CN108485653A - 同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针及其合成方法和应用，该近红外荧光探针由近红外花青荧光染料和线粒体靶向基团三苯基鏻盐，以及双硒结构单元通过化学共价键结合构成，激发发射波长在近红外区，能够提高方法的检测灵敏度，降低测试方法的检测限。有望实现细胞内H2O2和ONOO‑的差异化同时定量检测，对于动态观测研究活线粒体内活性氧自由基的产生、代谢、相互转化及其动态损伤生物机体的过程通路及机制，具有一定的理论意义；也为包括细胞活性、细胞毒性、细胞凋亡、细胞膜电位以及细胞周期等细胞功能方面的指标检测，提供一种有用的工具。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术及临床医学检测领域，具体的说是同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针及其合成方法和应用。
背景技术
线粒体是一个具有双层膜结构包裹的细胞器，对细胞的能量代谢起着至关重要的作用。研究发现，细胞功能的各种调控，包括细胞信号传导、代谢、自噬、衰老和肿瘤发生等，都与线粒体的质量和活性直接相关。线粒体产生过量的超氧离子自由基(包括过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子等)是诸多氧化应激疾病(如帕金森氏病、阿尔兹海默病等)发病的主要诱因。
近些年来，近红外荧光生物成像技术因为具有深的组织穿透性、低背景荧光干扰、最小生物样本光损伤、检测灵敏度高等优点引起人们越来越多的关注。该技术为活体组织和细胞中超氧离子自由基(包括过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子等)的“实时、可视、定量”检测提供了途径，一系列近红外荧光探针设计被合成(GuoZ,Park S,YoonJ,etal.ChemicalSociety Reviews,2013,43(1):16-29；Yang Y,Zhao Q,Feng W,et al.Chemical Reviews,2013, 113(1):192-270.)，并用于动态观测研究活细胞和组织内活性氧自由基的产生、代谢、相互转化及其动态损伤生物机体的过程。
然而，已报道的这些探针只是针对H2O2或ONOO-的单一识别(Yu F,Li P,Li G,etal. Journal of the American Chemical Society,2011,133(29):11030-11033；Xu K,Qiang M,Gao W, et al.Chemical Science,2013,4(3):1079-1086.)，忽略了肿瘤等疾病的发生、发展是细胞内多种超氧化物交互作用的结果，不能反映出细胞内H2O2和ONOO-水平实时、动态的量变规律，而且反复、分步测试的准确度较低，系统误差较高。另一方面，已有的探针缺乏线粒体靶向功能基团，组织穿透性差，容易受到细胞质和细胞膜中生物硫醇等因素的干扰，不能实现对线粒体内过氧化自由基的专属识别。线粒体靶向功能的H2O2和ONOO-双重识别同时检测的近红外荧光探针尚未见报道。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针及其合成方法和应用，该近红外荧光探针组织穿透性强、背景荧光干扰小、生物样本光损伤小，适用于线粒体内过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子同时检测成像；该近红外荧光探针的合成方法工艺简单、成本低、操作方便。
本发明为解决上述技术问题采用的技术方案为：同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针，该近红外荧光探针具有下列结构：
如上所述的同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成方法，该合成方法包括如下步骤：
步骤一、按照对碘苯胺：硒：Cu2O：乙二胺：KOH＝1:0.5-1.05：0.01-0.05:0.01-0.05:0.01-0.05 的摩尔比依次取对碘苯胺、硒、Cu2O、乙二胺和KOH进行混合，之后向所得混合物中加入其质量10-12倍的DMSO溶剂，充分搅拌至完全溶解后，加热至100-180℃进行微波反应1- 3h，过滤，并对所得滤渣进行干燥，制得二对氨基苯硒醚，备用；
