CN109073557A - 光活性荧光团和体内标记方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了光活性荧光团、光活性配体和光活性复合体。光活性荧光团包括含氮杂环丁烷的Janelia‑Fluor染料的可光活化衍生物。光活性配体包括光活性荧光团和蛋白标签。光活性复合体包括与蛋白缀合的光活性配体。本发明还提供了用光活性荧光团、光活性配体和光活性复合体进行体内标记和光活化光活性荧光团、光活性配体和光活性复合体的方法。
Description
相关申请
本申请要求2016年5月20日提交的第62/339,643号美国临时专利申请的优先权，其全部公开内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明的主题一般性地涉及光活性荧光团和体内标记方法。更具体地，本发明的主题涉及小分子光活性荧光团，用小分子光活性荧光团在体内标记的方法，以及荧光化合物的体内光活化方法。
背景技术
小分子荧光团是用于高级成像实验的重要工具。这些比荧光蛋白更亮的荧光团，是现代显微镜检查的关键要素。最近，新的蛋白特异性标记策略的开发，例如Johnsson倡导的自我标记标签概念，已经能够在活细胞内形成荧光生物缀合物：可透过膜的合成染料“配体”被动地扩散到细胞中，在细胞中与它们的同源蛋白“标签”形成共价键。这种类型的自我标记标签将遗传编码(荧光蛋白的主要优点之一)与有机荧光团的有利光物理学结合在一起。
基于这些复杂的连接技术，本发明人最近报道了掺入四元氮杂环丁烷环可以显著改善小的、可渗透细胞的荧光团的亮度和光稳定性。这些“Janelia Fluor”(JF)染料是用于活细胞成像的优秀标记，特别是在单分子跟踪实验中，它们可以实现更长时间的观察和更好的单个荧光缀合物的定位。然而，大多数笼子基团(caging group)大且疏水，这降低了溶解度和与自我标记标签蛋白的反应性。此外，经典的光笼策略与诸如JF549和JF646的完全N-烷基化罗丹明染料不相容。
尽管Hell及其同事已经发现了一种笼化策略，其中用草酰氯和重氮甲烷处理罗丹明染料产生无色且无荧光的螺环重氮酮，但该策略尚未应用于具有环胺取代基的染料。此外，尽管所得的重氮酮笼化染料已被用作固定细胞成像的抗体标记，但它们尚未被加入至自我标记标签系统中，也未用于活细胞中。因此，仍然需要可光活化(PA)形式的JF染料，其与现有的活细胞标记策略相容并保持JF染料的优异亮度。
发明内容
本发明的主题满足上述需求中的一些或全部，这对于研究本文提供的信息之后的本领域普通技术人员而言将变得显而易见。
本发明内容描述了本发明主题的若干实施方案，并且在许多情况下列出了这些实施方案的变型和置换。本发明内容仅仅是众多不同实施方案的示例。对给定实施方案的一个或多个代表性特征的提及同样是示例性的。这样的实施方案通常可以存在或不存在所提及的特征；同样地，无论是否在本发明内容中列出，这些特征可以应用于本发明主题的其他实施方案。为避免过度重复，本发明内容未列出或建议这些特征的所有可能组合。
在一些实施方案中，本发明的主题涉及光活性荧光团。在一些实施方案中，光活性荧光团包括含氮杂环丁烷的Janelia-Fluor染料的可光活化衍生物。在一些实施方案中，光活性荧光团通过光诱导脱羧。
在一些实施方案中，本发明的主题涉及形成光活性荧光团的方法。在一些实施方案中，该方法包括笼化Janelia-Fluor染料。在一些实施方案中，笼化Janelia-Fluor染料包括将草酰氯加入到Janelia-Fluor染料的溶液中以形成第一混合物，将三乙胺和(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷依次加入至第一混合物中以形成第二混合物，浓缩第二混合物以形成浓缩物，并纯化浓缩物以证明光活性荧光团。在一些实施方案中，笼化的Janelia-Fluor染料包括Si-罗丹明。
在一些实施方案中，本发明的主题涉及包含光活性荧光团和蛋白标签的光活性配体。在一些实施方案中，光活性荧光团包括含氮杂环丁烷的Janelia-Fluor染料的可光活化衍生物。合适的蛋白标签包括但不限于HaloTag配体、SNAP-tag配体、任何其他合适的蛋白标签或它们的组合。在一些实施方案中，光活性配体与同源蛋白的缀合增加光解后光活性配体的光吸收。在一些实施方案中，光活性荧光团的亮度基本上类似于衍生光活性荧光团的亲本荧光团的亮度。
在一些实施方案中，本发明的主题涉及光活性复合体，其包含与蛋白缀合的光活性配体。在一些实施方案中，光活性配体在体内与蛋白缀合。在一些实施方案中，光活性配体包含光活性荧光团和蛋白标签。在一些实施方案中，光活性荧光团被布置和设置为在光诱导时脱羧。在一些实施方案中，光活性荧光团被布置和设置以在脱羧时形成甲基-Janelia-Fluor化合物。在一些实施方案中，光活性荧光团被布置和设置以在脱羧时提供增加的荧光。
附图说明
在所附权利要求中具体阐述了本发明的新的特征。通过参考以下阐述使用本发明原理的说明性实施方案的详细描述以及附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，其中：
图1A-I示出说明可光活化的Janelia Fluor 549(PA-JF549)的合成、表征和效用的图表和图像。(A)PA-JF549的合成和光化学过程。用草酰氯和TMS重氮甲烷处理JF549(1)得到PA-JF549(2)。光活化(365nm)仅产生痕量的预期的苯乙酸衍生物(3)，其中甲基取代的JF549(4)为主要产物(50％)，而inadone 5为次要产物(10％)。(B)1、3和4的归一化吸收(abs)和荧光发射(fl)。(C)PA-JF549-HaloTag配体(6)和PA-JF549-SNAP-tag配体(7)的化学结构。(D)用PA-JF549配体6标记的HaloTag-Sox2的累积单粒子轨迹的图像，比例尺：5μm。(E)在相同成像条件下使用6-HaloTag融合(品红色，中值＝120.7光子)或mEos3.2融合(黑色，中值＝70.9光子)进行Sox2的sptPALM时检测到的光子/粒子/帧的直方图。(F)在相同成像条件下使用6-HaloTag融合(品红色，平均值＝0.20s)或mEos3.2融合(黑色，平均值＝0.07s)进行Sox2的sptPALM时的轨迹长度的直方图。(G)表达TOMM20-HaloTag并用PA-JF549配体6标记的U2OS细胞的PALM图像；根据它们在半最大值处的全宽定位显示268,561个检测到的分子；比例尺：2μm。(H)在相同成像条件下使用6-HaloTag融合(品红色，中值＝636.6光子)或mEos3.2融合(黑色，中值＝266.8光子)进行TOMM20的PALM时检测到的光子/定位/帧的直方图。(I)在相同成像条件下使用6-HaloTag融合(品红色，中值＝13.5nm)或mEos3.2融合(黑色，中值＝20.2nm)进行TOMM20的PALM时计算的定位精度的直方图。
图2A-H示出使用可光活化的Janelia Fluor 646(PA-JF646)的多色成像的图表和图像。(A)PA-JF646-HaloTag配体(16)和PA-JF646-SNAP-tag配体(17)的结构。(B)表达TOMM20-HaloTag并用10nM JF549-HaloTag配体8和10nM PA-JF646-HaloTag配体16标记的U2OS细胞的图像。来自JF549-HaloTag配体8的宽场荧光显微镜图像的空间分布类似细胞中典型的线粒体分布(比例尺：5μm)。将用PA-JF646标记的单个TOMM20融合体的轨迹(n＝154)绘制在平均宽场TOMM20-JF549信号上(插图；比例尺：1μm)。大多数单分子轨迹(>95％)与JF549-HaloTag信号共定位，表明PA-JF646的特异性标记。(C-G)在表达用17标记的组蛋白H2B-SNAP-tag配体和用PA-JF549-HaloTag配体(6)标记的HaloTag-Sox2的活ES细胞的同时进行双色sptPALM实验。(C)用17标记的组蛋白H2B-SNAP-tag的PALM图像；比例尺：5μm。(D)HaloTag-Sox2的单粒子轨迹，其与组蛋白H2B-SNAP-tag(6272轨迹，品红色)共定位或与组蛋白H2B-SNAP-tag(7081轨迹，绿色)非共定位。(E)Sox2的共定位分数的表观扩散系数图。(F)Sox2的非共定位分数的表观扩散系数图。(G)对共定位和非共定位Sox2轨迹中的每个步骤计算出的表观扩散系数的直方图。(H)Htt84Q-mEos3.2-NLS簇的PALM图像与用16标记的组蛋白H2B-HaloTag的PALM图像的叠加图。同时记录PALM图像并且每个图像由10000个连续帧组成。根据它们在半最大值处的全宽定位显示128740个检测到的mEos3.2分子(绿色)和739964个PA-JF646分子(品红色)。每帧每mEos3.2分子检测到的光子的中值数为115.6，每帧每个PA-JF646分子检测到的光子的中值数为757.6。mEos3.2的中值计算定位误差为34.5nm，PA-JF646的中值计算定位误差为21.3nm。比例尺：5μm。
图3A-V示出说明可光活化的Janelia Fluor 549(PA-JF549)的性质和性能的图表和图像。(A)PA-JF549-HaloTag配体(6)在光活化之前(-hv，黑线)和光活化之后(365nm；+hv，品红色线)与HaloTag蛋白结合的吸光度光谱。(B)JF549-HaloTag配体(8)和TMR HaloTag配体(9)的结构。(C)用HaloTag蛋白(黑色)孵育的8(5μm)的绝对吸光度光谱与用(品红色)或不用(品红色)HaloTag蛋白孵育的、然后用365nm光彻底光活化的6(5μm)的吸光度光谱的比较。(D)在光活化之前(-hv，黑线)和光活化之后(365nm；+hv，品红色系)与HaloTag蛋白结合的PA JF549-SNAP-tag配体(7)的吸光度光谱。(E)JF549-SNAP-tag配体(10)的结构。(F)用SNAP-tag蛋白孵育的10(5μm)的绝对吸光度光谱与用(品红色)或不用(品红色的虚线)SNAP-tag蛋白孵育的、然后用365nm光彻底光活化的7(5μm)的吸光度光谱的比较。(G)在相同成像条件下(n＝5，阴影显示±s.e.m.)用指数拟合覆盖的活U2OS细胞中用PA-JF549-HaloTag配体(6)或组蛋白H2B-mEos3.2标记的组蛋白H2B-HaloTag的活化率(黑色)。(H)比较在没有405nm活化光的情况下固定的U2OS细胞中用PA-JF549-HaloTag配体(6；品红色)或TOMM20-mEos3.2(黑色)标记的TOMM20-HaloTag的自我活化的图表；实线显示线性拟合。(I)使用在固定的U2OS细胞中用PA-JF549-HaloTag配体(6)或TOMM20-mEos3.2标记的TOMM20-HaloTag检测的光子/定位的直方图。(J)卡通显示spt-dSTORM实验(上图)和sptPALM实验(下图)的实验工作流程。将表达HaloTag-Sox2的ES细胞用PA-JF549-HaloTag配体6或TMR-HaloTag配体8标记至饱和，并在多聚焦显微镜上成像，这允许在～4μm的轴向深度上同时成像9个焦平面。(K)表达用PA-JF549配体6(sptPALM模式，品红色)或商业TMR-HaloTag配体(9；spt-dSTORM模式，黑色)标记的HaloTag-Sox2的ES细胞中每帧测量的单分子轨迹数的图；每个配体n＝5个细胞；s.d.以灰色显示。(L-M)对于帧2000-2500成像的累积单粒子轨迹的图像(在K中的虚线之间；仅在>5个连续帧显示中观察到的轨迹)；左下：测量的轨迹数量；右下：比例尺：2μm。(L)用PA-JF549配体6标记的细胞(1544个轨迹)。(M)用标准TMR配体9标记的细胞(191个轨迹)。(N-O)来自表达HaloTag-Sox2并用6或9标记的ES细胞中的3D跟踪实验(显示在J-M中)的统计数据。(N)使用标记6(品红色)或9(黑色)的检测的光子/粒子/帧的直方图。(O)使用标记6(品红色)或9(黑色)的粒子定位/帧的直方图。(P)表达TOMM20-mEos3.2融合体的固定U2OS细胞的PALM图像。比例尺：2μm。根据它们在半最大值处的全宽定位显示195422个检测到的分子。中值计算的定位误差为20.2nm。(Q)表达网格蛋白-HaloTag融合体并用配体6标记的固定U2OS细胞的PALM图像的放大图。全芯片图像由1048575个经漂移校正的定位组成，中值定位误差为10.8nm。数据显示了网格蛋白的预期环结构；每个小格为1μm2。(R)表达ensconsin-HaloTag融合体并用配体6标记的U2OS细胞的PALM图像。该图像由445242个定位组成，中值计算的定位误差为28.7nm。比例尺：5μm。(S)表达Sec61β-HaloTag融合体并用配体6标记的U2OS细胞的PALM图像。该图像由29,356个定位组成，中值计算的定位误差为20.9nm。比例尺：5μm。(T-V)在R中显示的ensconsin-HaloTag的PALM期间的PA-JF549的闪烁行为分析。(T)单个闪烁事件(品红色)的持续时间的直方图，覆盖与指数分布(黑色)的拟合。(U)闪烁事件(品红色)之间的间隔持续时间的直方图，覆盖与指数分布(黑色)的拟合。(V)每分子(品红色)的闪烁事件数的直方图，覆盖与几何分布(黑色)的拟合。
