CN106831642A - 用于检测锌离子或焦磷酸根荧光探针、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于锌离子或焦磷酸根离子荧光探针，同时提供其制备方法及应用。该荧光探针可快速响应并高选择性检测锌离子，且探针和锌离子的络合物对PPi有很好的选择性，并能够监测焦磷酸化酶催化降解PPi的反应进程，而且探针也可以检测细胞体内的锌离子和PPi。本发明的用于检测锌离子荧光探针，其具有如式L1、L2或L3所示的结构。
Description
技术领域
本发明涉及一种荧光探针、制备方法及应用，更具体地说涉及一种用于检测锌离子或焦磷酸根离子荧光探针、制备方法及应用。
背景技术
锌离子作为人体内含量仅次于铁离子的第二过渡金属离子，在人体内生理活动中扮演着重要角色，它参与许多生理活动，例如脑功能、病理学、DNA合成、免疫功能、酶活性和神经传递等过程。人体内一定含量的锌离子对人的身体健康是有益的，然而过量的锌离子可能引起某些神经方面病患，例如癫痫症、缺血性发作、帕金森氏病、幼儿腹泻、脑损伤的神经退行性等疾病。因此，探寻一种在生物体内有效的检测锌离子的方法显得尤为重要。焦磷酸根(PPi)在各种生理过程中发挥重要的作用，如代谢酶反应和生理能量转导等，PPi也与许多疾病如焦磷酸钙结晶脱水和软骨肉瘤病有一些关系。因此，PPi的选择性识别在各种生物过程中非常重要。尽管一些检测阴离子的常规方法已经被开发例如离子选择性电极法，但仍然迫切需要可以替代的检测方法。
目前用于检测锌离子和焦磷酸根(PPi)方法主要有：原子吸收光谱法、等离子体发射光谱法、电感耦合等离子体质谱法、固相微萃取-高效液相色谱法和荧光光谱法。但这些方法耗时长，响应慢，工艺复杂，而荧光光谱法能很好地克服这些缺点，所以需要研发出高选择性检测锌离子和PPi的荧光探针。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：克服现有技术存在的不足，提供用于锌离子或焦磷酸根离子荧光探针，同时提供其制备方法及应用。该荧光探针可快速响应并高选择性检测锌离子，且探针和锌离子的络合物对PPi有很好的选择性，并能够监测焦磷酸化酶催化降解PPi的反应进程，而且探针也可以检测细胞体内的锌离子和PPi。
本发明的技术构思如下：探针L1、L2和L3均可选择性与锌离子反应并伴随荧光由黄色到蓝色的变化，其中L1检测效果最佳。检测过程响应时间短，且产生的比率荧光强度与锌离子浓度线性相关。而且探针L1和锌离子结合后的络合物L1-Zn2+可再次检测焦磷酸根。本发明首次制备探针L1、L2及L3并首次将其用于选择性的检测锌离子，且L1和锌离子的络合物L1-Zn2+选择性的检测焦磷酸根，且可以用于监测酶催化裂解PPi。
本发明解决其技术问题的技术方案如下：
本发明的用于检测锌离子荧光探针，其具有如式L1、L2或L3所示的结构：
本发明上述的荧光探针可以在检测锌离子中进行应用。
本发明的用于检测焦磷酸根荧光探针，其是具有如式L1所述结构和锌离子结合后的络合物L1-Zn2+；
本发明上述的荧光探针可以在检测焦磷酸根中进行应用。
本发明上述用于检测锌离子荧光探针的制备方法，其包括以下步骤：
将2-氨基苯硫酚、5-甲基水杨醛和焦亚硫酸钠溶解在DMF中反应得到化合物3，再将化合物3和乌洛托品在三氟乙酸中经过醛基化反应得到化合物2，然后化合物2分别和三(羟基甲基)氨基甲烷、2-氨基-1,3-丙二醇或乙醇胺在乙醇中反应，得到最终产物探针L1、L2或L3。
本发明上述的制备方法，其进一步的技术方案是所述的反应生成化合物3时其反应条件为100℃-120℃下回流反应12小时或以上；所述的反应生成化合物2时其反应条件为90℃-110℃下回流反应5小时或以上；所述的反应得到探针L1、L2或L3其反应条件均为70℃-90℃下回流5小时或以上。
本发明上述的制备方法，其更进一步的技术方案是包括以下步骤:
所述的反应生成化合物3其反应结束后先在反应产物里加入去离子水，沉淀过滤，水洗并干燥，最后经硅胶柱纯化所得产物即为化合物3；
所述的反应生成化合物2其反应结束后在反应产物里加入稀盐酸，用二氯甲烷萃取，并用饱和食盐水水洗，减压蒸干有机相，用二氯甲烷作洗脱剂，经硅胶柱纯化粗产品后，得到的产物即为化合物2；
所述的反应得到探针L1、L2或L3其反应结束后冷却，过滤沉淀，然后在甲醇中重结晶，得到的产物即为探针L1、L2或L3。