步骤二、按照二对氨基苯硒醚：2-氯硒基苯甲酰氯＝1:1的摩尔比称取2-氯硒基苯甲酰氯，加入到步骤一制得的二对氨基苯硒醚中，之后再向其中加入乙醚和水的混合溶剂300-500mL，在室温下搅拌2-5h，过滤，并对所得滤渣进行干燥，制得2-(4-(4-氨基-苯基)-硒代)-苯基-1,2- 苯并异硒唑-3(2H)-酮(Eb-PSe-NH2)，备用；
步骤三、另称取与步骤二制得的2-(4-(4-氨基-苯基)-硒代)-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮等摩尔量的碘乙基三苯基碘化鏻，并与步骤二制得的2-(4-(4-氨基-苯基)-硒代)-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮混合，混合后向其中加入甲苯至溶解，之后回流反应6-24h，制得2,3,3-三甲基- 1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐，备用；
步骤四、按照2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐：2-氯-1-甲酰基-3-羟甲烯基环己烯＝1:1的摩尔比称取2-氯-1-甲酰基-3-羟甲烯基环己烯，加入到步骤三制得的2,3,3-三甲基-1- 三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐中，之后向其中加入醋酸钠和醋酸酐至溶解，在室温下反应2- 12h，制得花青素染料7-氯取代物(Cy.7.Cl)，备用；
步骤五、按照等摩尔量取步骤三制得的Eb-PSe-NH2和步骤四制得的Cy.7.Cl混合，向混合物中加入甲苯至溶解，回流反应6-24h，之后用硅胶柱层析分离得蓝紫色固体纯品，即为成品同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针(Mito P-Cy-SeSe)。
本发明所述的近红外荧光探针在细胞内H2O2和ONOO-的差异化同时定量检测中的应用。
本发明所述的近红外荧光探针在动态观测研究活线粒体内活性氧自由基的产生、代谢、相互转化及其动态损伤生物机体的过程通路及机制中的应用。
本发明所述的近红外荧光探针在细胞活性、细胞毒性、细胞凋亡、细胞膜电位以及细胞周期的指标检测中的应用。
作为一种优选方案，步骤一所述干燥时温度为15-60℃。
作为一种优选方案，步骤二所述乙醚和水的混合溶剂中，乙醚和水的体积比为1:1。
作为一种优选方案，步骤二所述乙醚和水的混合溶剂替换为乙腈或者二氯甲烷。
作为一种优选方案，步骤三所述碘乙基三苯基碘化鏻替换为碘甲基三苯基碘化鏻。
作为一种优选方案，步骤四加入醋酸钠和醋酸酐替换为加入正丁醇和甲苯，其中正丁醇和甲苯的体积比为3:1。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明提供了同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针及其合成方法和应用，该近红外荧光探针由近红外花青荧光染料和线粒体靶向基团三苯基鏻盐，以及双硒结构单元通过化学共价键结合构成，激发发射波长在近红外区，能够提高方法的检测灵敏度，降低测试方法的检测限。在生理pH溶液条件下，探针使用不受环境酸碱度影响，适用于生物体内使用。除线粒体外，其它细胞器内的生物组分不对检测造成干扰。另外，该近红外荧光探针分子结构简单，合成方法简便，设备投入和生产运行成本很低，操作方便且生产效率高，适于大规模工业化生产；
(2)本发明提供了同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针及其合成方法和应用，该近红外荧光探针分子能够同时识别并测定化学及细胞线粒体内过氧化氢(H2O2)和过氧化亚硝基阴离子(ONOO-)。本发明探针分子激发和发射光谱在近红外区，属于近红外荧光探针，激发位于790nm，发射位于806nm，可以有效避免细胞自发荧光的干扰，提高检测方法的选择性和灵敏度，减少对生命体的损伤，有利于活体检测；
(3)本发明近红外荧光探针的设计基于双硒结构单元的类似GSH-Px仿生酶作用的氧化还原反应，在细胞内谷胱甘肽(GSH)的协同作用下，产生“开关”效应，带来荧光吸收和强度的增强或弱化，结合光谱学定律和数学运算，荧光探针分子表现出对过氧化氢(H2O2)和过氧化亚硝基阴离子(ONOO-)良好的双重识别效应；