图4A-N示出说明可光活化的Janelia Fluor 646(PA-JF646)的合成、性质和性能的图表和图像。(A)PA-JF646的合成和光化学过程。用草酰氯和TMS重氮甲烷处理JF646(11)得到PA-JF646(12)。光活化(365nm)仅产生痕量的苯乙酸衍生物(13；<1％)和甲基取代的JF549(14；4％)；主要产物为indanone 15(24％；分离产率)。(B)JF646-HaloTag配体18和JF646-SNAP-tag配体19的结构。(C)在光活化之前(-hv，黑线)和光活化之后(365nm；+hv，品红色线)与HaloTag蛋白结合的PA JF646-HaloTag配体(16)的绝对吸收光谱。(D)用HaloTag蛋白(黑色)孵育的18(5μm)的绝对吸光度光谱与用(品红色)或不用(品红色)HaloTag蛋白孵育的、然后用365nm光彻底光活化的16(5μm)的吸光度光谱的比较。(E)用SNAP-tag蛋白(黑色)孵育的19(5μm)的绝对吸光度光谱与用(品红色)或不用(品红色)SNAP-tag蛋白孵育的、然后用365nm光彻底光活化的17(5μm)的吸光度光谱的比较。(F)在活U2OS细胞中用PA-JF646-HaloTag配体(6)标记的组蛋白H2B-HaloTag的活化率(与图3G相同的光活化条件和等效激发功率；n＝5，阴影显示±s.e.m.)用指数拟合覆盖(黑色)。(G)比较在没有405nm活化光的情况下在固定的U2OS细胞中用PA-JF646-HaloTag配体(16；品红色)或TOMM20-mEos3.2(黑色)标记的TOMM20-HaloTag的自发活化的图表；实线显示线性拟合。(H-I)HaloTag配体6和16的背景染色的评价。固定不表达融合蛋白(左图)的COS7细胞或表达组蛋白H2B-HaloTag融合体(右图)的COS7细胞，用HaloTag配体(100nM；30分钟)和Hoechst 33342(5μg/mL)染色，光活化(405nm)，然后使用相同的设置成像。比例尺：50μm。(H)PA-JF549-HaloTag配体6。(I)PA-JF646-HaloTag配体16。(J-K)表达用PA-JF646-SNAP-tag配体(17)标记的组蛋白H2B-SNAP-tag和用PA-JF549-HaloTag配体(6)标记的HaloTag-Sox2的两个活ES细胞。上图显示定位显微图像(PALM)，中心图像显示累积单粒子轨迹，下图显示表观扩散系数图。比例尺：5μm。(J)来自用17标记的组蛋白H2B-SNAP标签的图像。(K)来自用6标记的HaloTag-Sox2的图像。(L)表达波形蛋白-HaloTag融合并用配体16标记的U2OS细胞的PALM图像。图像由151,808个定位组成，中值计算的定位误差为20.4nm。比例尺：5μm。(M)表达TOMM20-HaloTag融合体并用配体16标记的U2OS细胞的PALM图像。PALM图像由203,015个检测到的分子组成。中值计算的定位误差为13.8nm。比例尺：2μm。(N)使用16-HaloTag融合体(品红色，中值＝13.8nm)或mEos3.2融合体(黑色，中值＝20.2nm)进行TOMM20的PALM时的计算的定位精度的直方图。
图5示出PA-JF549衍生物的合成示意图。
图6示出PA-JF646衍生物的合成示意图。
图7示出JF646-SNAP-tag配体的合成示意图。
图8示出PA-JF549光产物的合成示意图。
图9示出PA-JF646光产物的合成示意图。
图10A-B示出PA-JF549和PA-JF646的化学结构和吸收光谱。(A)PA-JF549(2)和光产物3-5的化学结构和绝对吸收光谱。(B)PA-JF646(12)和光产物13-15的化学结构和绝对吸光度。所有光谱均在10mM HEPES中，pH7.3，在5μm下进行。
图11A-D示出各种化合物的光转化、吸光度和HPLC峰面积。(A)光解(365nm)后PA-JF549(2)向甲基-JF549(4)的光转化。(B)2在551nm处的吸光度(A551)与照射时间(365nm)的图表。(C)光解(365nm)后JF549-苯乙酸(3)向甲基-JF549(4)的光转化。(D)4的HPLC峰面积(λ＝555nm)与3的照射时间(365nm)的图表。
具体实施方式
在本文中阐述了本发明主题的一个或多个实施方案的细节。在研究了本文中提供的信息之后，对本文中描述的实施方案和其他实施方案的修改对于本领域普通技术人员来说是显而易见的。本文中提供的信息，特别是所描述的示例性实施方案的具体细节，主要是为了清楚理解，不应从中理解为不必要的限制。在存在冲突的情况下，将以本文的说明书(包括定义)为准。
虽然本文使用的术语被认为是本领域普通技术人员很好理解的，但是阐述了某些定义以便于解释本发明主题。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
除非另有说明，否则本文整个公开内容中提及的所有专利、专利申请、公开的申请和出版物、GenBank序列、数据库、网站和其他公开材料均通过引用整体并入。
在参考URL或其他这样的标识符或地址的情况下，可理解这样的标识符可以改变，因特网上的特定信息可以自由选取，但是可以通过搜索因特网找到等同的信息。参考资料证明了这些信息的可用性和公开传播。
如本文所用，除非另有说明，否则任何保护基团、氨基酸和其他化合物的缩写符合它们的通用用法、公认的缩写或IUPAC-IUB生物化学命名委员会(参见Biochem.(1972)11(9):1726-1732)。
尽管与本文描述的那些类似或等同的任何方法、装置和材料可用于实践或测试本发明主题，但本文描述了代表性方法、装置和材料。
本申请可以“包括”(开放式)本发明的组分以及本文所述的其他成分或元素或“基本上由”本发明的组分以及本文所述的其他成分或元素“组成”。如本文所用，“包括”是开放式的并且表示所述元素或它们在结构或功能上的等同物，以及未列举的任何其他元素。除非上下文另有说明，否则术语“具有”和“包括”也应被解释为开放式的。
根据长期存在的专利法惯例，当在本申请(包括权利要求)中使用时，术语“一种”、“一个”和“该/所述”指的是“一个或多个”。因此，例如，提及“一个细胞”包括多个这样的细胞等。
除非另有说明，否则在说明书和权利要求中使用的表示成分、性质诸如反应条件等的量的所有数字应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，除非有相反的指示，否则本说明书和权利要求中列出的数值参数是近似值，其可以根据目前公开的主题寻求获得的所需性质而变化。
如本文所用，当提及质量、重量、时间、体积、浓度或百分比的值或量时，术语“约”意指包括从指定量在一些实施方案中±20％、在一些实施方案中±10％、在一些实施方案中±5％、在一些实施方案中±1％、在一些实施方案中±0.5％、在一些实施方案中±0.1％的变体，因为这样的变化适合于实施所公开的方法。
如本文所用，范围可表示为从“约”一个特定值，和/或至“约”另一个特定值。还应理解，本文公开了许多值，并且除了值本身之外，每个值在本文中也被公开为“约”该特定值。例如，如果公开了值“10”，则还公开了“约10”。还应理解，还公开了两个特定单元之间的每个单元。例如，如果公开了10和15，则还公开了11、12、13和14。
如本文所用，“任选的”或“任选地”是指随后描述的事件或情况发生或不发生，并且该描述包括所述事件或情况发生的实例和不发生的实例。例如，任选地变体部分意指该部分是变体或非变体。
本发明主题包括光活性荧光团和体内标记方法。更具体地，本发明主题涉及小分子光活性荧光团，用小分子光活性荧光团在体内标记的方法，以及荧光化合物的体内光活化方法。
在一些实施方案中，光活性荧光团包括一种或多种荧光团的可光活化衍生物。可光活化衍生物由任何合适的荧光团形成，例如但不限于含有一个或多个环胺取代基的荧光团。例如，在一个实施方案中，光活性荧光团包括含氮杂环丁烷的“Janelia-Fluor”(JF)染料的可光活化衍生物。在另一个实施方案中，这些JF染料包括代替现有荧光团中普遍存在的二甲氨基的四元氮杂环丁烷环，形成具有增加的亮度和光稳定性的、小的可透过细胞的荧光团。
如下所示，在一些实施方案中，光活性荧光团包括可光活化的Janelia-Fluor 549(PA-JF549)、可光活化的Janelia-Fluor 646(PA-JF646)、或任何其它合适的可光活化的Janelia Fluor。这些可光活化衍生物一旦活化就保持JF染料的亮度和光稳定性，与现有的荧光蛋白相比，提供增加的亮度。此外，这些化合物易于光活化提供了改进的单粒子追踪和容易实现的定位显微镜检查实验。此外，PA-JF化合物的细胞渗透性促进体内成像。
在一些实施方案中，形成光活性荧光团的方法包括笼化策略，包括用草酰氯和重氮甲烷处理JF染料。例如，在一个实施方案中，形成光活性荧光团的方法包括将草酰氯加入到JF染料的溶液中，并将反应物在室温下搅拌。接着，依次加入三乙胺和(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷，将反应物在室温下搅拌，浓缩，然后纯化。浓缩和纯化包括任何合适的浓缩和纯化方法，例如但不限于真空浓缩、硅胶快速色谱或其组合。
与预期的苯乙酸衍生物相反，本文所述的光活性荧光团的光化学过程意外地提供甲基-JF作为主要光产物(50％)。不受理论的束缚，据信甲基-JF是通过初始光化学产物(即预期的苯乙酸衍生物)的光诱导脱羧产生的。在一些实施方案中，由PA-JF化合物产生的甲基-JF保持亲本JF染料的亮度。在一些实施方案中，亮度基本上类似于亲本的亮度。在一些实施方案中，保持至少约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的亮度。
在一些实施方案中，PA-JF化合物与蛋白标签(例如HaloTag、SNAP tag或任何其他合适的蛋白标签)连接，以形成PA-JF-蛋白标签配体。例如，如下所示，PA-JF-蛋白标签配体可包括但不限于如下所示的PA-JF549-HaloTag配体、PA-JF549-SNAP-tag配体、PA-JF646-HaloTag配体、和/或PA-JF646-SNAP-tag配体。
PA-JF549-HaloTag配体
PA-JF549-SNAP-tag配体
PA-JF646-HaloTag配体
PA-JF646-SNAP-tag配体
在一些实施方案中，形成PA-JF-蛋白标签配体的方法包括形成所需的JF的6-甲氧基羰基-JF化合物，将6-甲氧基羰基-JF化合物转化为可光活化的6-甲氧基羰基-JF化合物(6-甲氧基羰基-PA-JF)，将6-甲氧基羰基-PA-JF化合物转化为PA-JF-N-羟基琥珀酰亚胺化合物(PA-JF-NHS)，然后将PA-JF-NHS化合物转化为PA-JF-蛋白标签配体。
在一个实施方案中，形成6-甲氧基羰基-JF化合物包括向小瓶中加入起始化合物Pd2dba3、XPhos和Cs2CO3，密封小瓶，并用氮气排气/回填小瓶。接下来，将二噁烷加入到小瓶中，并用氮气冲洗反应。然后将氮杂环丁烷加入到小瓶中，并在升高的温度下搅拌反应，例如但不限于100℃。在升高的温度下搅拌反应后，将组合物冷却至室温，用MeOH稀释，沉积在助滤剂(例如硅藻土(Celite))上，浓缩至干，然后纯化，以得到6-甲氧基羰基-JF化合物。如本领域技术人员所理解的，起始化合物将根据形成的PA-JF-蛋白标签配体而变化。例如，PA-JF549-蛋白标签配体的起始化合物可包括3',6'-二溴-6-甲氧基羰基荧烷，而PA-JF646-蛋白标签配体的起始化合物可包括6-甲氧基羰基硅基荧光素双(三氟甲磺酸酯)。
在形成6-甲氧基羰基-JF化合物之后，将6-甲氧基羰基-JF化合物转化为6-甲氧基羰基-PA-JF化合物包括上面详细描述的笼化方法。接下来，将6-甲氧基羰基-PA-JF化合物转化为PA-JF-NHS化合物包括在氮气下将NaOH加入到在2:1的MeOH/THF中的6-甲氧基羰基-PA-JF化合物的溶液中，并将反应物在室温下搅拌。然后将反应酸化，稀释并萃取，例如分别用HCl、水和CH2Cl2萃取。萃取后，将有机萃取液干燥，过滤并浓缩，得到羧酸。然后将羧酸与在DMF中的TSTU混合，加入DIEA，并将反应物在室温下搅拌。搅拌后，将反应混合物浓缩至干，沉积在助滤剂上，并纯化，以得到PA-JF-NHS化合物。
然后通过任何合适的方法将PA-JF-NHS转化为所需的PA-JF-蛋白标签配体。例如，将PA-JF-NHS化合物转化为PA-JF-HaloTag配体包括将PA-JF-NHS化合物溶解在DMF中，加入HaloTag(O2)胺的DMF溶液，随后加入DIEA，然后将反应物在室温下搅拌。搅拌后，将反应混合物浓缩至干燥并纯化，得到PA-JF-HaloTag配体。在另一个实例中，将PA-JF-NHS化合物转化为PA-JF-SNAP-tag配体包括将PA-JF-NHS化合物与BG-NH2和DMF合并，随后加入DIEA，然后将反应物在室温下搅拌。搅拌后，将反应浓缩至干燥并纯化，得到PA-JF-SNAP-tag配体。尽管在下面的实施例中更详细地描述了这些方法，但是如本领域技术人员将理解的，本文考虑了对浓度和/或反应条件的修改，并且本发明旨在涵盖这些修改。
在一些实施方案中，与不存在同源蛋白的PA-JF-蛋白配体相比，PA-JF-蛋白标签配体与同源蛋白的缀合在光解后提供了光吸收的显著增加。例如，与不存在同源蛋白的化合物相比，当与同源HaloTag蛋白缀合时，PA-JF549-HaloTag配体对所需荧光产物的光化学效率至少提高了两倍，而当与同源HaloTag蛋白缀合时，PA-JF646-HaloTag配体表现出在产生远红色吸收产物方面有至少五倍的增加。因此，在一些实施方案中，PA-JF-蛋白配体与同源蛋白的缀合影响反应朝向所需荧光形式的光化学结果。另外或可替代地，在一些实施方案中，PA-JF-蛋白配体促进单分子追踪、超分辨率成像和/或体内成像。
由于PA-JF-蛋白标签配体由可透过细胞的JF染料形成，在一些实施方案中，PA-JF-蛋白标签配体促进体内成像。例如，PA-JF-蛋白标签配体在递送至个体后可进入一个或多个细胞，在其上配体与所需蛋白结合。随后对与所需蛋白缀合的PA-JF-蛋白标签配体的光诱导提供增加的荧光，这有利于体内成像。在一些实施方案中，可以使用多于一种PA-JF-蛋白标签配体来提供多种颜色和/或分子成像。例如，第一PA-JF-蛋白标签配体可包括显示第一颜色的第一PA-JF和与第一蛋白结合的第一蛋白标签，第二PA-JF-蛋白标签配体可包括显示第二颜色的第二PA-JF和与第二蛋白结合的第二蛋白标签。在光活化后，第一PA-JF-蛋白标签配体和第二PA-JF-蛋白标签配体将显示第一颜色和第二颜色，第一颜色和第二颜色分别对应于第一蛋白和第二蛋白的位置。