本发明上述的制备方法，其进一步的技术方案还可以是所述的2-氨基苯硫酚、5-甲基水杨醛与焦亚硫酸钠的用量质量比为：1:1.1-1.2:1.3-1.5；所述的化合物3与乌洛托品的用量质量比为：1:1.1-1.2；所述的化合物2与三(羟基甲基)氨基甲烷的用量质量比为：2.2-2.3:1；所述的化合物2与2-氨基-1,3-丙二醇的用量质量比为：2.9-3:1；所述的化合物2与乙醇胺的用量质量比为：4.3-4.5:1。
本发明具有以下有益效果：
1)本发明中的三种荧光探针本身均为黄色荧光，当分别与锌离子反应后，荧光由黄色变为蓝色，且焦磷酸根加入到探针L1和锌离子络合物L1-Zn2+后荧光发生由蓝色到黄色的改变。
2)采用本发明的荧光探针后，检测灵敏度高，探针L1对锌离子的检测限可达10-9M，且L1-Zn2+对焦磷酸根的检测限可达10-8M。
3)本发明荧光探针仅与锌离子发生荧光反应，对其他金属离子均无反应，具有很好的选择性和特异性。而且探针L1和锌离子络合物L1-Zn2+对焦磷酸根有很好的选择性，且可以用于监测焦磷酸化酶催化裂解PPi的反应进程。
4)本发明荧光探针制备工艺简单易行，易于规模化生产。
附图说明
图1为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L1纯品的1H NMR图。
图2为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L1纯品的高分辨质谱图。
图3为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L2纯品的1H NMR图。
图4为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L2纯品的高分辨质谱图。
图5为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L3纯品的1H NMR图。
图6为本发明实施例Ⅰ-1制得荧光探针L3纯品的高分辨质谱图。
图7为本发明实施例Ⅰ-2荧光探针L1、L2和L3与各种金属离子反应的荧光发射光谱。
图8为本发明实施例Ⅰ-3荧光探针L1与锌离子反应的荧光增量图。
图9为本发明实施例Ⅰ-3荧光探针L1对锌离子浓度的荧光强度工作曲线。
图10为本发明实施例Ⅱ-1荧光探针L1和锌离子络合物的L1-Zn2+对PPi以及其他阴离子的反应的荧光发射光谱。
图11为本发明实施例Ⅱ-2荧光探针L1和锌离子络合物的L1-Zn2+与PPi反应荧光增量图。
图12为本发明实施例Ⅱ-2荧光探针L1和锌离子的络合物L1-Zn2+对PPi浓度的荧光强度工作曲线。
图13为本发明实施例Ⅱ-3荧光探针L1和锌离子络合物的L1-Zn2+监测焦磷酸化酶催化降解PPi的动态曲线图。
图14为本发明实施例Ⅱ-4荧光探针L1在细胞内检测锌离子和PPi的共聚焦显微镜成像图。
具体实施方式
下面参照附图并结合实施例Ⅰ，Ⅱ对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。
实施例Ⅰ-1制备检测锌离子的探针L1、L2和L3
将5g(36.7mmol)5-甲基水杨醛、4.6g(36.7mmol)2-氨基苯硫酚和6g(31.6mmol)焦亚硫酸钠溶于100mL N,N-二甲基甲酰胺溶液中，在110℃下回流一夜，通过TLC监控反应进程。反应完成后200mL去离子水加入反应液中，产生白色沉淀，粗产物用二氯甲烷作为洗脱剂，通过层析柱进一步纯化，最终得到8g化合物3；将4g(16.6mmol)化合物3和4.5g(32.14mmol)乌洛托品溶于50mL三氟乙酸中，100℃下回流五小时。反应完成后加入200mL(4M)盐酸继续搅拌2小时。之后反应混合物用二氯甲烷萃取，有机相用饱和食盐水洗后，用无水硫酸钠干燥，过滤，减压蒸干溶剂得到粗产品，进一步用二氯甲烷做洗脱剂经层析柱纯化，最终得到4.5g纯净的化合物2。
将1g(3.72mmol)化合物2和0.45g(3.72mmol)三(羟基甲基)氨基甲烷溶于40mL乙醇溶液中，在80℃下回流三小时。反应完成后，冷却至室温，固体析出，过滤沉淀物，并在真空下干燥。粗产物进一步在甲醇中重结晶，真空干燥，最终得到纯化的目标产物L11.05g,，即为探针L1纯品(1HNMR图和高分辨质谱图见图1，图2)。所得荧光探针纯品实测分子量为372。
将0.2g(0.74mmol)化合物2和0.068g(0.74mmol)2-氨基-1,3-丙二醇溶于15mL乙醇中，在80℃下回流三小时。反应完成后，冷却室温，析出沉淀，过滤，真空干燥，进一步在甲醇中重结晶，最终得到0.177g纯净的L2，即为探针L2纯品(1HNMR图和高分辨质谱图见图3，图4)。所得荧光探针纯品实测分子量为364。
