CN115636836B - 一种比率生物发光可视化检测次氯酸的荧光探针及其制备与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种比率生物发光可视化检测次氯酸的荧光探针及其制备与应用，属于分析检测技术领域。本发明提供一种带有HaloTag连接基团且对HOCl特异性响应的小分子荧光探针(H‑TMR‑HA)，将其与融合HaloTag蛋白标签的NanoLuc荧光素酶(H‑Nluc)构成一种新型比率生物发光检测系统。该方法能在PBS缓冲溶液和实际样品中实现对HOCl的高选择性和高灵敏度可视化定量检测。本发明采用生物发光作为信号来源，可以有效避免实际样品自发荧光带来的干扰及光漂白等，可实现简单、便捷的可视化检测，还可以有效避免探针浓度等因素造成的信号强度变化，实现HOCl精准定量检测。
Description
技术领域
本发明属于分析检测技术领域，特别是涉及一种比率生物发光可视化检测次氯酸的荧光探针及其制备与应用。
背景技术
次氯酸(HOCl)是一种强氧化剂，具有杀菌能力强、范围广、无残留、无污染、对人体无害、对金属腐蚀性弱等优点。作为一种食品添加剂广泛应用于餐饮业，食品和饮料加工。其杀菌机理是依靠次氯酸的氧化作用，次氯酸分子能渗入细菌及其他微生物细胞内部，分解、破坏微生物的氨基酸、酶系统，进而控制微生物蛋白质的合成，终止微生物的代谢机能。因此开发次氯酸在食品中安全检测、安全监管、临床和环境应用的方法是非常重要的。传统的检测方法有很多，比如碘还原滴定法，分光光度法，化学发光分析法和库仑法等。但上述方法大多操作手续繁琐，给实际操作带来一定的困难。即时检测(Point-of-care testing,POCT)技术作为一种简便、快速的在线分析检测手段，在疾病诊断、健康管理、环境监测等领域得到了广泛应用。因此利用POCT实现HOCl的可视化定量检测具有重大意义。
生物发光(Bioluminescence)是存在于生物体内的一种化学发光现象，通常由称为荧光素酶的蛋白质与其底物荧光素之间的相互作用引起。在辅酶因子的存在下，荧光素酶通过催化酶底物发生反应，形成激发态下的氧化底物分子，然后返回基态，以可见光的形式放出能量光。由于不需要外部激发来产生光信号，生物发光探针避免了来自组织自发荧光的干扰，因而显示出非常高的灵敏度与信噪比。目前，对荧光素酶底物的共价与非共价修饰是设计生物发光传感的通用策略。在此基础上，生物发光传感器在体外视觉检测、活性小分子的生物成像方面取得了令人满意的成果，如酶、金属离子、活性氧(ROS)和活性硫化物(RSS)。然而，开启式生物发光传感器的信号强度受到底物浓度的影响很大。当荧光素酶催化底物时，生物发光信号变得越来越弱。因此，传统的开启式生物发光传感器在实际应用中难以满足定量分析的要求。
基于生物发光的定量检测已被应用于蛋白、小分子等。如，2015年，MatthewB.Robers等人报道了一种基于生物发光共振能量转移(BioluminescenceResonanceEnergy Transfer，BRET)的传感器用于细胞内药物的定量分析。2017年，KaiJohnsson等人报道了一种生物发光传感器，用于血液中药物的定量检测。2018年，Daniel Citterio等人开发一种纸微流控分析装置用于快速定量检测血液中的抗体。同年，Kai Johnsson等人报道了一系列生物传感器，实现了血液中代谢物的定量、即时检测，为疾病的诊断与治疗提供了简单、快速、有效的工具。尽管文献报道了一系列基于生物发光的蛋白探针，且在对分析物的检测中取得了突出的优势，但此类探针的识别机理主要集中在蛋白与蛋白、蛋白与小分子的相互作用，分析对象也主要集中在抗原、药物及代谢物等，对HOCl的定量检测尚未报道。
