CN113582950A - 一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113582950A
CN113582950A CN202110914509.7A CN202110914509A CN113582950A CN 113582950 A CN113582950 A CN 113582950A CN 202110914509 A CN202110914509 A CN 202110914509A CN 113582950 A CN113582950 A CN 113582950A
Authority
CN
China
Prior art keywords
fluorescent probe
hydrogen polysulfide
compound
ratio
polysulfide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110914509.7A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113582950B (zh
Inventor
龚萍
向春柏
蔡林涛
向晶晶
张鹏飞
罗媛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Original Assignee
Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS filed Critical Shenzhen Institute of Advanced Technology of CAS
Priority to CN202110914509.7A priority Critical patent/CN113582950B/zh
Publication of CN113582950A publication Critical patent/CN113582950A/zh
Priority to PCT/CN2021/137297 priority patent/WO2023015795A1/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113582950B publication Critical patent/CN113582950B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D307/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom
    • C07D307/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D307/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D307/38—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings having two or three double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with substituted hydrocarbon radicals attached to ring carbon atoms
    • C07D307/54—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D455/00—Heterocyclic compounds containing quinolizine ring systems, e.g. emetine alkaloids, protoberberine; Alkylenedioxy derivatives of dibenzo [a, g] quinolizines, e.g. berberine
    • C07D455/03—Heterocyclic compounds containing quinolizine ring systems, e.g. emetine alkaloids, protoberberine; Alkylenedioxy derivatives of dibenzo [a, g] quinolizines, e.g. berberine containing quinolizine ring systems directly condensed with at least one six-membered carbocyclic ring, e.g. protoberberine; Alkylenedioxy derivatives of dibenzo [a, g] quinolizines, e.g. berberine
    • C07D455/04—Heterocyclic compounds containing quinolizine ring systems, e.g. emetine alkaloids, protoberberine; Alkylenedioxy derivatives of dibenzo [a, g] quinolizines, e.g. berberine containing quinolizine ring systems directly condensed with at least one six-membered carbocyclic ring, e.g. protoberberine; Alkylenedioxy derivatives of dibenzo [a, g] quinolizines, e.g. berberine containing a quinolizine ring system condensed with only one six-membered carbocyclic ring, e.g. julolidine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K11/00—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials
