CN111269160A - 含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物及制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物及制备和应用。本发明的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物本身能发出较强的荧光，但可直接或在脱去酯基后与一氧化氮特异快速反应，生成具有弱荧光的产物，且当一氧化氮浓度降低时，被淬灭的荧光能逐渐恢复至初始水平，从而实现对一氧化氮的可逆性、实时动态检测。本发明的荧光探针稳定性好，能够长期保存使用；检测信噪比高，灵敏度好；选择性好，有良好的生物膜通透性，检测反应快速，检测响应具有可逆性，适用于溶液、细胞内、活体组织等生物体中内源性一氧化氮的实时动态观测。含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物结构式为：

Description

含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物及制备和应用
技术领域
本发明属生物检测领域，涉及一类含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物及制备和应用，是一类含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物及其制备方法，并作为检测一氧化氮的荧光探针分子的应用、在活细胞中一氧化氮动态变化的应用。
背景技术
一氧化氮(NO)是生物系统中一种重要的内源性活性氮物质，同时也是一种重要的信号分子。它在哺乳动物细胞中主要以L-精氨酸为原料，经一氧化氮合酶催化的胍基去氮化反应而产生。1977年，人们首次在血管平滑肌中发现了NO，并在1987年将其定义为内皮源性舒张因子。在过去的几十年中，随着研究深入，人们发现NO不仅在血管系统中具有重要生理意义，在免疫系统，神经系统，细胞命运等方面也具有不同的功能。NO的信号传导途径主要依赖于第二信使，鸟苷3'，5'-环一磷酸(cGMP)。生理或病理刺激下，一氧化氮合酶被激活，催化生成NO，NO结合并激活可溶性鸟苷酸环化酶(sGC)，活化的sGC催化cGMP的生成。cGMP进而作用于下游信号分子，行使信号转导。除sGC-cGMP通路，NO还通过蛋白质s-亚硝基化或s-鸟嘌呤化参与翻译后修饰，调控蛋白功能。由于NO广泛的通过调节多种生化反应而参与各种生理过程，因而NO体内稳态的改变与多种疾病的发生发展有关，例如心血管疾病，炎性疾病和癌症等。然而，NO在这些疾病中的确切病理机制仍然未知，部分原因是由于NO的扩散性和不稳定性，人们难以检测NO相关的信号传导途径。实现NO在生物系统中的实时动态检测，有助于促进人们对NO相关的生理病理机制研究。
目前，生物NO通常通过Griess法进行测定。此方法首先需将NO转换为亚硝酸盐，因而实际检测的是体系中总亚硝酸盐含量，并非直接检测NO。该方法的另一个缺点是它仅限于裂解物，不适用于活细胞或组织中NO的检测。荧光成像因能在生物原位环境中检测生物分子正逐渐成为新型高效的生物检测手段。鉴于NO在多种病理生理过程中的重要意义，目前已有多种NO探针见诸报导，且多数探针能在活细胞中检测NO。虽如此，但目前报导的探针均通过不可逆反应识别响应NO，不能可逆检测NO。由于生物NO的浓度及表达定位处于动态变化中，这些探针因而不适用于NO动态检测。发展高灵敏性、高选择性的可逆荧光探针，实现NO在生物原位环境中的动态检测，是研究NO信号通路首先需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的是提供一类含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物，结构式如式I及式II所示：
Figure BDA0002401427030000021
其中：荧光团包括但不限于萘甲酸酯、磺酰萘胺、1,8-奈二酰亚胺、氧杂嗯、氟硼二吡咯、香豆素，硅杂嗯、花青染料等；连接链包括但不限于亚甲基、氮亚甲基、半胱胺、半胱氨酸、高半胱氨酸；连接方式包括但不限于酰胺键；R为C1-C4烷基，优选为甲基。本发明中，C1-C4烷基指的是具有1至4个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基。在优选的实施方案中，本发明的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物选自下列化合物：
Figure BDA0002401427030000022
本发明的另一个目的是提供上述含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物的制备方法，通过以下步骤实现：(1)将含羧基、磺酰氯、活泼氯等基团的荧光化合物与巯基乙胺，半胱氨酸酯或高半胱氨酸酯的二硫化物反应，得到的产物经二硫苏糖醇还原，以二氯甲烷-甲醇的混合洗脱体系(0-10％甲醇)经硅胶柱层析纯化，得式I所示的含巯基荧光化合物；(2)将步骤(1)产物与酸酐反应，得如式II所示的硫酯类荧光化合物。