将0.2g(0.74mmol)化合物2和0.046g(0.74mmol)乙醇胺溶解于15mL乙醇中，80℃下回流三小时。反应完成后，混合液冷却室温，析出沉淀，过滤，干燥，进一步在甲醇中重结晶，最终得到0.18g的L3，即为探针L2纯品(1HNMR图和高分辨质谱图见图5，图6)。所得荧光探针纯品实测分子量为334。
本实施例工艺路线：
实施例Ⅰ-2制得锌离子荧光探针与各种金属离子的光谱性质
称取3mg实施例Ⅰ-1制得锌离子荧光探针，配成浓度为1mM的10mL DMSO溶液，作为母液。
荧光光谱测试：将30μL上述母液加入到一定量的HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，然后分别加入各种金属离子：Cr3+，Ag+，Cu2+，Li+，Fe2+，Zn2+，Eu3+，Co2+，Hg2+，Zr4+，Cs2+，K+，Na+，Cd2+，Fe3+，Mg2+，Ni2+，Mn2+，Al3+，Ca2+之一，使每个金属离子的终浓度为100μM，荧光探针终浓度为10μM。在417nm激发光波长下测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为5nm：5nm。所得结果如图3所示。
以上结果表明：
实施例Ⅰ-1制得荧光探针本身在543nm处有一个发生峰，表现为黄色荧光，但随锌离子的加入，该探针在475nm处出现新的发射峰，表现为蓝色荧光。
实施例Ⅰ-3制得锌离子荧光探针与锌离子反应的光谱性质
将30μL实施例Ⅰ-2中的母液加入到一定量的HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，然后加入不同当量的锌离子溶液，使荧光探针的终浓度为10μM，锌离子终浓度分别为0μM,1μM，2μM，3μM，4μM，5μM，6μM，7μM，8μM，9μM，10μM。锌离子加入后即刻测量其荧光发射光谱。在417nm激发光波长下测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为5nm：5nm。所得荧光增量图见图5；以荧光强度比率(I475nm/I543nm)和锌离子的浓度关系数据制作工作曲线，结果见图6。
该实验结果表明，荧光强度比率(I475nm/I543nm)随锌离子浓度的增加而增加；且荧光强度比率(I475nm/I543nm)与0-10μM范围内的锌离子浓度呈线性关系，可以用于锌离子的定量检测。
实施例Ⅱ-1制得焦磷酸根离子荧光探针与各种阴离子的光谱性质
称取3mg实施例Ⅰ-1制得锌离子荧光探针L1，配成浓度为4mM的DMSO溶液，之后加入2个当量的高氯酸锌溶液使得最终的络合物L1-Zn2+浓度为2mM，作为母液。
荧光光谱测试：将30μL上述母液加入到一定量的HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，然后分别加入各种阴离子：PPi,HPO4 2-,H2PO4 -,PO4 3-,CH3COO-,SO4 2-,CO4 2-,F-,Cl-,Br-，I-之一，使每个阴离子终浓度为40μM，荧光探针终浓度为20μM。阴离子加入后，在417nm激发光波长下测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为5nm。所得结果如图10所示。
以上结果表明：
(1)实施例Ⅱ-1制得络合物L1-Zn2+本身在475nm处有一个发射峰表现为蓝色荧光，但随PPi的加入，该络合物L1-Zn2+在543nm处产生新的发射峰，荧光变为黄色。
(2)实施例Ⅱ-1制得荧光探针对PPi具有高度的选择性和特异性。
实施例Ⅱ-2制得PPi荧光探针与PPi反应的光谱性质
将30μL实施例Ⅱ-1中的母液加入到一定量的HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，然后加入不同当量的焦磷酸根离子溶液，使荧光探针的终浓度为20μM，PPi终浓度分别为0μM,2μM，4μM，6μM，8μM，10μM，12μM，14μM，16μM，18μM，20μM。阴离子加入后，在417nm激发光波长下测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为5nm。所得荧光增量图见图12；荧光强度比率(I543nm/I475nm)和锌离子的浓度关系数据制作工作曲线，结果见图6。
该实验结果表明，荧光强度比率(I543nm/I475nm)随PPi浓度的增加而增加；当采用终浓度20μM的荧光探针时，反应后荧光强度与0-60μM范围内的PPi浓度呈线性关系，可以用于PPi的定量检测。