实施例
实施例1
如本发明人最近所述，含氮杂环丁烷的“Janelia Fluor”(JF)染料的形成提供了改善小的、细胞可渗透的荧光团的亮度和光稳定性的一般方法。在该实施例中，通过合成与已建立的活细胞标记策略相容的可光活化衍生物来改善和扩展JF染料的效用。
更具体地，本实施例描述了JF549和JF646的可光活化(PA)版本，证明了它们与现有活细胞标记策略的相容性，并证明了它们在单分子追踪和超分辨率成像中的实用性。JF549和JF646是完全N-烷基化的罗丹明染料，并且不能如同其他罗丹明染料一样使用具有标准光不稳定基团的N-酰化来笼化。因此，为了形成JF549和JF646的可光活化形式，使用涉及用草酰氯和重氮甲烷处理JF染料的笼化策略。
如图1A所示，为了测试该笼化策略与氮杂环丁烷Janelia Fluor染料的相容性，首先从JF549(1)以高产率制备可光活化的JF549(PA-JF549)(2)。然后在水中评价化合物2的光化学反应；以前的报道只描述了重氮酮笼化的染料在甲醇中的光解作用。令人惊讶的是，化合物1在水溶液中彻底光解的主要产物不是预期的苯乙酸染料(3)，而是甲基取代的JF549(4)以及推定的非荧光“深色产物”(5)。以类似于光可切换荧光蛋白(ΦPC≈1％)的2.2％的表观光化学量子产率(ΦPC)值产生化合物4。不受理论的束缚，据信这种出乎意料的产物是初始光化学产物3的有效(ΦPC＝15％)光诱导的脱羧的结果。
然而，如图1B所示，两个光产物3和4是具有与化合物1(亲本JF549)相似光谱特性的高荧光分子。也就是说，这些化合物保留了JF染料的优异亮度。如前所报道，荧光团1表现出549nm的最大吸收(λmax)，1.01×105M–1cm–1的消光系数(ε)，571nm的最大发射值(λem)，0.88的荧光量子产率(ΦF)。荧光团3显示λmax/λem＝553nm/573nm并保持95％的1的亮度(ε＝9.89×104M–1cm–1；ΦF＝0.85)，而染料4具有λmax/λem＝551nm/570nm并保持75％的1的亮度(ε＝8.59×104M–1cm–1；ΦF＝0.78)。此外，这些化合物易于光活化提供了改进的单粒子追踪和定位显微技术实验。
在测量所得光活化荧光团的亮度后，合成PA-JF549(6)的HaloTag配体(图1C)。在体外、活细胞或固定细胞中用6标记HaloTag蛋白，得到具有低背景吸收和荧光的缀合物，其可通过单光子或双光子照射活化(图3A)。发现与游离PA-JF549配体(图3B-C)相比，将6连接到HaloTag改善了所需荧光产物的产率，不受理论的束缚，据信其是通过限制构象灵活性和防止平面深色产物5的形成(图1A)。参见图3D-F，对于PA-JF549-SNAP-tag配体(7)也观察到在与蛋白缀合时所需光化学结果的这种增强，其合成示于(图1C)中。虽然有利，但缀合时光化学过程的这种改善不足以消除对洗掉游离配体的需要。
将PA-JF549-HaloTag配体(6)的性能直接与遗传编码的mEos3.2进行比较。如图3G所示，PA-JF549的活化率(η＝94.5s)与mEos3.2(η＝107s)相似。此外，如图3H和表1所示，开关活化率(on-off activation ratio)也相似(～10-5)。然而，与mEos3.2相比，PA-JF549的检测到的光子/定位的中值数量(图3I)更高(JF549＝870.9，mEos3.2＝533.7)。
然后在表达HaloTag-Sox2或mEos3.2-Sox2融合体的活小鼠胚胎干(ES)细胞中的单粒子追踪光活化定位显微技术(sptPALM)试验中比较染料(图1D)。如图1E-F所示，与mEos3.2荧光团相比，PA-JF549在性能上显示出相当大的改善，具有比mEos3.2(中值检测的光子/粒子/帧＝70.9；平均轨迹长度＝0.07秒)更高的检测到的光子/粒子/帧(中值＝120.7)和更长的轨迹(平均值＝0.20s)。还使用多聚焦显微镜(MFM)装置将PA-JF549-HaloTag配体(6)的性能与市售的四甲基罗丹明(TMR)HaloTag配体(9)进行比较，其中在3D跟踪中观察到PA-JF549配体的优异性能(图3J-O)。
接下来，测试了PA-JF549-HaloTag配体作为固定细胞中PALM标记的效用。将与mEos3.2(图3P)或HaloTag蛋白融合并用配体6(图1G)标记的线粒体蛋白TOMM20成像。如所预期的(图3I)，与mEos3.2(中值检测的光子/定位/帧＝266.8；中值ζ＝20.2nm)相比，PA-JF549-HaloTag缀合物每帧每个定位事件给出更高的光子计数(中值＝636.6)(图1H)和计算的定位精度(中值ζ＝13.5nm)(图1I)。还证实染料可以在不同细胞区域中与其他HaloTag融合体一起作为PALM标记起作用(图3Q-S)。总的来说，PA-JF549标记给出了相对高的光子计数和计算的定位精度，并且仅显示适度的闪烁(图3T-V)。然而，使用遗传编码的自身标记标签并未解决标记密度问题，标记密度是定位显微技术中图像质量的关键决定因素。
然后进行双色单粒子追踪PALM，该实验由于两种光谱上不同的可光活化荧光团的稀缺性而受阻。据推断，在不同的Janelia Fluor染料上使用相同的重氮酮笼化策略可以允许具有相似效率的两种标签的稀疏光活化，从而促进双色实验。因此，如图4A所示，首先将JF646(11)转化为可光活化的Janelia Fluor 646(PA-JF646)(12)，以测试该笼化策略是否与Si-罗丹明支架相容。有趣的是，游离PA-JF646 12的光解仅产生少量(<5％)预期的荧光团13和14，主要产物为非荧光15(图4A)。然而，基于对PA-JF549化合物光化学过程观察到的“蛋白上”的改善(图3A-F)，预测PA-JF646在缀合时将显示出作为可光活化荧光团的更好的性能。因此，合成PA-JF646(16)的HaloTag配体和PA-JF646(17)的SNAP-tag配体(如图2A所示)。这些化合物在与其同源蛋白结合后显示出光化学结果的显著改善(图4B-E)和活细胞中的高活化率(η＝83.5)(图4F)。由于在红色激发光下自发激活的速率较低，所以导通-解离率显著较高(～10-6)(图4G，表1)。用允许在活细胞中sptPALM的PA-JF646-HaloTag配体16(图4H-1)还观察到PA-JF549配体6显示的低背景染色(图2B)。
为了进一步验证用于双色sptPALM的PA-JF646对，将转录因子Sox2表达为与HaloTag蛋白的融合体并用PA JF549-HaloTag配体6标记。组蛋白H2B与SNAP-共表达为融合体，该群体用PA-JF646-SNAP-tag配体(17)标记。这些可光活化的染料允许通过用405nm光的光活化同时跟踪H2B和Sox2。使用标准PALM分析产生组蛋白H2B位置的图谱(图2C)，并用于界定与染色质PALM图谱中的高密度区域共定位或不共定位的Sox2轨迹(图2D)。如图2E-G和4J-K所示，与组蛋白H2B共定位的Sox2分子表现出比非共定位部分更慢的扩散系数。
最后，研究PA-JF646标记用于多色定位显微技术。尽管一些自身标记标签配体已经用于PALM成像，但先前报道的分子表现出相对短的发射最大值，因此与诸如光可转换荧光蛋白的其他定位显微标记不相容。基于本发明人之前使用具有相似波长的另一笼化的Si罗丹明的研究，推断PA-JF646将被红移至足以用于具有mEos3.2的双色PALM。如图4L-M所示，首次显示PA-JF646-HaloTag配体16可用于表达HaloTag-波形蛋白或HaloTag-TOMM20融合体的细胞中的单色PALM。使用PA-JF646配体16在TOMM20图像中计算的定位精度类似于PA-JF549(中值ζ＝13.8nm)(图1I和4N)。对于双色实验，突变体亨廷顿蛋白(Huntingtin)Htt-94Q表达为与mEos3.2的融合蛋白，作为与HaloTag的融合体的组蛋白H2B，用PAJF646-HaloTag配体16标记。标记后，固定，并双色PALM(图2H)，观察到组蛋白H2B(品红色)和Htt-94Q聚集体(绿色)很少重叠(即几个白点)，这支持了由扩展的聚谷氨酰胺结构域形成的聚集体取代细胞核中的染色质结构的假设。
总之，上述方法提供了明亮的光稳定的Janelia Fluor染料的可光活化形式。这些荧光团保留了荧光JF染料显示的活细胞中优异的光子产率和效用，但具有光活化的附加益处，有利于复杂的单粒子追踪PALM实验。这些染料也构成了固定细胞的PALM标记扩展调色板的有用补充。特别是，PA-JF646是第一个使用HaloTag或SNAP标签系统的、与活细胞标记兼容的远红光可激活荧光团，允许多色单粒子追踪实验和超分辨率显微镜。
不受理论的束缚，据信这些小而明亮的可光活化标记与许多不同的标记策略相容，因此扩展了活细胞和固定细胞中单分子成像的边界。除了定位显微技术外，这些多功能的膜透过性标记应该在任何实时成像实验中为光可转换荧光蛋白提供有利的替代方案，其中光活化用于突出特定细胞或细胞区域。
方法
化学合成和光化学过程。所有新化合物的实验细节和表征以及随后的光谱学和光化学实验可以在实施例2中找到。
UV-Vis和荧光光谱。使用1cm路径长度的石英比色皿进行光谱分析。所有测量均在环境温度(22±2℃)下进行。在Cary Model 100光谱仪(Agilent)上记录吸收光谱。在CaryEclipse荧光计(Varian)上记录荧光光谱。使用Quantaurus-QY光谱仪(型号C11374，Hamamatsu)测量所有荧光团的绝对荧光量子产率(ΦF)。
一般显微镜法。所有成像实验的仪器参数的综合列表可以在表2中找到。附加信息在下面给出。
细胞培养。在不存在饲细胞的情况下，将小鼠D3ES细胞(ATCC)维持在0.1％w/v明胶包被的平板上。通过用15％v/v胎牛血清(FBS)、1mM谷氨酸、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、0.1mM 2巯基乙醇和1000单位的白血病抑制因子(LIF；Millipore)补充knockout杜氏改良eagle培养基(DMEM，Invitrogen)来制备ES细胞培养基。将U2OS(ATCC)和COS-7(ATCC)细胞在含有10％v/v胎牛血清(FBS)的DMEM(Corning)中培养，该胎牛血清补充有2mM L-谷氨酰胺或2mM GlutaMAX。通过Janelia细胞培养设施定期检测细胞的支原体污染。
质粒构建。从ES细胞cDNA文库扩增Sox2和组蛋白H2B cDNA。从Addgene(质粒#23966)获得Htt-94Q cDNA。将全长cDNA克隆到Piggybac转座子载体(PB533A-2，SystemBiosciences)或用PuroR修饰的Piggybac转座子载体中。将HaloTag(Promega)或mEos3.2(Addgene：质粒#54525)的序列与所需蛋白的cDNA在N-末端(HaloTag-Sox2)或C-末端(组蛋白H2B-HaloTag、组蛋白H2B-SNAP-tag和Htt-94Q-mEos3.2-NLS)框内连接。编码ensconsin-HaloTag、网格蛋白-HaloTag、TOMM20-HaloTag、Sec61β-HaloTag和波形蛋白-HaloTag的质粒通过用序列取代HaloTag构建mEmerald序列来构建。使用Nucleofactor试剂盒(Lonza)将每种质粒瞬时转染到U2OS细胞中。
稳定的细胞系生成。通过Piggybac转座子载体与过量表达Piggybac转座酶(SuperPiggybac Transposase，System Biosciences)的辅助质粒的共转染产生稳定的细胞系。在转染后48小时，对细胞进行新霉素或嘌呤霉素(Invitrogen)选择。通过使用Nucleofector系统(Lonza)进行转染。
ES细胞标记策略和成像准备。在成像前一天，将ES细胞接种到预涂有IMatrix-511(Clontech)的盖玻片上。在ES细胞成像培养基中进行成像，ES细胞成像培养基通过用10％v/v FBS、1mM glutamax、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠、10mM HEPES(pH 7.2-7.5)、0.1mM 2巯基乙醇和1000单位LIF(Millipore)补充FluoroBrite培养基(Invitrogen)来制备。对于PA-JF549或PA-JF646标记，将细胞与PA-JF549-HaloTag配体(6)或PA-JF646-HaloTag配体(16)以100nM的终浓度孵育1小时。对于双色sptPALM活细胞追踪实验，在成像前用ES细胞成像培养基(3×)洗涤标记的细胞。对于双色固定细胞PALM成像实验，用PBS(4×)洗涤标记的细胞，在4％w/v多聚甲醛中固定10分钟并用PBS(3×)洗涤。最终的PALM成像在PBS溶液中进行。
3D spt-dSTORM和spt-PALM跟踪实验。用PA-JF549-HaloTag配体(6)或TMR-HaloTag配体(9)标记的荧光标记的HaloTag-Sox2分子，使用定制的多聚焦显微镜在3D活ES细胞中进行跟踪。15九个焦平面的荧光使用iXon Ultra EMCCD相机(DU-897U-CS0-#BV，17MHz EM放大器，前置放大器设置1，增益300)在30ms的帧时间同时记录。
单色PALM标记和固定。细胞在预先清洁的25mm直径盖玻片或嵌入含有金纳米棒作为基准标记物(Gleb Shtengel,Janelia慷慨馈赠)的预先清洁的25mm直径盖玻片上生长。在固定之前，将细胞用10nM的HaloTag配体在37℃、5％CO2下标记30分钟。然后用含有10％FBS的预热DMEM缓冲液洗涤细胞三次。在固定之前，将盖玻片用预热的不含氯化镁或氯化钙的PBS溶液洗涤两次。将1mL的8％甲醛的PBS溶液缓慢加入到含有1mL PBS的培养皿中，并将得到的4％甲醛溶液在室温下孵育10分钟。盖玻片用PBS洗涤两次，并在0.1％v/v TritonX-100的PBS溶液中孵育4分钟。将盖玻片在PBS中洗涤两次，然后在环境温度下在PBS中的1％w/v BSA中孵育1小时。用PBS洗涤两次后，将盖玻片安装到金属细胞室中用于PALM成像。