上述步骤(1)的反应在有机溶剂(例如二氯甲烷，或N,N-二甲基甲酰胺)中进行，上述步骤(1)中的二硫苏糖醇还原反应在醇与水的混合溶剂(例如乙醇/水、甲醇/水)中进行。上述步骤(2)在有机溶剂(例如二氯甲烷，或N,N-二甲基甲酰胺)中进行，反应完毕后加水淬灭反应，经二氯甲烷或乙酸乙酯萃取，浓缩，及以石油醚-乙酸乙酯的混合洗脱体系(0-50％乙酸乙酯)经硅胶柱层析纯化得到本发明的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物。
本发明的又一个目的是提供所述的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物在制备检测一氧化氮的荧光探针中的应用，所述一氧化氮可以是溶液、细胞内或活体组织中的一氧化氮。
本发明的又一个目的是提供所述的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物在制备动态检测一氧化氮的荧光探针中应用，所述动态检测是检测细胞中一氧化氮在实时示踪中的动态变化。
本发明的又一个目的是提供所述的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物在制备检测生物样本荧光成像的荧光探针中的应用。以活细胞中的应用为例，可通过以下步骤实现：细胞培养基中加入本发明的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物，例如使其终浓度为1～50μM，37℃下孵育15分钟，观察记录之后一段时间内细胞荧光成像强度变化。
本发明所述应用中的荧光探针，以试纸、探针溶液、试剂盒等形式存在。
本发明的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物本身发出较强的荧光，但可直接或在脱去酯基释放巯基后与一氧化氮特异性快速反应，生成具有弱荧光的产物，且荧光强度与一氧化氮浓度间存在正相关；随着一氧化氮浓度降低，被淬灭的化合物荧光会逐渐恢复，从而实现对一氧化氮的动态可逆检测。本发明的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物适用于溶液、细胞内或活体组织中中一氧化氮的实时动态观测。
本发明提供的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物具有以下有益效果：(1)作为检测一氧化氮的荧光探针分子稳定性好，能够长期保存使用；(2)荧光信号亮度高，检测信噪比高，灵敏度好；(3)具有优秀的选择性，能在复杂生物样品中特异性地检测一氧化氮；(4)具有良好的生物膜通透性，因而能用于活细胞中一氧化氮的检测；(5)检测反应快速，对水溶液中的一氧化氮，1分钟内可给出检测结果；(6)检测响应具有可逆性，信号强度会随着待检物种中一氧化氮含量的增加而减弱，随着待检物种中一氧化氮含量的降低而增强，适合生物体中内源性一氧化氮的实时示踪。
附图说明
图1是化合物I-1，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图2是化合物I-2，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图3是化合物I-3，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图4是化合物I-4，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图5是化合物I-5，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图6是化合物I-6，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图7是化合物I-7，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图8是化合物I-8，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图9是化合物I-9，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图10是化合物I-10，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图11是化合物I-11，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图12是化合物I-12，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图13是化合物I-13，及其响应半胱氨酸、高半胱氨酸、还原型谷胱甘肽、亚硫酸根、双氧水、一氧化氮(*)、亚硝酸根、硫代硫酸根、硫酸根、羟基自由基后，及响应一氧化氮后再清除溶液中一氧化氮后(**)，在最大发射波长下的荧光强度。
