KR101179513B1

KR101179513B1 - 아미노산을 기반으로 한 수은 이온 검출용 센서 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR101179513B1
Application number: KR1020110049212A
Authority: KR
Inventors: 이건형; 양미화
Original assignee: 인하대학교 산학협력단
Priority date: 2011-05-24
Filing date: 2011-05-24
Publication date: 2012-09-07

Abstract

본 발명은 수은 이온(Hg² ⁺)을 선택적으로 검출하기 위한 형광 아미노산 센서, 그 제조방법 및 그를 이용한 검출방법에 관한 것이다. 종래의 형광 센서가 주로 유기 용매에서 중금속 이온을 검출할 수 있었던 반면, 본 발명에 따른 형광 아미노산 센서는 지하수, 하천과 같은 수계 환경에서 수은 이온(Hg² ⁺)을 검출할 수 있기 때문에 새로운 형광 아미노산 센서로 활용 가능하고, 특히 생체 시료의 pH범위에서 선택성이 뛰어나므로, 생체 시료로부터 수은 이온(Hg² ⁺)을 선택적으로 검출할 수 있고, 나노몰 수준의 검출한계를 갖는 바, 감도가 우수한 형광 아미노산 센서로 사용할 수 있다.

Description

아미노산을 기반으로 한 수은 이온 검출용 센서 및 그 제조방법 {Methionine amino acid based chemical sensor for selective detecting mercury ion, and preparation method thereof}

본 발명은 수은 이온(Hg² ⁺)을 선택적으로 검출하기 위한 아미노산 기반의 형광 센서, 이의 제조방법 및 상기 센서를 이용한 수은 이온 검출방법에 관한 것이다.

생체 내 주요물질과 이온들에 대한 새로운 센서의 설계와 연구는 그 동안 활발히 진행되어져 왔다. 최근 초분자(supramolecule)화학에 대한 이해와 연구는 선택적으로 이온 혹은 여러 가지 다른 종류의 게스트 화합물들과 결합할 수 있는 호스트 화합물의 설계에 큰 가능성을 보여 왔으며, 최근 이러한 초분자 화합물을 형광물질에 연결시킴으로써, 게스트 화합물과의 선택적 결합을 형광변화를 이용하여 보다 손쉽게 관찰할 수 있는 형광 화학 센서(fluorescent chemosensor)의 개발에 대한 연구에 큰 도움을 주고 있다.

형광이란 특정한 광파장 (여기 파장)을 갖는 광자가 표지분자(indicator molecule)와 충돌하고, 그 충돌의 결과로 전자가 고에너지 준위로 여기(excitation)되면서 일어나는 광화학적 현상이다. 여러 분석 방법 중에서 형광을 이용하는 방법은 아주 뛰어난 감도로 인해 10^-9 M 농도에서도 신호를 관찰할 수 있는 큰 장점을 가지고 있다. 최근에는 이러한 성질을 이용하여 양이온, 음이온 그리고 중성 유기분자들에 대한 형광 화학 센서에 대한 연구들이 발표된 바 있다[A. P. de Silva, Chem. Rev. 1997, 97, 1515].

최근 들어, 다양한 아미노산 기반의 형광 센서를 합성하여 여러 종류의 전이금속을 검출하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 형광 아미노산 센서는 아래에 나와 있는 몇 가지 측면에서 많은 관심을 받고 있다. 천연 아미노산을 포함하는 형광 센서는 고체상 합성법을 이용하여 빠른 시간 내에 비교적 손쉽게 합성을 할 수 있으며, 여러 가지 아미노산의 조합을 이용하여, 원하는 금속 이온에 대한 선택성과 감도를 조절할 수 있다. 또한, 생리적 조건과 유사한 수용액에 잘 녹는 점은 형광 화학 센서와 차별화 된 점으로 꼽을 수 있다. 더 나아가, 합성된 형광 아미노산 센서를 불수용성 고체상 장치에 손쉽게 결합시킬 수 있고, 이를 통해 미래에 더 많은 응용이 가능하다. 다만, 여기서 합성된 형광 아미노산 센서는 화학적으로 매우 수용성이기 때문에 세포 내로 투과시키는 것이 다소 어렵지만, 펩타이드에 존재하는 아마이드 결합을 통해서 추가적으로 기능을 부여하면, 세포 안으로 형광 아미노산 센서를 투과시켜 더 많은 연구를 진행시킬 수가 있다.

