CN109836420A - 一种化合物、其制备方法及作为荧光探针的应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种化合物I，其制备方法及作为荧光探针的应用。该化合物I具有近红外激发/发射，其中激发波长范围为500nm‑750nm，以最大吸收波长670nm激发，发射波长为700‑810nm；此外，该化合物I还对PGP‑1酶具有超高灵敏度响应，在λex/em＝670/700nm情况下对PGP‑1酶的检测限为0.18ng/mL。该化合物I用作荧光探针，首次实现了PGP‑1在体内的检测和荧光成像，可以实现体外、细胞和体内PGP‑1的检测及荧光成像，并且可以对所有有炎性反应和癌变的细胞和组织进行检测分析和成像。

Description

一种化合物、其制备方法及作为荧光探针的应用
技术领域
本申请涉及一种化合物、其制备方法及作为荧光探针的应用，属于荧光探针领域。
背景技术
天然存在的或人工合成的多肽和蛋白质末端封端基团大多是以乙酰基、甲酰基、焦谷氨酰基(pGlu)这三类封端含N末端的基团。其中以焦谷氨酰基封端的激素、多肽、蛋白质，直至目前，研究发现在生物体内或体外降解过程中只能通过焦谷氨酸氨基肽酶进行酶促解。
自1968年Doolittle和Armentrout第一次报道焦谷氨酸氨基肽酶1(英文Pyroglutamyl peptidase 1，简写为PGP-1)以来，科研人员对焦谷氨酸氨基肽酶的结构和功能进行了深入、细致的研究，发现其在神经信号通路的调节、传输以及机体的代谢调节中起着非常重要且最基础的作用。
目前在生物体内发现的焦谷氨酸氨基肽酶有三种：焦谷氨酸氨基肽酶1、焦谷氨酸氨基肽酶2以及存在于血清中的焦谷氨酸氨基肽酶3。其中，存在于血清中的焦谷氨酸氨基肽酶3表现出了与焦谷氨酸氨基肽酶2非常相似的特性，即高度的底物专一性：只对促甲状腺素释放激素(TRH)、及与其结构非常类似的促黄体素释放激素(LHRH)等极少数三肽激素进行酶促解。相比于焦谷氨酸氨基肽酶2和血清中焦谷氨酸氨基肽酶3严苛的底物专一性，焦谷氨酸氨基肽酶1表现出了广泛的底物专一性。除了端基为Glu-Pro结构的多肽和蛋白质，焦谷氨酸氨基肽酶1对其他所有含有Glu封端的二肽、多肽及蛋白质均可以进行酶解反应。值得一提的是，绝大多数的免疫球蛋白类的蛋白质是以谷氨酰胺封端的，封端的谷氨酰胺在刺激下往往又会通过环化反应形成以焦谷氨酸封端的蛋白质。因此设计一种对焦谷氨酸氨基肽酶1高灵敏度响应、且具有优异的选择性的探针，对于生物体信号通路、机体代谢、免疫反应及病变的研究，将会是一件非常重要且有意义的工作。
目前，虽然很多的科研工作者对三种类型的焦谷氨酸氨基肽酶的分布、结构和功能进行了大量的深入研究，但是在对焦谷氨酸氨基肽酶响应的探针设计方面所做的研究工作却很少。目前仅有两种可用于检测焦谷氨酸氨基肽酶1的探针，已商品化的L-焦谷氨酸-7胺基-4-甲基香豆素(CAS:66642-36-2,λex/em＝340/440nm,检测限14.6ng/mL)；还有就是基于甲酚紫合成的PGP-1酶响应探针(λex/em＝585/625nm,检测限5.6ng/mL,Chem.Sci.,2016,7,4694)。由这两种探针的激发/发射波长及检测限可以看出，这两种探针在酶的分析和检测方面存在很大不足，尤其是商品化的探针，其激发波长在紫外区，这对于细胞和生物体的检测是非常不利的，而且其较高的检测限也不利于低含量PGP-1的检测。除此之外，紫外和可见光的激发对生物体的穿透深度很有限，无法实现生物体内PGP-1的检测和成像。
到目前为止，能用于生物体内PGP-1的检测和成像的探针还未见报道。
发明内容
根据本申请的一个方面，提供一种化合物I，该化合物I具有近红外激发/发射，其中激发波长或吸收波长范围为500nm-750nm，以最大吸收波长670nm激发，发射波长为700-810nm；此外，该化合物I还对PGP-1酶具有超高灵敏度响应，在λex/em＝670/700nm情况下对PGP-1酶的检测限为0.18ng/mL。
所述化合物I包括有机阳离子和无机阴离子；
所述有机阳离子选自具有式I所示化学式的阳离子中的至少一种；
式I中，R101、R102、R103、R104、R106、R107、R108、R109、R110、R111、R112、R113、R114、R115、R116、R117、R118、R119独立地选自氢、C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；R105选自氢、C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基。
所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种。
可选择地，所述无机阴离子选自一价无机阴离子中的至少一种。优选地，所述无机阴离子选自氟离子、氯离子、溴离子、碘离子、硝酸根离子中的至少一种。
优选地，所述式I中，R101、R102、R103、R104、R106、R107、R108、R109、R110、R111、R112、R113、R114、R115、R116、R117是氢；R105、R118、R119独立地选自氢、C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种。
进一步优选地，所述式I中，R101、R102、R103、R104、R106、R107、R108、R109、R110、R111、R112、R113、R114、R115、R116、R117是氢；R105是丙基；R118和R119是甲基。即，化合物I中的有机阳离子的结构式如式V所示，其化学式为：C34H37N2O3 +；英文名称为：3,3-Dimethyl-2-(2-{6-[2-oxo-2-(5-oxo-pyrrolidin-2-yl)-ethyl]-2,3-dihydro-1H-xanthen-s-yl}-vinyl)-1-propyl-3H-indolium；