因此，结合生物发光蛋白定量分析的优势，构建基于生物发光的新型比率系统，实现实际样品中HOCl的可视化定量检测具有重大意义和应用前景。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种比率生物发光可视化检测次氯酸的荧光探针及其制备与应用，本发明荧光探针合成路线简单，采用生物发光作为信号来源，检测过程中不需要激发光，可以有效避免实际样品自发荧光带来的干扰及光漂白等，本发明基于比率生物发光信号输出，可以有效避免探针浓度等因素造成的信号强度变化，实现HOCl精准定量检测，本发明比率生物发光检测系统稳定性好，在分析化学、食品安全、以及环境科学等技术领域有着巨大的应用前景。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明目的之一是提供一种比率生物发光可视化检测次氯酸的荧光探针，所述荧光探针的结构式为：
本发明目的之二是提供一种所述的比率生物发光可视化检测次氯酸的荧光探针的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：将6-羧基四甲基罗丹明(TMR)、2-(2-(6-氯己基氧基)乙氧基)乙胺盐酸盐和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)溶解在N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，然后滴加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，经搅拌、蒸发、纯化、干燥，得到H-TMR；
步骤2：将H-TMR用无水二氯甲烷溶解，然后滴加草酰氯，室温搅拌3h后进行减压浓缩除去未反应完全的草酰氯，加入甲酰肼后溶解于无水二氯甲烷中，再滴加N,N-二异丙基乙胺(DIPEA)，经搅拌、蒸发、纯化、干燥，得到荧光探针H-TMR-HA。
进一步地，步骤1中，所述6-羧基四甲基罗丹明、2-(2-(6-氯己基氧基)乙氧基)乙胺盐酸盐、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:1.2:2。
进一步地，步骤1中，所述搅拌为置于氮气保护下室温搅拌4～6小时；所述纯化采用硅胶柱层析纯化法，将有机层旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用体积比10:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂柱层析分离；所述干燥为真空干燥。
进一步地，步骤2中，所述H-TMR、甲酰肼和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:3:3。
进一步地，步骤2中，所述搅拌为室温搅拌10h；所述纯化采用硅胶柱层析纯化法，将有机层旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用体积比10:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂柱层析分离；所述干燥为真空干燥。
具体反应过程如下：
本发明目的之三是提供一种所述的比率生物发光可视化检测次氯酸的荧光探针在比率生物发光检测系统构建中的应用。
进一步地，所述比率生物发光检测系统构建的步骤包括：将荧光探针H-TMR-HA与HOCl在缓冲溶液或含有实际样品的缓冲溶液中进行特异性响应，室温下特异性响应0.5h，将响应后的混合溶液与蛋白质H-Nluc于4℃共孵育0.5h；加入催化底物8-苄基-2-[(呋喃-2-基)甲基]-6-苯基咪唑并[1,2-A]吡嗪-3(7H)-酮后，测量比率信号。
进一步地，缓冲溶液选取pH7.4PBS或使用pH7.4PBS稀释20倍的牛奶样品；所述H-TMR-HA最终浓度为15μmol，HOCl使用超纯水稀释为0.1mmol的母液。