(4)本发明近红外荧光探针分子可以检测纳摩尔浓度的细胞内过氧化氢(H2O2)和过氧化亚硝基阴离子(ONOO-)，检测限低，对细胞本身没有毒副作用，适用于细胞内过氧化氢(H2O2)和过氧化亚硝基阴离子(ONOO-)的定量检测；
(5)本发明近红外荧光探针含有三苯基鏻盐阳离子线粒体靶向基团，可以实现线粒体靶向输送，细胞渗透性好，适用于线粒体内过氧化氢(H2O2)和过氧化亚硝基阴离子(ONOO- )的定量检测；
(6)本发明近红外荧光探针分子水溶性好，可以制备成溶液进行测试，避免了有机溶剂的使用，组织损伤小，具有较高的生物相容性。
附图说明
图1为本发明同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针对H2O2或 ONOO-自由基的双识别原理图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作详细说明，本实施例以本发明技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程。
同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针，该近红外荧光探针具有下列结构：
步骤一、按照对碘苯胺：硒：Cu2O：乙二胺：KOH＝1:0.5-1.05：0.01-0.05:0.01-0.05:0.01-0.05的摩尔比依次取对碘苯胺、硒、Cu2O、乙二胺和KOH进行混合，之后向所得混合物中加入其质量10-12倍的DMSO溶剂，充分搅拌至完全溶解后，加热至100-180℃进行微波反应1-3h，作为优选的，所述加热为微波加热或者回流加热。过滤，并对所得滤渣进行干燥，干燥时温度为15-60℃，制得二对氨基苯硒醚，备用；
步骤二、按照二对氨基苯硒醚：2-氯硒基苯甲酰氯＝1:1的摩尔比称取2-氯硒基苯甲酰氯，加入到步骤一制得的二对氨基苯硒醚中，之后再向其中加入乙醚和水的混合溶剂300-500mL，所述乙醚和水的混合溶剂中，乙醚和水的体积比为1:1。在室温下搅拌2-5h，过滤，并对所得滤渣进行干燥，制得Eb-PSe-NH2，备用；
步骤三、另称取与步骤二制得的2-(4-(4-氨基-苯基)-硒代)-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮等摩尔量的碘乙基三苯基碘化鏻，并与步骤二制得的2-(4-(4-氨基-苯基)-硒代)-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮混合，混合后向其中加入甲苯至溶解，之后回流反应6-24h，制得2,3,3-三甲基- 1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐，备用；
步骤四、按照2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐：2-氯-1-甲酰基-3-羟甲烯基环己烯＝1:1的摩尔比称取2-氯-1-甲酰基-3-羟甲烯基环己烯，加入到步骤三制得的2,3,3-三甲基-1- 三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐中，之后向其中加入醋酸钠和醋酸酐至溶解，在室温下反应2- 12h，制得Cy.7.Cl，备用；
步骤五、按照等摩尔量取步骤三制得的Eb-PSe-NH2和步骤四制得的Cy.7.Cl混合，向混合物中加入甲苯至溶解，回流反应6-24h，之后用硅胶柱层析分离得蓝紫色固体纯品，即为成品同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针。
同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成路线如下：
同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针，有望实现细胞内H2O2和ONOO-的差异化同时定量检测，对于动态观测研究活线粒体内活性氧自由基的产生、代谢、相互转化及其动态损伤生物机体的过程通路及机制，具有一定的理论意义；也为包括细胞活性、细胞毒性、细胞凋亡、细胞膜电位以及细胞周期等细胞功能方面的指标检测，提供一种有用的工具。
作为一种优选方案，步骤二所述乙醚和水的混合溶剂替换为乙腈或者二氯甲烷。
作为一种优选方案，步骤三所述碘乙基三苯基碘化鏻替换为碘甲基三苯基碘化鏻。
作为一种优选方案，步骤二中，加入加入乙醚和水的混合溶剂之后，还加入50-300g 的碳酸钾。