双色sptPALM活细胞追踪实验。使用定制的3照相显微镜同时跟踪表达用PA-JF549-HaloTag配体(6)标记的HaloTag-Sox2融合体和用PA-JF646-SNAP-Tag配体(17)标记的SNAP-Tag-组蛋白H2B融合体的ES细胞。21使用National Instruments DAQ(NI-DAQ-USB-6363)板在10ms的帧时间将两台iXon Ultra EMCCD摄像机(DU-897-CS0-BV和DU 897U CS0-EXF，均冷却至-80℃，17MHz EM放大器，前置放大器设置3，增益400)同步。通过LabVIEW 2012(National Instruments)将5毫秒频闪激发555纳米激光(CL555-1000-O，TTL调制，CrystaLaser)和639纳米激光(Stradus 637-140，Vortran)与两个相应摄像机的帧时间进行同步。两个激光器使用HiLo核照射，使用～1.7kW/cm2的峰值功率密度频闪地照射样品。PA-JF549和PA-JF646标记通过每秒407nm光(50W/cm2)的100μs长激发脉冲进行光转换。在图像采集过程中，脉冲长度增加到200μs长脉冲。在成像期间，使用Tokai-hit阶段顶部培养箱和物镜加热器将细胞维持在37℃和5％CO2。我们使用先前发表的分析确定了我们的活细胞实验中共定位的Sox2和组蛋白H2B轨迹。简而言之，我们分别在两个通道中定位粒子和构建轨迹。然后我们指定为共定位轨迹，其彼此在320nm内停留至少10ms。然后我们计算扩散系数图和直方图，如Grimm、English等人所述。
背景染色的确定。用表达人组蛋白H2B-HaloTag蛋白融合蛋白的质粒稳定转染COS-7细胞。将未转染的COS-7细胞和稳定的组蛋白H2B-HaloTag表达细胞以每片2×105个细胞接种于含有10％FBS和GlutaMAX的无酚红DMEM的35mm MatTek玻璃底皿中。24小时后，用PBS漂洗细胞，并用2mL新鲜的在0.1M磷酸盐缓冲液中的4％w/v多聚甲醛(pH 7.4)中固定30分钟，然后用PBS洗涤两次。将组蛋白H2B-HaloTag蛋白用100nM的PA-JF549-HaloTag配体(6)或PA-JF646-HaloTag配体(16)以及在PBS中的5μg/mL Hoechst 33342(Invitrogen)染色30分钟。然后用PBS洗涤细胞两次，用含有0.1％v/v Triton X-100和3％w/v BSA的PBS洗涤20分钟，然后再用PBS洗涤两次。使用Zeiss 710LSM对细胞成像。使用Hoechst 33342核参考染色设定Z维堆叠边界，其使用405nm激发和410-485nm发射成像。PA-JF549和PA-JF646的部分光活化在设置为75％激光功率的60次405nm下完成的。使用561nm激发和566-685nm发射收集活化的JF549的图像。使用633nm激发和638-759nm发射收集JF646的图像。分别收集Hoechst33342和JF染料轨迹。使用Fiji进行图像分析。共聚焦堆叠显示为最大投影图像。将实验和对照图像设置为相同的亮度/对比度。
双色固定细胞PALM成像采集。表达用PA-JF646-HaloTag配体(16)标记的Htt94Q-mEos3.2和组蛋白H2B-HaloTag的ES细胞，使用先前描述的定制的3-照相显微镜在50ms的帧时间和555nm和639nm激发激光器的～4kW/cm2的恒定的照射功率密度下成像。mEos3.2和PA-JF646通过每秒407nm光(100W/cm2)的100μs长激发脉冲进行光转换。mEos3.2发射115.6个检测到的光子/定位/帧，并且分子平均发射4帧，这通过使用严格的位移参数进行跟踪以选择固定粒子来确定。因此，每个mEos3.2发射大约460个检测到的光子，与文献报道一致。基于检测到的光子/定位/帧(757.6)和JF646的红移光谱的6.5倍，JF646提供的1.7倍高分辨率增强小于预期。这主要是由于相机像素大小针对调光蛋白荧光团进行了优化，以及增加的由明亮的离焦JF646分子产生的荧光背景。
PALM和sptPALM跟踪图像分析。对于同时双摄像机成像和跟踪，使用基于描述符的Fiji插件用相似性(2d)变换模型来登记两个16位TIFF堆叠。使用Dedecker等人的软件包定位器(Localizer)以8向邻接粒子检测、20GLRT灵敏度和1.3像素的PSF渲染超分辨率图像。为粒子轨迹链接选择了以下设置：5像素最大跳跃距离、3帧最小轨迹长度和15GLRT灵敏度。然后将得到的轨迹导出为文本文件，并使用Igor Pro 6.36(WaveMetrics)编写的代码执行扩散映射。该代码根据帧时间标度上的均方位移计算在20nm乘20nm网格中评估的局部表观扩散系数。Zeiss Zen 2.1软件用于分析从Zeiss Elyra显微镜拍摄的图像。
多聚焦图像处理。我们通过使用如前所述的珠子校准数据将九个同时获得的焦平面彼此对齐来组装3D堆叠。对于3D粒子追踪，我们将16位TIFF堆叠导入DiaTrack 3.04Pro，其可以识别并匹配强度点，其中3D高斯函数与预定的PSF相匹配。为3D粒子追踪选择以下设置：减去背景、过滤1.05的数据、1.3像素的PSF、去除15的暗淡、并去除0.05的模糊。使用在Igor Pro 6.36中编写的代码将所得到的3D轨迹导出为包含帧数的一个文本文件，以及所有检测到的点的x、y和z坐标。我们绘制了x-y平面中所有检测到的粒子位置的地图，对高度(z)进行颜色编码，并计算在3D sptPALM数据采集过程中检测到的粒子数量的直方图。计算在中心两个焦平面(多焦平面4和5)中检测到的粒子的积分荧光强度，并使用Igor Pro版本6.36中编写的分析程序将其转换为光子计数。使用Mortensen等人的等式(6)计算定位误差。
活化率测量。表达用配体6和16标记的组蛋白H2B-mEos3.2或组蛋白H2B-HaloTag(针对每个荧光团，n＝5个细胞)的活U2OS细胞在同时的激发光(PA-JF549和mEos3.2为561nm；PA-JF646为637nm)和300秒(每帧300ms)的激活光(405nm)下成像。时间常数(η)通过荧光与时间的指数拟合确定(图3G和图4F)。
导通-解离率和光子计数估计。使用Wang等人的方法测定导通-解离率，表1中给出数据的概述。简言之，将表达用配体6和16标记的TOMM20-mEos3.2或TOMM20-HaloTag的U2OS细胞在4％PFA中固定10分钟，然后按如上所述洗涤。然后将细胞仅用激发激光在PBS中成像(PA-JF549和mEos3.2为561nm；PA-JF646为637nm；每帧300ms)(图3H和图4G)。约300帧后，打开光活化激光(405nm)，逐渐增加强度直至光活化过程耗尽。使用定制软件(Airlocalize)计数荧光斑点。
将导通率(on-rate)计算为在预光活化阶段期间每帧的光活化斑点的平均数量除以在整个影片上检测到的荧光斑点的总数。为了测量解离率(off-rate)，首先分离来自光活化前阶段的斑点。在这些斑点中，由小于1个像素的分开的斑点组装在对应于单个分子的轨道中。基于在光活化阶段中的所有斑点上计算的对-相关函数的宽度来确定1个像素阈值。然后，为了获得μ，将帧中的平均荧光团寿命(解离率的倒数)、每个分子的帧数n的分布拟合为积分指数(等式1)：
最后，将导通-解离率(on–off ratio)计算为平均荧光团寿命的导通率的乘积。每个值是2-4个单独细胞的平均值。在这方面，应注意，导通-解离率mEos3.2固定的细胞的估计值高于先前的活细胞测量值。光在物理学上的这种差异可能源于实验条件的差异(PBS与活细胞)。从这些实验中，还通过对每个分子的斑点强度求和，并调整EM-CCD的增益转换因子的结果来计算检测到的光子/分子的总数(图3I)。
表征PALM成像期间PA-JF549-HaloTag配体的闪烁动力学。PALM成像影片的一部分选自ensconsin-HaloTag-PA-JF549实验(图3R)，其特征为低密度的发射器。在影片部分的最大强度投影上使用二维高斯掩模定位算法确定它们的位置。随后，在影片的各个帧上运行相同的定位软件，并且生成在最大强度投影中识别的每个点的时间轨迹：如果在最大投影中识别的点的1个像素内的给定帧上检测到斑点时，则假设它们代表相同的粒子，并且相应的位置、强度和帧数也包括在时间轨迹中。选择1个像素的阈值来解释漂移；基于互相关分析，估计漂移在影片的持续时间内在每个维度上贡献较少～0.25像素位移。值得注意的是，阈值的保守选择可能导致一小部分假阳性闪烁事件，因此测量结果可能略微高估了染料闪烁的倾向。使用每个粒子的时间轨迹，分离并量化各个闪烁事件。得到的统计数据表明PA-JF549荧光团几乎没有闪烁(平均1.4次闪烁事件，图3T-V)。
实施例2
合成的一般实验信息
商业试剂从信誉良好的供应商处获得并按原样使用。所有溶剂均以在惰性气氛下储存的隔膜密封瓶的形式购买。所有反应均用隔片密封，除非另有说明，否则引入氮气氛。反应在圆底烧瓶或含有特氟隆涂覆的磁力搅拌棒的隔膜覆盖的卷边小瓶中进行。在装有电子接触温度计的搅拌加热板顶部用硅油浴或铝反应块完成反应加热，以保持指定的温度。
通过薄层色谱(TLC)在预涂覆的TLC玻璃板(硅胶60F254，250μm厚)上或通过LC/MS(Phenomenex Kinetex 2.1mm×30mm 2.6μm C18柱；进样量5μL；5-98％MeCN/H2O，线性梯度，含有恒量的0.1％v/v HCO2H添加剂；运行6分钟；流速0.5mL/min；ESI；阳离子模式)监测反应。通过UV照射使TLC色谱图可视化或用对茴香醛、钼酸铈铵或KMnO4染色剂显色。使用预填充的硅胶柱或通过制备型HPLC(Phenomenex Gemini-NX 30×150mm 5μm C18柱)，在自动纯化系统上通过快速色谱法纯化反应产物。在指定条件下用Agilent Eclipse XDB 4.6×150mm 5μm C18柱进行分析型HPLC分析。通过爱荷华大学的高分辨率质谱设备获得高分辨率质谱。
在400MHz光谱仪上记录NMR光谱。1H和13C化学位移(δ)参考TMS或残留溶剂峰，19F化学位移(δ)参考CFCl3。1H NMR光谱的数据报告如下：化学位移(δppm)，多重性(s＝单峰，d＝双峰，t＝三重峰，q＝四重峰，dd＝双二重峰，m＝多重峰)，耦合常数(Hz)，整合。用从DEPT光谱获得的氢多重性(C、CH、CH2、CH3)信息通过化学位移(δppm)报告13C NMR光谱的数据。
PA-JF探针的合成
PA-JF549(2)(图1A、8和10A)：向在CH2Cl2(30mL)中的Janelia Fluor 5491(JF549)(1)(450mg，1.10mmol)溶液中加入草酰氯(111μL，1.32mmol，1.2eq)。将反应物在室温下搅拌30分钟后，依次加入三乙胺(229μL，1.64mmol，1.5eq)和(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(2.0M在Et2O中，3.29mL，6.58mmol，6eq)。将反应物在室温下搅拌1小时，真空浓缩，并通过硅胶快速色谱法纯化(0-20％EtOAc/甲苯，线性梯度)，得到333mg(70％)的2，为黄色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.83–7.79(m,1H),7.46(td,J＝7.5,1.3Hz,1H),7.39(td,J＝7.4,1.0Hz,1H),7.07–7.03(m,1H),6.69(d,J＝8.5Hz,2H),6.16(d,J＝2.3Hz,2H),6.07(dd,J＝8.5,2.3Hz,2H),3.88(t,J＝7.5Hz,8H),2.36(p,J＝7.2Hz,4H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ187.4(C),156.4(C),152.7(C),152.1(C),134.69(CH),134.66(C),128.8(CH),128.4(CH),125.5(CH),122.3(CH),109.7(C),107.9(CH),98.3(CH),77.4(C),52.3(CH2),49.4(C),16.9(CH2)；HRMS(ESI)计算值C27H23N4O2[M+H]+435.1816,实测值435.1820。
3',6'-二溴-6-甲氧基羰基荧烷(S2)(图5)：将3',6'-二溴-6-羧基荧烷2(S1)(1.50g，2.99mmol)悬浮于MeOH(50mL)中，并加入H2SO4(293mg，2.99mmol，1eq)。将反应物在回流下搅拌72小时。随后将其真空浓缩，将得到的残余物用饱和NaHCO3稀释，并用15％i-PrOH/CHCl3萃取(2×)。将合并的有机萃取物用无水MgSO4干燥，过滤并蒸发。硅胶色谱(0-10％EtOAc/己烷，线性梯度，含有恒量的40％v/v CH2Cl2)得到1.49g(97％)的S2，为白色固体。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.31(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.10(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.76(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),7.52(d,J＝1.9Hz,2H),7.20(dd,J＝8.5,1.9Hz,2H),6.68(d,J＝8.5Hz,2H),3.89(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ168.1(C),165.3(C),153.1(C),151.2(C),137.0(C),131.6(CH),129.24(C),129.21(CH),127.8(CH),125.7(CH),125.1(CH),124.6(C),120.7(CH),117.4(C),81.5(C),53.0(CH3)；HRMS(ESI)计算值C22H13Br2O5[M+H]+514.9124,实测值514.9141。