图14是式II-9所示化合物在Hela细胞中可逆响应NO。
图15是式II-12所示化合物在Hela细胞中可逆响应NO。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，以下的实施例不限制本发明的范围。
实施例1：I-1的制备
Figure BDA0002401427030000051
化合物1a与胱胺在干燥的二氯甲烷中，在多肽合成缩合剂(如HBTU)条件下反应。结束后，加入乙酸乙酯稀释，依此以饱和碳酸氢钠水溶液、饱和氯化铵水溶液、饱和食盐水洗涤两次，有机相无水硫酸钠干燥，旋干，以含甲醇的氯仿溶液(1％-10％甲醇，梯度洗脱)作为洗脱剂进行硅胶柱层析纯化，得1b(82％)，高分辨质谱HRMS:547.2113(M+H)+。
中间体1b以甲醇复溶，将二硫苏糖醇溶于水后加入体系，室温反应。薄层层析监测反应，结束后，旋去甲醇，以二氯甲烷萃取两次，合并有机层，无水硫酸钠干燥，旋干，以含乙酸乙酯的石油醚溶液(1％-50％乙酸乙酯，梯度洗脱)作为洗脱剂进行硅胶柱层析纯化，得I-1(88％)。高分辨质谱275.1264(M+H)+。
实施例2：I-2的制备
Figure BDA0002401427030000052
化合物2a与胱胺在干燥的二氯甲烷中，加入三乙胺，室温搅拌。反应结束够，依次加入纯水、饱和食盐水洗涤两次，有机相无水硫酸钠干燥，旋干，柱层析纯化，得2b(93％)。质谱m/z 618.15(M+H)+。
参照化合物I-1的合成,还原2b制备I-2，收率80％。高分辨质谱311.0935(M+H)+.
实施例3：I-3的制备
Figure BDA0002401427030000061
化合物3a溶于乙醇，加入胱胺，回流。反应完全后，冷却，抽滤得黄色固体3b。收率60％。质谱m/z 621.20(M+Na)+。
参照化合物I-1的合成,还原3b制备I-3，收率85％。高分辨质谱301.0989(M+H)+.
实施例4：I-4的制备
参照化合物1b的合成,以4a为原料制备中间体4b，收率70％。质谱m/z 515.24(M/2)+。
参照化合物I-1的合成,还原4b制备I-4，收率80％。质谱516.24(M+H)+。
实施例5：I-5的制备
参照化合物1b的合成,以5a为原料制备中间体5b，收率85％。质谱700.20(M+H)+。
参照化合物I-1的合成,还原5b制备I-5，收率90％。质谱351.15(M+H)+。
实施例6：I-6的制备
参照化合物2b的合成,以6a为原料制备6b，收率85％。质谱957.30(M+H)+。
参照化合物I-1的合成,还原6b得I-6，收率89％。高分辨质谱502.1545(M+Na)+。
实施例7：I-7的制备
参照化合物2b的合成,以7a为原料制备7b，收率80％。质谱639.20(M+H)+。
参照化合物I-1的合成,还原7b得I-7，收率90％。高分辨质谱368.1179(M+Na)+。
实施例8：I-8的制备
参照化合物1b的合成,以8a为原料制备8b，收率75％。质谱639.10(M+H)+。
参照参照化合物I-1的合成,还原8b得化合物I-8，收率90％。质谱321.1257(M+H)+。
实施例9：I-9的制备
参照化合物1b的合成,以8a为原料，将胱胺换成胱氨酸甲酯，得9b,收率81％。质谱755.15(M+H)+。
参照化合物I-1的合成,还原9b得I-9，收率80％。高分辨质谱379.1361(M+H)+。
实施例10：I-10的制备
参照化合物I-1b的合成,以8a为原料，将胱胺换成高胱氨酸甲酯，得10b,收率81％。质谱783.10(M+H)+。
参照化合物I-1的合成,还原10b得I-10，收率80％。高分辨质谱393.1494(M+H)+。
实施例11：I-11的制备
参照化合物1b的合成,以11a为原料，得11b，收率78％。高分辨质谱709.2025(M+Na)+。化合物I-1，还原11b得I-11，收率80％。质谱344.10(M+H)+。
实施例12：I-12的制备
参照化合物1b的合成,以11a为原料，将胱胺换成胱氨酸甲酯,得12b,收率75％。质谱803.30(M+H)+。参照化合物I-1的合成,还原12b得I-12，收率80％。质谱403.10(M+H)+。
实施例13：I-13的制备
参照化合物I-1b的合成,以11a为原料，将胱胺换成高胱氨酸甲酯,得13b,收率75％。质谱853.2396(M+H)+。参照化合物I-1的合成,还原13b得I-13，收率80％。质谱417.1488(M+H)+。
实施例14：II-1的制备
Figure BDA0002401427030000071
化合物I-1与乙酸酐在干燥的二氯甲烷中，室温搅拌反应。反应结束，旋干溶剂，柱层析纯化，得到II-1(产率90％)。质谱m/z 316.10(M+H)+。
实施例15：II-2的制备
参照化合物II-1的合成，以I-2为原料制备II-2,收率85％，质谱353.00(M+H)+。
实施例16：II-3的制备
参照化合物II-1的合成，以I-3为原料制备II-3,收率88％，质谱343.10(M+H)+。