作为一种实施方式，所述化合物I的激发波长或吸收波长范围是500nm～750nm。
作为一种实施方式，所述化合物I的发射波长范围是700nm～810nm。
根据本申请的又一方面，提供了所述化合物I的制备方法，包括如下步骤：
a)向含有化合物II和化合物III的溶液中加入碱性活化剂活化后，经水洗、干燥，得到混合物A；
所述化合物II选自具有式II所示化学式的化合物中的至少一种：
式II中，R201、R202、R203、R204、R206、R207、R208、R209、R210、R211、R212、R213、R215、R216、R217、R218、R219、R220、R221、R222、R223、R224独立地选自氢、C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；R205、R214独立地选自氢、C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种；X1、X2独立地选自F、Cl、Br、I；
所述化合物III选自具有式III所示化学式的化合物中的至少一种：
式III中，R301、R302、R303、R304独立地选自氢、C1～C5的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种；
b)向混合物A中加入催化剂，在非活性气氛中，于60～80℃下反应后，经水洗、干燥，得到混合物B；
c)采用有机碱和/或无机碱的方法活化化合物IV，得到活化后的化合物IV；
所述化合物IV选自具有式IV所示化学式的化合物中的至少一种：
式IV中，R401、R402、R403、R404、R408独立地选自氢、C1～C20的烷烃基；R405、R406、R407独立地选自C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种；
d)将活化后的化合物IV与混合物B混合后，于-10℃～80℃下反应0.01h-24h，待反应完全后经水洗、干燥，得到混合物C；
e)将酸性试剂加入混合物C中进行脱羧反应，反应完全后，经干燥、提纯后，即得所述化合物I。
优选地，所述式II中，R201、R202、R203、R204、R206、R207、R208、R209、R210、R211、R212、R213、R215、R216、R217、R218、R221和R222是氢；R205、R214、R219、R220、R223、R224独立地选自氢、C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种。
优选地，所述式III中，R301、R302、R303和R304是氢。
优选地，所述式IV中，R401、R402、R403、R404、R408是氢；R405、R406、R407独立地选自C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种。
可选地，所述步骤a)中含有化合物II和化合物III的溶液为溶解和/或分散了化合物II和化合物III的有机溶液。有机溶剂选自常见的有机溶剂，如低级醇、卤代烃、环己烷、石油醚、乙酸乙酯、乙腈、四氢呋喃、吡啶、二氧六环、丙酮、甲乙酮、DMF、DMSO中的至少一种。
本领域技术人员可根据实际需要选择化合物II、化合物III与碱性活化剂的比例。作为一种实施方式，所述步骤a)中化合物II、化合物III和碱性活化剂的摩尔比为：
化合物II、化合物III和碱性活化剂＝1：1～3：1～5。
优选地，所述步骤a)中化合物II和化合物III的摩尔比为1:1。
可选择地，所述步骤a)中的碱性活化剂选自NaH、CaH2、KH、NaOH、KOH、Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、MgCO3、Mg(HCO3)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、三甲胺、三乙胺、DBN、DBU、醇钠中的至少一种。
优选地，所述步骤a)中加入碱性活化剂活化为加入碱性活化剂后，于10℃～40℃下(优选室温)搅拌4～6小时。进一步优选地，所述步骤a)中加入碱性活化剂活化为加入碱性活化剂后，于优选室温下搅拌4～6小时。
可选择地，所述步骤b)中的非活性气氛选自氮气、氦气、氩气中的至少一种。优选地，所述步骤b)中的非活性气氛为氮气。
可选择地，所述步骤b)中的催化剂选自FeCl2、SnCl2、CuCl、CoCl、PbCl2中的至少一种。
本领域技术人员可根据实际需要选择催化剂与混合物A的比例。优选地，所述步骤b)中的催化剂与混合物A的摩尔比为：
催化剂：混合物A＝1:1～5:1。
可选地，所述步骤c)中活化化合物IV的方法包括：采用有机碱和/或无机碱活化剂活化化合物IV。进一步优选地，所述活化剂选自用于酰胺化反应的活化剂。更进一步优选地，所述活化剂选自N,N-二异丙基乙胺(简写为DIPEA)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(简写为HATU)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐(简写为EDCI)、1-羟基苯并三唑(简写为HOBT)、N-羟基琥珀酰亚胺(简写为NHS)中的至少一种。
