 Chromaffin cell 에서의 MAO 활성을 관측하였다(도 11, 12 참조).
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 화합물을 민감도와 선택성이 높은 형광 센서로 이용할 수 있음이 명백하다.
따라서 이를 이용하여 MAO 등 효소 활성 및 효소 저해제 탐색에 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.
화합물 1의 일반적인 합성 경로는 하기 도식 1에 나타내었다.
[도식 1]
Figure PCTKR2013002335-appb-I000001
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시 예에 본 발명 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 화학식 2와 화학식 1의 화합물의 합성
(1) 7-(다이메틸아미노)나프탈렌-2-올 (7-(dimethylamino)naphthalen-2-ol) (상기 도식 1의 5번 화합물) 의 합성
본 발명자들은 7-(다이메틸아미노)나프탈렌-2-올 (7-(dimethylamino) naphthalen-2-ol) 의 합성을 수행하였다.
합성 출발 물질인 4번 화합물(3 g, 18.7 mmol, Sigma-aldrich, D116408)와 소디움 메타바이설파이트 (Na2S2O5, 7.11 g, 37.4 mmol)가 들어있는 밀폐 용기(sealed-tube)에 물(H2O, 8 mL)과 다이메틸아민 수용액(dimethylamine solution, 40% in H2O, 10.5 mL, 93.5 mmol)을 첨가하고 용기를 막았다. 이 혼합물을 실리콘 오일 용기를 이용하여 150 ℃에서 8 시간 교반시켰다. 다음에 상온(25 ℃)으로 반응물의 온도를 낮춘 후 용기를 열어 다이클로로메탄(dichloromethane, 100 mL), 물(100 mL), 포화 소금물(30 mL)을 넣고 분별 깔때기를 이용하여 유기층을 추출했다. 유기층을 무수황산나트륨 (Na2SO4, 5 g)으로 건조하고, 흡기기(aspirator)를 이용(25 ℃, 20~500 mmHg)하여 농축했다. 이렇게 얻어지는 옅은 갈색의 고체 화합물은 실리카겔(silica gel, Merck-silicagel 60, 230-400 mesh)을 이용한 관 크로마토그래피(column chromatograph, 직경 6 cm, 높이 15 cm)를 이용하여 분리(전개 액: 20% EtOAc/Hexane)하여 흰색의 고체 화합물 5(2.10 g, 60%)를 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피(TLC, thin layer chromatography, silical gel 60F-254 glass plate, Merck)로 분석하면 Rf = 0.25(20% EtOAc/Hexane - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 7.66-7.59(m, 2H), 7.05-7.02(m, 1H), 6.96-6.95(d, 1H), 6.85-6.82(m, 1H), 6.78-6.77(d, 1H), 5.10(s, 1H), 3.05(s, 6H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ153.88, 149.17, 136.24, 129.39, 128.61, 122.44, 114.22, 113.80, 108.02, 105.32, 40.91. HRMS: m/z calcd. for C12H13NO 187.0997 found 187.0999.
(2) 7-(메톡시메톡시)-N,N-다이메틸나프탈렌-2-아민 (7-(methoxymethoxy)-N,N-dimethylnaphthalen-2-amine)(상기 도식 1의 6번 화합물) 의 합성
본 발명자들은 7-(메톡시메톡시)-N,N-다이메틸나프탈렌-2-아민 (7- (methoxymethoxy)-N,N-dimethylnaphthalen-2-amine) 의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 디엠에프 (DMF, N,N-dimethylformamide, 5 mL) 용매에 소디움 하이드라이드 (NaH, sodium hydride, 235 mg, 5.875 mmol)를 넣고 아르곤(argon) 풍선을 꽂아 준 후, 포화 소금물과 얼음을 이용하여 -15℃로 온도를 낮추어 주었다. 이 혼합 용액에 5번 화합물 (1 g, 5.34 mmol)를 DMF (5 mL)에 녹인 후, 온도를 유지한 상태에서 약 5분간 서서히 한 방울씩 넣어주었다. 이 과정에서 H2 gas가 발생하게 되는데, 이것은 실리콘오일 트랩 (silicon oil trap)을 거친 후 옥외로 배출시켰다. 동일한 온도에서 1시간 교반시킨 후, 트랩에서 방울(H2 gas)이 더 이상 발생하지 않는 것을 확인하였다. 이어서, 클로로메틸 메틸 에테르 (chloromethyl methyl ether, 0.4 mL, 5.34 mmol)를 약 5분간 서서히 한 방울씩 넣어주었다. 주입이 완료되면, 온도를 상온 (25 ℃)으로 바꾸어주고, 6시간을 교반시켰다. 6시간 후, 물(100 mL)를 넣어주고, 에틸아세테이트(EtOAc, 200 mL)를 이용하여 추출을 수행하였다. 추출된 유기층(EtOAc)은 무수황산나트륨(10 g)으로 유기층 내 존재하는 물을 건조하였다. 건조된 에틸아세테이트 유기층은 흡기기를 이용해 농축하였다. 이렇게 얻어진 옅은 갈색의 액체 화합물은 실리카겔을 이용한 관 크로마토그래피 (직경 6 cm, 높이 15 cm)방법을 통하여 분리(전개 액: 5% EtOAc/Hexane)하며, 흰색의 고체 6번 화합물(988 mg, 80%)을 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피로 분석하면 Rf = 0.45(20% EtOAc/Hexane - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 7.75(d, 1H), 7.72(d, 1H), 7.40-7.39(d, 1H), 7.15-7.08(m, 2H), 6.98-6.97(d, 1H), 5.39(s, 2H), 3.69(s, 3H), 3.11(s, 6H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ 155.75, 149.16, 136.23, 129.11, 128.55, 123.00, 114.99, 114.58, 108.69, 105.96, 94.62, 56.07, 40.83. HRMS: m/z calcd. for C14H17NO2 231.1259 found 231.1262.