금속이온의 생리적 조건에서의 높은 선택적 검출은 환경 및 생물학적 응용을 위한 형광 화학 센서 개발이라는 점에서 매우 중요하다[Fluorescent Chemosensors for Ion and Molecular Recognition, Czarnik, A. W. Ed., American Chemical Society: Washington, DC, 1993].

특히, 수은 이온은 인간의 건강에 유해한 영향을 끼치기 때문에 생물학적으로 중요한 중금속이다. 대양과 화산에 의한 방출[Renzoni, A; Zino, F.; Franchi, E. Environ. Res. 1998, 77, 68.], 금채광[Malm, O. Environ. Res. 1998, 77, 73.], 혹은 고체 폐기물 소각에 의한 수은 오염은 면역계, 유전자, 신경계에 대한 극심한 독성 때문에 큰 이슈가 되어 왔다. 이와 같이 수은은 매우 위험한 맹독성 오염물질이지만 불행하게도 우리 주변 환경 속에 많이 존재한다. 주변 환경 속에 존재하는 수은은 먹이 사슬을 통해 축적된다. 먹이사슬의 상층에 위치할수록 축적도가 상승하기 때문에 음식물 섭취를 통해 인간에게 축적되는 오염물질의 수준도 높아진다. 수은은 여러 가지 경로를 통해 물에 잘 용해되는 이온형태(Hg² ⁺)로 전환되고 생선이나 다른 여러 음식물에 축적된다. 따라서 이들을 먹는 인간에게도 당연히 수은의 축적이 일어난다. 그러므로 수용액상에 존재하는 수은의 함량을 잘 모니터링 하는 것은 인류의 건강을 지키는 중요한 활동 중 하나가 될 수 있다. 따라서 상기 금속 이온에 대해 충분한 선택성을 갖는 새로운 형광 화학 센서의 개발에 큰 관심이 모아지고 있다. 수은 이온을 선택적으로 인식하는 많은 형광 화학 센서들이 보고되었으나, 수용액 내에서 수은 이온을 선택적으로 검출하며, 다른 금속이온에 간섭 받지 않는 형광 화학 센서의 예는 매우 드물다.

이에 본 발명자들은 수은 이온(Hg² ⁺)에 대해 선택적으로 인식하는 화합물에 대하여 연구하던 중, 아미노산에 형광체인 5-디메틸아미노-1-나프타렌설포닐기(또는“Dansyl”이라 함)을 도입하는 경우 수용액 상에서 수은 이온(Hg² ⁺)을 검출할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명은 수은 선택성과 감도가 우수한 아미노산 기반의 형광 아미노산 센서를 제공하는 것을 그 첫 번째 과제로 한다.

또한 본 발명은 상기 형광 아미노산 센서의 제조방법을 제공하는 것을 그 두 번째 과제로 한다.

마지막으로 본 발명은 상기 형광 아미노산 센서를 이용한 수은 이온의 검출방법을 제공하는 것을 그 세 번째 과제로 한다.

상기 첫 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은, 하기 화학식 1로 표시되는 수은 이온 검출용 형광 아미노산 센서를 제공한다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 -NH₂, -OCH₃ 또는 -OCH₂CH₃이다.