进一步地，所述蛋白质H-Nluc为融合了HaloTag蛋白标签的NanoLuc荧光素酶。
本发明中，NanoLuc荧光素酶为19.1kDa，单体，非ATP依赖性酶，通过定向进化从深海虾荧光素酶中提取，所述NanoLuc荧光素酶通过催化底物(8-苄基-2-[(呋喃-2-基)甲基]-6-苯基咪唑并[1,2-A]吡嗪-3(7H)-酮)发生反应，形成激发态下的氧化底物分子，然后返回基态，以可见光的形式放出能量。
进一步地，所述蛋白质H-Nluc通过重组蛋白表达和纯化技术获得，包括如下步骤：将pET28a质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(DE3)中，将细胞于37℃在含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，使用0.1mmol异丙基硫代半乳糖苷在20℃过夜，在OD600为0.6时诱导H-Nluc表达，收获细胞并使用蛋白提取试剂进行裂解，使用Ni-NTA亲和色谱法来纯化传感器蛋白，进行Strep-Tactin纯化，得到蛋白质H-Nluc。利用BCA蛋白定量法通过在562nm处测量吸光度来确定蛋白质浓度。通SDS-PAGE确认蛋白质纯度。纯化的蛋白质在使用前储存于-80℃环境中。
进一步地，所述H-Nluc的最终浓度为0.1μmol或1.5μmol，取决于是否需要肉眼可视化检测。
进一步地，所述比率信号通过荧光光谱仪(F-7000)测得450和580nm处生物发光强度或智能手机拍照后使用imageJ计算红色通道的平均像素强度与蓝色通道的平均像素强度，得到与HOCl相关的比率信号进行定量检测。
本发明的有益效果：
(1)本发明通过TMR合成带有氯己烷小分子的H-TMR-HA，H-TMR-HA可对HOCl特异性识别并反应生成H-TMR，且通过重组蛋白表达和纯化技术获得带有HaloTag标签的H-Nluc，HaloTag标签蛋白利用其Asp-106与H-TMR上修饰的氯己烷小分子的亲核取代反应，在H-Nluc和H-TMR之间生成共价键，在加入8-苄基-2-[(呋喃-2-基)甲基]-6-苯基咪唑并[1,2-A]吡嗪-3(7H)-酮后使得该系统拥有在450与580nm处的比率信号。
(2)本发明采用生物发光作为信号来源，检测过程中不需要激发光，可以有效避免实际样品的自发荧光带来的干扰及探针的光漂白等。此外，采用发光强度高的生物发光体系，信号可以直接通过智能手机收集，有望实现简单、便捷的即时检测，而无需大型仪器的参与。
(3)本发明基于生物发光的比率信号输出，检测过程中避免探针的浓度、仪器的效率、环境等因素的干扰等造成的信号强度变化。此外，仪器测量的450/580nm处生物发光强度的比值和智能手机中提取出蓝色/红色平均色素的比值与次氯酸的浓度在一定范围内呈线性关系。因此以比率变化作为定量HOCl浓度的标准，具有选择性好、准确性高、灵敏度高等优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明生物发光系统对HOCl的识别示意图；
图2为实施例1化合物H-TMR的质谱图；
图3为实施例1化合物H-TMR-HA的1HNMR图；
图4为实施例1化合物H-TMR-HA的质谱图；
图5为验证例1生物发光系统的聚丙烯酰胺凝胶电泳数据图，1号泳道为H-Nluc，2号泳道为H-Nluc与H-TMR孵育0.5h后的混合溶液(两个泳道中H-Nluc的最终浓度相同)；
图6为验证例2不同HOCl浓度(0-5μmol)时，生物发光系统发射比率变化图(580/450nm)；其中a图为不同浓度次氯酸(0-5μmol)处理后，生物发光系统数据归一化的光谱图；b图为不同浓度次氯酸(0-5μmol)处理后生物发光系统发射比率(580/450nm)数据图，小图为低浓度次氯酸(0-0.8μmol)处理后生物发光系统发射比率(580/450nm)数据图。