本领域技术人员可根据实际需要选择活化后的化合物IV与混合物B的比例。优选地，所述步骤d)中活化后的化合物IV与混合物B的摩尔比为：
活化后的化合物IV：混合物B＝1:1～5:1。
可选择地，所述步骤e)为在不超过0℃的温度下将-酸性试剂加入混合物C中，然后温度升至10℃～40℃(优选为室温)进行反应。
可选择地，所述步骤e)中的酸性试剂选自三氟乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、冰乙酸、甲酸、对甲苯磺酸中的至少一种。优选地，所述步骤e)中的酸性试剂为三氟乙酸。
可选择地，所述步骤a)、步骤b)、步骤c)、步骤d)、步骤e)中的水洗为将待洗涤混合物与水混合后，用分液漏斗分离水相和有机相，保留有机相。
可选择地，所述步骤a)、步骤b)、步骤c)、步骤d)、步骤e)中的干燥均为旋转蒸发干燥，目的是除去体系中的水和有机溶剂。
作为一种具体的实施方式，所述化合物I的制备步骤如下：
(1)在100毫升圆底烧瓶中，加入IR-780(1mmol)和间硝基苯酚(1mmol)溶于有机溶剂中，加入碱性活化剂，室温搅拌4-6小时，水洗三遍，旋干溶剂；(2)往(1)中加入适量的催化剂，氮气保护下，70摄氏度反应过夜，混合物水洗三遍，旋干溶剂；(3)将活化后的BOC-焦谷氨酸加入(2)中，室温反应8h，混合物水洗3遍，旋干溶剂；(4)在0摄氏度下往(3)中缓慢滴加三氟乙酸，室温反应，根据点板判断反应程度，旋干溶剂，过柱提纯(二氯甲烷/甲醇：5/1，体积比)，得到所述化合物I。
根据本申请的又一方面，提供了一种荧光探针，与目前已知的用于PGP-1检测和成像的荧光探针相比，该荧光探针具有最长的激发波长和发射波长，长波长的激发/发射首次实现了PGP-1在体内的检测和荧光成像；该荧光探针可以实现体外、细胞和体内PGP-1的检测及荧光成像，并且可以对所有有炎性反应和癌变的细胞和组织进行检测分析和成像。此外，与目前已知的用于PGP-1检测和成像的荧光探针相比，该荧光探针对PGP-1具有最低的检测限和最高的检测灵敏度。
所述荧光探针包括所述化合物I、根据所述方法制备得到的化合物I中的至少一种。
可选择地，所述荧光探针用于检测焦谷氨酸氨基肽酶1。所述荧光探针不仅可以特异性的识别焦谷氨酸氨基肽酶PGP-1，并以荧光增强的方式体现出来。
所述荧光探针在发射波长λex 670nm、激发波长λem 700nm对于焦谷氨酸氨基肽酶1的检测浓度下限不超过0.2ng/mL。
优选地，所述荧光探针在发射波长λex 670nm、激发波长λem 700nm对于焦谷氨酸氨基肽酶1的检测浓度下限为0.18ng/mL。
根据本申请的又一方面，提供了所述化合物I、根据所述方法制备得到的化合物I中的至少一种在制备用于检测焦谷氨酸氨基肽酶1的检测试剂和/或焦谷氨酸氨基肽酶1成像试剂中应用。
根据本申请的又一方面，提供了所述化合物I、根据所述方法制备得到的化合物I中的至少一种在制备用于检测炎症细胞的检测试剂和/或炎症细胞成像试剂中应用。
根据本申请的又一方面，提供了所述化合物I、根据所述方法制备得到的化合物I中的至少一种在制备用于检测癌变细胞的检测试剂和/或癌变细胞成像试剂中应用。
根据本申请的又一方面，提供了所述化合物I、根据所述方法制备得到的化合物I中的至少一种在制备用于评价消炎药物和/或癌症治疗药物的疗效的检测试剂和/或成像试剂中应用。
本申请中，“烷烃基”为烷烃分子失去任意一个氢原子所形成的基团。所述烷烃分子包括直链烷烃、支链烷烃、环烷烃。
本申请中，“C1～C20”表示含有的碳原子数为1～20；例如，“C1～C20的烷烃基”表示碳原子数为(1～20)1、2、3、4或5的烷烃分子失去任意一个氢原子所形成的基团。
本申请中，“含有取代基的烷烃基”为烷烃基上至少一个氢原子被取代基取代所形成的基团。“C1～C20含有取代基的烷烃基”为含有1～20个碳原子数的烷烃基上，至少一个氢原子被取代基取代所形成的基团。
本申请的有益效果包括但不限于：
(1)本申请所提供的化合物I，具有近红外激发/发射，其中激发波长范围为500nm-750nm，以最大吸收波长670nm激发，发射波长为700-810nm；此外，该化合物I还对PGP-1酶具有超高灵敏度响应，在λex/em＝670/700nm情况下对PGP-1酶的检测限为0.18ng/mL。
(2)本申请所提供的化合物I的制备方法，可以高纯度、高产率的得到化合物I。
(3)本申请所提供的荧光探针，不仅可以特异性的识别焦谷氨酸氨基肽酶PGP-1，并以荧光增强的方式体现出来。
(4)本申请所提供的荧光探针，与目前已知的用于PGP-1检测和成像的荧光探针相比，该荧光探针具有最长的激发波长和发射波长，长波长的激发/发射首次实现了PGP-1在体内的检测和荧光成像；该荧光探针可以实现体外、细胞和体内PGP-1的检测及荧光成像，并且可以对所有有炎性反应和癌变的细胞和组织进行检测分析和成像。
(5)本申请所提供的荧光探针，与目前已知的用于PGP-1检测和成像的荧光探针相比，该荧光探针对PGP-1具有最低的检测限和最高的检测灵敏度。
(6)鉴于有炎症和癌变的细胞/组织中PGP-1的表达会高于正常细胞/组织，本申请所提供的荧光探针可用于炎症和癌症的检测分析和成像。
附图说明
图1(a)是样品1#的1HNMR谱图。
图1(b)是样品1#的13CNMR谱图。
图2是样品1#的高分辨质谱图。
图3是样品1#与PGP-1酶在磷酸盐缓冲液中反应前后的吸收曲线，pH＝7.4。
图4是样品1#在不同pH下与PGP-1酶反应的荧光增强实验，激发波长为670nm；其中，线1是5μM样品1#的荧光结果，线2是5μM样品1#与100ng/mL PGP-1反应后的荧光结果。