상기 두 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 아미노 말단이 보호기에 의해 보호된 메티오닌 및 수지를 순차적으로 반응시켜, 보호기에 의해 보호된 메티오닌과 수지의 결합물을 고체상 합성법으로 합성하는 단계; (b) 상기 결합물을 5-디메틸아미노-1-나프타렌설포닐 클로라이드와 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응 결과물을 트리플루오로아세트산과 반응시키는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 아미노산 센서의 제조방법을 제공한다.

상기 세 번째 기술적 과제를 달성하기 위하여 본 발명은, 상기 형광 아미노산 센서를 이용한 수은 이온의 검출방법으로써, 상기 검출은 수용액상, 유기용액상 또는 유기용액과 수용액의 혼합상에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 수은 이온의 검출방법을 제공한다.

본 발명에 따른 아미노산 기반의 수은 이온 검출용 센서는 오직 수은 이온에 대해서만 선택적이고, 수용액상, 유기용액상 또는 유기용액과 수용액의 혼합상 모두에서 수은 이온에 대해서만 선택적인 형광 변화를 보인다. 종래의 형광 펩타이드 센서의 경우 주로 유기 용매에서 중금속 이온을 검출할 수 있었던 반면, 본 발명에 따른 형광 아미노산 센서는 지하수, 하천과 같은 수계 환경에서도 수은 이온(Hg² ⁺)을 검출할 수 있기 때문에 다양한 활용이 가능하고, 특히 생체 시료의 pH 범위에서 선택성이 뛰어나므로 생체 시료로부터 수은 이온(Hg² ⁺)을 선택적으로 검출할 수 있다는 장점이 있다.

또한 나노몰 수준의 검출 한계를 갖는 바 선택성과 감도가 우수하며, 고체상 합성을 이용하여 손쉽게 합성할 수 있다는 장점이 있다.

도 1은 10 mM HEPES buffer(pH 7.4) 중에서, 금속 이온들(90 μM)과 화합물 1(30 μM)의 형광 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 화합물 1(30 μM)에 대해 3 당량의 다양한 금속 이온들을 첨가한 후 자외선 빛아래서 형광 변화를 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 3은 화합물 1과 Hg² ⁺이온 복합체의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 4는 화합물 1과 Hg² ⁺이온 복합체에 대한 Job's plot의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 Hg² ⁺이온의 각각 다른 농도 조건에서의 화합물 1의 형광 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 6은 화합물 1의 가역성 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 50% 아세토나이트릴-HEPES 버퍼(Acetonitrile-HEPES buffer)(pH 7.4) 중에서 금속 이온들(150 μM)과 화합물 1(30 μM)의 형광 스펙트럼 측정 결과를 나타낸 그래프이다.
도 8은 50% 아세토나이트릴-HEPES 버퍼(pH 7.4) 중에서 화합물 1(30 μM)에 대해 5 당량의 Hg² ⁺를 첨가하기 전과 Hg² ⁺를 포함한 여러 금속 이온들을 첨가한 후 형광 변화를 관찰한 결과를 나타낸 사진이다.
도 9는 50% 아세토나이트릴-물(Acetonitrile-water) 중에서 화합물 1과 Hg² ⁺이온 복합체의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.
도 10은 50% 아세토나이트릴-HEPES 버퍼(pH 7.4) 중에서 화합물 1과 Hg² ⁺이온 복합체에 대한 Job's plot의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 11은 50% 아세토나이트릴-HEPES 버퍼(pH 7.4) 중에서 Hg² ⁺이온의 각각 다른 농도 조건에서의 화합물 1의 형광 스펙트럼을 나타낸 그래프이다.

본 발명은 수은 이온을 검출하기 위한 형광 아미노산 센서에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 하기 화학식 1로 표시되는 수은 이온 검출용 형광 아미노산 센서에 관한 것이다:

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 -NH₂, -OCH₃ 또는 -OCH₂CH₃이다.