图7为验证例3离子选择性，加入不同生物小分子后生物发光系统比率变化(450/580nm)的对比图；1-17分别代表生物活性小分子blank,Ca2+(1mmol),Cu2+(1mmol),Fe3+(1mmol),Mg2+(1mmol),NH4 +(1mmol),CO3 2-(1mmol),NO3 -(1mmol),S2O3 2-(1mmol),SO3 2-(1mmol),HO·(100μmol),O2 ·-(100μmol),ONOO-(100μmol),H2O2(100μmol),GSH(1mmol),Cys(1mmol),HOCl(5μmol)；
图8为验证例4不同HOCl浓度(1μmol、2μmol、5μmol)生物发光系统30分钟内的比率稳定性；
图9为验证例4使用智能手机可视化定量HOCl数据图，a为拍照图片，b为使用imageJ提取得到的红色平均色素强度与蓝色平均色素强度的比值；
图10为验证例5牛奶中不同HOCl浓度(0-15μmol)时，生物发光系统发射比率变化图(580/450nm)；其中a图为在实际样品牛奶中不同浓度次氯酸(0-15μmol)处理后，生物发光系统数据归一化的光谱图；b图为在实际样品牛奶中不同浓度次氯酸(0-15μmol)处理后生物发光系统发射比率(580/450nm)数据图，小图为在实际样品牛奶中低浓度次氯酸(0-3μmol)处理后生物发光系统发射比率(580/450nm)数据图。
图11为验证例5牛奶中使用智能手机可视化定量HOCl数据图；a为拍照图片，b为使用imageJ提取得到的红色平均色素强度与蓝色平均色素强度的比值。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。
实施例1
1、一种特异性识别HOCl的探针H-TMR-HA的制备方法：
(1)合成H-TMR：将TMR(6-羧基四甲基罗丹明，43.0mg，0.1mmol)，(2-(2-(6-氯己基氧基)乙氧基)乙胺盐酸盐(26.0mg，0.1mmol)和HBTU(45.6mg，0.12mmol)溶解在DMF(3mL)中。然后滴加DIPEA(35μL，0.2mmol)。置于氮气保护下室温搅拌4～6小时，反应结束后旋转蒸发除去溶剂，然后用硅胶柱层析纯化，真空干燥，得到H-TMR为红色固体(30.0mg，产率47％)。H-TMR的13CNMR如图2所示。
(2)合成H-TMR-HA：H-TMR(63.5mg，0.1mmol)使用无水二氯甲烷(2mL)溶解。然后缓慢滴加草酰氯(1mL)，室温搅拌3h后减压浓缩除去未反应完全的草酰氯。所得到的中间产物与甲酰肼(18.2mg，0.3mmol)混合后加入无水二氯甲烷(2mL)溶解，再缓慢滴加DIPEA(40μL)后室温搅拌10h。待反应结束后旋转蒸发除去溶剂，然后用硅胶柱层析纯化，真空干燥，得到H-TMR-HA为红色固体(17.6mg，产率26％)。H-TMR-HA的1HNMR和13CNMR如图3和图4所示：
1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.87-9.73(m,1H),8.67(dd,J＝10.3,5.1Hz,1H),8.12-7.91(m,2H),7.57(s,1H),7.39(d,J＝10.3Hz,1H),6.54(d,J＝9.5Hz,1H),6.49-6.38(m,5H),3.59(t,J＝6.6Hz,2H),3.50-3.44(m,4H),3.41(dd,J＝5.7,3.4Hz,2H),3.32-3.30(m,4H),2.92(d,J＝5.4Hz,12H),1.72-1.62(m,2H),1.42(dd,J＝14.0,7.0Hz,2H),1.33(dd,J＝15.5,7.4Hz,4H).MS(ESI)calculatedforC36H45ClN5O6[M+H]+:678.3,found:678.2.