作为一种优选方案，步骤四加入醋酸钠和醋酸酐替换为加入正丁醇和甲苯，其中正丁醇和甲苯的体积比为7:3。
作为一种优选方案，步骤五中，向混合物中加入甲苯至溶解后，加入Cy.7.Cl质量25-30％的三乙胺作为缚酸剂。
实施例一
如上所述的同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成方法，该合成方法包括如下步骤：
步骤一、市售对碘苯胺(220g,1mol)，加入硒粉(40g,0.5mol)，Cu2O(1.4g,0.01mol),乙二胺(0.6g,0.01mol)，KOH(12g,0.01mol)，DMSO(500mL),100℃微波反应,1h。反应完毕倾入5L冰水中，搅拌，过滤，用大量水洗涤固体，干燥即得二-对氨基-苯硒醚，收率72％。
步骤二、将步骤一制得的二-对氨基苯硒醚置于1500ml三颈瓶中，加入200ml水和200ml乙醚，K2CO350g。冰浴冷却条件下慢慢滴加化合物2-氯硒基苯甲酰氯105g(0.5mol)的乙醚溶液200ml，乳黄色沉淀生成，然后于-5℃搅拌约2h，然后抽滤，取滤渣逐次用饱和碳酸氢钠溶液和纯化水清洗多次，干燥后用无水乙醇重结晶得淡黄色结晶，制得Eb-PSe- NH2。收率95％。
步骤三、取步骤二制得的Eb-PSe-NH2(95mL,0.5mol)和碘乙基三苯基碘化鏻(200g,0.5mol)加入到2L单口烧瓶中，加入磁子，加入500mL甲苯，搭建回流装置，回流反应6h，然后停止反应冷却至室温，减压除去溶剂，过滤，固体用乙酸乙酯(3×100mL) 洗涤，得到粉红色晶体，干燥称重，制得2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐，收率 91％；
步骤四、向步骤三制得的2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐中加入2-氯-1-甲酰基-3-羟甲烯基环己烯(94g，0.5mol)，并向其中加入47g醋酸钠和1L醋酸酐至溶解，之后室温反应2h，制得Cy.7.Cl，备用；
步骤五、按照等摩尔量取步骤二制得的Eb-PSe-NH2和步骤四制得的Cy.7.Cl，向混合物中加入300mL甲苯至溶解，回流反应6h，之后用硅胶柱层析分离得蓝紫色固体纯品，即为成品同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针。
实施例二
如上所述的同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成方法，该合成方法包括如下步骤：
步骤一、市售对碘苯胺(220g,1mol)，加入硒粉(80g,1.05mol)，Cu2O(7g,0.05mol),乙二胺(3g,0.05mol)，KOH(30g,0.05mol)，DMSO(1000mL),180℃回流反应,3h。反应完毕倾入10L冰水中，搅拌，过滤，用大量水洗涤固体，干燥即得二-对氨基-苯硒醚，收率86％。
步骤二、将步骤一制得的二-对氨基苯硒醚置于5000ml三颈瓶中，加入500ml水和500ml乙醚，K2CO3500g。冰浴冷却条件下慢慢滴加化合物2-氯硒基苯甲酰氯210g(1.05mol)的乙醚溶液500ml，乳黄色沉淀生成，然后于35℃搅拌约12h，然后抽滤，取滤渣逐次用饱和碳酸氢钠溶液和纯化水清洗多次，干燥后用无水乙醇重结晶得淡黄色结晶，制得Eb-PSe-NH2。收率97％。
步骤三、取步骤二制得的Eb-PSe-NH2(95mL,0.5mol)和碘甲基三苯基碘化鏻(200g,0.5mol)加入到2L单口烧瓶中，加入磁子，加入500mL甲苯，搭建回流装置，回流反应24h，然后停止反应冷却至室温，减压除去溶剂，过滤，固体用乙醚(3×100mL)洗涤，得到粉红色晶体，干燥称重，制得2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐，收率 93％；
步骤四、向步骤三制得的2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐中加入2-氯-1-甲酰基-3-羟甲烯基环己烯(94g，0.5mol)，并向其中加入500mL正丁醇和甲苯的混合溶液(体积比7： 3)至溶解，之后回流反应12h，制得Cy.7.Cl，备用；
步骤五、按照等摩尔量取步骤二制得的Eb-PSe-NH2和步骤四制得的Cy.7.Cl，向混合物中加入500mL甲苯至溶解，加入Cy.7.Cl质量25％的三乙胺作为缚酸剂，回流反应24h，之后用硅胶柱层析分离得蓝紫色固体纯品，即为成品同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针。