상기 화학식 1로 표시되는 아미노산 기반의 형광 센서는 수은(Hg² ⁺) 이온과 반응하여 형광 변화를 나타낸다. 즉, Ag⁺, Al³ ⁺, Ca² ⁺, Cd² ⁺, Co³ ⁺, Cr³ ⁺, Cu² ⁺, K⁺, Mg² ⁺, Mn² ⁺, Na⁺, Ni² ⁺, Zn² ⁺, Pb² ⁺ 등의 다른 금속이온에 대해서는 형광 변화를 나타내지 않고, 오로지 수은 이온(Hg² ⁺)에 대해서만 높은 선택성과 민감성을 나타낸다.

또한 본 발명의 상기 형광 아미노산 센서는 나노몰 수준의 수은 이온 존재까지도 탐지가 가능하다. 본 발명의 아미노산 센서는 Perkin-Elmer luminescence spectrophotometer(model LS 55) 사용 시 검출한계가 120 nM로 최소 120 nM 까지 수은 이온 검출이 가능하다. 하지만 본 발명이 상기 범위에 의해 제한되는 것은 아니다.

또한 본 발명에 따른 형광 아미노산 센서를 이용하는 경우 수용액상, 유기용액상 또는 유기용액과 수용액의 혼합상 모두에서 수은 이온 검출이 이루어질 수 있다. 상기 유기용액은 예를 들어, 디메틸포름아마이드(dimethylformamide), 아세토나이트릴(acetonitrile), 메탄올(methanol) 등이 사용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 유기용액과 수용액의 혼합상의 경우, 유기용액의 부피비가 50 % 미만인 경우 수은 이온 존재 시 형광 증가를 보이는 반면, 유기용액의 부피비가 50 % 이상인 경우 수은 이온 존재 시 형광 감소를 보인다.

기존 형광 센서 기술의 경우 감도가 떨어지거나 검출하고자 하는 금속 이온에 대한 선택성이 좋지 않고, 다른 금속이온의 간섭(interference)을 받으며, 수용액상에서 좋지 않은 용해도를 나타내는 등과 같은 문제들로 인해 실제 물에 녹아 있는 수은 이온을 검출하는 것이 어려웠으나, 본원발명의 형광 아미노산 센서의 경우 수용액상에서 용해도가 좋고, 감도가 우수하며, 수은이온(Hg²⁺)만을 선택적으로 검출할 수 있고, 다른 금속 이온의 간섭(interference)이 없으며, 수용액상에서 수은 이온 존재 시 형광이 증가하는 형광 변화를 나타내는 특징을 갖고 있다.

따라서 본 발명에 따른 상기 화학식 1로 표시되는 아미노산 기반의 형광 센서는 생체 또는 환경 내 수은 이온 검출을 위한 센서로서 유용하게 이용될 수 있다. 실시예에서 확인할 수 있는 바와 같이, 생체 또는 환경으로부터 수득한 시료 내에서 수은 이온의 존재 유무는 화학식 1로 표시되는 아미노산 기반의 형광 센서를 시료와 반응시킨 후 형광 변화의 여부를 관찰함으로써 쉽게 탐지할 수 있으며, 수은 이온의 농도에 의존적으로 형광 변화의 정도가 달라지므로 시료 내 수은 이온의 정량분석 또한 가능하다는 특징이 있다. 상기 시료는 수은 이온의 존재 검출이 요구되는 생체 또는 환경으로부터 얻은 시료이면 어떠한 것이든 가능하다. 예를 들어, 상기 시료는 수질 환경의 오염을 평가하기 위해 강이나 바다로부터 얻은 물이나, 동물 또는 사람의 수은 중독을 평가하기 위한 체액 또는 혈액일 수 있다.

본 발명의 형광 아미노산 센서는 다음과 같은 방법을 통해 제조할 수 있다.