2、H-Nluc的表达和纯化：
将pET28a质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞(DE3)中，将细胞于37℃在含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养。使用0.1mmol异丙基硫代半乳糖苷在20℃过夜，在OD600为0.6时诱导H-Nluc表达。收获细胞并使用蛋白提取试剂(Novagen)进行裂解。使用Ni-NTA亲和色谱法来纯化传感器蛋白，然后进行Strep-Tactin纯化。利用BCA蛋白定量法通过在562nm处测量吸光度来确定蛋白质浓度。通SDS-PAGE确认蛋白质纯度，纯化的蛋白质在使用前储存于-80℃环境中。
3、比率生物发光检测系统的构建：在PBS缓冲液(pH7.4)中，加入初始浓度为1mmol的H-TMR-HA，使溶液中H-TMR-HA的浓度为15μmol。然后依次加入不同量的初始浓度为0.1mmol的HOCl，静置0.5h使HOCl与H-TMR-HA充分反应；将响应后的混合溶液与H-Nluc(最终浓度为0.1μmol)于4℃共孵育0.5h；取190μL孵育好的生物发光系统缓冲溶液加入10μL稀释50倍后的8-苄基-2-[(呋喃-2-基)甲基]-6-苯基咪唑并[1,2-A]吡嗪-3(7H)-酮，马上使用荧光光谱仪测量比率信号(580/450nm)。
验证例1
使用聚丙烯酰胺凝胶电泳实验验证生物发光系统的成功构建：
使用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodiumdodecyl sulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis，SDS-PAGE)在12％的分离胶和5％的浓缩胶的组合胶中进行。将含有8μLH-Nluc的缓冲溶液和2μL5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲溶液混合后，95℃孵育10分钟进行蛋白退火变性。电泳在1×电泳液(25mmolTris-base，0.2mol甘氨酸，0.1％(w/v)SDS(十二烷基硫酸钠))中进行，首先在60V电泳30分钟，之后转至120V电泳1小时。电泳结束后先用凝胶成像仪使用Krypton通道进行荧光成像，随后用考马斯亮蓝染色液对凝胶进行染色、脱色处理，最后使用Cy2通道进行凝胶成像。如图5所示，1号泳道为H-Nluc，2号泳道为H-Nluc与H-TMR孵育0.5h后的混合溶液(两个泳道中H-Nluc的最终浓度相同)。在未经考马斯亮蓝染色前，仅2号泳道有明显的荧光蛋白条带，染色后两个泳道均有明显的蛋白条带。测定结果表明：H-Nluc与H-TMR被成功偶联，实施例1制备的生物发光系统构建成功。
验证例2
不同HOCl浓度(0-5μmol)时，生物发光系统发射比率(580/450nm)变化：
在PBS缓冲液(pH7.4)中，加入初始浓度为1mmol的H-TMR-HA，使溶液中H-TMR-HA的浓度为15μmol。然后，依次加入不同量的初始浓度为0.1mmol的HOCl，使得溶液中HOCl的浓度分别为0μmol,0.03μmol,0.05μmol,0.07μmol,0.1μmol,0.2μmol,0.3μmol,0.4μmol,0.5μmol,0.6μmol,0.7μmol,0.8μmol,0.9μmol,1.5μmol,2μmol,3μmol,4μmol,5μmol。静置0.5h使HOCl与H-TMR-HA充分反应后再加入H-Nluc(最终浓度为0.1μmol)于4℃共孵育0.5h；取190μL孵育好的生物发光系统缓冲溶液加入10μL稀释50倍后的8-苄基-2-[(呋喃-2-基)甲基]-6-苯基咪唑并[1,2-A]吡嗪-3(7H)-酮立即用荧光光谱仪测试不同浓度HOCl条件下的生物发光发射比率(580/450nm)，结果如图6所示。由图6可知，随着HOCl的增加(0-5μmol)，580/450nm处发射比率增强。测定结果表明：实施例1制备的生物发光系统能够实现对HOCl的定量检测。
验证例3
检测HOCl的选择性测试：