(3) 6-(다이메틸아미노)-3-(메톡시메톡시)-2-나프트알데하이드 (6-(dimethylamino)-3-(methoxymethoxy)-2-naphthaldehyde) 의 합성
본 발명자들은 6-(다이메틸아미노)-3-(메톡시메톡시)-2-나프트알데하이드 (6-(dimethylamino)-3-(methoxymethoxy)-2-naphthaldehyde) (상기 도식 1에서 7번 화합물) 의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 100 mL 라운드 바텀 플라스크 (round-bottom flask)에 6번 화합물 (2.2606 g, 9.774 mmol)을 넣은 후, 아르곤 풍선을 꽂아주었다. 이어서 에틸 에테르(Et2O, 50 mL)을 넣어주고, 포화된 소금물과 얼음을 이용하여 온도를 -20 ℃로 낮추었다. 온도 확인 후, 3차 부틸리튬 (tert-BuLi, 8.6 mL, 14.66 mmol)을 약 30분에 걸쳐 서서히 한 방울씩 넣어주었다. 이때 색깔은 서서히 짙은 갈색으로 바뀌며, 주입이 완료되면 같은 온도에서 2시간을 교반시켰다. 2시간 교반 후, DMF (1.3 mL, 16.62 mmol)를 약 5분에 걸쳐 서서히 한 방울씩 넣어주었다. 주입이 완료되면 동일한 온도에서 1시간을 교반하며, 이때 색깔은 점차 밝은 노란색으로 변했다. 1시간 교반 후, 4N HCl (10 mL)와 1차 증류수(10 mL)를 넣어주고 10분간 교반했다. 10분 후, EtOAc (300 mL)와 포화 소금물(100 mL), 물(200 mL)를 이용하여 추출과정을 수행했다. 추출을 통해 얻어진 유기층(EtOAc)은 무수황산나트륨(15 g)으로 유기층 내 존재하는 물을 건조하고, 흡기기를 이용하여 농축했다. 이렇게 얻어지는 밝은 노란색의 고체 화합물은 실리카겔을 이용한 관 크로마토그래피 (직경 6 cm, 높이 15 cm)방법을 이용하여 분리(전개 액: 20% EtOAc/Hexane)하여 밝은 노란색의 고체 7번 화합물(1.27 g, 50%)을 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피로 분석하면 Rf = 0.25(20% EtOAc/Hexane - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 10.49(s, 1H), 8.25(s, 1H), 7.75-7.73(d, 1H), 7.29-7.24(d, 1H), 7.05-7.03(dd, 1H), 6.77-6.76(d, 1H), 5.40(s, 2H), 3.59(s, 3H), 3.12(s, 6H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ 189.61, 155.99, 150.71, 139.74, 131.16, 130.89, 122.26, 121.29, 114.76, 107.66, 104.30, 94.75, 56.39, 40.32. HRMS: m/z calcd. for C15H17NO3 259.1208 found 259.1211.
(4) 6-(다이메틸아미노)-3-하이드록시-2-나프트알데하이드 (6-(dimethylamino)-3-hydroxy-2-naphthaldehyde) (화학식 2의 화합물) 의 합성
본 발명자들은 6-(다이메틸아미노)-3-하이드록시-2-나프트알데하이드 (6-(dimethylamino)-3-hydroxy-2-naphthaldehyde) 의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 25 mL 라운드 바텀 플라스크에 7번 화합물 (195 mg, 0.75 mmol)와 아이소프로필 알콜(isopropyl alcohol, 10 mL), 5M HCl (5 mL)를 넣어준 후 60 ℃에서 3시간을 교반시켰다. 3시간 후, 상온으로 플라스크를 식힌 후 아이소프로필 알콜은 흡기기에서 제거하고, 에틸 아세테이트(100 mL)와 물(100 mL)를 이용하여 추출과정을 수행했다. 추출을 통해 얻어진 유기층(EtOAc)은 무수황산나트륨 (3 g)으로 유기층 내 존재하는 물을 건조하고, 흡기기를 이용하여 농축했다. 이렇게 얻어지는 노란색의 고체 화합물은 실리카겔을 이용한 관 크로마토그래피(직경 2 cm, 높이 15 cm)방법을 이용하여 분리(전개 액: 20% EtOAc/Hexane)하여 노란색의 화학식 2의 화합물(113 mg, 70%)을 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피로 분석하면 Rf = 0.35(20% EtOAc/Hexane - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K): δ 10.54(s, 1H), 9.89(s, 1H), 7.90(s, 1H), 7.70-7.67(d, 1H), 7.02-6.98(m, 2H), 6.66-6.65(d, 1H), 3.13(s, 6H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, 293K): δ 195.26, 156.83, 151.39, 140.62, 137.75, 130.87, 120.63, 119.03, 114.18, 108.73, 103.22, 40.26. HRMS: m/z calcd. for C13H13NO2 215.0946 found 259.0946.
(5) 8-(다이메틸아미노)-2-이미노-2에이치-벤조[지]크로멘-3-카보나이트릴 (8-(dimethylamino)-2-imino-2H-benzo[g]chromene-3-carbonitrile) 의 합성
본 발명자들은 8-(다이메틸아미노)-2-이미노-2에이치-벤조[지]크로멘-3-카보나이트릴 (8-(dimethylamino)-2-imino-2H-benzo[g]chromene -3-carbonitrile) (화합식 1의 화합물) 의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 10 mL 라운드 바텀 플라스크에 화학식 2의 화합물 (27 mg, 0.125 mmol)와 말로노나이트릴(Malononitrile, 66 mg, 0.125 mmol), 에탄올(EtOH, 2 mL)을 넣어주었다. 이어서 상온에서, 피페리딘(Piperidine, 124 uL, 1.25 mmol)를 넣어주고 1시간 교반했다. 1시간 후, 흡기기를 이용해 에탄올을 제거했다. 이렇게 얻어지는 붉은색의 고체 화합물은 실리카겔을 이용한 관 크로마토그래피(직경 2 cm, 높이 15 cm)를 이용하여 분리(전개 액: 40% EtOAc/Hexane)하여 붉은색의 고체 화학식 1의 화합물(29.7 mg, 90%)을 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피로 분석하면 Rf = 0.35(40% EtOAc - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (DMSO, 300 MHz, 293K): δ 8.75(s, 1H), 8.30(s, 1H), 7.90(s, 1H), 7.79-7.76(d, 1H), 7.24-7.15(m, 2H), 6.86(s, 1H), 3.08(s, 6H). 13C NMR (DMSO, 75 MHz, 293K): δ 152.11, 150.45, 150.21, 146.82, 137.81, 130.38, 130.20, 122.28, 115.91, 115.68, 113.37, 108.20, 103.83, 100.56. HRMS: m/z calcd. for C13H13NO2 263.1059 found 263.1058.
실시예 2. 화학식 1의 화합물 1의 형광 특성 확인
본 발명자들은 화합물 1의 광학적 특성을 확인하였으며, 그것을 도 1, 도 2 및 도 3에 나타내었다.
본 발명자들은 화합물 1의 광학적 특성 확인에 있어 비교군으로 아세단(Acedan)과 쿠마린 153(Coumarin 153)을 사용하였다. 광학 특성은 에탄올 용매하에서 10 μM의 농도로 측정되었다. 양자효율(quantum yield, ΦF) 및 이광자 흡수 단면(two-photon cross-section, GM) 수치는 로다민 6G(Rhodamine 6G, ΦF =0.6, GM = 700)를 기준으로 측정되었다. 에탄올 용매 하에서 화합물 1은 446 nm의 여기파장, 585 nm의 방출파장을 보인다. 그리고 0.67의 높은 양자효율과, GM = 126 값을 나타낸다. 반면, 아세단의 경우 365 nm의 여기파장과 501 nm의 방출파장을 가지며, 쿠마린 153의 경우 425 nm의 여기파장과 548 nm의 방출파장을 가진다. 도 2는 각각의 광학적 특성을 정리한 것이며, 도 3은 각각의 흡수 및 방출 그래프를 나타낸 것이다.