형광 아미노산 센서는 (a) 아미노 말단이 보호기에 의해 보호된 메티오닌 및 수지를 순차적으로 반응시켜, 보호기에 의해 보호된 메티오닌(Met)과 수지의 결합물을 고체상 합성법으로 합성하는 단계; (b) 상기 보호기에 의해 보호된 메티오닌(Met)과 수지의 결합물을 5-디메틸아미노-1-나프타렌설포닐 클로라이드와 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 반응 결과물을 트리플루오로아세트산과 반응시키는 단계를 포함하여 이루어진 방법으로 합성될 수 있다.

이때, 상기 메티오닌은 L-form 또는 D-form이 모두 사용될 수 있으며, 상기 보호기는 당 분야에서 통상적으로 사용할 수 있는 것으로, 특별히 한정하지 않으나, 구체적으로, 아미노 말단을 보호하는 보호기로써, 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐기를 보다 바람직하게 사용할 수 있다. 또한, 상기 수지는 당 분야에서 통상적으로 사용할 수 있는 것으로, 특별히 한정하지 않으나, 예를 들어, 링크드 아마이드 메틸벤즈하이드릴 아민(rinked amide MBHA) 수지 또는 왕(Wang) 수지를 보다 바람직하게 사용할 수 있다.

또한, 상기 수지에 결합된 아미노산을 고체상 합성법으로 합성하는 단계에 있어서, 상기 수지 및 아미노산은 1 : 2 ~ 10의 몰비로 결합되어 이루어진 것을 사용하는 것이 좋다. 보다 바람직하기로는 경제성을 고려하여, 수지 및 아미노산이 1 : 3 ~ 7의 몰비로 결합되어 이루어진 것을 사용하는 것이 좋다.

본 발명의 형광 아미노산 센서는 또한 다음과 같은 용액상 합성법을 통해서도 제조할 수 있다.

메티오닌 메틸 에스터와 트리-에틸아민(Tri-ethylamine)을 무수 아세톤 용매에 녹인 후 무수 아세톤에 녹여진 5-디메틸아미노-1-나프타렌설포닐 클로라이드와 반응시켜 형광 아미노산 센서를 제조할 수 있다.

또한 본 발명은 상기 형광 아미노산 센서를 이용한 수용액 환경 또는 생체 내에 존재하는 수은 이온의 선택적 검출방법을 제공한다.

상기 수은 이온의 검출은 형광 아미노산 센서와 수은 이온의 복합체를 여기시켜 킬레이트 증폭 형광(CHEF) 효과를 확인함으로써 수행될 수 있으며, 이 형광 아미노산 센서는 수지나 필름 등에 고정화된 후에도 이온 인식 능력이 유지되며, 이 경우 보다 저 농도의 수은 이온을 검출 할 수 있으며 재활용이 가능하다. 이 경우 상기 킬레이트 증폭을 위한 여기 파장은 330 ~ 380 nm인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 형광 아미노산 센서의 경우 상기 검출은 수용액상, 유기용액상 또는 유기용액과 수용액의 혼합상 모두에서 수행될 수 있어, 수질오염 측정 또는 생체 내 수은량 측정 등 보다 다양한 활용이 가능하다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 아미노산 기반 형광 센서의 합성

화학식 1로 표시되는 아미노산 기반의 형광 센서를 하기 반응식 1에 따라 합성하였다.

[반응식 1]