在PBS缓冲液(pH7.4)中，加入初始浓度为1mmol的H-TMR-HA，使溶液中H-TMR-HA的浓度为15μmol。如验证例2所述，在同样测试条件下，向溶液中加入过量的其它生物活性小分子，测试加入不同生物活性小分子之后的生物发光发射比率(580/450nm)，结果如图7所示。1-17分别代表生物活性小分子blank,Ca2+(1mmol),Cu2+(1mmol),Fe3+(1mmol),Mg2+(1mmol),NH4 +(1mmol),CO3 2-(1mmol),NO3 -(1mmol),S2O3 2-(1mmol),SO3 2-(1mmol),HO·(100μmol),O2 ·-(100μmol),ONOO-(100μmol),H2O2(100μmol),GSH(1mmol),Cys(1mmol),HOCl(5μmol)。由图7可知，只有当HOCl存在时，580/450nm比率才明显升高。测定结果表明：其它生物活性小分子不对检测结果产生干扰，说明本发明制备的生物发光系统对HOCl具有较高的选择性。
验证例4
测试生物发光系统的稳定性：
如验证例2所述，在同样测试条件下，依次加入不同量的初始浓度为0.1mmol的HOCl(1μmol、2μmol、5μmol)，再加入稀释50倍后的8-苄基-2-[(呋喃-2-基)甲基]-6-苯基咪唑并[1,2-A]吡嗪-3(7H)-酮使用荧光光谱仪持续测量0.5h内的发射比率。如图8所示，在0.5h内比率基本保持平稳，测定结果表明：生物发光系统有良好的稳定性。
使用智能手机进行生物发光系统拍照，实现HOCl可视化检测：
如验证例2中得到不同HOCl的浓度(0μmol,0.1μmol,0.3μmol,0.5μmol,0.7μmol,1μmol,2μmol,3μmol,4μmol,5μmol)的生物发光系统，其中H-Nluc最终浓度为1.5μmol。取80μL孵育好的生物发光系统缓冲溶液加入20μL稀释50倍后的8-苄基-2-[(呋喃-2-基)甲基]-6-苯基咪唑并[1,2-A]吡嗪-3(7H)-酮放入透明的横排96孔板中，使用智能手机在黑暗中拍摄以防止环境光干扰测量，手机参数设置曝光时间为1s，光圈为f/1.79，焦距为4.71mm，感光度为6400。然后通过imageJ提取红色和蓝色通道并计算平均像素强度来分析所述图片。图9中a显示所得图片，图9中b显示不同HOCl浓度下红色通道的平均像素强度除以蓝色通道的平均像素强度的比率。测定结果表明：使用智能手机可以很好的可视化定量检测HOCl。
验证例5
实际样品牛奶中对HOCl进行检测：
在超市中购买蒙牛纯牛奶，将其12000rpm五分钟离心后取上清液，通过0.44μm滤膜过滤得到牛奶样品。随后使用PBS缓冲液(pH7.4)将牛奶样品稀释20倍得到牛奶-PBS缓冲溶液。在牛奶-PBS缓冲溶液中，加入初始浓度为1mmol的H-TMR-HA，使溶液中H-TMR-HA的浓度为15μmol。如验证例2所述，在同样测试条件下，依次加入不同量的初始浓度为0.1mmol的HOCl，使得溶液中HOCl的浓度分别为0μmol,0.2μmol,0.5μmol,1μmol,2μmol,3μmol,4μmol,5μmol,6μmol,7μmol,8μmol,9μmol,10μmol,12μmol,15μmol。测试其生物发光发射比率(580/450nm)，如图10所示，随着HOCl的增加(0-15μmol)，580/450nm处发射比率增强。测定结果表明：本发明制备的生物发光系统能够实现牛奶样品中HOCl的定量检测。
使用智能手机进行生物发光系统拍照，实现实际样品牛奶中HOCl可视化检测：
首先得到不同HOCl的浓度(0μmol,0.5μmol,1μmol,2μmol,3μmol,4μmol,5μmol,9μmol,12μmol,15μmol)的生物发光系统，如验证例4所述，在同样测试条件下，使用智能手机在黑暗中进行拍摄，然后通过imageJ提取红色和蓝色通道并计算平均像素强度来分析所述图片。图11中a显示所得图片，图11中b显示不同HOCl浓度下红色通道的平均像素强度除以蓝色通道的平均像素强度的比率。测定结果表明：使用智能手机可以很好的可视化定量检测牛奶中的HOCl。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (7)
1.一种比率生物发光可视化检测次氯酸的荧光探针，其特征在于：所述荧光探针的结构式为：
2.一种如权利要求1所述的比率生物发光可视化检测次氯酸的荧光探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：将6-羧基四甲基罗丹明、2-(2-(6-氯己基氧基)乙氧基)乙胺盐酸盐和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯溶解在N,N-二甲基甲酰胺中，然后滴加N,N-二异丙基乙胺，经搅拌、蒸发、纯化、干燥，得到H-TMR；
所述步骤1中，所述6-羧基四甲基罗丹明、2-(2-(6-氯己基氧基)乙氧基)乙胺盐酸盐、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:1:1.2:2；
