CN112881355A - 用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物pH和氧气浓度荧光检测的技术领域，具有为用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器及其制备方法。本发明荧光纳米传感器是聚苯乙烯纳米颗粒，其内部疏水，包埋有氧敏感探针，以及pH和氧气惰性的参比荧光探针，其表面修饰有氨基基团，并通过共价连接方式在纳米颗粒表面修饰pH敏感探针。该传感器采用一锅法聚合反应合成得到。该荧光纳米传感器具有生物相容性好、制备简单、灵敏度好、可逆性好的优点，在适当波长的激发光照射下，传感器暴露在不同pH和不同氧浓度环境中，其荧光强度会发生明显变化，可用于细胞内pH和氧气浓度的同时测量。比率型检测方法荧光检测的准确性更高，且细胞毒性极低。

Description

用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器 及其制备方法
技术领域
本发明属于生物pH和氧气浓度荧光检测的技术领域，具有涉及一种用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器及其制备方法。
背景技术
细胞作为组成生命体的最基本单元，保持细胞功能正常对于维持生命体的健康十分重要。细胞的功能失调与一系列疾病的产生息息相关，如肥胖症、神经性疾病和癌症等。细胞生理活动所需的能量大部分都来源于线粒体呼吸作用。氧气在线粒体呼吸作用的氧化磷酸化环节至关重要，其与还原性分子反应生成水并释放大量能量。能量通过电子传递链传递，驱动了质子逆浓度梯度运输，从而产生线粒体膜电势。质子通过化学渗透的方式回流，释放的能量驱动ATP合成酶的部分旋转，从而将二磷酸腺苷（ADP）转化为三磷酸腺苷（ATP）。此外，氧气浓度过低会引起线粒体功能障碍，而氧气浓度过高可能会促进细胞内活性氧的产生，损害生物分子。同时，细胞内的质子还参与了许多细胞内其他的重要生理活动，例如钙离子信号传导。因此，同时检测细胞内的pH和氧气浓度对于监控细胞生理活动和功能状态具有重要的意义。
荧光传感器由于其检测速度快、灵敏度高、成本低以及对样品无损等特性近年来受到了研究者的青睐。彭洪尚课题组报告了一种具有细胞线粒体靶向性的荧光氧气纳米传感器（CN103575717B），该传感器是以十二烷基三甲氧基硅烷-聚苯乙烯和二氧化硅为核，以多聚赖氨酸为壳的核壳结构，氧气探针分散在核层中，通过静电吸附作用表面偶联线粒体靶向基团。虽然其具有较好的氧气响应性能，但是通过沉淀法制备的聚合物纳米颗粒尺寸分布比较不均匀，且颗粒表面呈现化学惰性，难以以共价的方式在纳米颗粒表面修饰其他荧光探针或者靶向基团。虽然具有氧浓度检测功能的荧光传感器可与具有pH检测功能的传感器共同使用实现pH和氧气浓度的同时测定，但是由于传感器在细胞内的分布位置不同，使用多种传感器不利于对细胞内同一位置处的pH和氧气浓度同时进行检测，并且引入多个传感器会增加对细胞正常生理活动的干扰。我们课题组曾报告过一种超小尺寸高稳定性的细胞内pH和氧气同时检测的荧光纳米传感器(Wang et al., 2012)，其将普朗尼克聚合物溶解在水溶液形成核壳结构的胶束，内部疏水包埋了氧敏感探针，外部亲水的PEG层连接pH敏感探针，然后通过在表面形成一层薄二氧化硅来固化结构。独特的结构使其具有良好的pH和氧气检测性能，但是由于其致密的PEG结构，纳米颗粒无法通过胞吞的方式进入细胞，只能通过电穿孔或者显微注射的方式进入细胞。因此，有必要开发一种生物相容性好、制备简单、灵敏度好、可逆性好，能方便地进入细胞并用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生物相容性好、制备简单、灵敏度好、可逆性好，能用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器及其制备方法。