    • C09K11/06—Luminescent, e.g. electroluminescent, chemiluminescent materials containing organic luminescent materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6428—Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring "optrodes"
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/6447—Fluorescence; Phosphorescence by visual observation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/62—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
    • G01N21/63—Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
    • G01N21/6456—Spatial resolved fluorescence measurements; Imaging
    • G01N21/6458—Fluorescence microscopy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1007—Non-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1003—Carbocyclic compounds
    • C09K2211/1014—Carbocyclic compounds bridged by heteroatoms, e.g. N, P, Si or B
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1029—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing one nitrogen atom as the heteroatom
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C09—DYES; PAINTS; POLISHES; NATURAL RESINS; ADHESIVES; COMPOSITIONS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; APPLICATIONS OF MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • C09K—MATERIALS FOR MISCELLANEOUS APPLICATIONS, NOT PROVIDED FOR ELSEWHERE
    • C09K2211/00—Chemical nature of organic luminescent or tenebrescent compounds
    • C09K2211/10—Non-macromolecular compounds
    • C09K2211/1018—Heterocyclic compounds
    • C09K2211/1025—Heterocyclic compounds characterised by ligands
    • C09K2211/1088—Heterocyclic compounds characterised by ligands containing oxygen as the only heteroatom

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Materials Engineering (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)

Abstract

本发明公开了一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针的结构式如式(I)所示。所述荧光探针以2‑(3‑氰基‑4,5,5‑三甲基呋喃‑2(5H)‑亚甲基)丙二腈与前体化合物反应得到具有聚集诱导发光特性的前驱体，然后连接亲电识别基团2‑氟‑5‑硝基苯甲酸酯所得。该比率型多硫化氢荧光探针具有合成原料易得、合成简单、目标化合物产率高及比率型响应等优点，避免了传统荧光探针不宜在高浓度下检测及单一发射在检测过程中易受浓度、温度、pH值及仪器等外界因素干扰的缺点，荧光强度高、响应快、分辨率高、抗干扰能力强，能够用于细胞和活体内多硫化氢的定性和定量检测，具有良好的应用前景。

Description

一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及分子探针技术领域，具体涉及一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
活性硫种(RSS)是一种含硫分子，在生物系统中具有重要的调节功能。其中硫化氢(H2S)是一种重要的内源性气体传递体，由于参与多种生理活动而被广泛研究。作为硫化氢的一种氧化形式，多硫化氢(H2Sn)一直没有引起人们的注意。然而，最近的一些证据表明，多硫化氢参与了越来越多与硫化氢有关的生理活动。例如，多硫化氢比硫化氢更有可能激活TRAP1通道，诱导星形胶质细胞内Ca2+内流。
为了更好地了解多硫化氢在生物系统中的作用，开发新技术监测多硫化氢在生物系统中的作用至关重要。传统的检测多硫化氢的方法是紫外-可见分光光度法和质谱法。这些方法需要对样品进行预处理，使得在体内快速、准确地检测多硫化氢和实时成像具有挑战性。与传统分析方法相比，荧光探针具有灵敏度高、选择性好和非侵入性检测的优点。然而，大多数用于检测多硫化氢的荧光探针主要依靠单个波长荧光强度的变化，会受到探针浓度、温度、pH和仪器效率的干扰。此外，一些比率探针在体内被聚集诱导猝灭(ACQ)所困扰，导致大量弱荧光和自身荧光中断。因此，开发出荧光强度高、响应快、准确性高的比率型多硫化氢探针具有重要意义。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用。所述荧光探针的结构式如式(I)所示。所述荧光探针以2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈与前体化合物反应得到具有聚集诱导发光特性的前驱体，然后连接亲电识别基团2-氟-5-硝基苯甲酸酯所得。