实施例三
如上所述的同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成方法，该合成方法包括如下步骤：
步骤一、市售对碘苯胺(220g,1mol)，加入硒粉(40g,0.5mol)，Cu2O(7g,0.05mol),乙二胺 (3g,0.05mol)，KOH(30g,0.05mol)，DMSO(1000mL),120℃微波反应,1h。反应完毕倾入10L冰水中，搅拌，过滤，用大量水洗涤固体，干燥即得二-对氨基-苯硒醚，收率90％。
步骤二、将步骤一制得的二-对氨基苯硒醚置于3000ml三颈瓶中，加入500ml乙腈，K2CO3300g。冰浴冷却条件下慢慢滴加化合物2-氯硒基苯甲酰氯165g(0.75mol)的乙醚溶液300ml，乳黄色沉淀生成，然后于15℃搅拌约6h，然后抽滤，取滤渣逐次用饱和碳酸氢钠溶液和纯化水清洗多次，干燥后用无水乙醇重结晶得淡黄色结晶，制得Eb-PSe-NH2。收率 98％。
步骤三、取步骤二制得的Eb-PSe-NH2(95mL,0.5mol)和碘乙基三苯基碘化鏻(200g,0.5mol)加入到2L单口烧瓶中，加入磁子，加入500mL甲苯，搭建回流装置，回流反应12h，然后停止反应冷却至室温，减压除去溶剂，过滤，固体用乙醚(3×100mL)洗涤，得到粉红色晶体，干燥称重，制得2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐，收率 92％；
步骤四、向步骤三制得的2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐中加入2-氯-1-甲酰基-3-羟甲烯基环己烯(94g，0.5mol)，并向其中加入750mL正丁醇和甲苯的混合溶液至溶解，其中，正丁醇和甲苯的体积比为7：3，之后回流反应6h，制得Cy.7.Cl，备用；
步骤五、按照等摩尔量取步骤二制得的Eb-PSe-NH2和步骤四制得的Cy.7.Cl，向混合物中加入300mL甲苯至溶解，加入Cy.7.Cl质量25％的碳酸钾作为缚酸剂，回流反应6h，之后用硅胶柱层析分离得蓝紫色固体纯品，即为成品同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针。
试验研究数据
(1)近红外荧光探针对H2O2/GSH的荧光应答
测试利用本发明合成方法合成的近红外荧光探针在模拟生物体条件下(Tris-HCl缓冲溶液， pH 7.4，终浓度20mM)，与不同浓度的H2O2/GSH作用及探针空白的荧光发射光谱。体系中没有H2O2存在时，GSH催化还原依布硒林开环导致荧光减弱。当H2O2存在时，与GSH 开启“乒乓机制”，开环的依布硒林被阻止，探针荧光增强。
(2)近红外荧光探针对ONOO-/GSH的荧光应答
测试利用本发明合成方法合成的近红外荧光探针在模拟生物体条件下(Tris-HCl缓冲溶液， pH 7.4，终浓度20mM)，与不同浓度的ONOO-/GSH作用及探针空白的荧光发射光谱。体系中没有ONOO-存在时，GSH催化还原依布硒林开环导致荧光减弱。当ONOO-存在时，氧化二苯硒醚，探针荧光增强。
(3)近红外荧光探针对H2O2/GSH和ONOO-/GSH的双重应答
测试利用本发明合成方法合成的近红外荧光探针在模拟生物体条件下(Tris-HCl缓冲溶液， pH 7.4，终浓度20mM)，与不同浓度的H2O2/GSH和ONOO-/GSH及探针空白的荧光发射光谱。体系中没有H2O2和ONOO-同时存在时，GSH催化还原依布硒林开环导致荧光减弱。当 H2O2和ONOO-同时存在时，氧化二苯硒醚，探针荧光增强。
如图1所示，本发明的检测过氧化氢(H2O2)和过氧化亚硝基阴离子(ONOO-)近红外荧光探针的设计原理，是将依布硒林和二苯硒醚，按照分子结构共振能量转移的荧光发生规则，同时引入到一个含有线粒体靶向基团的近红外荧光染料中，发挥有机硒化合物的类似GSH-Px仿生酶作用的氧化还原反应，在细胞内谷胱甘肽(GSH)的协同作用下，产生“开关”效应，带来荧光吸收和强度的增强或弱化，从而实现细胞线粒体内H2O2和ONOO-的同步、差异化定量检测。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例描述如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述所述技术内容作出的些许更动或修饰均为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (10)