本发明提供的用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器，是一种聚苯乙烯纳米颗粒，其内部疏水，包埋有氧敏感探针，以及pH和氧气惰性的参比荧光探针，其表面修饰有氨基基团，并通过共价连接方式在纳米颗粒表面上修饰pH敏感探针；聚苯乙烯材料具有良好的氧气通透性，通过将氧敏感探针和参比荧光染料包裹在纳米颗粒内部，可有效地减少外部环境对荧光检测的干扰，提升氧气检测的准确度。将检测质子浓度的pH敏感探针修饰在纳米颗粒表面，使得其可以充分与外部环境中的质子接触，有利于提升纳米传感器的响应性能。所述的三种荧光探针的发射光谱没有较大发射光谱重叠，可准确地对pH和氧气浓度进行检测。所述的荧光纳米传感器具有均匀的尺寸，良好的生物相容性，可实现细胞内pH和氧气浓度的同时检测。
本发明中，所述氧敏感探针，其种类包括但不仅限于铂和钯卟啉配合物、钌配合物、铱配合物；所述pH和氧气惰性的参比荧光探针，其种类包括但不仅限于罗丹明B，4,4’-双（2-苯并恶唑基）二苯乙烯；所述pH敏感探针，其种类包括但不仅限于荧光素及其衍生物、8-羟基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐。
该双参数荧光纳米传感器由如下制备方法得到（采用一锅聚合反应合成）：
（1）将脂肪醇聚氧乙烯醚、参比荧光染料、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐与超纯水按质量为1：（0.01~1）：（0.2~1）：（50~300）混匀，搅拌过夜，得混合液，记为A；
（2）将十六烷、苯乙烯和氧敏感探针按质量比为100：（500~3000）：（1~600）混合均匀，得到混合液，记为B；将溶液A与溶液B按体积比（35~100）：10混合，得到混合液，记为C，混合液除氧后在室温下搅拌1-2小时；
（3）将混合液C在冰浴下超声2-4分钟，然后将2,2'-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐与混合液C按质量比为1：（220~500）混合均匀，得到混合液，记为D，混合液D除氧后在65-100oC搅拌18~24小时；
（4）将混合液D置于冰浴中10-15分钟，终止反应，得到包埋有氧敏感探针和参比荧光染料的聚苯乙烯纳米颗粒，纳米颗粒表面带有氨基基团；将反应完的混合液D用乙醇溶液稀释10倍，反复离心洗涤3次，得到混合液，记为E；
（5）将混合液E离心重新分散在无水乙醇中，将混合液E与三乙胺和pH敏感探针按质量比为（5000~10000）：100：（0.025~0.5）混合，搅拌过夜，将所得溶液用乙醇溶液反复离心洗涤3-4次，得到pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米颗粒。
本发明步骤（1）中，脂肪醇聚氧乙烯醚、参比荧光染料、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐与超纯水质量比优选为1：（0.1~1）：（0.5~1）：（100~200）。
本发明步骤（5）中，混合液E与三乙胺和pH敏感探针的质量比优选为（6000~8000）：100：（0.03~0.5）。
本发明中，纳米颗粒采用一锅聚合反应合成，疏水性的氧敏感探针和参比荧光染料可直接在聚合过程中包裹在纳米颗粒的内部疏水区域；合成纳米传感器表面直接带有可功能化的氨基基团，用于连接pH敏感探针。
本发明中，甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐为苯乙烯的共聚体，使得合成的纳米颗粒表面带有氨基基团，可用于修饰其他荧光探针或者细胞器靶向基团。
本发明中，使用的三种荧光探针，其荧光发射光谱没有较大重叠，并且最好能使用同一波长的光源激发。
本发明制备的用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器，将三种荧光探针集成在单个纳米颗粒上，具有特定的探针分布和颗粒结构，尺寸均匀，在适当波长激发下，其对pH和氧气的响应具有灵敏度高、准确度高、可逆性好、荧光亮度高等优点。且由于其具有较好的生物相容性，可用于细胞内pH和氧气浓度的同时测量。
本发明提供用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器具有以下优点：