本发明提供一种比率型多硫化氢荧光探针，所述荧光探针的结构式如式(I)所示：
Figure BDA0003204974000000021
其中，R为
Figure BDA0003204974000000022
中的任意一种。
本发明还提供所述的比率型多硫化氢荧光探针的制备方法，所述荧光探针以2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈与4-(二乙氨基)水杨醛反应得到具有聚集诱导发光特性的前驱体，然后连接亲电识别基团2-氟-5-硝基苯甲酸酯所得。
进一步的，包括如下步骤：
(1)将前体化合物、2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈、碱性化合物和第一有机溶剂混合，在保护气氛下进行Knoevenagel反应，得到中间化合物；
(2)将所述中间化合物与2-氟-5-硝基苯甲酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到所述比率型多硫化氢荧光探针；
所述前体化合物为
Figure BDA0003204974000000031
时，所述中间化合物为
Figure BDA0003204974000000032
所述前体化合物为
Figure BDA0003204974000000033
时，所述中间化合物为
Figure BDA0003204974000000034
所述前体化合物为
Figure BDA0003204974000000035
时，所述中间化合物为
Figure BDA0003204974000000036
进一步的，所述碱性化合物为哌啶或吡啶；所述第一有机溶剂为无水乙醇，所述第二有机溶剂为无水二氯甲烷。
进一步的，所述步骤(1)反应的温度为60～100℃；反应时间为5～12个小时，优选为10～12小时。所述反应温度能够保证中间化合物产率达到85％。所述反应时间过短不能够实现所述荧光探针85％的产率，时间过长会生成副产物。
进一步的，所述前体化合物、所述2-氟-5-硝基苯甲酸、所述二环己基碳二亚胺和所述4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：(1-2.5)：(1-2)：(0.1-0.5)，优选为1：2：1.5：0.2；所述中间化合物、所述2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈和所述碱性化合物的摩尔比为1：1：0.5。采用上述比例制备的所述荧光探针产率高，可达83％。
进一步的，所述步骤(1)的Knoevenagel反应完成后，还包括将所得产物进行后处理的步骤，所述后处理包括以下步骤：
将反应后的液态混合物浓缩，得到浓缩物；
将所述浓缩物进行柱层析，得到所述中间化合物。
本发明还提供所述的比率型多硫化氢荧光探针在生物体内多硫化氢的定性或定量检测中的应用。
进一步的，包括如下步骤：将待测样品加入到比率型多硫化氢荧光探针溶液中，然后目测颜色变化和/或测试紫外吸收变化。
进一步的，所述比率型多硫化氢荧光探针溶液为比率型多硫化氢荧光探针与水和有机溶剂的混合溶液。
进一步的，所述水和所述有机溶剂的体积比为99.5：5～99：10。在上述测试条件的参数范围内，所述探针对多硫化氢有明显的检测识别效果，而在所述参数范围之外的测试条件下，所述探针对多硫化氢则无明显检测识别效果。
进一步的，所述有机溶剂为二甲基亚砜。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
(1)本发明的比率型多硫化氢荧光探针具有聚集诱导发光特性，在聚集态时能发出较强的荧光，避免了大量弱荧光和自身荧光中断。
(2)本发明的比率型多硫化氢荧光探针响应时间短、速度快，仅为2min。
(3)本发明的比率型多硫化氢荧光探针通过两个不同发射波长的荧光强度的比率变化进行自校正，可以有效避免传统荧光分子在高浓度下荧光猝灭或单一波长荧光强度易受浓度、温度、pH值及仪器等外界因素干扰的缺点，有效提高了检测的准确性和分辨率。
(4)本发明的比率型多硫化氢荧光探针可以在一定浓度范围内对溶液中的多硫化氢实现比率型线性响应，能够定量检测细胞和活体内的多硫化氢。
(5)本发明的比率型多硫化氢荧光探针的制备合成原料易得，步骤简单，容易操作，荧光探针的产率可达到83％，适合工业化生产。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明的比率型多硫化氢荧光探针的工作原理图；
图2为5μM的TCFPB-H2Sn在不同浓度的多硫化氢存在条件下孵化不同时间后619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值变化图；
图3为5μM的TCFPB-H2Sn溶液中加入不同浓度多硫化氢孵化后荧光发射光谱的变化图；
图4为5μM的TCFPB-H2Sn溶液在619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值与多硫化氢浓度的线性曲线图；
图5为5μM的TCFPB-H2Sn溶液619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值随不同pH值变化图；
图6为5μM的TCFPB-H2Sn溶液中分别加入不同竞争分子后619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值变化图；
图7为5μM的TCFPB-H2Sn与HeLa细胞37℃下孵化20min后的激光共聚焦显微成像照片；
图8为细胞中绿色通道荧光强度与红色通道荧光强度的比值随不同多硫化氢浓度的变化图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明提供一种比率型多硫化氢荧光探针，其结构式如式(I)所示。
Figure BDA0003204974000000061
其中，R为
Figure BDA0003204974000000062