흡수 및 방출 그래프는 각각 HP 8453 UV/Vis 분광 광도계(spectrophotometer)와 Photon Technical International Fluorescence System을 이용하여 측정하였으며, 1 cm의 석영 셀(quartz cell)이 사용되었다. GM 값의 측정에는 자체 제작한 cavity-dumped Ti:sapphire oscillator pumped 5.0 W output frequency doubled Nd:YV04 laser (Verdi, Coherent) 장비가 사용되었다. 기준 여기 파장은 800 nm이며, output pulse 는 40 nJ, repetition rate는 380 kHz이다. 데이터 처리 방법은 TPACS(two-photon induced fluorescence) 방법이며, 1 GM 은 10-50cm4s photon-1molecules-1을 기준으로 한다.
실시예 3. 화학식 3, 화학식 4의 화합물의 합성
일반적인 합성 경로는 하기 도식 2에 나타내었다.
[도식 2]
Figure PCTKR2013002335-appb-I000002
(1) 6-다이메틸아미노-3-{3-[엔, 엔-비스(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}나프틸렌-2-카르보알테하이드 (6-dimethylamino-3-{3-[N,N-bis(tert-butyloxycarbonyl)amino]propyloxy}naphthalene-2-carbaldehyde) (상기 도식 2에서 화합물 9a) 의 합성
본 발명자들은 6-다이메틸아미노-3-{3-[엔, 엔-비스(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}나프틸렌-2-카르보알테하이드 (6-dimethylamino-3-{3-[N,N-bis(tert-butyloxycarbonyl)amino]propyloxy}naphthalene-2-carbaldehyde) 의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 25 mL 라운드 바운드 바텀 플라스크에 화학식 2의 화합물 (176.6 mg, 0.82 mmol)와 엔-터트-부틸록시카보닐-3-(클로로프로필)카바믹 에시드 터트-부틸 에스터 (N-tert-butyloxycarbonyl-3-(chloropropyl)carbamic acid tert-butyl ester, 242 mg, 0.82 mmol), 포타시움 카보네이트 (potassium carbonate, 227 mg, 1.64 mmol)을 DMF (5 mL)을 녹였다. 혼합물은 50 ℃에서 27시간 교반했다. 27시간 후, 혼합물을 상온으로 식히고, EtOAc (100 mL)와 물 (100 mL), 포화 소금물 (100 mL)을 이용해 추출과정을 수행했다. 추출을 통해 얻어진 유기층(EtOAc)은 무수황산나트륨 (3 g)으로 유기층 내 존재하는 물을 건조하고, 흡기기를 이용하여 농축했다. 이렇게 얻어지는 노란색의 고체 화합물은 실리카겔을 이용한 관 크로마토그래피(직경 2 cm, 높이 15 cm)방법을 이용하여 분리(전개 액 : 20% EtOAc/Hexane)하여 노란색의 고체 화학식 3의 화합물(271 mg, 71%)을 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피로 분석하면 Rf = 0.35(20% EtOAc - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K): δ 10.51(s, 1H), 8.24(s, 1H), 7.73-7.71(d, 1H), 7.02-7.00(dd, 1H), 6.93(s, 1H), 6.73-6.72(d, 1H), 4.22-4.19(t, 2H), 3.90-3.87(t, 2H), 3.12(s, 6H), 2.22-2.20(t, 2H), 1.51(s, 18H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, 293K): δ 189.70, 157.83, 152.63, 150.68, 139.88, 131.28, 130.38, 122.02, 120.66, 114.27, 104.47, 103.99, 82.47, 66.01, 43.94, 40.34, 28.84, 28.07. HRMS: m/z calcd. for C26H36N2O6 472.2573 found 472.2571.
(2) 6-다이메틸아미노-3-{3-[엔-메틸-엔-(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}나프틸렌-2-카르보알테하이드 (6-dimethylamino-3-{3-[N-methyl-N-(tert-butyloxycarbonyl)amino]propyloxy}naphthalene-2-carbaldehyde) (상기 도식 2에서 화합물 9b) 의 합성
본 발명자들은 6-다이메틸아미노-3-{3-[엔-메틸-엔-(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}나프틸렌-2-카르보알테하이드 (6-dimethylamino-3-{3-[N-methyl-N-(tert-butyloxycarbonyl)amino]propyloxy}naphthalene-2-carbaldehyde) 의 합성을 수행하였다.
본 합성방법은 실시예 3의 (1)과 동일하며, N-tert-butyloxycarbonyl-3- (chloropropyl)carbamic acid tert-butyl ester를 대신하여 3-chloropropyl-N -(methyl)carbamic acid tert-butyl ester를 사용하였다. 정제방법은 실시예 3의 (1)과 동일하며, 70%의 수득율로 화합물 9b를 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K): δ 10.48(s, 1H), 8.21(s, 1H), 7.71-7.69(d, 1H), 7.00-6.98(dd, 1H), 6.92(s, 1H), 6.71-6.70(d, 1H), 4.17-4.15(t, 2H), 3.49-3.46(t, 2H), 3.10(s, 6H), 2.90(s, 3H), 2.12(s, 2H), 1.43(s, 9H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, 293K): δ 189.53, 157.73, 155.86, 150.75, 139.90, 131.28, 130.79, 121.99, 120.68, 114.31, 104.54, 103.98, 46.03, 40.33, 29.71, 29.26, 28.44, 14.13. HRMS: m/z calcd. for C22H30N2O4 386.2206 found 386.2208.
(3) 2-{3-[엔,엔-비스(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}-3-(2,2-다이사이아노)바이닐-7-(다이메틸아미노)나프탈렌 (2-{3-[N,N-bis(tert-butyloxycarbonyl)amino]propyloxy}-3-(2,2-dicyano)vinyl-7-(dimethylamino)naphthalene) (상기 도식에서 화학물 10a) 의 합성
본 발명자들은 2-{3-[엔,엔-비스(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}-3-(2,2-다이사이아노)바이닐-7-(다이메틸아미노)나프탈렌 (2-{3-[N,N-bis(tert-butyloxycarbonyl)amino]propyloxy}-3-(2,2-dicyano)vinyl-7-(dimethylamino)naphthalene) 의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 10 mL 라운드 바텀 플라스크에 화합물 9a (152 mg, 0.32 mmol)와 말로노나이트릴(malononitrile, 43 mg, 0.64 mmol)을 에탄올(EtOH, 3 mL)에 녹였다. 아르곤 풍선을 꽂아주고, 상온에서 피페리딘 (piperidine, 316 μL, 3.2 mmol)을 서서히 넣어주었다. 혼합물을 상온에서 3시간 교반한 후, 흡기기를 이용하여 용매를 제거했다. 이렇게 얻어지는 짙은 붉은색의 고체 화합물은 실리카겔을 이용한 관 크로마토그래피 (직경 2 cm, 높이 15 cm)방법을 이용하여 분리(전개 액: 30% EtOAc/Hexane)하여 짙은 붉은 색의 고체 화합물 10a(151 mg, 90%)을 얻었다. 생성물은 박막 크로마토그래피로 분석하면 Rf : 0.30(30% EtOAc - 1회 전개)의 전개 값을 갖는다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 8.71(s, 1H), 8.37(s, 1H), 7.72-7.70(d, 1H), 7.01-7.00(d, 1H), 6.87(s, 1H), 6.68-6.67(s, 1H), 4.16-4.14(t, 2H), 3.87-3.84(t, 2H), 3.16(s, 6H), 2.20(t, 2H), 1.52(s, 18H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ 155.00, 153.69, 152.62, 151.40, 140.12, 131.43, 131.15, 120.74, 117.18, 115.44, 114.47, 104.27, 103.76, 82.58, 66.23, 43.52, 40.28, 28.79, 28.79, 28.09. HRMS: m/z calcd. for C29H36N4O5 520.2686 found 520.2689.