实施例17：II-4的制备
参照化合物II-1的合成，以I-4为原料制备II-4,收率88％，质谱544.30(M+H)+。
实施例18：II-5的制备
参照化合物II-1的合成，以I-5为原料制备II-5,收率90％，质谱393.15(M+H)+。
实施例19：II-6的制备
参照化合物II-1的合成，以I-6为原料制备II-6,收率90％，质谱522.20(M+H)+。
实施例20：II-7的制备
参照化合物II-1的合成，以I-7为原料制备II-7,收率90％，质谱388.10(M+H)+。
实施例21：II-8的制备
参照化合物II-1的合成，以I-8为原料制备II-8,收率95％，质谱378.10(M+H)+。
实施例22：II-9的制备
参照化合物II-1的合成，以I-9为原料制备II-9,收率85％，质谱421.10(M+H)+。
实施例23：II-10的制备
参照化合物II-1的合成，以I-10为原料制备II-10,收率90％，质谱434.10(M+H)+。
实施例24：II-11的制备
参照化合物II-1的合成，以I-11为原料制备II-11,收率90％，质谱387.20(M+H)+。
实施例25：II-12的制备
参照化合物II-1的合成，以I-12为原料制备II-12,收率95％，质谱445.10(M+H)+。
实施例26：II-13的制备
参照化合物II-1的合成，以I-13为原料制备II-13,收率95％，质谱459.10(M+H)+。
实施例27：实施例1中1-1所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
将实施例1中化合物1-1用作探针分子，以少量DMSO溶解，再加入PBS缓冲液稀释至终浓度2μM。将溶液分为若干份，取其中一份记录其在最大发射波长下的荧光强度。另取若干份，分别加入高浓度的半胱氨酸，高半胱氨酸，还原型谷胱甘肽，亚硫酸根，双氧水，一氧化氮，亚硝酸根，硫代硫酸根，硫酸根，羟基自由基溶液，保证体积变化小于1％且使上述物质浓度为10μM。反应30分钟后，使用荧光分光光计记录I-1在上述物质存在条件下，在最大发射波长处的荧光强度，做图。如图1所示，I-1对一氧化氮呈荧光降低响应，且其它物质不能导致这种变化，说明I-1对一氧化氮有特异性荧光响应。在一氧化氮处理后的I-1溶液中加入一氧化氮清除剂，30分钟后再次记录荧光强度，发现I-1荧光强度恢复至原始水平，说明I-1对一氧化氮响应呈可逆性，结果见图1。
实施例28：实施例2中1-2所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例2中化合物1-2对一氧化氮的荧光响应。结果如图2所示，I-2对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例29：实施例3中1-3所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例3中化合物1-3对一氧化氮的荧光响应。结果如图3所示，I-3对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例30：实施例4中1-4所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例4中化合物1-4对一氧化氮的荧光响应。结果如图4所示，I-4对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例31：实施例5中1-5所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例5中化合物1-5对一氧化氮的荧光响应。结果如图5所示，I-5对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例32：实施例6中1-6所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例6中化合物1-6对一氧化氮的荧光响应。结果如图6所示，I-6对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例33：实施例7中1-7所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例7中化合物1-7对一氧化氮的荧光响应。结果如图7所示，I-7对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例34：实施例8中1-8所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例8中化合物1-8对一氧化氮的荧光响应。结果如图8所示，I-8对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例35：实施例9中1-9所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例9中化合物1-9对一氧化氮的荧光响应。