中的任意一种。
本发明还提供所述荧光探针的制备方法，所述荧光探针以2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈与前体化合物反应得到具有聚集诱导发光特性的前驱体，然后连接亲电识别基团2-氟-5-硝基苯甲酸酯所得，亲电识别基团2-氟-5-硝基苯甲酸酯为多硫化氢识别单元。
包括如下步骤：
(1)将前体化合物、2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈、碱性化合物和第一有机溶剂混合，在保护气氛下进行Knoevenagel反应，将所得产物进行后处理，将反应后的液态混合物浓缩，得到浓缩物；将所述浓缩物进行柱层析，得到中间化合物。反应的温度为60～100℃；反应时间为5～12个小时，优选为10～12小时。所述碱性化合物为哌啶或吡啶；所述第一有机溶剂为无水乙醇。所述前体化合物、所述2-氟-5-硝基苯甲酸、所述二环己基碳二亚胺和所述4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：(1-2.5)：(1-2)：(0.1-0.5)，优选为1：2：1.5：0.2。
(2)将所述中间化合物与2-氟-5-硝基苯甲酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到所述比率型多硫化氢荧光探针；所述第二有机溶剂为无水二氯甲烷。所述中间化合物、所述2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈和所述碱性化合物的摩尔比为1：1：0.5。
所述前体化合物为
Figure BDA0003204974000000071
时，所述中间化合物为
Figure BDA0003204974000000072
所述前体化合物为
Figure BDA0003204974000000073
时，所述中间化合物为
Figure BDA0003204974000000074
所述前体化合物为
Figure BDA0003204974000000081
时，所述中间化合物为
Figure BDA0003204974000000082
实施例1本发明的多硫化氢荧光探针(TCFPB-H2Sn)的制备
本实施例采用两步法制备，前体化合物为4-(二乙氨基)水杨醛，按照如下路线进行制备：
Figure BDA0003204974000000083
具体工艺为：
(1)在氮气保护下，准确称取199mg的4-(二乙氨基)水杨醛(前体化合物)和231mg的2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈溶于6mL无水乙醇，再往反应液中滴加28μL哌啶，在75℃回流搅拌过夜，当TLC监测反应已不再进行时停止反应，减压蒸馏除去溶剂，并经柱层析分离提纯，真空干燥后得到紫色固体318mg，即为中间化合物，产率为85％。
(2)在氮气保护下，先准确称取93mg的2-氟-5-硝基苯甲酸和100mg中间化合物溶于6mL无水二氯甲烷中，接着再称取67mg的DCC和6mg DMAP加入反应液，室温搅拌5h。TLC监测反应完全后停止反应，减压蒸馏除去溶剂，并经柱层析分离提纯，真空干燥后得到紫色固体121mg，即为目标产物TCFPB-H2Sn，产率为83％。
实施例2中间化合物的鉴定
对实施例1制备得到的紫色中间化合物进行核磁分析，核磁型号为Bruker AVANCE400，测试条件为室温，核磁共振数据为：
1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.87(s,1H),8.24(s,1H),7.70(d,J＝9.2Hz,1H),6.94(d,J＝15.2Hz,1H),6.45(dd,J＝9.3,2.4Hz,1H),6.15(d,J＝2.4Hz,1H),3.46(q,J＝7.1Hz,4H),1.70(s,6H),1.16(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ177.97,175.75,162.69,154.55,114.55,113.67,113.30,112.47,107.25,97.67,96.93,49.26,45.04,26.43,13.14。
对实施例1制备得到的紫色中间化合物进行质谱分析，质谱分析仪的设备型号为Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer，测试条件为室温，紫色中间化合物的高分辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculated for C22H22N4O2Na:[[M+Na]＝397.16405；found:397.16354。说明中间化合物成功制备。
实施例3本发明的多硫化氢荧光探针的的鉴定
对实施例1制备得到的紫色化合物TCFPB-H2Sn进行核磁分析，紫色化合物TCFPB-H2Sn即为本发明的多硫化氢荧光探针。核磁型号为Bruker AVANCE 400，测试条件为室温。通过核磁共振对所得产物进行表征，可知本实施例制备得到的比率型多硫化氢荧光探针的结构式为
Figure BDA0003204974000000091
核磁共振数据为：1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.87(dd,J＝5.9,2.9Hz,1H),8.65(dd,J＝8.0,4.2Hz,1H),8.15-8.07(m,2H),7.77(t,J＝9.5Hz,1H),6.97-6.83(m,3H),3.52(q,J＝7.0Hz,4H),1.67(s,6H),1.17(t,J＝7.0Hz,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ178.08,175.71,166.68,164.00,153.26,153.19,144.15,141.90,131.85,131.65,128.56,119.98,119.73,114.21,113.82,112.89,111.35,109.87,105.89,98.86,91.85,51.84,45.00,25.51,13.01.