图5是样品1#在不同温度下与PGP-1酶反应的荧光增强实验，激发波长为670nm，其中，线1是5μM样品1#的荧光结果，线2是5μM样品1#与100ng/mL PGP-1反应后的荧光结果。
图6是样品1#的选择性实验结果。
图7是样品1#对PGP-1酶检测限的测定结果。
图8是对比例中商业化探针对PGP-1酶检测限的测定结果。
图9是样品1#对细胞中PGP-1酶的荧光成像和定量分析结果；其中，(a)是荧光成像，(b)是定量分析。
图10是样品1#对小鼠体内PGP-1酶的荧光成像和定量分析结果；其中，(a)是荧光成像，(b)是定量分析。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
如无特殊说明，本申请所用原料和试剂均来自商业购买，未经处理直接使用，所用仪器设备采用厂家推荐的方案和参数。
实施例中，商业化探针L-焦谷氨酸-7-胺基-4-甲基香豆素(CAS:66642-36-2)购自Sigma-Aldrich。
实施例中，IR-780碘化物购自Sigma-Aldrich。
实施例中，所用催化剂购自国药、Aladdin、Sigma-Aldrich。
实施例中，核磁共振氢谱1H-NMR在布鲁克公司(Bruker)的400AVANCEⅢ型分光仪(Spectrometer)上测定，400MHz，CD3OD；碳谱13C-NMR，400MHz，CD3OD。
实施例中，电子轰击质谱MS(EI)采用AB Sciex公司的TripleTOF 4600型质谱仪。
实施例中，荧光测试在法国Horiba公司的FL3-111型仪器测定。
化合物I的产率，以化合物II的量为基准，通过以下公式计算得到：
产率％＝(目标产物实际得到的质量÷目标产物理论上应得到的质量)×100％。
实施例1化合物I样品1#的制备
在100毫升圆底烧瓶中，加入IR-780碘化合物(1mmol)和间硝基苯酚(1mmol)溶于10mL的有机溶剂乙腈中，加入2mol的碱性活化剂Na2CO3，室温搅拌4小时后，经水洗三遍，在40℃下旋转蒸发干燥，得到混合物A。向混合物A中加入2mol的催化剂SnCl2，氮气保护下，70℃反应8小时，混合物水洗三遍，在40℃下旋转蒸发干燥，得到混合物B。采用DIPEA和HATU对BOC-焦谷氨酸进行活化，得到活化后的BOC-焦谷氨酸。将2mol活化后的BOC-焦谷氨酸加入混合物B，室温下反应8h经水洗3遍，在40℃下旋转蒸发干燥，得到混合物C。在0℃下向混合物C中缓慢滴加2ml三氟乙酸，室温下反应3h；反应完全后在40℃下旋转蒸发干燥，过硅胶柱提纯，二氯甲烷与甲醇体积比为5/1的混合溶剂)，得到所述化合物I，记为样品1#，产率为70％。
样品1#的1H NMR谱和13C NMR谱图分别如图1(a)和图1(b)所示。样品1#的高分辨质谱图如图2所示，可以看出，样品1#的分子量为522.2745。
实施例2化合物I样品2#～样品6#的制备
具体步骤同样品1#的制备，不同之处在于，制备条件根据表1中变化(表1中未指明的条件与实施例1中样品1#的制备条件相同)，分别得到样品2#～样品6#。
表1
样品2#～样品6#的核磁表征结果和高分辨质谱同样品1#。
实施例3化合物I样品7#的制备
(1)在100毫升圆底烧瓶中，加入2,3,3-三甲基吲哚、4-溴丁酸和1,2二氯苯，升温到110摄氏度反应12小时，乙酸乙酯沉淀、抽滤，得到粉色的沉淀物；(2)往环己酮中加入二氯甲烷、N,N-二甲基甲酰胺、三氯氧磷，回流状态下反应2小时，倒入水中进行沉淀、抽滤，得到黄色的沉淀物；(3)将(1)和(2)得到的沉淀物加入到乙酸酐溶剂中，同时加入乙酸钠70摄氏度反应40分钟后倒入水溶液中进行沉淀，得到绿色的沉淀物；(4)往(3)中加入间硝基苯酚和适量催化剂，氮气保护下，70摄氏度反应过夜，混合物水洗三遍，旋干溶剂；(5)将活化后的BOC-焦谷氨酸加入(4)中，室温反应8小时，混合物水洗3遍，旋干溶剂；(6)在0摄氏度下往(5)中缓慢滴加三氟乙酸，室温反应3小时，旋干溶剂，过柱提纯(二氯甲烷/甲醇：5/1，体积比)，得到带官能团的化合物I，记为样品7#。
样品7#与样品1#具有相同的功能。
实施例4化合物I对PGP-1酶反应前后吸收光谱的变化
在具刻度小试管中，加入5μL的探针溶液(溶剂为DMSO)，再加入5μL的PGP-1酶溶液(溶剂为超纯水)，用磷酸盐缓冲液将体系定容至1mL，得到反应前体系1，探针和PGP-1的终浓度分别为5μM和5μg/mL；反应前体系于37℃下反应30min，得到反应后体系2。
分别对反应前体系1和反应后体系2进行吸收光谱测定，结果如图3所示。图3中线对应反应前体系1，线2对应反应后体系2。由图3可以看出，本申请化合物I与酶反应后的吸收波长为500～750nm，因此荧光检测时的激发波长可为500～750nm。
实施例5pH值对化合物I与PGP-1酶反应的影响
使用HCl和NaOH溶液调整标准的磷酸盐缓冲液的pH，分别得到pH为5、6、7、8、9的缓冲溶液。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液，并分别用上述不同pH值的缓冲溶液将体系定容至2mL，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针终浓度为5μM(结果对于图4中线1)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和10μL的PGP-1酶溶液，并分别用上述不同pH值的缓冲溶液将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和PGP-1的终浓度分别为5μM和100ng/mL(结果对于图4中线2)。