第一、其特定的纳米颗粒结构提升了检测的灵敏度。将氧敏感荧光探针和参比荧光染料在聚合过程中包裹在聚苯乙烯内部，降低了环境因素对氧气检测的干扰。通过加入甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐共聚体，使得纳米颗粒表面带有氨基基团，通过化学偶联在纳米颗粒表面共价修饰上pH敏感荧光探针，使其充分与外部溶液接触，提高了pH检测的响应性能；
第二、纳米颗粒表面的氨基基团除了可用于修饰pH敏感探针，还可用于修饰其他荧光探针或者细胞器靶向基团；
第三、所使用的三种荧光探针的发射光谱没有较大重叠。比率型检测方法提高了荧光检测的准确性，避免了由传感器浓度和仪器设置等因素引起的测量误差；
第四、荧光纳米传感器具有优异的生物相容性，极低的细胞毒性，可用于细胞内pH和氧气的同时检测。
附图说明
图1为双参数荧光纳米传感器的透射电子显微镜图（TEM）。
图2为双参数荧光纳米传感器在不同pH下的荧光光谱图。
图3为双参数荧光纳米传感器在不同pH下的标准曲线图。
图4为双参数荧光纳米传感器在不同氧浓度下的荧光光谱图。
图5为双参数荧光纳米传感器在不同氧浓度下的Stern-Volmer曲线。
图6为双参数荧光纳米传感器在HeLa细胞中的荧光成像图。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
称取40 mg AT-50、1 mg罗丹明异硫氰酸酯、30 mg甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐，放入10 mL烧杯中，加入4.8 mL超纯水，搅拌混匀得到溶液A。
在三颈瓶中加入0.63 mL苯乙烯，加入50 μL十六烷和0.6 mg铂八乙基卟啉，混匀得到溶液B。
将溶液A加入到溶液B中混合。在三颈瓶中加入磁转子搅拌，放置在磁力搅拌器上，装上温度计，混合液用氮气除氧30min之后继续搅拌30min。
将混合液C在冰浴下超声2分钟，形成细乳液溶液。
在混合液C中加入12 mg V-50，得到混合液D，继续除氧30 min后在70oC油浴中搅拌反应18小时。
将混合液D置于冰浴中冷却10分钟终止反应，将产物转移到50 mL离心管中。取出2mL反应液加入8 mL水稀释，混匀后在22000 rpm离心30min，再用乙醇离心洗涤3次，重新将纳米颗粒分散在无水乙醇中，得到混合液E。
取1 mL混合液E，加入20 μL 1%三乙胺和60 μL 0.0025 mg/mL荧光素异硫氰酸酯，搅拌过夜，将所得溶液用乙醇溶液反复离心洗涤3次，得到pH和氧气测量的双参数荧光纳米颗粒。
双参数荧光纳米传感器对于pH的响应
探究所得双参数荧光纳米传感器在不同pH条件下的荧光响应。配置不同pH的伯瑞坦-罗宾森缓冲液，取100 μL将所制备的荧光纳米颗粒加入到900 μL不同pH的缓冲液中，混匀后再荧光仪上扫描荧光发射光谱，激发波长为485 nm。如图2所示，随着pH的增加，520 nm处的荧光强度明显增强。计算520 nm处的荧光强度与575 nm处的荧光强度的比值，得到随pH值变化的荧光比率校准曲线（图3）。当pH从4.5增加到10.0时，荧光强度比率从0.96增加到2.14，pKa为7.0，由于细胞内pH的范围通常为5.5-8.0，因此本传感器适用于细胞内pH检测。
双参数荧光纳米传感器对于氧气的响应
将所得传感器分散在pH为7.4的PBS缓冲溶液中，将其置于混有不同比例氮气与氧气的混合气体环境下，保持15分钟使溶液中的氧气浓度与环境中所设置的氧气浓度一致，然后在荧光仪上测量光谱，得到在不同溶解氧浓度下的荧光光谱，如图4所示。用Stern-Volmer方程拟合得到校准曲线，其检测灵敏度达到36。
双参数荧光纳米传感器在细胞内的应用
将所得荧光纳米传感器应用在HeLa细胞中。在共聚焦皿中孵育HeLa细胞，待细胞贴壁后，在培养基中加入双参数荧光纳米传感器共同孵育4h，用PBS洗涤3遍除去未进入细胞的纳米颗粒。在荧光显微镜中进行荧光成像，如图6所示，通过选择合适的滤光片，能在显微镜下同时观察到三个荧光探针的荧光，表明该传感器能适用于细胞内pH和氧气的同时检测。
实施例2
称取250 mg AT-50、5 mg罗丹明异硫氰酸酯、120 mg甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐，放入50 mL烧杯中，加入24 mL超纯水，搅拌混匀得到溶液A。
在三颈瓶中加入3.3 mL苯乙烯，加入250 μL十六烷和5 mg铂八乙基卟啉，混匀得到溶液B。