6-甲氧基羰基-JF549(S3)(图5)：向小瓶中加入S2(400mg，775μmol)、Pd2dba3(71mg，77.5μmol，0.1eq)、Xphos(111mg，232μmol，0.3eq)和Cs2CO3(707mg，2.17mmol，2.8eq)。将小瓶密封并用氮气(3×)排气/回填。加入二噁烷(6mL)，并再次用氮气(3×)冲洗反应。加入氮杂环丁烷(115μL，1.70mmol，2.2eq)后，将反应在100℃下搅拌3小时。然后将其冷却至室温，用MeOH稀释，沉积在硅藻土上，并浓缩至干。通过硅胶色谱法纯化(0-10％MeOH(2M NH3)/CH2Cl2，线性梯度；用硅藻土干燥负载)，得到S3(312mg，86％)，为紫色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)d8.24(dd,J＝8.1,1.7Hz,1H),8.12(dd,J＝8.1,0.4Hz,1H),7.83–7.80(m,1H),7.16(d,J＝9.2Hz,2H),6.56(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.48(d,J＝2.2Hz,2H),4.32–4.22(m,8H),3.90(s,3H),2.54(p,J＝7.6Hz,4H)；分析型HPLC:tR＝12.7分钟,纯度>99％(进样量5μL；10–95％MeCN/H2O,线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA添加剂；运行20分钟；流速1mL/min；ESI；阳离子模式；550nm处UV检测)；HRMS(ESI)计算值C28H25N2O5[M+H]+469.1758,实测值469.1766。
6-甲氧基羰基-PA-JF549(S4)(图5)：使用用于描述2的方法将S3转化为标题化合物(38％，黄色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)d 8.07(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.87(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.68(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.66(d,J＝8.5Hz,2H),6.18(d,J＝2.3Hz,2H),6.07(dd,J＝8.5,2.4Hz,2H),3.96–3.84(m,8H),3.82(s,3H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H)；13CNMR(CDCl3,101MHz)δ186.2(C),166.2(C),156.3(C),152.8(C),152.2(C),138.4(C),135.8(C),129.8(CH),128.7(CH),126.9(CH),122.3(CH),108.8(C),108.0(CH),98.5(CH),78.4(C),52.5(CH3),52.3(CH2),49.5(C),16.9(CH2)；HRMS(ESI)计算值C29H25N4O4[M+H]+493.1870,实测值493.1877。
PA-JF549-NHS(S5)(图5)：在氮气下，向在2:1的MeOH/THF(7.5mL)中的S4(53mg，108μmol)溶液中加入1M NaOH(538μL，538μmol，5eq)。将反应在室温下搅拌24小时。随后用1MHCl(575μL)酸化，用水稀释，并用CH2Cl2萃取(2×)。有机萃取物经无水MgSO4干燥，过滤，真空浓缩，得到羧酸，为黄色固体(47mg，91％)。
将酸(47mg，98.2μmol)与TSTU(44mg，147μmol，1.5eq)在DMF(3mL)中合并，并添加DIEA(51μL，295μmol，3eq)。将反应物在室温下搅拌1小时后，将其浓缩至干燥并沉积在硅藻土上。在硅胶上进行快速色谱(10-100％EtOAc/己烷，线性梯度；用硅藻土干燥负载)，得到S5，为黄色固体(40mg，71％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)d 8.16(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.93(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.75(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.66(d,J＝8.5Hz,2H),6.16(d,J＝2.3Hz,2H),6.09(dd,J＝8.5,2.4Hz,2H),3.90(t,J＝7.3Hz,8H),2.86(s,4H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ185.5(C),169.0(C),161.2(C),156.4(C),153.0(C),152.1(C),140.0(C),130.6(CH),130.4(C),128.5(CH),127.9(CH),122.8(CH),108.3(CH),108.1(C),98.5(CH),78.7(C),52.3(CH2),49.7(C),25.8(CH2),16.9(CH2)；HRMS(ESI)计算值C32H26N5O6[M+H]+576.1878,实测值576.1890。
PA-JF549-HaloTag配体(6)(图1C和图5)：将NHS酯S5(15mg，26.1μmol)溶解在DMF(1mL)中。加入在DMF(250μL)中的HaloTag(O2)胺(S6，11.7mg，52.1μmol，2eq)溶液，然后加入DIEA(22.7μL，130μmol，5eq)。将反应物在室温下搅拌2小时后，将其浓缩至干燥并通过硅胶色谱法(0-100％EtOAc/甲苯，线性梯度)纯化，得到6，为黄色泡沫(15.9mg，89％)。1H NMR(CDCl3,400MHz)d 7.86(dd,J＝7.9,0.6Hz,1H),7.79(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.43(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.66(d,J＝8.5Hz,2H),6.59(t,J＝5.1Hz,1H),6.16(d,J＝2.3Hz,2H),6.07(dd,J＝8.5,2.4Hz,2H),3.95–3.83(m,8H),3.64–3.48(m,10H),3.39(t,J＝6.6Hz,2H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),1.78–1.69(m,2H),1.55–1.48(m,2H),1.46–1.36(m,2H),1.36–1.27(m,2H)；分析型HPLC:tR＝17.1分钟,纯度>99％(进样量5μL；10–95％MeCN/H2O,线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA添加剂；运行20分钟；流速1mL/min；ESI；阳离子模式；254nm处UV检测)；HRMS(ESI)计算值C38H43ClN5O5[M+H]+684.2947,实测值684.2952。
PA-JF549-SNAP-tag配体(7)(图1C和5)：将NHS酯S5(10mg，17.4μmol)和BG-NH2(S7，7.0mg，26.1μmol，1.5eq)在DMF(1mL)中合并，并加入DIEA(15.1μL，86.9μmol，5eq)。将反应物在室温下搅拌1小时后，将其浓缩至干燥，沉积在硅藻土上，并通过硅胶色谱法(0-10％MeOH/EtOAc，线性梯度；用硅藻土干燥负载)纯化，得到7，为黄色固体(11.2mg，88％)。1HNMR(CD3OD,400MHz)δ7.94(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.85(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.80(s,1H),7.53(dd,J＝1.4,0.5Hz,1H),7.37(d,J＝8.1Hz,2H),7.22(d,J＝8.1Hz,2H),6.64(d,J＝8.5Hz,2H),6.16(d,J＝2.3Hz,2H),6.12(dd,J＝8.5,2.3Hz,2H),5.46(s,2H),4.43(s,2H),3.90–3.77(m,8H),2.34(p,J＝7.2Hz,4H)；分析型HPLC:tR＝13.0分钟,纯度>99％(进样量5μL；10–95％MeCN/H2O,线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA添加剂；运行20分钟；流速1mL/min；ESI；阳离子模式；254nm处UV检测)；HRMS(ESI)计算值C41H35N10O4[M+H]+731.2837,实测值731.2852。
PA-JF646(12)(图4A、图9和图10B)：使用用于描述2的方法将Janelia Fluor 646(JF646)(11)转化为标题化合物(37％，黄色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.87–7.82(m,1H),7.42(td,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.37(td,J＝7.4,1.2Hz,1H),6.93–6.89(m,1H),6.78(d,J＝8.8Hz,2H),6.56(d,J＝2.7Hz,2H),6.33(dd,J＝8.8,2.7Hz,2H),3.89(t,J＝7.4Hz,8H),2.36(p,J＝7.2Hz,4H),0.57(s,3H),0.46(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ188.4(C),157.8(C),149.9(C),135.2(C),134.6(CH),134.4(C),134.0(C),130.1(CH),127.9(CH),125.5(CH),122.6(CH),114.4(CH),114.1(CH),79.1(C),57.5(C),52.3(CH2),17.0(CH2),1.0(CH3),0.2(CH3)；HRMS(ESI)计算值C29H29N4OSi[M+H]+477.2105,实测值477.2104。
6-甲氧基羰基硅基荧光素双(三氟甲磺酸酯)(S9)(图6)：将6-叔丁氧基羰基硅基荧光素双(三氟甲磺酸双酯)1(S8；400mg，541μmol)溶于CH2Cl2(20mL)中，并加入三氟乙酸(4mL)。将反应物在室温下搅拌5小时。加入甲苯(20mL)；将反应混合物浓缩至干，然后与MeOH共沸三次。将所得羧酸溶于4:1THF/MeOH(10mL)中。加入(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷(2.0M在Et2O中，406μL，812μmol，1.5eq)，并将反应物在室温下搅拌15分钟。然后将黄色溶液真空浓缩，并通过硅胶色谱法(0-25％EtOAc/己烷，线性梯度)纯化，得到344mg(91％)的S9，为白色泡沫。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.28(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),8.08(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),8.03(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),7.58(d,J＝2.5Hz,2H),7.24(d,J＝8.8Hz,2H),7.20(dd,J＝8.9,2.6Hz,2H),3.95(s,3H),0.81(s,3H),0.71(s,3H)；19F NMR(CDCl3,376MHz)δ-73.27(s)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ168.5(C),165.3(C),152.6(C),149.6(C),144.0(C),138.7(C),136.2(C),131.3(CH),128.81(CH),128.75(C),127.0(CH),126.7(CH),125.4(CH),123.1(CH),118.9(q,1JCF＝320.7Hz,C),88.7(C),53.1(CH3),0.0(CH3),-1.3(CH3)；HRMS(ESI)计算值C26H19F6O10S2Si[M+H]+697.0088,实测值697.0097。