结果如图4所示，由图可以看出，本申请所提供的化合物I在很宽的pH范围内均可进行PGP-1的检测和成像。
实施例6温度对化合物I与PGP-1酶反应的影响
使用恒温摇床、设定不同的反应温度，温度设定为从25℃到42℃，进行荧光光谱的测定，具体为：
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL，在不同温度下反应30min，然后进行荧光光谱的测定，探针终浓度为5μM(结果对于图5中线1)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和10μL的PGP-1酶溶液，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，在不同温度下反应30min，然后进行荧光光谱测定，探针和PGP-1的终浓度分别为5μM和100ng/mL(结果对于图5中线2)。
结果如图5所示，由图可以看出，本申请所提供的化合物I在很大的温度范围内均可进行PGP-1的检测和成像。
实施例7化合物I对PGP-1酶的特异性识别
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL，作为对照组进行荧光光谱测定，探针终浓度为5μM(结果对应图6中测试体系1)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.3mmol的KCl，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和KCl的终浓度分别为5μM和150mM(结果对应图6中体系2)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.004mmol的CaCl2，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和CaCl2的终浓度分别为5μM和2mM(结果对应图6中体系3)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.2μmol的ZnCl2，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和ZnCl2的终浓度分别为5μM和100μM(结果对应图6中体系4)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.004mmol的MgCl2，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和MgCl2的终浓度分别为5μM和2mM(结果对应图6中体系5)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.2μmol的CuCl2，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和MgCl2的终浓度分别为5μM和100μM(结果对应图6中体系6)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.02mmol的葡萄糖，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和葡萄糖的终浓度分别为5μM和10mM(结果对应图6中体系7)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.002mmol的半胱氨酸，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和半胱氨酸的终浓度分别为5μM和1mM(结果对应图6中体系8)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.010mmol的谷胱甘肽，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和谷胱甘肽的终浓度分别为5μM和5mM(结果对应图6中体系9)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.02μmol的ClO–，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和ClO–的终浓度分别为5μM和10μM(结果对应图6中体系10)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.002mmol的色氨酸，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和色氨酸的终浓度分别为5μM和1mM(结果对应图6中体系11)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.002mmol的丙氨酸，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和丙氨酸的终浓度分别为5μM和1mM(结果对应图6中体系12)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.002mmol的赖氨酸，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和赖氨酸的终浓度分别为5μM和1mM(结果对应图6中体系13)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和0.002mmol的苏氨酸，