将溶液A加入到溶液B中混合。在三颈瓶中加入磁转子搅拌，放置在磁力搅拌器上，装上温度计，混合液用氮气除氧30min之后继续搅拌30min。
将混合液C在冰浴下超声2分钟，形成细乳液溶液。
在混合液C中加入60 mg V-50，得到混合液D，继续除氧30 min后在70oC油浴中搅拌反应18小时。
将混合液D置于冰浴中冷却10分钟终止反应，将产物转移到50 mL离心管中。取出2mL反应液加入8 mL水稀释，混匀后在22000 rpm离心30min，再用乙醇离心洗涤3次，重新将纳米颗粒分散在无水乙醇中，得到混合液E。
取1 mL混合液E，加入20 μL 1%三乙胺和10 μL 0.025 mg/mL荧光素异硫氰酸酯，搅拌过夜，将所得溶液用乙醇溶液反复离心洗涤3次，得到pH和氧气测量的双参数荧光纳米颗粒。
将将所得荧光纳米传感器用于细胞内pH和氧气的同时检测，其结果类似于实施例1。
参考文献：
Wang, X. D., Stolwijk, J. A., Lang, T., Sperber, M., Meier, R. J.,Wegener, J., & Wolfbeis, O. S. (2012). Ultra-Small, Highly Stable, andSensitive Dual Nanosensors for Imaging Intracellular Oxygen and pH inCytosol. Journal of the American Chemical Society, 134(41), 17011-17014. doi:10.1021/ja308830e。

Claims (4)

1.一种用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器的制备方法，其特征在于，采用一锅法聚合反应合成，具体步骤如下：
（1）将脂肪醇聚氧乙烯醚、参比荧光染料、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐与超纯水按质量为1：（0.01~1）：（0.2~1）：（50~300）混匀，搅拌过夜，得混合液，记为A；
（2）将十六烷、苯乙烯和氧敏感探针按质量比为100：（500~3000）：（1~600）混合均匀，得到混合液，记为B；将溶液A与溶液B按体积比（35~100）：10混合，得到混合液，记为C，混合液除氧后在室温下搅拌1-2小时；
（3）将混合液C在冰浴下超声2-4分钟，然后将2,2'-偶氮二(2-甲基丙基咪)二盐酸盐与混合液C按质量比为1：（220~500）混合均匀，得到混合液，记为D，混合液D除氧后在65-100oC搅拌18~24小时；
（4）将混合液D置于冰浴中10-15分钟，终止反应，得到包埋有氧敏感探针和参比荧光染料的聚苯乙烯纳米颗粒，纳米颗粒表面带有氨基基团；将反应完的混合液D用乙醇溶液稀释10倍，反复离心洗涤3次，得到混合液，记为E；
（5）将混合液E离心重新分散在无水乙醇中，将混合液E与三乙胺和pH敏感探针按质量比为（5000~10000）：100：（0.025~0.5）混合，搅拌过夜，将所得溶液用乙醇溶液反复离心洗涤3-4次，得到pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米颗粒。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，脂肪醇聚氧乙烯醚、参比荧光染料、甲基丙烯酸2-氨基乙酯盐酸盐与超纯水质量比为1：（0.1~1）：（0.5~1）：（100~200）。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，混合液E与三乙胺和pH敏感探针的质量比优选为（6000~8000）：100：（0.03~0.5）。
4.一种由权利要求1-3之一所述制备方法得到的用于细胞内pH和氧气浓度同时测量的双参数荧光纳米传感器，是一种聚苯乙烯纳米颗粒，其内部疏水，包埋有氧敏感探针，以及pH和氧气惰性的参比荧光探针，其表面修饰有氨基基团，并通过共价连接方式在纳米颗粒表面上修饰pH敏感探针。
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