6-甲氧基羰基-JF646(S10)(图6)：使用用于描述S3的方法将双(三氟甲磺酸酯)S9转化为标题化合物(86％，黄色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.18(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.99(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.94(dd,J＝1.2,0.8Hz,1H),6.75(d,J＝8.7Hz,2H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.26(dd,J＝8.7,2.7Hz,2H),3.894(t,J＝7.3Hz,8H),3.892(s,3H),3.95–3.83(m,11H),2.36(p,J＝7.2Hz,4H),0.64(s,3H),0.58(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ169.9(C),166.0(C),155.0(C),151.1(C),136.7(C),135.2(C),132.2(C),130.2(C),130.0(CH),127.8(CH),125.9(CH),125.8(CH),115.7(CH),112.5(CH),92.2(C),52.7(CH3),52.4(CH2),17.0(CH2),0.4(CH3),-1.2(CH3)；HRMS(ESI)计算值C30H31N2O4Si[M+H]+511.2048,实测值511.2057。
6-甲氧基羰基-PA-JF549(S11)(图6)：使用用于描述2的方法将S10转化为标题化合物(39％，黄色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.03(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.88(dd,J＝8.0,0.6Hz,1H),7.58(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.80(d,J＝8.8Hz,2H),6.58(d,J＝2.7Hz,2H),6.33(dd,J＝8.8,2.7Hz,2H),3.94–3.85(m,8H),3.80(s,3H),2.36(p,J＝7.2Hz,4H),0.63(s,3H),0.48(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ187.3(C),166.2(C),157.6(C),150.1(C),138.6(C),135.5(C),134.7(C),133.3(C),129.7(CH),129.2(CH),126.9(CH),122.7(CH),114.8(CH),114.1(CH),79.7(C),57.8(C),52.4(CH3),52.3(CH2),17.1(CH2),0.9(CH3),0.2(CH3)；HRMS(ESI)计算值C31H31N4O3Si[M+H]+535.2160,实测值535.2172。
PA-JF646-NHS(S12)(图6)：使用用于描述S5的方法将S11转化为标题化合物(2步为69％，黄橙色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.13(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.94(dd,J＝8.0,0.5Hz,1H),7.66–7.62(m,1H),6.80(d,J＝8.8Hz,2H),6.58(d,J＝2.7Hz,2H),6.35(dd,J＝8.8,2.7Hz,2H),3.91(t,J＝7.4Hz,8H),2.93–2.78(m,4H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),0.60(s,3H),0.47(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ186.6(C),169.1(C),161.2(C),157.7(C),150.3(C),140.2(C),134.6(C),132.5(C),130.1(C),129.9(CH),129.6(CH),127.8(CH),123.1(CH),115.0(CH),114.4(CH),80.2(C),57.9(C),52.4(CH2),25.7(CH2),17.0(CH2),0.8(CH3),0.3(CH3)；HRMS(ESI)计算值C34H32N5O5Si[M+H]+618.2167,实测值618.2179。
PA-JF646-HaloTag配体(16)(图6)：使用用于描述5的方法将S12转化为标题化合物(74％，黄色固体)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.87(dd,J＝8.0,0.5Hz,1H),7.76(dd,J＝8.0,1.5Hz,1H),7.32(dd,J＝1.4,0.6Hz,1H),6.77(d,J＝8.8Hz,2H),6.57(d,J＝2.6Hz,2H),6.52(t,J＝5.0Hz,1H),6.32(dd,J＝8.8,2.7Hz,2H),3.90(t,J＝7.6Hz,8H),3.62–3.49(m,10H),3.39(t,J＝6.6Hz,2H),2.37(p,J＝7.2Hz,4H),1.79–1.69(m,2H),1.55–1.48(m,2H),1.47–1.37(m,2H),1.36–1.27(m,2H),0.62(s,3H),0.46(s,3H)；分析型HPLC:tR＝16.2min,纯度>99％(进样量5μL；10–95％MeCN/H2O,线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA添加剂；运行20分钟；流速1mL/min；ESI；阳离子模式；254nm处UV检测)；HRMS(ESI)计算值C40H49ClN5O4Si[M+H]+726.3237,实测值726.3253。
PA-JF646-SNAP-tag配体(17)(图6)：使用用于描述7的方法将S12转化为标题化合物(71％，黄色固体)。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ7.90(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H),7.87(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.83(s,1H),7.43(d,J＝8.2Hz,2H),7.37(dd,J＝1.3,0.8Hz,1H),7.26(d,J＝8.2Hz,2H),6.73(d,J＝8.8Hz,2H),6.66(d,J＝2.6Hz,2H),6.40(dd,J＝8.8,2.7Hz,2H),5.50(s,2H),4.44(s,2H),3.85(t,J＝7.3Hz,8H),2.34(p,J＝7.2Hz,4H),0.55(s,3H),0.44(s,3H)；分析型HPLC:tR＝11.9分钟,纯度>99％(进样量5μL；10–95％MeCN/H2O,线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA添加剂；运行20分钟；流速1mL/min；ESI；阳离子模式；254nm处UV检测)；HRMS(ESI)计算值C43H41N10O3Si[M+H]+773.3127,实测值773.3141。
JF646-SNAP-tag配体(19)(图7)：将6-羧基-JF646(S13，三氟乙酸盐；25mg，40.9μmol)与DSC(23.1mg，90.1μmol，2.2eq)在DMF(2mL)中合并。加入Et3N(34μL，246μmol，6eq)和DMAP(0.5mg，4.09μmol，0.1eq)后，将反应物在室温下搅拌1小时，同时避光。然后加入BG-NH2(S7，28mg，102μmol，2.5eq)。将反应物在室温下再搅拌2小时。随后用饱和NaHCO3稀释，并用CH2Cl2萃取(2×)。将合并的有机萃取物经无水MgSO4干燥，过滤，并真空浓缩。采用硅胶色谱(0-10％MeOH/EtOAc，线性梯度)得到24.7mg(80％)的19，为蓝色固体。1H NMR(MeOD,400MHz)δ8.02(dd,J＝8.0,1.3Hz,1H),7.99(dd,J＝8.0,0.7Hz,1H),7.82(s,1H),7.67–7.64(m,1H),7.46(d,J＝8.1Hz,2H),7.32(d,J＝8.2Hz,2H),6.73(d,J＝2.6Hz,2H),6.70(d,J＝8.7Hz,2H),6.32(dd,J＝8.7,2.6Hz,2H),5.51(s,2H),4.52(s,2H),3.87(t,J＝7.3Hz,8H),2.35(p,J＝7.1Hz,4H),0.58(s,3H),0.51(s,3H)；分析型HPLC:纯度>99％(4.6mm×150mm 5μm C18柱；进样量5μL；10–95％CH3CN/H2O,线性梯度，含有恒量的0.1％v/vTFA添加剂；运行20分钟；流速1mL/min；ESI；阳离子模式；650nm处UV检测)；HRMS(ESI)计算值C42H41N8O4Si[M+H]+749.3015,实测值749.2971。
光产物的合成：PA-JF探针的制备性光活化。
PA-JF549的光解(水性)(图1A)：在石英烧瓶中在氮气下将重氮酮2(50mg，115μmol)溶于MeCN(120mL)中。加入缓冲液(10mM HEPES pH 7.3，120mL)，并将所得黄色溶液用氮气鼓泡30分钟。将反应混合物在室温下照射并搅拌8小时(Luzchem LZC 4V光反应器，365nm灯)。然后将其浓缩至干燥并沉积在硅藻土上。首先通过用0-50％EtOAc/己烷(线性梯度)洗脱进行硅胶色谱，以分离深色产物5(用硅藻土干燥负载)。用0-15％MeOH/CH2Cl2(线性梯度，恒量的1％v/v AcOH)进一步洗脱得到荧光产物4，为深紫色固体(乙酸盐，25.3mg，50％)。通过快速色谱法(0-10％EtOAc/甲苯，线性梯度)再次纯化深色产物，得到4.6mg(9.8％)的5，为黑色固体。通过反相HPLC(10-75％MeCN/H2O，线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA)获得用于光谱表征的4的分析纯样品。
荧光产物4：(50％，深紫色固体)1H NMR(CD3OD,400MHz)δ7.55(td,J＝7.5,1.3Hz,2H),7.51–7.42(m,2H),7.22(dd,J＝7.5,1.2Hz,1H),7.11(d,J＝9.2Hz,2H),6.64(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.56(d,J＝2.2Hz,2H),4.38–4.27(m,8H),2.57(p,J＝7.6Hz,4H),2.04(s,3H),1.90(s,3H)；13C NMR(CD3OD,101MHz)δ159.4(C),159.0(C),158.2(C),137.2(C),133.4(C),132.5(CH),131.8(CH),131.2(CH),130.1(CH),127.3(CH),114.7(C),113.8(CH),95.2(CH),52.9(CH2),19.6(CH3),16.8(CH2)；HRMS(ESI)计算值C26H25N2O[M]+381.1961,实测值381.1973。
深色产物5：(9.8％，黑色固体)1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.78(d,J＝8.4Hz,1H),7.59(d,J＝8.5Hz,1H),7.55–7.50(m,1H),7.41–7.37(m,1H),7.34(td,J＝7.4,1.2Hz,1H),7.22(td,J＝7.3,1.2Hz,1H),6.33–6.26(m,4H),3.99(t,J＝7.3Hz,4H),3.92(t,J＝7.3Hz,4H),2.43(p,J＝7.3Hz,2H),2.38(p,J＝7.3Hz,2H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ195.8(C),159.5(C),158.2(C),155.3(C),153.9(C),150.4(C),144.2(C),132.9(CH),132.8(C),129.8(CH),128.3(CH),127.5(C),122.6(CH),121.1(CH),115.7(C),114.8(C),108.5(CH),107.5(CH),104.2(CH),103.6(CH),52.4(CH2),52.1(CH2),16.9(CH2),16.8(CH2)；HRMS(ESI)计算值C27H23N2O2[M+H]+407.1754,实测值407.1772。
PA-JF549的光解(甲醇)(图8)：在石英烧瓶中在氮气下将重氮酮2(75mg，173μmol)溶于MeOH(300mL)中，并将所得黄色溶液用氮气鼓泡30分钟。将反应混合物在室温下照射并搅拌8小时(Luzchem LZC 4V光反应器，365nm灯)。然后将其浓缩至干燥。首先通过用0-50％EtOAc/己烷(线性梯度)洗脱进行硅胶色谱，以分离黑色产物5，为黑色固体(14mg，20％)。用0-15％MeOH/CH2Cl2(线性梯度，含有恒量的1％v/v AcOH)进一步洗脱，得到荧光产物S14，为深红-紫色固体(乙酸盐，56mg，65％)。通过反相HPLC(10-75％MeCN/H2O，线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA)获得用于光谱表征的S14的分析纯样品。
荧光产物S14：(65％，深紫色固体)1H NMR(CD3OD,400MHz)δ7.68–7.52(m,3H),7.29(d,J＝7.1Hz,1H),7.08(d,J＝9.2Hz,2H),6.63(dd,J＝9.2,2.1Hz,2H),6.54(d,J＝2.1Hz,2H),4.32(t,J＝7.7Hz,8H),3.42(s,2H),3.35(s,3H),2.57(p,J＝7.7Hz,4H)；13C NMR(CD3OD,101MHz)δ172.5(C),158.9(C),158.2(C),157.9(C),134.3(C),133.8(C),132.7(CH),131.4(CH),130.6(CH),128.8(CH),114.9(C),113.7(CH),95.2(CH),52.9(CH2),52.4(CH3),39.5(CH2),16.8(CH2)；HRMS(ESI)计算值C28H27N2O3[M]+439.2016,实测值439.2017。