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和苏氨酸的终浓度分别为5μM和1mM(结果对应图6中体系14)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和4μg的酯酶，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和酯酶的终浓度分别为5μM和2μg/ml(结果对应图6中体系15)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和2μg的脯氨酸二肽酶，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定,探针和脯氨酸二肽酶的终浓度分别为5μM和1μg/ml(结果对应图6中体系16)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和4μg的胰蛋白酶，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和胰蛋白酶的终浓度分别为5μM和2μg/ml(结果对应图6中体系17)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和600ng的亮氨酸氨肽酶，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和亮氨酸氨肽酶的终浓度分别为5μM和300ng/ml(结果对应图6中体系18)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和2μg的成纤维细胞激活蛋白，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和成纤维细胞激活蛋白的终浓度分别为5μM和1μg/ml(结果对应图6中体系19)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和600ng的二肽基肽酶4，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和二肽基肽酶4的终浓度分别为5μM和300ng/ml(结果对应图6中体系20)。
在具刻度小试管中，加入10μL的探针溶液和60ng的PGP-1酶，用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)将体系定容至2mL后，于37℃下反应30min，进行荧光光谱测定，探针和PGP-1酶的终浓度分别为5μM和30ng/ml(结果对应图6中体系21)。
由图6可以看出，本申请所提供的化合物I对PGP-1具有优异的选择性。
实施例8化合物I对PGP-1酶的检测限测定
首先配置一系列不同浓度的PGP-1酶体系；其次往具刻度试管中分别加入PGP-1酶溶液和探针溶液；然后用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)配置成终体积为2mL的溶液；放入37℃的摇床中反应30min后，进行荧光光谱测定，激发波长670nm、发射波长700nm。探针终浓度为5μM；PGP-1酶终浓度分别为0.01ng/mL、0.03ng/mL、0.06ng/mL、0.10ng/mL、0.15ng/mL、0.20ng/mL、0.25ng/mL。
结果如图7所示，根据检测限的计算公式：3S/m，S是空白试剂的标准偏差，n＝11，m是线性方程的斜率，最后计算本申请所提供的化合物I对PGP-1酶的检测限为0.18ng/mL，据我们所知这是目前所测得的最低检测限。
对比例1商业荧光探针对PGP-1酶的检测限测定
首先配置一系列不同浓度的PGP-1酶体系；其次往具刻度试管中分别加入PGP-1酶溶液和商品化探针(CAS:66642-36-2)；然后用磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)配置成终体积为2mL的溶液；放入37℃的摇床中反应30min后，进行荧光光谱测定，激发波长340nm、发射波长440nm。探针终浓度为5μM；PGP-1酶终浓度分别为50ng/mL、75ng/mL、125ng/mL、150ng/mL、175ng/mL、225ng/mL、300ng/mL。
结果如图8所示，根据检测限的计算公式：3S/m，S是空白试剂的标准偏差，n＝11，m是线性方程的斜率，最后计算本申请所提供的化合物I对PGP-1酶的检测限为14.6ng/mL，这一结果远远高于本申请所提供的化合物I的检测限。
实施例9化合物I对细胞内PGP-1酶的荧光成像和半定量检测
将RAW264.9细胞(来自江苏凯基生物技术有限公司)于37℃、5％的二氧化碳培养箱中进行培养，根据实验目的的不同可与不同的药物进行共孵育，该实施例研究了药物刺激对PGP-1含量的影响。
图9中的空白试验(control)细胞正常培养，1#和2#细胞与脂多糖共孵育12h(浓度分别为0.5μg/mL、1.0μg/mL)，孵育结束后用无血清的培养基洗涤3次，加入相同浓度的探针溶液(最终浓度5μM)，37℃下继续孵育30min，孵育完成后将未反应的探针用培养基洗去，然后进行细胞成像(图9左侧6个图)并可利用分析软件对荧光强度进行半定量分析(图9右侧图)。由图9可以看出，经药物刺激后的RAW细胞中PGP-1表达升高，并可利用分析软件对荧光强度进行半定量分析以表征不同浓度药物刺激下PGP-1的表达水平。同样地，利用本申请所提供的化合物I也可以进行药物抑制剂的研究和半定量分析。
实施例10化合物I对动物体内PGP-1酶的荧光成像和定量检测