Rink amide MBHA resin(200 mg, 0.1 mmol)을 3 ml 무수 DMF에 넣고 약 30 분간 미리 팽윤시킨다. 상기의 수지에 50 % 피페리딘/DMF 용액 3 ml을 첨가하여 15 분간 반응시켜 아미노 말단의 Fmoc 그룹을 제거한 후, 1.5 ml 무수 DMF 용매 안에 0.3 mmol Fmoc-L-Methionine(111.45 mg), DIC(47 μl), 그리고 HOBt(40 mg)를 첨가한 후, 미리 15 분간 활성화시킨 용액과 약 4 시간 정도 반응시킨다. 반응 후 용액을 걸러내고, 수지를 DMF와 메탄올로 수차례 세척한 후, kaiser 테스트를 실행한다. kaiser 테스트가 양성으로 나오면 상기의 활성화 용액을 다시 만들어 첨가하고, 음성으로 나올 경우 50 % 피페리딘/DMF를 이용해 아미노 말단의 Fmoc 그룹을 제거하고, 무수 DMF 용매 안에 Dansyl Chloride(0.3 mmol), Triethylamine(0.6 mmol)가 든 용액을 상기의 수지와 혼합한 후, 상온에서 3 시간 동안 적절한 속도로 교반시킨다. 수지에 붙어 있는 형광 아미노산은 제거 용액(Trifluoroacetic acid 95 부피%, water 5 부피%)과 상온에서 2 시간 반응시켜 수지로부터 형광 아미노산을 떼어낸 후 여과를 통해 수지와 용액에 녹아있는 형광 아미노산을 분리하고, 여과된 형광 아미노산 분리 용액 내의 트리플루오로아세트산은 질소 기체를 통과시켜 제거하였다. 이렇게 얻어진 형광 아미노산은 역상 HPLC(C-18 칼럼 delta pak C18-300A, 1.9 * 30 cm)을 이용하여 정제하였다(화합물 1)(78% 수율)(Eluent: water/acetonitrile in 0.1% TFA (gradient): Flow Rate 3.0 mL/min). 정제된 형광 아미노산의 분자량은 ESI 질량분석기를 이용하여 확인하였다. ESI-MS: calcd 382.12 [M+H⁺]⁺, obsd 382.04 [M+H⁺]⁺.

¹H NMR (400 MHz, 50 % CD₃CN/D₂O) δ 8.39(d, 1H, J = 8.8 Hz), 8.07(d, 1H, J = 8.4 Hz), 8.0(d, 1H, J = 7.4 Hz), 7.61(d, 1H, J = 7.7 Hz), 7.52-7.45(m, 2H), 3.40-3.36(m, 1H), 3.0(s, 6H), 1.79-1.75(m, 1H), 1.55-1.50(m, 1H), 1.38-1.34(m, 2H), 1.27(s, 3H)

¹³C NMR (50 % CD₃CN/D₂O) δ 175.1, 144.2, 136.2, 131.3, 129.8, 128.8, 128.3, 127.8, 126.4, 124.8, 118.7, 55.8, 46.8 (x2), 32.1, 29.9, 14.5

실시예 2: 금속 이온 용액의 제조 및 이를 이용한 형광변화 분석

화합물 1(Dansyl-Met) 30 μM의 금속 이온 결합 특성을 평가하기 위하여 Ag⁺, Al³ ⁺, Ca² ⁺, Cd² ⁺, Co³⁺, Cr³ ⁺, Cu² ⁺, K⁺, Hg² ⁺, Mg² ⁺, Mn² ⁺, Na⁺, Ni² ⁺, Zn² ⁺, Pb² ⁺이온들을 사용하였다. 상기 금속 이온들을 포함하는 용액을 먼저 제조하였다. 수용액 상의 Ag⁺, Al³ ⁺, Ca² ⁺, Cd² ⁺, Co³ ⁺, Cr³ ⁺, Cu² ⁺, K⁺, Hg² ⁺, Mg²⁺, Mn² ⁺, Na⁺, Ni² ⁺, Zn² ⁺, Pb² ⁺이온들의 퍼클로레이트 염 스톡 솔루션(10 mM)을 제조하였다. 그리고 화합물 1의 스톡 솔루션(1 mM)도 물로 제조하였다. 화합물 1의 스톡 솔루션을 테스트 튜브로 옮기고, 각 금속 이온의 스톡 솔루션의 적당 분취량을 가한 후, 20 mM HEPES buffer(pH 7.4)와 물로 이 용액을 2 mL로 희석하여 테스트 용액을 제조하였다. 상기 제조된 테스트 용액들에 대해 형광 스펙트럼을 측정하였다. 형광 스펙트럼의 측정 시, 일반적으로, 여기 파장은 380 nm, 여기와 방출 슬릿 폭은 10 nm 와 6 nm였다. Hg² ⁺의 저농도 적정시에는 Hg² ⁺의 첨가 후 5 분 뒤에 형광 스펙트럼을 측정하였다.