JF549-苯乙酸(初始光解产物)(3)(图1A、图8和图10A)：将罗丹明S14(50mg，100μmol)溶于MeOH(5mL)，并加入1M NaOH(1.00mL，1.00mmol，10eq)。将反应物在室温下搅拌18小时；然后将其用2M HCl(510μL)酸化，并通过反相HPLC(10-75％MeCN/H2O，线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA)直接纯化以分离22mg(TFA盐，41％)的3，为深红色固体。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ7.66–7.58(m,2H),7.54(td,J＝7.3,1.7Hz,1H),7.27(d,J＝7.4Hz,1H),7.11(d,J＝9.2Hz,2H),6.61(dd,J＝9.2,2.2Hz,2H),6.54(d,J＝2.1Hz,2H),4.32(t,J＝7.7Hz,8H),3.37(s,2H),2.57(p,J＝7.6Hz,4H)；13C NMR(CD3OD,101MHz)δ173.8(C),159.0(C),158.21(C),158.20(C),134.7(C),133.8(C),132.8(CH),132.7(CH),131.3(CH),130.5(CH),128.6(CH),115.0(C),113.6(CH),95.2(CH),52.9(CH2),39.5(CH2),16.8(CH2)；HRMS(ESI)计算值C27H25N2O3[M+H]+425.1860,实测值425.1865。
PA-JF646的光解(水性)(图4A)：在石英烧瓶中在氮气下将重氮酮12(25mg，52.5μmol)溶于MeCN(60mL)中。加入缓冲液(10mM HEPES pH7.3，60mL)，并将所得黄色溶液用氮气鼓泡30分钟。将反应混合物在室温下照射并搅拌8小时(Luzchem LZC 4V光反应器，365nm灯)。然后将其浓缩至干燥并沉积在硅藻土上。通过首先用0-50％EtOAc/己烷(线性梯度)洗脱进行硅胶色谱法(用硅藻土干燥负载)，以分离黑色产物15，为黑色固体(9mg，24％)。用0-15％MeOH/CH2Cl2(线性梯度，含有恒量的1％v/vAcOH)洗脱，得到少量荧光产物14，为深蓝色固体(乙酸盐，1.1mg，4.3％)。通过反相HPLC(10-75％MeCN/H2O，线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA)获得用于光谱表征的14的分析纯样品。
荧光产物14：(4.3％，深蓝色固体)1H NMR(CD3OD,400MHz)δ7.45(td,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.42–7.33(m,2H),7.09(d,J＝7.5Hz,1H),7.02(d,J＝9.4Hz,2H),6.94(d,J＝2.6Hz,2H),6.35(dd,J＝9.4,2.6Hz,2H),4.37(t,J＝7.5Hz,8H),2.55(p,J＝7.7Hz,4H),2.01(s,3H),0.56(s,3H),0.55(s,3H)；13C NMR(CD3OD,101MHz)δ170.3(C),154.6(C),149.0(C),141.9(CH),140.3(C),136.9(C),131.3(CH),130.1(CH),130.0(CH),128.4(C),126.8(CH),120.1(CH),113.0(CH),53.0(CH2),19.4(CH3),16.9(CH2),-1.2(CH3),-1.4(CH3)；HRMS(ESI)计算值C28H31N2Si[M]+423.2251,实测值423.2260。
深色产物15：(24％，黑色固体)1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.58(d,J＝8.5Hz,1H),7.56(d,J＝7.0Hz,1H),7.51(d,J＝8.3Hz,1H),7.34(td,J＝7.5,1.1Hz,1H),7.27–7.20(m,2H),6.60(d,J＝2.5Hz,1H),6.54(d,J＝2.3Hz,1H),6.52(dd,J＝8.4,2.6Hz,1H),6.49(dd,J＝8.5,2.5Hz,1H),3.96(t,J＝7.3Hz,4H),3.90(t,J＝7.4Hz,4H),2.40(p,J＝7.3Hz,2H),2.38(p,J＝7.2Hz,2H),0.74(s,3H),0.15(s,3H)；13C NMR(CDCl3,101MHz)δ197.4(C),154.0(C),152.5(C),151.6(C),146.5(C),141.4(C),139.7(C),133.1(CH),132.4(C),131.4(CH),131.3(C),128.7(CH),128.2(CH),126.1(C),125.3(C),122.7(CH),122.0(CH),114.3(CH),114.2(CH),112.2(CH),111.2(CH),52.5(CH2),52.2(CH2),17.1(CH2),17.0(CH2),-3.6(CH3),-5.2(CH3)；HRMS(ESI)计算值C29H29N2OSi[M+H]+449.2044,实测值449.2046。
PA-JF646的光解(甲醇)(图9)：在石英烧瓶中在氮气下将重氮酮12(75mg，157μmol)溶于MeOH(300mL)中，并将所得黄色溶液用氮气鼓泡30分钟。将反应混合物在室温下照射并搅拌3小时(Luzchem LZC 4V光反应器，365nm灯)。然后将其浓缩至干燥。首先通过用0-50％EtOAc/己烷(线性梯度)洗脱进行硅胶色谱，以分离深色产物15，为黑色固体(16mg，23％)。用0-15％MeOH/CH2Cl2(线性梯度，含有恒量的1％v/v AcOH)进一步洗脱，得到荧光产物S15，为深蓝色固体(乙酸盐，36mg，42％)。通过反相HPLC(10-75％MeCN/H2O，线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA)获得用于光谱表征的S15的分析纯样品。
荧光产物S15：(42％，深蓝色固体)1H NMR(CD3OD,400MHz)δ7.57–7.45(m,3H),7.17–7.13(m,1H),6.97(d,J＝9.4Hz,2H),6.94(d,J＝2.5Hz,2H),6.33(dd,J＝9.4,2.6Hz,2H),4.37(t,J＝7.4Hz,8H),3.39(s,2H),3.32(s,3H),2.55(p,J＝7.7Hz,4H),0.58(s,3H),0.54(s,3H)；13C NMR(CD3OD,101MHz)δ172.6(C),168.3(C),154.5(C),149.0(C),142.2(CH),140.6(C),133.9(C),132.5(CH),130.7(CH),130.2(CH),128.5(C),128.2(CH),120.2(CH),112.8(CH),53.1(CH2),52.3(CH3),39.6(CH2),16.8(CH2),-0.9(CH3),-1.9(CH3)；HRMS(ESI)计算值C30H33N2O2Si[M]+481.2306,实测值481.2305。
JF646-苯乙酸(初始光解产物)(13)(图4A、图9和图10B)：在石英烧瓶中在氮气下将二氮杂酮12(75mg，157μmol)溶于MeCN(294mL)中；加入2-(三甲基甲硅烷基)乙醇(6mL)，并将所得黄色溶液用氮气鼓泡30分钟。将反应混合物在室温下照射并搅拌4小时(LuzchemLZC 4V光反应器，365nm灯)。然后将其浓缩至干燥。首先通过用0-50％EtOAc/己烷(线性梯度)洗脱进行硅胶色谱，以分离深色产物15，为黑色固体(16mg，23％)。用0-15％MeOH/CH2Cl2(线性梯度，含有恒量的1％v/v AcOH)进一步洗脱，得到2-(三甲基甲硅烷基)乙酯荧光光产物S16，为深蓝色固体(乙酸盐，35mg，35％)。
将酯光产物S16(35mg，55.8μmol)溶于CH2Cl2(3L)中，并加入TFA(1.5L)。将反应物在室温下搅拌8小时后，将其用甲苯(5L)稀释并浓缩至干。将所得残余物用饱和NaHCO3稀释，并用15％i-PrOH/CHCl3萃取(2×)。将合并的有机萃取物用无水MgSO4干燥，过滤，并真空浓缩。通过反相HPLC(30-70％MeCN/H2O，线性梯度，含有恒量的0.1％v/v TFA)纯化粗产物。合并产物馏分，部分浓缩以除去MeCN，用饱和NaHCO3中和，并用CH2Cl2萃取(2×)。有机萃取物经无水MgSO4干燥，过滤并蒸发，得到10mg(38％)的13，为蓝色固体。1H NMR(CD3OD,400MHz)δ7.54(d,J＝7.4Hz,1H),7.48(td,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.34(td,J＝7.5,1.1Hz,1H),7.10(d,J＝9.4Hz,2H),7.06–7.02(m,1H),6.89(d,J＝2.5Hz,2H),6.31(dd,J＝9.4,2.5Hz,2H),4.35(t,J＝7.6Hz,8H),3.23(s,2H),2.54(p,J＝7.7Hz,4H),0.55(s,3H),0.53(s,3H)；13C NMR(CD3OD,101MHz)δ170.1(C),154.6(C),148.9(C),142.9(CH),140.2(C),137.5(C),132.1(CH),130.0(CH),129.7(CH),129.0(C),126.8(CH),119.9(CH),112.8(CH),53.0(CH2),43.0(CH2),16.9(CH2),-1.2(CH3),-1.3(CH3)；HRMS(ESI)计算值C29H31N2O2Si[M+H]+467.2149,实测值467.2156。
用于光谱学和光化学的一般实验信息
一般实验信息。用于光谱学的荧光分子和生成荧光的分子在DMSO中制备成储备溶液并稀释使得DMSO浓度不超过1％v/v。通过稀释1M商业原料(Fisher)制备10mM HEPES缓冲液，pH 7.3。Janelia Fluor 549(JF549)(1)、JF549-HaloTag配体(6)、JF549-SNAP-tag配体(10)，Janelia Fluor 646(JF646)(11)和JF646-HaloTag配体(18)可从先前的研究获得。四甲基罗丹明HaloTag配体(9)来自Promega。
UV-可见光和荧光光谱。使用1-cm路径长度、来自Starna Cells的3.5-mL石英比色皿或1-cm路径长度、来自Hellma的1.0-mL石英微量离心机进行光谱分析。所有测量均在环境温度(22±2℃)下进行。在Cary Model 100光谱仪(Agilent)上记录吸收光谱。最大吸收波长(λmax)和消光系数(ε)取自10mM HEPES，pH7.3缓冲液；报告的ε值为平均值(n＝3)。在Cary Eclipse荧光计(Varian)上记录荧光光谱；为清楚起见，显示了归一化光谱。
荧光量子产率(ΦF)测定。所有报告的量子产率值在相同条件下在我们的实验室中测得。使用Quantaurus-QY光谱仪(型号C11374，Hamamatsu)测量绝对量子产率。该仪器使用积分球(integrating sphere)来确定样品吸收和发射的光子。使用稀释样品(A<0.1)进行测量，并使用仪器软件进行自吸收校正3。报告的值为平均值(n＝3)。
光化学量子产率(ΦPC)测定。在配备有365nm UV灯、转盘和计时器的Luzchem LZC4V光反应器中，在1cm路径长度/3.5mL石英比色皿(Starna)中进行光化学试验。通过草酸钾光度法测定强度。4使用光反应器装置照射60mM K3Fe(C2O4)3的溶液，并通过用1,10菲咯啉的配位滴定法测定释放的Fe2+。利用该过程的已知光化学量子产率(ΦPC＝1.21)，我们确定光子通量(I)＝3.88×10-7ein/min·cm2。对于PA-JF549(2)至甲基-JF549(4)的转化，照射样品(在10mM HEPES pH 7.3中的5μm，3.0mL)并测量551nm处的吸光度的增加。对于苯乙酸-JF549(3)至甲基-JF549(4)的转化，照射样品并将小等分试样(50μL)置于琥珀玻璃高回收率HPLC小瓶中。通过HPLC(配备有自动进样器和二极管阵列检测器的Agilent 1200AnalyticalHPLC系统(λabs＝550nm)；Phenomenex 4.6×150mm，5μm，Kinetex C18柱；于含有0.1％v/vTFA的H2O中的10-95％MeCN梯度)分析这些样品。通过将吸光度增加或HPLC峰积分信号(S)与照射时间的曲线拟合到由等式2描述的单相关联来确定光化学量子产率(ΦPC，mol/ein)：
St＝Smax–Smax(e–IζΦt) (2)
其中Smax＝最大荧光，t＝时间(分钟)，St＝时间t处的信号，I＝照射(ein/min·cm2)，ζ＝十进制消光系数(以cm2/mol为单位；比基于比色皿几何形状的单位为M-1cm-1的ε值高1000倍)。发现ΦPC＝2.2％，确认化合物2转化为化合物4(图11A-B)。发现ΦPC＝15％，确认3经光诱导脱羧生成4(图11C-D)。