本申请所提供的化合物I具有近红外波长的激发和发射，近红外穿透深度深的优势有利于实现荧光的体内成像，因此该实施例研究了探针在BABL/c小鼠的体内的检测和成像。本实施例通过在肝脏处进行皮内注射脂多糖，2h后经尾静脉注射100μL浓度为50μM的探针，使用小动物成像仪进行荧光成像，结果如图10(a)中2个图所示。1#老鼠为对照组，2#老鼠为肝脏处皮内注射脂多糖的实验组。图10(b)中柱1对应1#老鼠，柱2对应2#老鼠。由图10可以看出，在肝脏处注射脂多糖的实验组老鼠肝脏处的荧光信号显著高于对照组，说明经药物刺激后，肝脏处的PGP-1表达升高，本申请所提供的化合物I成功的实现了对体内PGP-1的特异性识别和荧光成像。
实施例11化合物I在癌症检测方面的应用
在非神经元细胞的分裂增殖过程中，PGP-1的表达与细胞增殖速度呈正相关。由于细胞的癌变可导致细胞的无限次、快速得分裂增殖，因此可以通过监测PGP-1在体内某一部位的含量变化预测这一部位的细胞增殖情况，进而为癌症的诊断做出判断参考。本实施例通过对建有宫颈癌病毒模型的BABL/c小鼠每天进行探针注射进行活体成像，观察种有病毒部位PGP-1的表达水平变化。实验发现PGP-1的表达与细胞的癌变有关，随着细胞癌变程度的加深，PGP-1的表达呈明显上升趋势，因此利用本探针的高灵敏度和对PGP-1的特异性识别有望实现对癌症最早期的检测。
实施例12化合物I在体内及细胞水平对抗癌药物的疗效的评估
因为细胞的癌变和PGP-1的表达呈正相关，所以可以通过把本发明制备的探针与治疗癌症的药物相结合使用，作为癌症药物治疗效果的评价。本实施例通过对接种MCF-7的BABL/c小鼠，在给药DOX治疗后进行探针注射，然后观察肿瘤区荧光信号强度的变化，结果表明小鼠癌变的程度与荧光信号的强度呈正相关，因此可以利用这一发现对癌症治疗的效果进行评价。
实施例13化合物I用于神经胶质细胞的成像和PGP-1的检测
PGP-1在神经胶质细胞中有特异性表达，因此可以用于检测脑胶质区的病变。本实施例通过对本发明制备的化合物I进行结构改造使得丙烷处的端基为羧基-COOH，然后通过化学合成的方法与一端带氨基的抗癌药物相连，再在外面包覆上双亲性的高分子形成胶束，通过尾静脉的注射方式注射到患有脑胶质瘤的小鼠中，通过对荧光的检测用于判断癌症治疗药物是否通过了血脑屏障系统(即BBB系统)。通过荧光强度的变化还可以进一步判断癌症的治疗效果。
实施例14化合物I用于动脉粥样硬化的检测
动脉粥样硬化斑块往往呈现炎性细胞浸湿，而PGP-1因为可以特异性的水解免疫类蛋白质，因此在炎性区域呈现高表达(实施例8、9均验证了这一结果)。本实施例基于动脉粥样硬化区的炎性高表达，因此通过把本发明制备的探针和用于临床中钆类造影剂相结合，通过MRI/FL双模态成像技术实现了斑块的准确定位。利用有机小分子探针进行体内荧光成像不仅可以在术前对病变区有一个精准的判断，而且在手术中也可以起到指导的作用，对于病变组织的精准切除起到了非常积极的作用。
实施例15化合物I用于关节处炎症的检测
因为细胞的炎性程度和PGP-1的表达呈正相关，所以本发明所制备的探针可以用于炎症区域的检测和成像。在本实施例中，通过建立关节炎的模型，实现了体内关节处炎症的病变程度检测和成像分析。具体实施方式是通过使用药品LPS皮下注射到BABL/c小鼠的脚掌处，分为不同浓度组和不同时间组，然后在脚的部位皮下注射探针，进行成像分析，并用免疫组化分析进行进一步验证分析。结果表明关节处的荧光强度与炎性程度呈正相关，因此本发明制备的探针可以用于对关节处炎症病变程度的分析和检测。
实施例16化合物I对体内及细胞水平对抗炎药物的疗效的评估
因为细胞和组织的炎性程度和PGP-1的表达呈正相关，所以可以通过把本发明制备的探针与用于治疗炎症的药物相结合使用，作为炎症药物治疗效果的评价。本实施例是在实施例14的基础上，对已患有关节炎的老鼠进行给抗炎药物的治疗，通过分析荧光强度的变化对抗炎药物的治疗效果进行评价。结果表明，荧光的强度与炎性程度呈正相关，因此本发明制备的探针不仅可以用于炎性组织的检测和成像，还可以用于对抗炎药物的疗效的评估。
以上所述，仅是本申请的几个实施例，并非对本申请做任何形式的限制，虽然本申请以较佳实施例揭示如上，然而并非用以限制本申请，任何熟悉本专业的技术人员，在不脱离本申请技术方案的范围内，利用上述揭示的技术内容做出些许的变动或修饰均等同于等效实施案例，均属于技术方案范围内。

Claims (10)

1.一种化合物I，其特征在于，所述化合物I包括有机阳离子和无机阴离子；
所述有机阳离子选自具有式I所示化学式的阳离子中的至少一种；
式I中，R101、R102、R103、R104、R106、R107、R108、R109、R110、R111、R112、R113、R114、R115、R116、R117、R118、R119独立地选自氢、C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；R105选自氢、C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；
所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的化合物I，其特征在于，所述式I中，R101、R102、R103、R104、R106、R107、R108、R109、R110、R111、R112、R113、R114、R115、R116、R117是氢；
R105、R118、R119独立地选自氢、C1～C20烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种。