实施例Ⅱ-3制得焦磷酸根荧光探针对焦磷酸化酶催化裂解PPi的监测
将30μL实施例Ⅱ-1中的母液加入到一定量的的HEPES缓冲液(10mM，pH＝7.4)中，然后加入10个当量的PPi，氯钯酸氨，使L1-Zn2+的终浓度为20μM，PPi的终浓度为200μM。焦磷酸化酶首先在37℃下孵化5分钟，然后在如下不同的催化体系下监测反应进程：(1)只有40μM的Mg2+存在；(2)只有20units的焦磷酸化酶存在；(3)40μM的Mg2+和20units的焦磷酸化酶同时存在。417nm激发光波长下测试其荧光发射光谱。激发与发射的狭缝宽度为5nm。
该实验结果表明：实施例Ⅱ-1制得焦磷酸根荧光探针只有Mg2+和焦磷酸化酶同时存在下，荧光强度比率(I475nm/I543nm)随着时间的增加在5分钟开始增加，并在40分钟后达到稳定，说明焦磷酸化酶已经催化裂解PPi完全，L1-Zn2+可用于监测焦磷酸化酶裂解PPi反应进程。因此除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。
实施例Ⅱ-4制得焦磷酸根荧光探针对细胞体内锌离子和PPi的检测
海拉细胞先在含有10μM L1中培养10分钟，通过蓝色和绿色两个通道观察荧光成像，再用100μM Zn(ClO4)2培养10分钟，通过蓝色和绿色两个通道观察荧光成像，最后在含有100μM的PPi中培养10分钟，通过蓝色和绿色两个通道观察荧光成像。其中蓝色通道的激发波长为405nm,黄色通道的激发波长为480nm。
该实验结果表明：实施例Ⅰ-1制得锌离子荧光探针培养后的细胞，在共聚焦显微镜下观察从绿色通道可看出明显的黄色荧光，而蓝色通道几乎没有蓝色荧光；在锌离子溶液中培养后，尽管从绿色通道可以看出黄色荧光依然存在，但是蓝色通道出现明显的蓝色荧光；之后在PPi中培养后，从蓝色通道观察到蓝色荧光消失。
Claims (8)
1.一种用于检测锌离子荧光探针，其特征在于所述的探针具有如式L1、L2或L3所示的结构：
2.一种用于检测焦磷酸根荧光探针，其特征在于所述的探针是具有如式L1所述结构和锌离子结合后的络合物L1-Zn2+；
3.一种如权利要求1所述用于检测锌离子荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
将2-氨基苯硫酚、5-甲基水杨醛和焦亚硫酸钠溶解在DMF中反应得到化合物3，再将化合物3和乌洛托品在三氟乙酸中经过醛基化反应得到化合物2，然后化合物2分别和三(羟基甲基)氨基甲烷、2-氨基-1,3-丙二醇或乙醇胺在乙醇中反应，得到最终产物探针L1、L2或L3。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的反应生成化合物3时其反应条件为100℃-120℃下回流反应12小时或以上；所述的反应生成化合物2时其反应条件为90℃-110℃下回流反应5小时或以上；所述的反应得到探针L1、L2或L3其反应条件均为70℃-90℃下回流5小时或以上。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于包括以下步骤:
所述的反应生成化合物3其反应结束后先在反应产物里加入去离子水，沉淀过滤，水洗并干燥，最后经硅胶柱纯化所得产物即为化合物3；
所述的反应生成化合物2其反应结束后在反应产物里加入稀盐酸，用二氯甲烷萃取，并用饱和食盐水水洗，减压蒸干有机相，用二氯甲烷作洗脱剂，经硅胶柱纯化粗产品后，得到的产物即为化合物2；
所述的反应得到探针L1、L2或L3其反应结束后冷却，过滤沉淀，然后在甲醇中重结晶，得到的产物即为探针L1、L2或L3。
6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于：
所述的2-氨基苯硫酚、5-甲基水杨醛与焦亚硫酸钠的用量质量比为：1:1.1-1.2:1.3-1.5；
所述的化合物3与乌洛托品的用量质量比为：1:1.1-1.2；
所述的化合物2与三(羟基甲基)氨基甲烷的用量质量比为：2.2-2.3:1；
所述的化合物2与2-氨基-1,3-丙二醇的用量质量比为：2.9-3:1；
所述的化合物2与乙醇胺的用量质量比为：4.3-4.5:1。
7.一种如权利要求1所述的荧光探针在检测锌离子中的应用。
8.一种如权利要求2所述的荧光探针在检测焦磷酸根中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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