도 1은 10 mM HEPES buffer (pH 7.4) 중에서, 다양한 금속이온들(90 μM)과 화합물 1 (30 μM)의 형광 스펙트럼 측정 결과를 보여준다. 시험된 다양한 금속 이온들 가운데 오직 Hg² ⁺에 대해서만 화합물 1이 큰 형광 상승을 보였다. 즉, Hg² ⁺첨가에 의하여 6 배 큰“off-on" 타입의 형광 상승이 관찰되었다.

도 7은 50% 아세토나이트릴-HEPES 버퍼(Acetonitrile-HEPES buffer)(pH 7.4)중에서, 금속 이온들(150 μM)과 화합물 1(30 μM)의 형광 스펙트럼 측정 결과를 보여준다. 시험된 다양한 금속 이온들(5 당량) 가운데 오직 Hg² ⁺에 대해서만 화합물 1이 큰 형광 하강을 보였다. 즉, Hg² ⁺첨가에 의하여 5 배 작은“on-off" 타입의 형광 하강이 관찰되었다.

도 2는 화합물 1(30 μM)에 대해 3 당량의 다양한 금속 이온들을 넣은 후 자외선빛(365 nm) 아래서의 형광 변화를 보여준다.

도 8은 50% 아세토나이트릴-HEPES 버퍼(Acetonitrile-HEPES buffer)(pH 7.4) 중에서, 화합물 1(30 μM)에 대해 5 당량의 다양한 금속 이온들을 첨가하기 전과 첨가한 후의 형광 변화를 보여준다.

실시예 3: 형광 아미노산 센서( Dansyl - Met )-수은 복합체의 제조

형광 아미노산 센서인 화합물 1과 수은 이온 간의 결합 상태를 분석하기 위하여, 화합물 1 - 수은 복합체를 제조하였다.

도 3은 화합물 1 - 수은 복합체의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸다. 각각 [2Dansyl-Met + Hg² ⁺ - H⁺]⁺와 [2Dansyl-Met + Hg² ⁺ +2ClO₄ ^-- H⁺]⁺에 상응하는 m/z 963.02 와 1162.94에서 피크를 명확히 관찰할 수 있다. 화합물 1 - 수은 복합체에서의 화합물 1과 수은의 결합 비율을 다시 한번 검증하기 위하여 Job's plot을 수행하였다.

도 4는 화합물 1 - 수은 복합체에 대한 Job's plot의 결과를 나타낸다. 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) 에서 화합물 1과 수은의 전체 농도를 90 μM로 일정하게 유지하여 실험한 결과, 화합물 1과 수은의 결합 비율이 2 : 1임을 알 수 있었다.

도 9는 50% 아세토나이트릴-물(Acetonitrile-water) 중에서, 화합물 1 - 수은 복합체의 ESI-MS 스펙트럼을 나타낸다. [Dansyl-Met + Hg² ⁺ - H⁺]⁺에 상응하는 m/z 581.90 에서 피크를 명확히 관찰할 수 있다. 50% 아세토나이트릴-물(Acetonitrile-water) 중에서, 화합물 1 - 수은 복합체에서의 화합물 1과 수은의 결합 비율을 다시 한번 검증하기 위하여 Job's plot을 수행하였다.

도 10은 화합물 1 - 수은 복합체에 대한 Job's plot의 결과를 나타낸다. 50% 아세토나이트릴-HEPES 버퍼(Acetonitrile-HEPES buffer)(pH 7.4)에서 화합물 1과 수은의 전체 농도를 90 μM로 일정하게 유지하여 실험한 결과, 화합물 1과 수은의 결합 비율이 1 : 1임을 알 수 있었다.

실시예 4: 수은 이온의 농도에 따른 검출능 평가

Hg² ⁺의 농도에 따른 본 발명의 아미노산 기반의 형광 센서의 검출능을 평가하기 위하여, 각기 다른 Hg²⁺의 농도 조건에서의 화합물 1의 형광 스펙트럼을 측정하였다.

도 5는 10 mM HEPES buffer(pH 7.4)에서, Hg² ⁺의 각각 다른 농도(0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 μM) 조건에서의 화합물 1의 형광 스펙트럼을 보여준다. 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, Hg² ⁺의 농도 증가에 따라 화합물 1이 나타내는 형광 강도는 강해짐을 알 수 있다.

도 11은 50% 아세토나이트릴-HEPES 버퍼(Acetonitrile-HEPES buffer)(pH 7.4)에서, Hg² ⁺의 각각 다른 농도(0, 30, 60, 90, 120, 150, 180 μM) 조건에서의 화합물 1의 형광 스펙트럼을 보여준다. 도 11에서 볼 수 있는 바와 같이, Hg² ⁺의 농도 증가에 따라 화합물 1이 나타내는 형광 세기가 감소함을 알 수 있다.

추가적으로, 화합물 1과 Hg² ⁺ 이온과의 결합이 가역적인지를 확인하고자 다음과 같은 조건 하에서 형광 스펙트럼을 측정하였다.

도 6은 10 mM HEPES 버퍼(pH 7.4) 중에서 화합물 1(30 μM)과 Hg² ⁺이온(90 μM) 복합체를 형성시켜 EDTA의 각각 다른 농도(0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 μM) 조건에서의 화합물 1과 Hg² ⁺이온 복합체의 형광 스펙트럼을 보여준다. 도 6에서 볼 수 있는 바와 같이, EDTA의 농도 증가에 따라 화합물 1과 Hg² ⁺이온 복합체의 형광 강도가 낮아짐을 알 수 있다. 이 결과를 통해 화합물 1과 Hg²⁺이온 간의 결합이 가역적임을 알 수 있다.

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 수은 이온 검출용 형광 아미노산 센서:
[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 -NH₂, -OCH₃ 또는 -OCH₂CH₃이다.
제 1 항에 있어서, 상기 수은 이온 검출은 수용액상, 유기용액상 또는 유기용액과 수용액의 혼합상에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 형광 아미노산 센서.
제 2 항에 있어서, 상기 유기용액은 디메틸포름아마이드, 아세토나이트릴 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 유기용액인 것을 특징으로 하는 형광 아미노산 센서.
제 1 항에 있어서, 검출한계가 120 nM인 것을 특징으로 하는 형광 아미노산 센서.
(a) 아미노 말단이 보호기에 의해 보호된 메티오닌 및 수지를 순차적으로 반응시켜, 보호기에 의해 보호된 메티오닌과 수지의 결합물을 고체상 합성법으로 합성하는 단계;
(b) 상기 결합물을 5-디메틸아미노-1-나프타렌설포닐 클로라이드와 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 반응 결과물을 트리플루오로아세트산과 반응시키는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 형광 아미노산 센서의 제조방법.
메티오닌메틸에스터와 트리-에틸아민(Tri-ethylamine)을 무수 아세톤 용매에 녹인 후 무수 아세톤에 녹여진 5-디메틸아미노-1-나프타렌설포닐 클로라이드와 반응시켜 형광 아미노산 센서를 제조하는 단계
를 포함하는 것을 특징으로 하는 용액상 합성법을 통한 형광 아미노산 센서의 제조방법.
제 1 항 내지 제 4 항 중 선택된 어느 한 항의 형광 아미노산 센서를 이용한 수은 이온의 검출방법으로써, 상기 검출은 수용액상, 유기용액상 또는 유기용액과 수용액의 혼합상에서 이루어지는 것을 특징으로 하는 수은 이온 검출방법.