3.根据权利要求2所述的化合物I，其特征在于，所述化合物I的激发波长或吸收波长范围是500nm～750nm；
优选地，所述化合物I的发射波长范围是700nm～810nm。
4.权利要求1至3任一项所述化合物I的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
a)向含有化合物II和化合物III的溶液中加入碱性活化剂活化后，经水洗、干燥，得到混合物A；
所述化合物II选自具有式II所示化学式的化合物中的至少一种：
式II中，R201、R202、R203、R204、R206、R207、R208、R209、R210、R211、R212、R213、R215、R216、R217、R218、R219、R220、R221、R222、R223、R224独立地选自氢、C1～C20的烷烃基；R205、R214独立地选自氢、C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种；X1、X2独立地选自F、Cl、Br、I；
所述化合物III选自具有式III所示化学式的化合物中的至少一种：
式III中，R301、R302、R303、R304独立地选自氢、C1～C5的烷烃基、C1～C5含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种；
b)向混合物A中加入催化剂，在非活性气氛中，于60～80℃下反应后，经水洗、干燥，得到混合物B；
c)采用有机碱和/或无机碱活化剂活化化合物IV，得到活化后的化合物IV；
所述化合物IV选自具有式IV所示化学式的化合物中的至少一种：
式IV中，R401、R402、R403、R404、R408独立地选自氢、C1～C20的烷烃基；R405、R406、R407、独立地选自C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种；
d)将活化后的化合物IV与混合物B混合后，于-10℃～80℃下反应0.01h～24h，经水洗、干燥，得到混合物C；
e)将酸性试剂加入混合物C中进行脱羧反应，反应完全后，经干燥、提纯后，即得所述化合物I；
优选地，所述式II中，R201、R202、R203、R204、R206、R207、R208、R209、R210、R211、R212、R213、R215、R216、R217、R218、R221和R222是氢；
R205、R214、R219、R220、R223、R224独立地选自氢、C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种；
所述式III中，R301、R302、R303、R304是氢；
所述式IV中，R401、R402、R403、R404、R408是氢；R405、R406、R407独立地选自C1～C20的烷烃基、C1～C20含有取代基的烷烃基；所述含有取代基的烷烃基中含有至少一个取代基；所述取代基选自羧基、氨基、巯基、酯基、酰胺基中的至少一种；
优选地，所述步骤a)中化合物II、化合物III和碱性活化剂的摩尔比为：
化合物II、化合物III和碱性活化剂＝1：1～3：1～5；
优选地，所述步骤a)中的碱性活化剂选自NaH、CaH2、KH、NaOH、KOH、Na2CO3、NaHCO3、K2CO3、KHCO3、MgCO3、Mg(HCO3)2、CaCO3、Ca(HCO3)2、三甲胺、三乙胺、DBN、DBU、醇钠中的至少一种；
优选地，所述步骤b)中的催化剂选自FeCl2、SnCl2、CuCl、CoCl2中的至少一种；
优选地，所述步骤b)中的催化剂与混合物A的摩尔比为：
催化剂：混合物A＝1:1～5:1；
优选地，所述步骤c)中活化化合物IV的活化剂包括N,N-二异丙基乙胺、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、1-羟基苯并三唑、N-羟基琥珀酰亚胺中的至少一种；
优选地，所述步骤d)中活化后的化合物IV与混合物B的质量比为：
活化后的化合物IV：混合物B＝1:1～5:1；
优选地，所述步骤e)中的酸性试剂选自三氟乙酸、盐酸、硫酸、硝酸、冰乙酸、甲酸、对甲苯磺酸中的至少一种。
5.一种荧光探针，其特征在于，包括权利要求1至3任一项所述的化合物I、根据权利要求4方法制备得到的化合物I中的至少一种。
6.根据权利要求5所述的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针用于检测焦谷氨酸氨基肽酶1；或者
所述荧光探针在发射波长λex 670nm、激发波长λem 700nm对于焦谷氨酸氨基肽酶1的检测浓度下限不超过0.2ng/mL；或者
所述荧光探针在发射波长λex 670nm、激发波长λem 700nm对于焦谷氨酸氨基肽酶1的检测浓度下限为0.18ng/mL。
7.权利要求1至3任一项所述的化合物I、根据权利要求4方法制备得到的化合物I中的至少一种在制备用于检测焦谷氨酸氨基肽酶1的检测试剂和/或焦谷氨酸氨基肽酶1成像试剂中应用。
8.权利要求1至3任一项所述的化合物I、根据权利要求4方法制备得到的化合物I中的至少一种在制备用于检测炎症细胞的检测试剂和/或炎症细胞成像试剂中应用。
9.权利要求1至3任一项所述的化合物I、根据权利要求4方法制备得到的化合物I中的至少一种在制备用于检测癌变细胞的检测试剂和/或癌变细胞成像试剂中应用。
10.权利要求1至3任一项所述的化合物I、根据权利要求4方法制备得到的化合物I中的至少一种在制备用于评价消炎药物和/或癌症治疗药物的疗效的检测试剂和/或成像试剂中应用。
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