(4) 2-{3-[엔-메틸-엔-(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}-3-(2,2-다이사이아노)바이닐-7-(다이메틸아미노)나프탈렌 (2-{3-[N-methyl-N-(tert-butyloxycarbonyl)amino]propyloxy}-3-(2,2-dicyano)vinyl-7-(dimethylamino)naphthalene) (상기 도식에서 화합물 10b) 의 합성
본 발명자들은 2-{3-[엔-메틸-엔-(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}-3-(2,2-다이사이아노)바이닐-7-(다이메틸아미노)나프탈렌(2-{3-[N-methyl-N-(tert-butyloxycarbonyl)amino]propyloxy}-3-(2,2-dicyano)vinyl-7-(dimethylamino)naphthalene) 의 합성을 수행하였다.
본 합성방법은 실시예 3의 (3)과 동일하며, 90%의 수득율로 화합물 10b를 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K): δ 8.36(s, 1H), 7.98(s, 1H), 7.45-7.42(d, 1H), 6.83-6.79(dd, 1H), 6.67(s, 1H), 6.51(s, 1H), 3.99-3.95(t, 2H), 3.36-3.32(t, 2H), 3.01(s, 6H), 2.81(s, 3H), 2.01-1.97(t, 2H), 1.33(s, 9H). 13C NMR (CDCl3, 75 MHz, 293K): δ 155.74, 154.76, 152.94, 151.37, 140.15, 131.27, 130.83, 120.53, 116.77, 115.61, 114.51, 114.37, 104.11, 103.73, 79.47, 75.67, 66.00, 46.04, 40.17, 34.44, 28.40, 27.51. HRMS: m/z calcd. for C25H30N4O3 434.2318 found 434.2319.
(5) 2-{[3-[3-아미노프로폭시)-6-(다이메틸아미노)나프틀렌-2-일]메틸렌}말로노나이트릴 (2-{[3-(3-aminopropoxy)-6-(dimethyamino)naphthalene-2-yl]methylene}malononitrile) (화학식3의 화합물) 의 합성
본 발명자들은 2-{[3-[3-아미노프로폭시)-6-(다이메틸아미노)나프틀렌-2-일]메틸렌}말로노나이트릴 (2-{[3-(3-aminopropoxy)-6-(dimethyamino) naphthalene-2-yl]methylene}malononitrile 의 합성을 수행하였다.
구체적으로, 25 mL 라운드 바텀 플라스크에 화합물 10a (51.1 mg, 0.1 mmol)와 트리아이소프로필실레인(triisopropylsilane, 3 μL)을 다이클로로메탄(dichloromethane, 3 mL), 트리플로로아세트산 (trifluoroacetic acid, 3 mL)에 녹인다. 아르곤 풍선을 꽂아주고, 혼합물을 0 ℃에서 1시간 교반한 후, 흡기기를 이용하여 농축했다. 이렇게 얻어지는 짙은 붉은색의 고체 화합물(화학식 3의 화합물)은 추가 정제과정 없이 활용했다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 8.50(s, 1H), 8.43(s, 1H), 7.94(bs, 2H), 7.74-7.71(d, 1H), 7.14-7.10(m, 2H), 6.84-6.83(d, 1H), 4.24-4.22(t, 2H), 3.11(s, 6H), 3.10(m, 2H), 2.15-2.09(t, 2H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ 158.33, 157.96, 151.19, 139.74, 130.86, 130.53, 119.95, 116.52, 115.37, 114.81, 114.44, 104.64, 103.54, 76.16, 65.34, 36.43, 26.52.
(6) 2-({6-다이메틸아미노-3-[(3-메틸아미노)프로폭시]-나프탈렌-2-일}메틸렌)말로나이트릴 (2-({6-dimethylamino-3-[(3-methylamino)propoxy]-naphthalen-2-yl}methylene)malononitrile) (화학식 4의 화합물) 의 합성
본 발명자들은 2-({6-다이메틸아미노-3-[(3-메틸아미노)프로폭시]-나프탈렌-2-일}메틸렌)말로나이트릴 (2-({6-dimethylamino-3- [(3-methylamino)propoxy]-naphthalen-2-yl}methylene)malononitrile) 의 합성을 수행하였다.
본 합성방법은 실시예 3의 (5)와 동일하다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 8.54(bs, 1H), 8.45(s, 1H), 8.42(s, 1H), 7.74-7.71(d, 1H), 7.14(s, 1H), 6.84-6.837.11-7.10(d, 1H), 6.83(d, 1H), 4.23-4.19(t, 2H), 3.20(m, 2H), 3.11(s, 6H), 2.64-2.63(t, 3H), 2.18-2.13(m, 2H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ 154.55, 154.25, 151.23, 139.75, 130.90, 130.61, 119.99, 116.51, 115.41, 114.87, 114.47, 104.68, 103.57, 76.27, 65.39, 45.84, 32.63, 25.18.
실시예 4. 화학식 1, 3, 4의 화합물의 형광 특성 확인
본 발명자들은 화합물 1, 3, 4의 광학적 특성을 확인하였으며, 그것을 도 3에 나타내었다.
본 발명자들은 화합물 1, 3, 4를 각각 10 μM의 농도로 완충 용액(100 mM HEPES, pH 7.4 with 5% glycerol and 1% DMSO) 하에서 흡수 및 형광 방출 실험을 수행하였다. 흡수 그래프(absorbance spectra)는 HP 8453 UV/Vis 분광 광도계(spectrophotometer)와 Photon Technical International Fluorescence System가 사용되었다. 형광 측정용 셀(cell)은 1 cm의 석영 셀(quartz cell)이 사용되었다. 형광 그래프는 448 nm의 여기파장(excitation wavelength)으로 측정되었다. 도 3의 상단은 흡수 그래프이며, 하단은 방출 그래프이다.
실시예 5. 화학식 3, 4의 화합물을 이용한 MAO 효소 활성 분석
본 발명자들은 화학식 3 및 화학식 4의 화합물을 이용하여 MAO 효소의 활성을 분석하였으며, 그것을 도 8에 나타내었다.
본 발명자들은 96-well fluorescence assay plate를 이용해 효소 활성 측정(enzyme kinetic assays)을 수행하였다. 화학식 3의 화합물의 농도는 0 μM에서 800 μM까지 사용되었으며, MAO A와 B 효소는 10 μg/mL을 사용하였다. 완충용액은 실시예 4와 동일하며, 96-well fluorescence assay plate는 37℃에서 3시간 보관하였다. 3시간 후 형광세기의 관측은 Microplate spectrofluorometer (VICTOR 3 VTM multilabel counter, Perkin Elmer-Wellesley, MA, USA)가 사용되었다. 여기파장은 465 nm이며, 방출파장은 600 nm에서 기록되었다. 미카엘리스-멘텐 상수 (Michaelis-Menten constants)는 오리진(Origin) 프로그램을 이용하여, 효소 활성 그래프로부터 계산되었다.
실시예 6. 화학식 3 및 4의 화합물과 MAO 효소와의 반응에 의한 형광 관측
본 발명자들은 화학식 3 및 4의 화합물을 이용하여 MAO 효소와의 반응에 의한 형광변화를 관측하였으며, 그것을 도 9에 나타내었다.
본 발명자들은 본 화합물을 각각의 Michaelis-Menten 상수 값에 해당하는 농도(화학식3/MAO A; 70 μM, 화학식4/MAO B; 252 μM, 화학식3/MAO B; 75 μM, 화학식4/MAO B; 210 μM)로 사용하고, 50 μg/mL의 MAO 효소를 완충 용액(100 mM HEPES, pH 7.4 with 5% glycerol and 1% DMSO) 하에서 형광 방출 실험을 수행하였다. 형광 그래프 측정에는 Photon Technical International Fluorescence system이 사용되었다. 형광 측정용 셀(cell)은 1 cm 폭의 표준 quartz cell이 사용되었다. 형광 그래프는 37 ℃에서 3시간 보관 후 448 nm의 여기파장에 의해 측정되었다.
실시예 7. 화학식 3의 화합물과 MAO 효소 억제제의 영향 확인
본 발명자들은 화학식 3의 화합물을 이용하여 MAO 효소의 활성을 관측함과 동시에, MAO 효소 억제제의 영향을 확인하였으며, 그것을 도 10에 나타내었다.
본 발명자들은 96-well fluorescence assay plate를 이용해 효소 활성 측정 및 효소 억제제 실험을 수행하였다. MAO A(10 μg/mL) 와 MAO B(10 μg/mL) 효소는 억제제인 모클로베마이드(Moclobemide, 70 μM)와 파질린(Pargyline, 70 μM)과 각각 37 ℃에서 2 시간 동안 보관되었다. 그리고 이어서 화학식 3의 화합물(70 μM)를 처리하고 3 시간에 걸쳐 10분 단위로 형광을 관측하였다. 완충 용액 및 형광 관측 방법은 실시예 4와 동일하다.
Moclobemide는 MAO A 효소의 저해제로, Pargyline은 MAO B 효소의 저해제로 알려져 있다. MAO A와 함께 Moclobemide를 처리한 경우, Pargyline을 처리했을 때와 비교해 형광 신호 증가가 적고, 따라서 MAO A가 Moclobemide에 의해 효과적으로 활성이 저해되었음을 확인 할 수 있다. 또한 MAO B와 함께 Pargyline을 처리한 경우, Moclobemide를 처리하였을 때와 비교해 형광 신호 증가가 적은 것으로 보아 MAO B가 Pargyline에 의해 그 활성이 저해되었음을 확인 할 수 있다.
실시예 8. 화학식 3의 화합물 및 저해제를 처리한 C6 glioma cell 및 Chromaffin cell의 일광자(one-photon) 전자현미경 측정
본 발명자들은 화합물 1과 화학식 3의 화합물을 C6 glioma cell과 Chromaffin cell에 각각 처리한 형광 변화와 MAO 효소 저해제를 처리한 형광 변화를 일광자 전자현미경을 통해 관찰하였으며, 그것을 도 11에 나타내었다. C6 glioma cell은 MAO 효소가 발현되어 있지 않은 대표적인 세포이며(Aw. J. et al., Chem. Asian. J. 2010, 5, 1317.), Chromaffin cell은 MAO B가 과발현(over-express)되어 있는 것으로 알려진 세포이다(Youdim. M. B. H. et al., Science 1984, 224, 619.).
C6 glioma cell과 Chromaffin cell은 60 mm dish에 2 × 106 cell의 밀도(density)로 준비되었다(Park. Y. et al., Endocrinology 2006, 147, 1349). 각각의 cell은 DMEM(Hyclone)과 10%의 fetal bovine serum(Hyclone)과 1%의 antibiotics(WelGENE)의 용매 조건과, 5% CO2-95% air 조건 및 37℃ 에서 보관되었다.
세포 형광 영상화는 각각의 셀 접시(cell dish)에 100 μM의 화합물 1과 화학식3의 화합물을 각각 처리하고 위와 동일 보관 조건에서 1 시간 보관 후, 형광 영상화 현미경(fluorescence imaging microspcope; Axiovert 200M, Carl Zeiss)을 이용하여 측정하였다. 형광 측정 전 세포 내로 침투하지 못한 화합물은 피펫 흡입(pipet suction)을 통해 제거하였으며, PBS(phosphate buffer saline) 완충용액을 넣어주고 형광을 관측하였다. 여기파장은 435-455 nm이며, 방출파장은 555-575 nm에서 기록되었다.
저해제를 사용한 셀 형광 이미징의 경우, 먼저 각각의 cell dish에 100 μM의 저해제를 처리하고, 위와 동일한 조건의 보관 과정을 수행하였다. 이어서 100 μM의 화학식 3의 화합물을 처리하고 동일한 조건에서 1 시간 보관 후 형광을 측정하였다.
화합물 1을 처리한 C6 glioma cell과 Chromaffin cell의 경우 밝은 일광자세포 영상을 제공한다(도 11의 b, h). 화학식 3의 화합물을 처리한 경우 MAO가 발현되지 않은 C6 glioma cell에서는 IminoPOS가 생성되지 않아, 형광을 나타내지 않는다(도 11의 e). 하지만 MAO B가 과발현된 Chromaffin cell의 경우, IminoPOS가 생성되면서 밝은 세포 영상을 제공한다(도 11의 k). MAO A의 저해제인 Moclobemide를 처리한 Chromaffin cell의 경우 화학식 3의 화합물이 정상적으로 IminoPOS를 생성해 형광을 제공하는 반면(도 11의 n), MAO B 저해제인 Pargyline을 처리한 경우 Chromaffin cell의 MAO B의 활성이 저해되어 IminoPOS를 생성하지 못해 형광이 관측되지 않는다(도 11의 q). 이 실험을 통해 Chromaffin cell에 MAO B가 과발현되어 있음과 동시에 Pargyline이 효과적인 MAO B 효소 활성 억제제임을 확인 할 수 있다.
실시예 9. 화학식 3의 화합물 및 저해제를 처리한 C6 glioma cell 및 Chromaffin cell의 이광자(two-photon) 전자현미경 관찰
본 발명자들은 화합물 1과 화학식 3의 화합물을 C6 glioma cell과 Chromaffin cell에 각각 처리한 형광 변화와 MAO 효소 저해제를 처리한 형광 변화를 이광자 전자현미경을 통해 관찰하였으며, 그것을 도 12에 나타내었다. Cell의 준비과정 및 형광측정 방법은 실시예 8과 동일하며, 이광자 전자현미경을 형광 관측에 사용하였다.
이광자 전자현미경은 Upright microscope (BX51, Olympus)와 20배 대물렌즈(XLUMPLFLN-W, NA 1.0 water immersion, Olympus)로 구성되어있으며, 타이태늄:싸파이어 레이저(Ti:Sapphire laser; Chameleon Ultra, Coherent)가 사용되었다. 10 mW의 레이저 파워와, 900 nm의 이광자 여기파장, 0.382 프레임/초의 영상 촬영 속도로 관측되었다.
일광자 전자현미경 결과와 유사하게, 이광자 전자현미경 결과에서도 화합물 1은 밝은 이광자 세포 영상을 제공하였다(도 12, a, c). 또한, 화학식 3의 화합물을 처리한 C6 glioma cell의 경우 IminoPOS의 형광이 관측되지 않았으며(도 12, b), Chromaffin cell에서는 IminoPOS가 생성됨이 관측되었다(도 12, d). 저해제를 처리한 세포의 경우, 일광자 실험에서와 동일한 결과를 보였다. Chromaffin cell에 Moclobemide를 처리한 경우 IminoPOS의 생성이 관측된 반면(도 12, e), Pargyline을 처리한 경우 관측되지 않았다(도 12, f).
실시예 10. 화학식 5의 화합물에 R기로서 바이닐 이써(Vinyl ehter)의 도입
(1) 합성법
Figure PCTKR2013002335-appb-I000003
(여기서 2번 물질이 화학식 2임)
(2) 세부 실험 내용
(a) 3-(2-브로모에톡시)-6-(다이메틸아미노)-2-나프탈알데히드 (3-(2-bromoethoxy)-6-(dimethylamino)-2-naphthaldehyde) (11)의 합성
화합물 2(150 mg, 0.697 mmol), 1,2-dibromoethane(2.11 mL, 24.69 mmol), Bu4NOH(0.3 mL,0.47 mmol), KOH(3.53 mL,25.63 mmol)을 넣고 50 ℃에서 6시간 동안 교반시켰다. 추가의 추출과정 없이 컬럼 크로마토그래피(전개용액 : EtOAc/n-hexane(v/v) = 1/9)로 분리 정제하여 74 % (166 mg)의 노란색 고체 화합물 11을 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 300 MHz, 293K): δ 10.53(s, 1H), 8.26(s, 1H), 7.75-7.72(d, 1H), 7.05-6.94(m, 2H), 6.74-6.73(d, 1H), 4.51-4.47(t, 2H), 3.79-3.75(t, 2H), 3.13(s, 6H). 13C NMR (CDCl3, 75MHz, 293K); δ189.43, 156.96, 150.77, 139.67, 131.30, 130.84, 121.95, 120.93, 114.56, 104.99, 103.94, 67.94, 40.31, 28.82. HRMS: m/z calcd. for C13H13NO2 321.0364 found 321.0366.
(b) 6-(다이메틸아미노)-3-(바이닐록시)-2-나프탈알데히드 (6-(dimethylamino)-3-(vinyloxy)-2-naphthaldehyde) (12)의 합성
화합물 11 (113 mg, 0.35 mmol)을 DMSO(5.6 mL)에 녹인 후 t-BuOK(39 mg, 0.347 mmol)을 첨가했다. 이 혼합물을 상온에서 3시간 동안 교반시킨 후 ethyl acetate와 brine으로 추출한다. 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 용매를 감압증류하여 제거했다. 컬럼 크로마토그래피(전개용액 : EtOAc/n-hexane(v/v) = 1/9)로 분리 정제하여 59 % (50 mg)의 노란색 고체 화합물 12 을 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K); δ 10.43(s, 1H), 8.28(s, 1H), 7.78-7.75(d, 1H), 7.10-7.05(m, 2H), 6.84-6.75(m, 2H), 4.94-4.88(d, 1H), 4.62-4.60(d, 1H), 3.13(s, 6H). 13C NMR (CDCl3, 75MHz, 293K); δ 189.02, 155.51, 150.75, 147.99, 139.45, 131.28, 130.96, 122.06, 121.98, 115.21, 109.94, 104.05, 96.63, 40.29. HRMS: m/z calcd. for C15H15NO2 241.1103 found 241.1105.
(c) 2-((6-다이메틸아미노)-3-(바이닐록시)나프탈렌-2일)메틸렌)말로노나이드릴 (2-((6-(dimethylamino)-3-(vinyloxy)naphthalen-2yl)methylene)malononitrile) (13)의 합성
화합물 12(16 mg, 0.066 mmol)을 EtOH(1 mL)에 녹인 후 malononitrile(9 mg, 0.14 mmol)과 piperidine(0.06 mL, 0.61 mmol)를 첨가하여 1시간 동안 상온에서 교반했다. 반응이 완결되고 나면 EtOH를 감압 증류하여 제거한 후 추가의 추출과정 없이 컬럼 크로마토그래피(전개용액 : EtOAc/n-hexane(v/v) = 1/3)로 분리 정제하여 63 % (12 mg)의 주황색 고체 화합물 13를 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K); δ 8.75(s, 1H), 8.28(s, 1H), 7.77-7.73(d, 1H), 7.09-7.04(m, 2H), 6.74-6.67(m, 2H), 4.99-4.94(dd, 1H), 4.68-4.66(dd, 1H), 3.17(s, 1H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K); δ 153.40, 153.30, 151.70, 147.32, 139.88, 131.73, 131.45, 122.19, 117.18, 115.55, 115.46, 114.40, 109.34, 104.18, 98.19, 40.49. HRMS: m/z calcd. for C18H15N3O 289.1215 found 289.1213.
(3) 실험 결과
본 발명자들은 화합물 13의 수은이온 (Hg ion)에 대한 형광 변화 특성을 확인하였으며, 그것을 도 13에 나타내었다.
본 발명자들은 화합물 13을 3 μM의 농도로 완충 용액(PBS, pH 7.4 with 5% DMSO) 하에서 형광 방출 실험을 수행하였다. 형광 측정에는 Photon Technical International Fluorescence System가 사용되었다. 형광 측정용 셀(cell)은 1 cm의 석영 셀(quartz cell)이 사용되었다. 형광 그래프는 448 nm의 여기파장(excitation wavelength)으로 측정되었다.
관측 결과 수은 이온(HgCl2)의 농도 증가에 따라 형광이 증가함을 보였다 (좌측 그래프). 또한 3 μM의 수은이온을 첨가 후 시간에 따른 형광변화를 관찰한 결과 시간 경과에 따라 형광이 증가함을 관찰하였다 (우측 그래프).
실시예 11. 화학식 5의 화합물에 R 기로서 터셔리부틸-다이메틸-실릴 이써(t-butyldimethylsilyl ether)의 도입
(1) 합성법
Figure PCTKR2013002335-appb-I000004
(여기서 2번 물질이 화학식 2임)
(2) 세부 실험 내용
(a) 3-(터셔리-부틸다이메틸실릴)-6-(다이메틸아미노)-2-나프트알데히드 (3-(tert-butyldimethylsilyl)-6-(dimethylamino)-2-naphthaldehyde) (14)의 합성
화합물 2(300 mg, 1.394 mmol)을 DCM(10 mL)에 녹인 후 4-dimethylaminopyridine(DMAP, 5 mg, 0.0187 mmol)과 Et3N (0.2ml, 1.394 mmol)을 차례로 넣어준 후 얼음물을 이용해 0℃로 온도를 낮추어 주었다. 온도 확인 후 t-butyldimethylsilyl chloride (252.1 mg, 1.6725 mmol)을 5 mL의 DCM에 녹여 서서히 넣어주었다. 이 혼합물은 서서히 상온으로 바꾸어 12시간 교반했다. 12시간 경과 후 10 mL의 포화된 NaHCO3 수용액과 60 mL의 DCM을 이용하여 추출과정을 수행했다. DCM 층은 MgSO4 (5 g)을 이용하여 물을 건조 시킨 후 컬럼 크로마토그래피(전개용액 : EtOAc/n-hexane(v/v) = 1/4)로 분리 정제하여 91 % (415.7 mg)의 노란색 고체 화합물 14 를 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 10.45(s, 1H), 8.21(s, 1H), 7.72-7.69(d, 1H), 7.02-6.98(dd, 1H), 6.92(s, 1H), 6.66-6.65(d, 1H), 3.10(s, 6H), 1.05(s, 9H), 0.32(s, 6H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ 190.07, 154.90, 150.57, 139.88, 131.25, 130.49, 124.02, 121.39, 111.72, 112.57, 103.61, 40.35, 25.80, 18.41, -4.25. HRMS: m/z calcd. for C19H27NO2Si 329.1811 found 329.1808.
(b) 2-((6-다이메틸아미노)-3-(터셔리부틸다이메틸실릴)나프탈렌-2일)메틸렌)말로나이트릴 (2-((6-(dimethylamino)-3-(tert-butyldimethylsilyl)naphthalen-2yl)methylene)malononitrile) (15)의 합성
화합물 14(415.7 mg, 1.2616 mmol)를 EtOH(9 mL)에 녹인 후 malononitrile(83.4 mg, 1.2616 mmol)과 piperidine(1 mL, 12.616 mmol)를 첨가하여 3시간 동안 상온에서 교반했다. 반응이 완결되고 나면 EtOH를 감압 증류하여 제거한 후 추가의 추출과정 없이 컬럼 크로마토그래피(전개용액 : EtOAc/n-hexane(v/v) = 1/4)로 분리 정제하여 70 % (333.4 mg)의 주황색 고체 화합물 15를 얻었다. 1H NMR (CDCl3, 300MHz, 293K):δ 8.70(s, 1H), 8.24(s, 1H), 7.70-7.67(d, 1H), 7.02-6.98(dd, 1H), 6.88(s, 1H), 6.60-6.59(d, 1H), 3.14(s, 6H), 1.05(s, 9H), 0.31(s, 6H). 13C NMR(CDCl3, 75MHz, 293K):δ 154.13, 152.53, 151.30, 140.20, 131.43, 131.09, 121.46, 119.27, 115.40, 114.88, 114.30, 111.78, 103.41, 40.29, 25.79, 18.38, -4.23. HRMS: m/z calcd. for C22H27N3OSi 377.1923 found 377.1923.
(3) 실험결과
본 발명자들은 화합물 15의 플로라이드 이온 (F ion)에 대한 형광 변화 특성을 확인하였으며, 그것을 도 14에 나타내었다.
본 발명자들은 화합물 15를 20 μM의 농도로 완충 용액(10mM HEPES, pH 7.4 with 20% ACN) 하에서 형광 방출 실험을 수행하였다. 형광 측정에는 Photon Technical International Fluorescence System가 사용되었다. 형광 측정용 셀(cell)은 1 cm의 석영 셀(quartz cell)이 사용되었다. 형광 그래프는 460 nm의 여기파장(excitation wavelength)으로 측정되었다.
관측 결과 플로라이드 이온(NaF, 20mM)을 첨가한 후 시간에 따른 형광이 증가하는 것을 관측할 수 있다 (좌측 그래프). 또한 20 μM의 농도의 화합물 15와 함께 다양한 종류의 음이온을 첨가 후 형광 증가를 확인한 결과 오직 플로라이드 이온만이 선택적으로 반응하여 형광증가를 유도함이 관찰되었다 (우측 그래프). 우측 그래프의 형광세기는 595 nm에서 관측된 것이다.
본 발명의 이광자 흡수 형광체는 종래 형광체에 비해 장파장에서 흡수 및 방출을 하기 때문에 생체 영상화 연구에 활용할 수 있으며, 일광자 현미경에서도 높은 형광 감도를 보이므로 화학식 1 화합물의 전구체를 각 기질에 대한 높은 민감도 및 선택성을 가지는 검출 프로브로써 활용할 수 있을 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물은 MAO 효소와 관련된 질환 연구 및 치료에 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

Claims (20)

  1. 하기 화학식 1, 화학식 2, 화학식 3, 및 화학식 4로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000005
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000006
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000007
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000008
  2. 하기 화학식 5의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염.
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000009
    상기 화학식 5에서, R은 바이닐 이써(Vinyl ether), 프로파질 이써(Propargyl ether), 4-보로네이토-벤질 이써(4-boronato-benzyl ether), 터셔리부틸-다이메틸-실릴 이써(t-butyldimethylsilyl ether), 호모알릴 이써 (Homoallyl ether), 또는 포스페이트 (Phosphate)이다.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 화학식 1의 화합물은 일광자 및 이광자 흡수 형광체인 것을 특징으로 하는 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염.
  4. 1) 2,7-다이하이드록시나프탈렌에 소디움 메타바이설파이트와 다이메틸아민 수용액을 첨가하여 7-(다이메틸아미노)나프탈렌-2-올을 합성하는 단계;
    2) 상기 7-(다이메틸아미노)나프탈렌-2-올에 소디움 하이드라이드와 클로로메틸 메틸 에테르를 첨가하여 7-(메톡시메톡시)-N,N-다이메틸나프탈렌-2-아민을 합성하는 단계;
    3) 상기 7-(메톡시메톡시)-N,N-다이메틸나프탈렌-2-아민에 에틸 에테르와 3차 부틸리튬을 첨가하여 6-(다이메틸아미노)-3-(메톡시메톡시)-2-나프트알데하이드를 합성하는 단계; 및
    4) 상기 6-(다이메틸아미노)-3-(메톡시메톡시)-2-나프트알데하이드에 아이소프로필 알콜과 HCl을 첨가하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 2의 화합물의 제조 방법.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000010
  5. 하기 화학식 2의 화합물에 말로노나이트릴 및 피페리딘을 첨가하여 하기 화학식 1의 화합물을 제조하는 방법.
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000011
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000012
  6. 1) 하기 화학식 2의 화합물에 엔-터트-부틸록시카보닐-3-(클로로프로필)카바믹 에시드 터트-부틸 에스터 및 포타시움 카보네이트를 첨가하여 6-다이메틸아미노-3-{3-[엔, 엔-비스(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}나프틸렌-2-카르보알데하이드)를 합성하는 단계;
    2) 상기 6-다이메틸아미노-3-{3-[엔, 엔-비스(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}나프틸렌-2-카르보알데하이드)에 말로노나이트릴과 피페리딘을 첨가하여 2-{3-[엔,엔-비스(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}-3-(2,2,-다이사이아노)바이닐-7-(다이메틸아미노)나프탈렌을 합성하는 단계; 및
    3) 상기 2-{3-[엔,엔-비스(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}-3-(2,2,-다이사이아노)바이닐-7-(다이메틸아미노)나프탈렌에 트리아이소프로필실레인을 첨가하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 3의 화합물의 제조방법.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000013
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000014
  7. 1) 하기 화학식 2의 화합물에 엔-터트-부틸록시카보닐-3-(클로로프로필)카바믹 에시드 터트-부틸 에스터 및 포타시움 카보네이트를 첨가하여 6-다이메틸아미노-3-{3-[엔-메틸-엔-(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}나프틸렌-2- 카르보알데하이드를 합성하는 단계;
    2) 상기 6-다이메틸아미노-3-{3-[엔-메틸-엔-(터셔리부틸록시카보닐)아미노]프로필록시}나프틸렌-2- 카르보알데하이드에 말로노나이트릴과 피페리딘을 가하여 2-{3-[엔-메틸-엔-(터셔리부틸록시카보닐)아미노)나프탈렌을 합성하는 단계; 및
    3) 상기 2-{3-[엔-메틸-엔-(터셔리부틸록시카보닐)아미노)나프탈렌에 트리아이소프로필실레인을 첨가하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 4의 화합물의 제조방법.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000015
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000016
  8. 하기 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물을 포함하는 모노아민 옥시데이즈(monoamine oxidase, MAO)의 검출 프로브.
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000017
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000018
  9. 하기 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물을 포함하는 모노아민 옥시데이즈 저해제 탐색 방법.
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000019
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000020
  10. 하기 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물을 이용한 모노아민 옥시데이즈 효소 활성(enzyme activity) 측정방법.
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000021
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000022
  11. 하기 화학식 3 또는 화학식 4의 화합물을 이용한 효소 저해제(inhibitor) 탐색 방법.
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000023
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000024
  12. 제 1항 또는 제 2항의 화합물을 이용한 세포 영상화(imaging) 방법.
  13. 하기 화학식 5에서 R은 바이닐 이써(Vinyl ether)인 화합물을 포함하는, 수은 이온(Hg ion)의 검출 프로브.
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000025
  14. 하기 화학식 5에서 R은 프로파질 이써(Propargyl ether)인 화합물을 포함하는, 팔라듐 이온(Pd ion)의 검출 프로브.
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000026
  15. 하기 화학식 5에서 R은 4-보로네이토-벤질 이써(4-boronato-benzyl ether)인 화합물을 포함하는, 과산화수소수(H2O2)의 검출 프로브.
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000027
  16. 하기 화학식 5에서 R은 터셔리부틸-다이메틸-실릴 이써(t-butyldimethylsilyl ether)인 화합물을 포함하는, 플로라이드 이온(F ion)의 검출 프로브.
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000028
  17. 하기 화학식 5에서 R은 호모알릴 이써 (Homoallyl ether)인 화합물을 포함하는, 오존 (Ozone)의 검출 프로브.
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000029
  18. 하기 화학식 5에서 R은 포스페이트 (Phosphate)인 화합물을 포함하는, 포스페테이즈 효소 (Phosphatases)의 검출 프로브.
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000030
  19. 1) 하기 화학식 2의 화합물에 1,2-dibromoethane, Bu4NOH 및 KOH를 첨가하여 3-(2-브로모에톡시)-6-(다이메틸아미노)-2-나프탈알데히드(3-(2-bromoethoxy)-6-(dimethylamino)-2-naphthaldehyde)를 합성하는 단계;
    2) 상기 3-(2-브로모에톡시)-6-(다이메틸아미노)-2-나프탈알데히드(3-(2-bromoethoxy)-6-(dimethylamino)-2-naphthaldehyde)에 t-BuOK를 첨가하여 6-(다이메틸아미노)-3-(바이닐록시)-2-나프탈알데히드 (6-(dimethylamino)-3-(vinyloxy)-2-naphthaldehyde)를 합성하는 단계; 및
    3) 상기 (6-(dimethylamino)-3-(vinyloxy)-2-naphthaldehyde)에 malononitrile과 piperidine을 첨가하여 2-((6-다이메틸아미노)-3-(바이닐록시)나프탈렌-2일)메틸렌)말로노나이드릴을 합성하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 5의 화합물에 R기로서 바이닐 이써를 도입한 화합물의 제조 방법.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000031
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000032
  20. 1) 하기 화학식 2의 화합물에 4-dimethylaminopyridine, Et3N 및 t-butyldimethylsilyl chloride을 첨가하여 3-(터셔리-부틸다이메틸실릴)-6-(다이메틸아미노)-2-나프트알데히드 (3-(tert-butyldimethylsilyl)-6-(dimethylamino)-2-naphthaldehyde)를 합성하는 단계; 및
    2) 상기 (3-(tert-butyldimethylsilyl)-6-(dimethylamino)-2-naphthaldehyde)에 malononitrile과 piperidine을 첨가하여 2-((6-다이메틸아미노)-3-(터셔리부틸다이메틸실릴)나프탈렌-2일)메틸렌)말로나이트릴(2-((6-(dimethylamino)-3-(tert-butyldimethylsilyl)naphthalen-2yl)methylene)malononitrile)을 합성하는 단계를 포함하는, 하기 화학식 5의 화합물에 R기로서 터셔리부틸-다이메틸-실릴 이써(t-butyldimethylsilyl ether)를 도입한 화합물의 제조방법.
    [화학식 2]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000033
    [화학식 5]
    Figure PCTKR2013002335-appb-I000034
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