对实施例1制备得到的紫色化合物TCFPB-H2Sn进行质谱分析，质谱分析仪的设备型号为Orbitrap Fusion Tribrid mass spectrometer，测试条件为室温，紫色化合物TCFPB-H2Sn的高分辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculated for C29H24N5O5FNa:[M+Na]＝564.16592；found:564.16553。以上结果表明本发明的多硫化氢荧光探针成功制备。
实施例4本发明的多硫化氢荧光探针的制备和鉴定
其他条件和实施例1相同，仅将前体化合物替换为
Figure BDA0003204974000000101
可得到中间化合物
Figure BDA0003204974000000102
所述中间化合物的核磁共振数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3-d)δ7.78-7.70(m,4H),6.92(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),6.85(d,J＝2.0Hz,2H),6.70(s,1H),2.89(s,9H),1.48(s,9H)；13C NMR(101MHz,CDCl3-d)δ156.21,149.45,142.05,135.31,135.23,132.41,129.16,128.84,126.02,116.15,115.61,114.73,102.89,101.50,78.77,40.35,27.22。所述中间化合物的高分辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculated for C20H18N4O2Na:[[M+Na]＝369.13275；found:369.13254。以上结果表明中间化合物成功制备。
通过核磁共振对所得产物进行表征，可知本实施例制备得到的比率型多硫化氢荧光探针的结构式为
Figure BDA0003204974000000111
所述荧光探针的核磁共振数据为：1H NMR(400MHz,CDCl3-d)δ8.66(d,J＝2.0Hz,2H),8.24(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),7.56(dd,J＝7.5,1.1Hz,2H),7.43-7.36(m,4H),7.24(d,J＝2.0Hz,2H),7.18(s,1H),6.96(dd,J＝7.5,2.0Hz,2H),2.93(s,9H),1.49(s,9H).；13C NMR(101MHz,CDCl3-d)δ164.96,159.74,156.78,143.93,141.65,141.37,137.21,135.85,129.04,127.64,127.03,126.58,125.72,124.53,118.25,115.62,114.97,114.95,114.13,103.96,88.49,81.67,40.52,27.64。所述荧光探针的高分辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculated for C27H20FN5O5Na:[[M+Na]＝536.13462；found:536.13496。以上结果表明本发明的多硫化氢荧光探针成功制备。
实施例5本发明的多硫化氢荧光探针的制备和鉴定
其他条件和实施例1相同，仅将前体化合物替换为
Figure BDA0003204974000000112
可得到中间化合物
Figure BDA0003204974000000113
所述中间化合物的核磁共振数据为1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.79(s,1H),8.44(s,1H),7.46(s,1H),6.72(d,J＝14.2Hz,1H),3.41-3.34(m,4H),2.66(t,J＝6.2Hz,2H),2.58(d,J＝12.8Hz,2H),1.84(p,J＝6.1Hz,4H),1.66(s,6H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ177.98,173.70,157.58,151.49,118.01,115.12,114.22,114.12,113.99,106.62,97.01,50.76,49.96,47.28,27.08,26.53,21.43,21.02,20.40。所述中间化合物的高分辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculated for C24H23N4O2:[[M+H]+＝399.18155；found:399.18167。以上结果表明中间化合物成功制备。
通过核磁共振对所得产物进行表征，可知本实施例制备得到的比率型多硫化氢荧光探针的结构式为
Figure BDA0003204974000000121
所述荧光探针的核磁共振数据为1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.86(dd,J＝6.1,3.0Hz,1H),8.70-8.61(m,1H),8.13(d,J＝15.5Hz,1H),7.83-7.73(m,2H),6.85(d,J＝15.6Hz,1H),3.43(s,4H),2.79(t,J＝6.2Hz,4H),1.96-1.83(m,4H),1.63(s,6H).13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ178.22,174.96,149.57,148.59,141.93,132.21,127.50,121.21,114.18,113.91,113.35,113.21,108.53,98.47,89.17,50.58,50.37,49.72,25.56,21.27,20.89,20.03。高分辨质谱分析结果为：HRMS m/z calculatedfor C31H24FN5O5Na:[[M+Na]＝588.16592；found:588.16570。以上结果表明本发明的多硫化氢荧光探针成功制备。
实施例6本发明的比率型多硫化氢探针(TCFPB-H2Sn)的性能测试
以实施例1制备的荧光探针为测试对象，具体步骤如下：