步骤2：将H-TMR用无水二氯甲烷溶解，然后滴加草酰氯，搅拌3h后进行减压浓缩，加入甲酰肼后溶解于无水二氯甲烷中，再滴加N,N-二异丙基乙胺，经搅拌、蒸发、纯化、干燥，得到荧光探针H-TMR-HA；
所述步骤2中，所述H-TMR、甲酰肼和N,N-二异丙基乙胺的摩尔比为1:3:3；
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述纯化采用硅胶柱层析纯化法，将有机层旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用体积比10:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂柱层析分离。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述纯化采用硅胶柱层析纯化法，将有机层旋转蒸馏除去溶剂，固体用二氯甲烷溶解，用体积比10:1的二氯甲烷和甲醇混合溶剂柱层析分离。
5.一种如权利要求1所述的比率生物发光可视化检测次氯酸的荧光探针在制备比率生物发光检测系统中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述比率生物发光检测系统构建的步骤包括：将荧光探针H-TMR-HA与HOCl在缓冲溶液或含有实际样品的缓冲溶液中进行特异性响应，将响应后的混合溶液与蛋白质H-Nluc于4℃共孵育0.5h；加入催化底物8-苄基-2-[(呋喃-2-基)甲基]-6-苯基咪唑并[1,2-A]吡嗪-3(7H)-酮后，测量比率信号；
所述蛋白质H-Nluc为融合了HaloTag蛋白标签的NanoLuc荧光素酶。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述蛋白质H-Nluc通过重组蛋白表达和纯化技术获得，包括如下步骤：将pET28a质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，将细胞于37℃在含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养，使用0.1mmol异丙基硫代半乳糖苷在20℃过夜，在OD600为0.6时诱导H-Nluc表达，收获细胞并使用蛋白提取试剂进行裂解，使用Ni-NTA亲和色谱法来纯化传感器蛋白，得到蛋白质H-Nluc。
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| CN (1) | CN115636836B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109073557A (zh) * | 2016-05-20 | 2018-12-21 | 霍华德休斯医学研究所 | 光活性荧光团和体内标记方法 |
| CN109384779A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-02-26 | 湖南科技大学 | 一种可比率检测次氯酸的荧光纳米探针及其制备方法和应用 |
| CN109851622A (zh) * | 2019-01-22 | 2019-06-07 | 济南大学 | 一种靶向溶酶体的次氯酸根荧光探针 |
-
2022
- 2022-10-13 CN CN202211252111.2A patent/CN115636836B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109073557A (zh) * | 2016-05-20 | 2018-12-21 | 霍华德休斯医学研究所 | 光活性荧光团和体内标记方法 |
| CN109384779A (zh) * | 2018-11-05 | 2019-02-26 | 湖南科技大学 | 一种可比率检测次氯酸的荧光纳米探针及其制备方法和应用 |
| CN109851622A (zh) * | 2019-01-22 | 2019-06-07 | 济南大学 | 一种靶向溶酶体的次氯酸根荧光探针 |
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| Publication number | Publication date |
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