在存在和不存在HaloTag蛋白的情况下HaloTag配体6和16的光化学过程。HaloTag蛋白是来自Adam Berro和Eric Schreiter(Janelia Research Campus，HHMI)的慷慨馈赠，并以含20％v/v甘油(TBS-甘油)、50mM TRIS·HCl、75mM NaCl的100μm溶液(pH 7.4)的形式使用。吸光度测量在1mL石英比色皿中进行。将HaloTag配体6和16(5μm)溶于含有0.1mg·mL-1CHAPS的pH 7.3的10mM HEPES中。加入等份的HaloTag蛋白(1.5当量)或等体积的TBS-甘油，并将所得混合物在室温下孵育1小时，同时避光。记录初始吸光度，并将样品在室温下在光反应器(Luzchem LZC 4V，365nm灯)中照射。在t＝5、10、15、20、25、30、40、50和60分钟时进行吸光度扫描，之后额外的照射没有引起额外的吸光度增加。
在存在和不存在SNAP-tag蛋白下，SNAP-tag配体7和17的光化学过程。SNAP标签蛋白(SNAPf-6×His)是来自Eric Schreiter(Janelia Research Campus，HHMI)的慷慨馈赠，并以在含1mg DTT的1×PBS的2.8mg·mL-1(142μM)溶液的形式使用。在1mL石英比色皿中测量吸光度。将SNAP-tag配体7和17(5μm)溶于含有0.1mg·mL-1CHAPS的pH 7.3的10mM HEPES中。加入等分的SNAP-tag蛋白(1.5当量)或等体积的缓冲液，将得到的混合物在4℃孵育18小时，同时避光。记录初始吸光度，并将样品在室温下在光反应器(Luzchem LZC 4V，365nm灯)中照射。在t＝5、10、15、20、25、30和60分钟时进行吸光度扫描，之后额外的照射而没有引起额外的吸光度增加。
PA-JF染料光化学过程的结果和讨论
为了测试重氮酮笼化策略与明亮的、含氮杂环丁烷的Janelia Fluor染料的相容性，首先用草酰氯、TEA，然后用TMS-重氮甲烷处理JF549(1)1，以得到所需的可光活化的JF549(PA)-JF549)(2)，收率为70％(图1A)。与JF549的强可见吸收相反(图1B)，PA-JF549在可见光中显示低吸收(图10A)。然后在水的存在下研究该分子的光化学过程(1:1v/v MeCN:10mMHEPES pH 7.3)；之前的实验仅在甲醇中检测了这种光化学过程。4,5由于2在水中的适当溶解度，添加MeCN共溶剂对于以制备规模进行该反应是必要的。根据以前的报告，预计有两种主要产品，即苯乙酸衍生物3和indanone“深色产物”5。令人惊讶的是，主要的光产物(50％)不是预期的苯乙酸衍生物3，而是甲基-JF549(4)(图1A)，其也显示与亲本1相似的光谱特性(图1B、图10A和表3)。在没有MeCN共溶剂的情况下，在稀释的含水样品(含有0.1％v/v DMSO的10mM HEPES pH 7.3)中证实了该结果，其中通过LC-MS也观察到甲基-JF549(4)为主要产物(数据未显示)。该化合物由光诱导的初始光化学产物3的脱羧反应产生。在整个光化学反应过程中仅观察到痕量的3(数据未显示)，表明脱羧反应比初始光化学重排快。还分离出少量(10％)的“深色产物”S16，其表现出低但宽的吸收曲线(图10A)。然后通过测定该过程的光化学量子产率来量化2的解笼化(uncaging)效率(参见光化学量子产率(ΦPC)测定)。发现ΦPC＝2.2％，确认2转化为4(图11A-B)。
表3.PA-JF549和PA-JF646光产物的光谱性质。
为了证实甲基-JF549产物4是由推定的初始光化学产物3的光诱导脱羧产生的，我们由2逐步地合成3(图8)。在甲醇中光解2产生预期的5,6甲基苯基乙酸酯S14，然后将其皂化以提供JF549-苯乙酸3。该荧光团显示出与亲本JF549类似的光谱性质(图1B、表3)。用365nm光照射3实现快速转化为4，从水溶液中2的光解得到的相同产物(图11C-D)。重要的是，在黑暗中老化时，在相同缓冲液(10mM HEPES pH 7.3)中的3的样品显示没有明显转化为4。从图11D中的图可以确定脱羧的光化学量子产率为ΦPC＝15％。相对于初始解笼化的2(2.2％)，脱羧反应的近7倍高的光化学量子产率与在2的光解过程中观察到可忽略量的3一致。
然后将相同的笼化策略应用于氮杂环丁烷基Si-罗丹明JF646(11)。通过先前使用的相同TMS-重氮甲烷方案，以合理的产率(37％)将罗丹明11转化为重氮酮12(PA-JF646)(图4A)。如对PA-JF549(2)所观察到的，PA-JF646在可见区域中显示出最小的吸收(图10B)。然而，当在水溶液(1:1v/vMeCN:10mM HEPES pH 7.3)中照射时，12仅提供少量荧光光产物14(～4％)。我们在反应期间观察到低水平的苯乙酸13(随着反应逐渐完成而大部分消失)，并且最显著的分离产物是indanone 15(24％)。在不存在MeCN的情况下观察到类似的结果(即通过LC-MS分析稀释的含水样品)。
因为不能通过PA-JF646的光解分离和表征预期的初始光产物13，我们试图通过与3的制备类似的途径(图9)分别合成该化合物。不同于12在水溶液中的光解作用，在甲醇中进行相同的反应，得到中等(42％)产率的苯基乙酸甲酯光产物S15。然而，尝试在各种条件下(NaOH，LiOH等)水解甲酯未成功，仅产生原料或分解。相反，我们在含有2％v/v 2-(三甲基甲硅烷基)乙醇的MeCN中进行12的光解，以产生2(三甲基甲硅烷基)乙酯光产物S16(35％产率)。用TFA/CH2Cl2成功地将该酯脱保护，以分离出所需的苯乙酸13。如表3所示，PA-JF646光产物14和S15，以及预期的初始光产物13，均显示出类似于JF646的优异的亮度和光谱(图10B)。很难预测哪种光产物(13或14)会在更复杂的成像实验(如PALM)的更精细照射条件下占主导地位，但两种物种的相对良好的光谱特性证实，在任何一种情况下都会产生明亮的荧光团。尽管游离PA-JF646的光解仅在水溶液中提供少量荧光光产物，但我们预期(参见下文)该探针的蛋白缀合物(例如HaloTag、SNAP-tag)将显示出改善的光化学行为。
为了研究蛋白缀合对解笼化反应的影响并评估PA-JF549和PA-JF646用于细胞成像的性能，我们合成了这些化合物的HaloTag(6,16)和SNAP-tag(7,17)配体(图5和图6)。通过二溴荧烷S2或硅基荧光素双(三氟甲磺酸酯)S9的C-N交叉偶联来安装氮杂环丁烷环。用草酰氯处理，然后用TMS-重氮甲烷处理，得到重氮酮S4和S11。在6位水解甲酯，然后酰胺偶联至HaloTag(S6)和SNAP-tag(S7)配体片段，得到四种所需标记：PA-JF549-HaloTag配体(6)、PA-JF549-SNAP-标签配体(7)、PA-JF646-HaloTag配体(16)和PA-JF646-SNAP-标签配体(17)。
然后在存在或不存在同源蛋白(HaloTag或SNAP-tag)的情况下评估配体的光化学过程，以测试与蛋白的缀合如何影响光化学结果。首先，将PA-JF549-HaloTag配体(6)与过量的HaloTag蛋白(1小时)一起孵育，然后用365nm光彻底光解(图3A)。缀合物在光解之前表现出低的可见光吸收，但在用365nm光光解后在约550nm处显示出吸收的显著增加(从照射时间的5-60分钟以规则间隔记录吸收光谱)。6的光转换缀合物(“6+HaloTag+hv”，图3C)的吸光度在强度上类似于传统的不可光活化的JF549-HaloTag(“8+HaloTag”，图3B和图3C)的吸光度。当配体6在不存在HaloTag蛋白的情况下被光活化时，我们观察到在550nm处的吸收显著降低(图1C)。比较这些结果，发现与HaloTag蛋白的缀合导致在550nm处的产物吸收量增加近两倍。这表明与蛋白的缀合可以提高光化学效率并分配成所需的荧光产物。这可能是由于酶对染料的构象偏差或限制造成的，这可能不利于通向平面深色产物5的路径并阻止其形成。当用PA-JF549-SNAP-tag配体(7)进行相同的实验时，观察到类似的结果(图3D和3F)。与未结合的7的光活化相比，7的SNAP-标签缀合物(“7+SNAP-tag+hv”)的光解导致荧光产物的量增加1.6倍；标准JF549-SNAP标签的吸收光谱(“10+SNAP-tag”，图3E和图3F)显示用于比较。
尽管游离PA-JF646的光化学行为较差，但PA-JF549对酶的改善行为促使我们追求PA-JF646配体(参见上文)。将PA-JF646-HaloTag配体(16)与HaloTag酶一起孵育并用365nm光进行光活化。观察到在光解之前HaloTag缀合物的低吸光度，但也观察到在用UV光照射时远红(～650nm)吸收物质的显著增加(图4C)。在HaloTag蛋白存在(“16+HaloTag+hv”)和不存在(“16+hv”)的情况下，16的光化学的比较显示，蛋白的缀合使得远红吸收化合物的产生提高了近5倍(图4D)，表明当该PA-JF配体与蛋白连接时，所需的光化学结果得到增强。PA-JF646-SNAP-tag配体(17)也观察到与蛋白结合后光化学结果的显著改善，尽管效果的幅度(2.4倍)不那么大(图4E)。光活化的缀合物(“16+HaloTag+hv”和“17+SNAP-tag+hv”)的吸收光谱也有利地与非光活化配体18(JF646-HaloTag配体)(图4B和图D)和19(JF646-SNAP-tag配体)(图4B和4E)的缀合物相比。对于每种PA-JF配体，我们还通过比较活化后吸光度与相应游离甲基-JF光产物(甲基-JF5494或甲基-JF64614)的吸光度来估算荧光产物的光转换效率(表3-4)。对于HaloTag配体6和16的缀合物，我们估算转化率为90％(PA-JF549-HaloTag)和76％(PA-JF646-HaloTag)。发现7和17的SNAP-tag缀合物的效率稍低，估算的荧光产物产率为45％(PA-JF549-SNAP-tag)和39％(PA-JF646-SNAP-tag)。尽管如此，所有这些值远远大于对游离PA-JF549(2.50％)和PA-JF646(12.4％)测量的光转换效率。
表4.当与蛋白结合时游离染料PA-JF549和PA-JF646以及HaloTag和SNAP-tag配体的光转换效率。
a通过隔离光产物来测量。b通过相对于游离甲基取代的吸光度估算。
该实施例的结果表明，使用重氮酮策略可以使Janelia Fluor染料可光活化。PA-JF549和PA-JF646的活化产生意料不到的荧光产物甲基-JF549(4)和甲基-JF646(14)，其保持亲本化合物的亮度。更重要的是，其显示与蛋白的缀合可以影响反应朝向所需荧光形式的光化学结果。PA-JF549HaloTag配体(6)与同源HaloTag蛋白的缀合增加了可见吸收产物的产率，并且缀合物具有与标准JF549-HaloTag配体的缀合物相似的吸收性(图3C)。类似地，当连接到HaloTag蛋白时，PA-JF646HaloTag配体(16)显示远红色吸收产物显著增加5倍(图4D)。用这些探针(7,17)的SNAP-tag配体证实了这种效应的一般性，这也显示出当在蛋白上光活化时改善的荧光产物产率。总之，这些结果验证了PA-JF染料的效用，特别是在蛋白缀合物的背景下。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体和单独地指出通过引用并入，包括以下列表中列出的参考文献：
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应当理解，在不脱离本文公开的主题范围的情况下，可以改变本发明主题的各种细节。此外，前面的描述仅用于说明的目的，而不是限制的目的。
Claims (19)
1.一种光活性荧光团，其包括含氮杂环丁烷的Janelia-Fluor染料的可光活化衍生物。
2.根据权利要求1所述的光活性荧光团，其中所述荧光团通过光诱导脱羧。
3.根据权利要求1所述的光活性荧光团，其中所述可光活化衍生物为可光活化的Janelia-Fluor 549。
4.根据权利要求1所述的光活性荧光团，其中所述可光活化衍生物为可光活化的Janelia-Fluor 646。
5.一种形成光活性荧光团的方法，所述方法包括笼化Janelia-Fluor染料。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述笼化包括：
将草酰氯加入到Janelia-Fluor染料的溶液中，形成第一混合物；
将三乙胺和(三甲基甲硅烷基)重氮甲烷依次加入至所述第一混合物中，形成第二混合物；
浓缩所述第二混合物，形成浓缩物；
纯化所述浓缩物，以提供所述光活性荧光团。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述Janelia-Fluor染料包含Si-罗丹明。
8.一种光活性配体，其包括光活性荧光团和蛋白标签。
9.根据权利要求8所述的光活性配体，其中所述光活性荧光团包括含氮杂环丁烷的Janelia-Fluor染料的可光活化衍生物。
10.根据权利要求8所述的光活性配体，其中所述蛋白标签为HaloTag配体。
11.根据权利要求8所述的光活性配体，其中所述蛋白标签为SNAP-tag配体。
12.根据权利要求8所述的光活性配体，其中所述光活性配体与同源蛋白的缀合增加了光解后光活性配体的光吸收。
13.根据权利要求8所述的光活性配体，其中所述光活性荧光团的亮度实质上类似于衍生所述光活性荧光团的亲本荧光团的亮度。
14.一种光活性复合体，其包含与蛋白缀合的光活性配体。
15.根据权利要求14所述的光活性复合体，其中光活性配体在体内与蛋白缀合。
16.根据权利要求14所述的光活性复合体，其中所述光活性配体包括光活性荧光团和蛋白标签。
17.根据权利要求14所述的光活性复合体，其中所述光活性荧光团被布置和设置为在光诱导时脱羧。
18.根据权利要求17所述的光活性复合体，其中所述光活性荧光团被布置和设置以在脱羧时形成甲基-Janelia-Fluor化合物。
19.根据权利要求17所述的光活性复合体，其中所述光活性荧光团被布置和设置以在脱羧时提供增加的荧光。
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