(1)比率型多硫化氢探针的响应时间测定：在2mL 95％PBS/DMSO混合溶液(pH值为7.4)中加入10μLTCFPB-H2Sn的DMSO溶液(1mM)得到5μM的TCFPB-H2Sn溶液，然后分别加入5μM、10μM和20μM的多硫化钠溶液，所得混合溶液在37℃下孵化不同的时间(30s、60s、90s、120s、180s、210s、140s、270s、300s)，测定所述混合溶液的619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值随孵化时间的变化情况。
图2为TCFPB-H2Sn在不同浓度的多硫化氢存在条件下在95％PBS/DMSO混合溶液中孵化不同时间后619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值变化图，由图2可知，在37℃下孵化2min后，荧光强度基本达到饱和，这说明多硫化氢探针响应较快，仅为2min。
(2)多硫化氢探针的荧光滴定测试：在2mL 95％PBS/DMSO混合溶液(pH值为7.4)中加入10μL TCFPB-H2Sn的DMSO溶液(1mM)，得到5μM的TCFPB-H2Sn溶液，然后分别加入不同浓度的多硫化钠溶液(浓度范围为0～250μM)，在37℃下孵化5min后，测定加入不同浓度多硫化氢后所得溶液的荧光发射光谱(Ex＝575nm)，并以619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值为纵坐标、多硫化氢的浓度为横坐标建立TCFPB-H2Sn对多硫化氢检测的线性曲线。
图3为在5μM的TCFPB-H2Sn溶液中加入不同浓度多硫化氢孵化后荧光发射光谱的变化图；根据图3可以看出，随着多硫化氢浓度的增大，619nm处荧光强度逐渐增强，而751nm处荧光强度逐渐下降。
图4为TCFPB-H2Sn溶液在619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值与多硫化氢浓度的线性曲线图，所述线性曲线具体为Y＝0.04682X+0.36183，荧光强度对于一氧化碳的浓度的线性响应在1～30μM(R2＝99.3％)之间。由图4可以看出，荧光探针TCFPB-H2Sn可以在一定浓度范围内对溶液中的多硫化氢实现比率型线性响应。
(3)一多硫化氢探针对pH的敏感性测定：在2mL 95％PBS/DMSO混合溶液(pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)中加入10μL TCFPB-H2Sn的DMSO溶液(1mM)，得到5μL TCFPB-H2Sn溶液，然后加入50μM的多硫化钠溶液，所得混合溶液在37℃下孵化5min后，测定所述混合溶液在619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值随PBS缓冲溶液pH值的变化情况。
图5为TCFPB-H2Sn在不同pH值的PBS/DMSO混合溶液619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值变化图，由图5可知，探针TCFPB-H2Sn本身具有很好的pH稳定性，对pH值不敏感，探针TCFPB-H2Sn对多硫化氢的响应在pH值为6.0～10.0范围内具有很好的响应能力。
多硫化氢探针的选择性测试：在2mL 95％PBS/DMSO混合溶液(pH值为7.4)中加入10μL TCFPB-H2Sn的DMSO溶液(1mM)，得到5μM的TCFPB-H2Sn溶液，分别加入250μM的其他离子，其中a:S2O5 2-；b:ClO-；c:H2O2；d:MnO4 -；e:Mg2+；f:K+；g:Cys；h:Fe3+；i:H2S；j:HSO3-；k:SO4 2-；l:HCy；m:I-；n:OH；o:ATP；p:S2O8 2-；q:GSH；r:NO3 -；s:blank；t:Na2S4。所得混合溶液分别在37℃下孵化5min，然后测定混合溶液619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值的变化。
图6为TCFPB-H2Sn溶液中分别加入不同竞争分子后619nm处荧光强度与751nm处荧光强度的比值变化图，由图6可知，除H2Sn外的其它生物分子与TCFPB-H2Sn反应前后的荧光强度比值均没有明显变化，说明TCFPB-H2Sn可以选择性的识别H2Sn，不易受其他离子的干扰，特异型强。
实施例7本发明的多硫化氢荧光探针定性和定量检测细胞内的多硫化氢
对人宫颈癌细胞(HeLa)内多硫化氢荧光成像情况进行测试，使用实施例1制备的荧光探针，具体步骤如下：
HeLa细胞经过复苏接种于含10％胎牛血清的RPMI 1640培养基中，在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养，然后在18mm盖玻片上培养24h，待用。
将培养后的HeLa细胞浸入含5μM TCFPB-H2Sn(实施例1制备得到)的培养基中，在37℃、5％CO2、100％饱和湿度的培养箱中培养20min后，倒出培养基，用新鲜培养基清洗细胞3遍；加入2mL PBS溶液，实验组分别加入10μM、20μM、50μM的多硫化钠，在激光共聚焦荧光显微镜下观察，并用561nm作为激发光源，对其进行明场和暗场下拍照。
图7为TCFPB-H2Sn与HeLa细胞37℃下孵化5min后的激光共聚焦显微成像照片，由图7可知，TCFPB-H2Sn在HeLa细胞中，不管是红光通道还是绿光通道都呈现弱的荧光信号，而在加入了多硫化氢的HeLa细胞中，红光通道荧光信号基本逐渐减弱，而绿光通道的荧光信号明显增强。
图8为细胞中绿色通道荧光强度与红色通道荧光强度的比值随不同多硫化氢浓度的变化图，可见TCFPB-H2Sn对细胞内多硫化氢的成像呈现浓度依赖关系，说明TCFPB-H2Sn可以对细胞内多硫化氢进行比率型荧光成像。本发明的多硫化氢荧光探针不仅能对细胞和活体内的多硫化氢进行定性检测，还可以实现定量的检测。
按照实施例6～7的方法对实施例4和实施例5所得比率型多硫化氢荧光探针进行响应时间、荧光滴定、pH敏感性、选择性和人宫颈癌细胞内成像情况进行测试，所得结果和实施例6～7相似。
综合以上实施例，本发明提供的比率型多硫化氢荧光探针具有聚集诱导发光特性和比率型响应特性，且响应时间短，对pH值不敏感，能够定性和定量检测细胞内的多硫化氢，且能够通过两个不同发射波长的荧光强度比率进行响应和细胞成像，可有效避免单一波长易受温度、pH、浓度及仪器等外界因素的干扰，获得更高的成像分辨率，且制备原料易得，步骤简单，容易操作，产率高，适合工业化生产，具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (12)