结果如图9所示，I-9对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例36：实施例10中1-10所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例10中化合物1-10对一氧化氮的荧光响应。结果如图10所示，I-10对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例37：实施例11中1-11所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例11中化合物1-11对一氧化氮的荧光响应。结果如图11所示，I-11对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例38：实施例12中1-12所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例12中化合物1-12对一氧化氮的荧光响应。结果如图12所示，I-12对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例39：实施例13中1-13所示化合物对一氧化氮的特异性可逆荧光响应
采用实施例27所述方法，评价实施例13中化合物1-13对一氧化氮的荧光响应。结果如图13所示，I-13对一氧化氮呈特异性的荧光降低响应，且这种响应呈可逆性。
实施例29：实施例22中1I-9所示化合物检测Hela细胞中一氧化氮浓度的动态变化
将实施例21中II-8所示化合物用作探针分子。将探针分子以少量DMSO溶解，配制成探针溶液，加入HeLa细胞培养基中，孵育15分钟后，利用荧光纤维镜进行时间序列成像。成像过程中依次加入一氧化氮供体DEA·NONOate或一氧化氮清除剂还原型谷胱甘肽(GSH,400μM)(间隔：30分钟)上调或下调细胞中一氧化氮的水平，成像结果见图14所示，II-8所示化合物可在活细胞中动态检测一氧化氮。
实施例30：实施例25中1I-12所示化合物检测Hela细胞中一氧化氮浓度的动态变化
将实施例25中II-12所示化合物用作探针分子。将探针分子以少量DMSO溶解，配制成探针溶液，加入HeLa细胞培养基中，孵育15分钟后，利用荧光纤维镜进行时间序列成像。成像过程中依次加入一氧化氮供体DEA·NONOate或一氧化氮清除剂还原型谷胱甘肽(GSH,
400μM)(间隔：30分钟)上调或下调细胞中一氧化氮的水平，成像结果见图15所示，II-12所示化合物可在活细胞中动态检测一氧化氮。

Claims (7)

1.含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物，其特征在于，选自式I或式II的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物，
Figure FDA0002401427020000011
其中：
荧光团为萘甲酸酯、磺酰萘胺、1,8-奈二酰亚胺、氧杂嗯、氟硼二吡咯、香豆素、硅杂嗯、花青染料等；
连接链选用亚甲基、氮亚甲基、半胱胺、半胱氨酸酯、高半胱氨酸酯；
R为C1-C4烷基。
2.根据权利要求1所述的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物，其特征在于，选自下列化合物：
Figure FDA0002401427020000012
3.权利要求1或2所述的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物的制备方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)将含羧基、磺酰氯、活泼氯基团的荧光化合物与巯基乙胺，半胱氨酸酯或高半胱氨酸酯中的二硫化物反应，所得产物经二硫苏糖醇还原，得到式I所示的含巯基荧光化合物；其中含羧基、磺酰氯、活泼氯基团的荧光化合物选用式1a-式8a及式11a所示的化合物：
Figure FDA0002401427020000021
(2)将步骤(1)产物与酸酐反应，得如式II所示的硫酯类荧光化合物。
4.权利要求1或2所述的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物在制备检测一氧化氮的荧光探针中的应用，所述一氧化氮是溶液、细胞内或活体组织中的一氧化氮。
5.根据权利要求1或2所述的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物在制备动态检测一氧化氮的荧光探针中应用，所述动态检测是检测细胞中一氧化氮在实时示踪中的动态变化。
6.根据权利要求1或2所述的含巯基荧光化合物或其硫酯衍生物在制备检测生物样本荧光成像的荧光探针中的应用。
7.根据权利要求4-6任一所述的应用，其特征在于，所述的荧光探针以试纸、探针溶液、试剂盒形式存在。
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