1.同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针，其特征在于：该近红外荧光探针具有下列结构：
。
2.根据权利要求1所述的同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成方法，其特征在于：该合成方法包括如下步骤：
步骤一、按照对碘苯胺：硒：Cu2O：乙二胺：KOH=1:0.5-1.05：0.01-0.05:0.01-0.05:0.01-0.05的摩尔比依次取对碘苯胺、硒、Cu2O、乙二胺和KOH进行混合，之后向所得混合物中加入其质量10-12倍的DMSO溶剂，充分搅拌至完全溶解后，加热至100-180℃进行微波反应1-3h，过滤，并对所得滤渣进行干燥，制得二对氨基苯硒醚，备用；
步骤二、按照二对氨基苯硒醚：2-氯硒基苯甲酰氯=1:1的摩尔比称取2-氯硒基苯甲酰氯，加入到步骤一制得的二对氨基苯硒醚中，之后再向其中加入乙醚和水的混合溶剂400-1000mL，在室温下搅拌2-5h，过滤，并对所得滤渣进行干燥，制得2-(4-(4-氨基-苯基)-硒代)-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮，备用；
步骤三、另称取与步骤二制得的2-(4-(4-氨基-苯基)-硒代)-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮等摩尔量的碘乙基三苯基碘化鏻，并与步骤二制得的2-(4-(4-氨基-苯基)-硒代)-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮混合，混合后向其中加入甲苯至溶解，之后回流反应6-24h，制得2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐，备用；
步骤四、按照2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐：2-氯-1-甲酰基-3-羟甲烯基环己烯=1:1的摩尔比称取2-氯-1-甲酰基-3-羟甲烯基环己烯，加入到步骤三制得的2,3,3-三甲基-1-三苯基鏻乙基-3H-吲哚盐中，之后向其中加入醋酸钠和醋酸酐至溶解，在室温下反应2-12h，制得花青素染料7-氯取代物，备用；
步骤五、按照等摩尔量取步骤二制得的2-(4-(4-氨基-苯基)-硒代)-苯基-1,2-苯并异硒唑-3(2H)-酮和步骤四制得的花青素染料7-氯取代物混合，向混合物中加入甲苯至溶解，回流反应6-24h，之后用硅胶柱层析分离得蓝紫色固体纯品，即为成品同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针。
3.如权利要求2所述的同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤一所述干燥时温度为15-60℃。
4.如权利要求2所述的同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤二所述乙醚和水的混合溶剂中，乙醚和水的体积比为1:1。
5.如权利要求2所述的同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤二所述乙醚和水的混合溶剂替换为乙腈或者二氯甲烷。
6.如权利要求2所述的同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤三所述碘乙基三苯基碘化鏻替换为碘甲基三苯基碘化鏻。
7.如权利要求2所述的同时检测过氧化氢和过氧化亚硝基阴离子的近红外荧光探针的合成方法，其特征在于：步骤四加入醋酸钠和醋酸酐替换为加入正丁醇和甲苯的混合溶液，其中正丁醇和甲苯的体积比为7:3。
8.如权利要求1所述的近红外荧光探针在细胞内H2O2和ONOO-的差异化同时定量检测中的应用。
9.如权利要求1所述的近红外荧光探针在动态观测研究活线粒体内活性氧自由基的产生、代谢、相互转化及其动态损伤生物机体的过程通路及机制中的应用。
10.如权利要求1所述的近红外荧光探针在细胞活性、细胞毒性、细胞凋亡、细胞膜电位以及细胞周期的指标检测中的应用。
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