1.一种比率型多硫化氢荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式如式(I)所示：
Figure FDA0003204973990000011
其中，R为
Figure FDA0003204973990000012
中的任意一种。
2.权利要求1所述的比率型多硫化氢荧光探针的制备方法，其特征在于，所述荧光探针以2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈与前体化合物反应得到具有聚集诱导发光特性的前驱体，然后连接亲电识别基团2-氟-5-硝基苯甲酸酯所得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将所述前体化合物、所述2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈、碱性化合物和第一有机溶剂混合，在保护气氛下进行Knoevenagel反应，得到中间化合物；
(2)将所述中间化合物与所述2-氟-5-硝基苯甲酸、二环己基碳二亚胺、4-二甲氨基吡啶和第二有机溶剂混合，在保护气氛下进行缩合反应，得到所述比率型多硫化氢荧光探针；
所述前体化合物为
Figure FDA0003204973990000021
时，所述中间化合物为
Figure FDA0003204973990000022
所述前体化合物为
Figure FDA0003204973990000023
时，所述中间化合物为
Figure FDA0003204973990000024
所述前体化合物为
Figure FDA0003204973990000025
时，所述中间化合物为
Figure FDA0003204973990000026
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述碱性化合物为哌啶或吡啶；所述第一有机溶剂为无水乙醇；所述第二有机溶剂为无水二氯甲烷。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)反应的温度为60～100℃；反应时间为5～12个小时，优选为10～12小时。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述前体化合物、所述2-氟-5-硝基苯甲酸、所述二环己基碳二亚胺和所述4-二甲氨基吡啶的摩尔比为1：(1-2.5)：(1-2)：(0.1-0.5)，优选为1：2：1.5：0.2；
所述中间化合物、所述2-(3-氰基-4,5,5-三甲基呋喃-2(5H)-亚甲基)丙二腈和所述碱性化合物的摩尔比为1：1：0.5。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)的Knoevenagel反应完成后，还包括将所得产物进行后处理的步骤，所述后处理包括以下步骤：
将反应后的液态混合物浓缩，得到浓缩物；
将所述浓缩物进行柱层析，得到所述中间化合物。
8.权利要求1所述的比率型多硫化氢荧光探针在生物体内多硫化氢的定性或定量检测中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：
将待测样品加入到比率型多硫化氢荧光探针溶液中，然后目测颜色变化和/或测试紫外吸收变化。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述比率型多硫化氢荧光探针溶液为比率型多硫化氢荧光探针与水和有机溶剂的混合溶液。
11.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述水和所述有机溶剂的体积比为99.5：5～99：10。
12.根据权利要求10所述的应用，其特征在于，所述有机溶剂为二甲基亚砜。
CN202110914509.7A 2021-08-10 2021-08-10 一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用 Active CN113582950B (zh)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110914509.7A CN113582950B (zh) 2021-08-10 2021-08-10 一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用
PCT/CN2021/137297 WO2023015795A1 (zh) 2021-08-10 2021-12-12 一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110914509.7A CN113582950B (zh) 2021-08-10 2021-08-10 一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113582950A true CN113582950A (zh) 2021-11-02
CN113582950B CN113582950B (zh) 2022-07-29

Family

ID=78256839

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110914509.7A Active CN113582950B (zh) 2021-08-10 2021-08-10 一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN113582950B (zh)
WO (1) WO2023015795A1 (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023015795A1 (zh) * 2021-08-10 2023-02-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107188876A (zh) * 2017-04-10 2017-09-22 台州学院 一种用于检测多硫化氢的近红外荧光探针的合成及应用
CN112159377A (zh) * 2019-12-11 2021-01-01 渤海大学 一种近红外发射同时识别h2s、hso3-的荧光探针及其应用

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104610774B (zh) * 2009-08-24 2017-07-18 独立行政法人情报通信研究机构 二阶非线性光学化合物及含有它的非线性光学元件
CN110511742A (zh) * 2019-09-04 2019-11-29 中南大学 一种特异性识别多硫化氢的近红外荧光探针
CN113582950B (zh) * 2021-08-10 2022-07-29 中国科学院深圳先进技术研究院 一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107188876A (zh) * 2017-04-10 2017-09-22 台州学院 一种用于检测多硫化氢的近红外荧光探针的合成及应用
CN112159377A (zh) * 2019-12-11 2021-01-01 渤海大学 一种近红外发射同时识别h2s、hso3-的荧光探针及其应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNBIN LI等: "An easily available ratiometric AIE probe for nitroxyl visualization in vitro and in vivo", 《MATERIALS CHEMISTRY FRONTIERS 》 *
CHUNRONG LIU等: "Rational Design and Bioimaging Applications of Highly Selective Fluorescence Probes for Hydrogen Polysulfides", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 *
KELI ZHONG: "A colorimetric and near-infrared fluorescent probe for detection of hydrogen sul fide and its real multiple applications", 《SPECTROCHIMICA ACTA PART A: MOLECULAR AND BIOMOLECULAR》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023015795A1 (zh) * 2021-08-10 2023-02-16 中国科学院深圳先进技术研究院 一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113582950B (zh) 2022-07-29
WO2023015795A1 (zh) 2023-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Peng et al. A novel fluorescent probe for selective detection of hydrogen sulfide in living cells
CN108484622B (zh) 多信号荧光探针的合成及其同时区分检测Hcy、Cys和GSH的应用
CN108844931B (zh) Lzq荧光探针在同时检测so2衍生物和hsa中的应用
CN113121520B (zh) 一种具有aie+esipt+ict机制的荧光染料和荧光探针及其制备方法与应用
CN105017196A (zh) 一种检测肼的近红外比率荧光探针及其应用
CN111285833A (zh) 一种检测onoo-的比率型荧光分子探针及其制备方法和应用
CN109942508B (zh) 一种比率型一氧化碳荧光探针及其制备方法和应用
CN113582950B (zh) 一种比率型多硫化氢荧光探针及其制备方法和应用
Wu et al. A near-infrared fluorescent probe of dicyanoisophorone derivatives for selective detection and fluorescence cellular imaging of Palladium
CN111349071A (zh) 一种用于检测onoo-的氧杂蒽衍生物及其合成方法和应用
CN110386898B (zh) 一种喹啉环类衍生物荧光探针及其制备方法和应用
CN111635388B (zh) 基于芘和香豆素衍生物的亚硫酸氢根荧光探针、制备方法及应用
CN109734710A (zh) 一种检测半胱氨酸的荧光探针及其合成方法与应用
CN111662279B (zh) 一种萘取代咔唑-苯并噻唑基腙类化合物及其制备方法和用途
CN112225743B (zh) 一种喹啉基近红外罗丹明荧光染料、比率荧光探针及其合成和应用
CN108383819B (zh) 一种基于香豆素酮醛的半胱氨酸荧光探针及其制备和应用
CN114957180A (zh) 一种基于双激发波长荧光分析法识别pH值的荧光探针及其制备方法和应用
CN115073434B (zh) 一种检测肼的近红外荧光探针及其制备方法和应用
CN115433181B (zh) 基于半花菁结构的荧光探针及其制备方法和应用
CN114507204B (zh) 一种高尔基体靶向超氧阴离子荧光探针及其制备方法和应用
CN112409330B (zh) 一种新型检测Hg2+的荧光分子探针的制备方法及其在环境和生物体内的应用
CN114436957B (zh) 氰乙酸乙酯-二氢喹啉酮衍生物荧光探针及其制备方法和应用
CN113603702B (zh) 一种检测汞离子的比色/荧光探针及其制备方法与应用
CN115232098B (zh) 一种用于快速灵敏检测过氧硝酸盐的Rhodol荧光探针及其制备方法和应用
CN113004266B (zh) 一种基于苯并噻唑酚-半花菁体系的荧光探针及其制备方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant