TW313588B - - Google Patents
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Description
313588 A6 B6 經濟部中央揉準局典工消费合作社印製 五、發明説明(1 ) 荈明背# 本發明是有Μ於使用反應囊或反應装置與方法來放大及 偵測核酸物質。 DHA偵測,見述於歐洲專利申請案第381,501號,使用 的方法其中極微量的核酸物質的PC R放大作用與其偵測能 夠同時發生在一儷反應囊中•而保持埴些經放大的物質不 會漏失。六個暫時封閉的反應囊泡*也稱之為反應室,由 通道連接到反應室的偵测位址(detection site)。反懕囊, 泡依序為PCR反應室,第一次清洗反應室*酵素標記反應 室,其中含有如抗生蛋白鐽菌素一山葵過氧化物 (St reptav.i din horseradish peroxidase) (M 下文中稱 SA-HRP),第二次清洗反應室*含有對酵素反應的訊息物 質反應室,及停止反應溶液室。其中每一個都依序排空到 反應室•其内的一届偵測位址則用來捕捉放大的核酸物質 及產生可偵測的訊號。 兩僩清洗步驟使用了兩個清洗反懕室是符合偵測核酸物 質的傳統方法。例如,Vol. 30 of J . Clin Μ i r 〇 h i ο 1 . 845-853 (April, 1992)所"述的•為Roche所使用的方法 即為其中之一(P.846-847)。在生物素醯化產物 (biotinylated product)與固體壁表雜交作用之後,「我 們Μ清洗嫒衝液'1清洗反齡碟(Plate) 4次,K除去任何 未雜交的產物」。瑄4次清洗相當於歐洲專利申請案第 381,501號中所指反應囊中第一次清洗反應囊的第一次清 洗步驟。也就是任何「未雜交」於偵測位址的DHA或核酸 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4规格(210 X 297公;¢) 82.3. 40,000 --------------- -------裝------,玎---- f (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 313588 B6__ 五、發明説明(2 ) (請先閲讀背面之注意事項再瑱寫本頁) 物質都會被洗除的地方。之後,Roche步驟「於37T下與 抗生物素蛋白(avidin) —山奠遇氧化_ (horseradish peroxidase)结合體(conjugate)」作用。而此步驟正相當 於EPA反應囊之酵素反應囊泡的排空目的。之後· Roche 步驟「再次清洗反應碟四次以除去未鐽结的结合體J 。這 步驟當然相當於EPA 381,501反應囊中位於酵素反應囊與 訊號物質反懕囊之間的第二次清洗反應囊的步驟。 這些步驟•包括所有的清洗步驟·雖然相當有效,卻I 費時而昂貴的。而且清洗程序增加了反應搡作的複雑性。 然而•為了減少「非專一性的訊息J •即非目標物的未鍵 结核酸物質產生的訊息,或未_结的SA-HRP,這些程序被 認為是重要的。 因此,在本發明之前一直存在一個問題*能夠即使減少 至少一個清洗步驟,最好是兩個,而不會引起檢測中太多 雜訊使訊號不可靠,而能符合檢測结果。 我們已發現EPA 381,501中所述方法所用的反應形式合 乎減少一個或全部清洗反應囊泡,而结果幾乎完全相同。 更令人驚訝的是過去認為濟洗程序為重要的步驟。 娌濟部中央標準屬R工消费合作社印* 更明確地說•與本發明一部份相符的,這個問題由將放 大的核酸物質與包含了至少一儷固定化探針的檢測位址之 雜交作用*而獲得解決。在檢測,位址加入本身即是訊息物 質或能與訊息物質作用的檷記,使已雑交而目前不動 (now-iB«obilized)的核酸物質檷上了禰記*而能產生訊 號,再加入訊息物質,使之產生訊號。此部份的特點是* 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4现格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 經濟部中央標準局ec工消费合作杜印* A6 B6 五、發明説明(3 ) 直接在雑交步骤之後進行檷記步驟* 「可Μ不用J加人一 道清洗步睇。或者直接在標記步驟之後進行添加步骤 (adding step) 「可以不需要」一道清洗步驟。很明顯地 ,闞於這部份内容,是「不排除」的用法。 與本發明的另一部份相符的,使用至少一股目棵核酸為 棋板以放大及檢測核酸物質的装置•該裝置包括一個反應 室Μ放大核酸物霣樣品,一僩檢测位址以檢測放大的核酸 物質,及一個儲存室内有訊息物質及棵記•可有效產生可, 偵測的訊號,及連接各室與檢測位址的通道。這部份的特 點是,該装置更進一步地不超過一個清洗反應室内含的清 洗液體,完全沒有儲存或反懕室内所用的試劑。而且不超 過一個通道連接清洗室到檢測位址,所Μ在步驟系列中, 包括反應室内容物的排空及移到檢测位址的清洗步驟不超 過一個。 於是,這是本發明一個有利的意想不到的特微* Μ«免 至少一個清洗步驟的装置和方法來放大及檢測核酸物質。 在參考了下列詳细的描述之後•其他有利的特微將顯而 易見,按附圖解謅*其中 _1是根據本發明設計的反應装置的平面圖;而 圖2及3是類似圈1的平面圔*但顯示本發明的各種形式 • - * 圖4A-4C是描述本發明的假設櫬制的部份斷面圖 (fragaentary section views) > 圓5A-5B及6A-6B是顯示本發明執行時所得之重覆顔色 本紙張尺度適用中國困家標準(CNS〉ψ 4規格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 ----------------------裝------,玎----- f (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) S13588 A6 B6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印褽 五、發明説明(4 ) 評分(5A, 6A及6B)或其比較的實例(5B);而 圓7是類似圖2的平面園·但顯示一届用在有效霣例中 加以修飾的反應。 之後的描述說了該發明文中較佳的實例*其中提出一個 可變通的反懕II或装置,而且依c〇BB〇nly-〇wned美國專利 號碼第5,229,297號中所指的方式使用(其中某些附頁如 EPA 381,501中所見 >。此外•本發明是有用的,不管 PCR放大作用是否使用,而且不管是否出現反懕囊的所有, 特微,倘若不超過一届清洗步驟介於之中。 如此文中所使用;「清洗J或「清洗溶液J指的是•一 種溶液完全不具有抓取(capture) *標記(1ABEL)及形成 訊號(Signal-forming)的,用在其他反應室中的試劑,也 就是,在榡記反應室或訊息物質反懕室。 前述的USSN 673,053可變式反應囊減少清洗步驟而不會 造成嚴重的非專一性訊號的能力,不完全被了解。然而* 認為它是連續Μ線性通過少量的(a slug of)的液體,來 設計反應囊*使得前面的「少量液體」用來洗去其之前殘 存的未鍵结的試劑。任何發**生在這種「前面J的交互作用 ,對固定化位址發展的訊號所造成的影響是無鼷緊要的。 而且,所有的每份通過檢澜位址的少量液體*促進了反應 效率。 — · » 額外加入極微量的膠體也有助於這種能力,因為這似乎 能夠產生較具黏稠性的「少量液體J ,可阻礙被其前端除 去的成份的向後移動。 -6 - 衣紙張尺度適用中困a家揉準(CNS>甲4規格(210 X 297公* > --------------- -------裝------# (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 85.m修正 年月日^ ] 補充丨 第821070δδ號專利申請案 中1Τ銳明婁铨TF苜ίΜ年11月)A7' B7 五、發明説明() 圖1說明了本發明的一種形式,其中反應室和標記反應 室之間的清洗反懕室和清洗步驟已被省略。10號反應小管 (cuvette)装置有一個22號入口増(inlet port),用來注入 病人檢體。經21號通道連接至26號PCR反應室。46號封口 暫時阻斷了 26號反應室的流出。當46號封口打開,液體經 44號通道流到具有41號偵測位址的40號檢測反應室。更棒 的是,其中的珠子將會與任何已被反應的分析物 (analyte),從26號反應室而來的複合,然後與來自其他 反應室的試劑作用。這些其他的反應室為30, 32, 34號反 應室,每個經48及50號通道流入40號反應室。每一個這些 通道都暫時封閉在56號·而且内含有適當的液體。 所有反應室中詳细所使用的化合物,包括41號偵测位址 ,在前述的USSN 673,053中有更詳细的解釋。滂洗室内最 好包含有緩衝液,介面活性劑,EDTA, NaCl及其他鹽類。 苻合本發明的*所需的反應室數目已被簡化,因此: 26號反應室除了加入病入檢體外,最好包括所有傳统 PCR放大作用所需的試劑,而暫時留在25號封口處。(這些 試劑可預先加入,或者當病人檢體加入後再同時加入。)包 括先驅子(primer)的試劑是接在鍵结對的一元件,另一元 件則出現在30¾反懕室。接附至先驅子之鐽结元件之有用 實例是生物素(biotin)(若存在,注射檢體充滿封口 25)。 30號反應室最好有的檷記如接在一種複合試劑 (conplexing agent)的酵素*例如抗生物素蛋白 (avidin),為鍵结對(binding pair)的一部份。鍵结對的 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) --------批衣------^------線 (請先聞讀背面之注意事項再填寫太.頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 A6 _B6_ 五、發明説明(6 ) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 其他部份接在先驅子上則成為目禰分析物(targeted analyte)的一部份,在如上所述的26¾反應室的放大作用 時。因此* 30號反應室的一種有效試劑為Streptavidin horserade\ish peroxidase(以下文中稱SA-HRP)。鍵结 對的其他部份則為生物素(biotin)。 非酵素的檷記也是可用的,例如,螢光的、放射性的和 化學發光的檷記也是著名的用法。化學發光的檷記也最好 使用34號反懕室*其内有訊號試劑當作酵素檷記之用。 32號反應室最好含有清洗溶液當作試劑。 34號反應室最好含有訊息物質*及任何一種染色穩定劑 。例如| 34號反應室的一種有效的試劑溶液為leuco dye 的溶液,leuco dye為30號反應室中的酵素的受質。 H2〇2和極微量的膠體也包括在内。 42號反應室為睡物收集室,通常内含一棰吸收劑。 60號滾茼將外壓平均值給範例化,以脹滿各個反應室, 連鑛增加各反應室的内容量。因為在進行程序時,所有反 應室和通道都呈封閉狀態,裝置不會漏而滯留污染的情況 也不會發生。22號人口的閉是將70號折成沿72號折線而 使得74號洞正好蓋在22號入口上,使21號通道因此束緊。 因此使用一個截帽(closure cap)來使70號角落 (corner)保持曲'折的樣子。〃
I 經濟部中央標準局S工消費合作社印製 一種進行操作10號装置的有效的處理器(processor)述 於EPA 40 2,994中。這種處理器使用了 一種支持界面 (support surface),使10號装置成一列放置*而歷力姐 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4规格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 313538 A6 _B6_ 五、發明説明(7 ) · (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 如滚简(rollers)則W所有反應小管(reaction cuvett) 平行排列的位置放置。為了方便滾茼装上一涸或更多的輪 袖,在齒輪嚙合時會漸漸昇高。而且支持界面或水平或向 上提昇15度。此外,加熱器(heater)也包括在内,以固定 形式或帶有滾茼。 因此在40號反應室的41號反應位址與SA-HRP作用之後, 只需要32號反應室來進行一項清洗步驟* Μ除去未鍵结的 SA-HRP。一種認為在放大的核酸物質及SA-HRP循序移動至, 41號偵测位址之間•不需要清洗步驟或澝洗液體。因為等 流至檢測位址的每樣試劑在進入反應位置(station)之前 會有效地被下一項試劑洗去。令人驚訝地是*每一偁反應 室中的小體積即已足夠完成這些。 另外(未顯示),正如画1的结構是有用的,除了清洗液 體只位於30號反應室中*所KSA-HRP是在32號反懕室中。 在這種结構中所進行的方法是直接將34號反應室中的訊息 物質與41號偵测位址内的SA-HRP作用•而不需要清洗步驟 。理由已於前述實例中說明。 經濟部中央標準局R工消费合作杜印製 在其他的實例中,若是需-要,可額外提供清洗反應室。 進行的一種便利方式如圈2 ,是於第一清洗反應室外槽加 一個清洗反應室。所Μ最初第一清洗反應室是排空到偵澜 位址,之後到第'二清洗反應'室。與先前所述的部份類似, 有相同的參考數字•所Μ增加了 一個區別字母「AJ 。 因此* 10Α反應囊包含了在匾1實例中相同的特激,除 了一個額外的暫時封閉的36¾清洗反應室,介於32 Α及 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4规格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 A6 B6 _ 五、發明説明(3 ) 34A反應室之間。在36號反應室的56 A封口已爆滿之後· 由52號通道連接到40A反應室。 此外·有較大淸洗體積的單一清洗反應室也是可用的。 如圖3所示,不一定要有任何清洗反應室或任何清洗步 驟。如先前所述的部份有相同的參考數宇,所Μ增加了一 個區別字母「B J 。 因此,圈3, 10Β反應囊包含了前述實例中所有的特激 •除了沒有清洗反懕室之外。唯一的反應室是熱循環反應, (thermal cycling reaction)反懕室 26Β,及含禰示的(例 如抗生蛋白鏈菌素-山葵«氧化物)反應室30B ,及含訊 息物質的反應室34B ·訊息物霣如H2〇2,少量的膠體及一 種leucodye ,能與檷示酷素作用產生染色。當46B及 56B封口連績被滾筒60B脹滿之後,其内部分別經由44B 和48B通道排空到偵测位址40B ·然後排到廢料室42B 。 在所有的實例中* 一種包含了訊息物質的非必要成份是 約0.5«瓊脂糖溶液*來穩定檢測反應室中偵澜位址的呈色 形成。瓊脂耱有修薄的作用,在40度C時,於此澹度下測 得的黏度降低27届波Μ司(Poise·液《黏滞性單位),在 每秒1至102的Shear rate之間(超過其60¾) *而只有3傾 波K司在超過102的速率。’其他具有相同黏度行為及低濃 » 經濟部中央欉準局貝工$合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 百分比的膠脂也都能夠利用。 如Μ上所說明的•並不完全了解為何反應囊能夠允許完 全沒有情洗步驟,當被認為加入放大的核酸物質或檷示之 -10 - •.. 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS〉甲4规格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 經濟部中央揉毕扃霣工消費合作社印製 A6 B6_ 五、發明説明(9 ) 間及下一種試劑於偵测位址時•是很重要的步驟。 4A-4C有助於說明此一假設機制*利用如圈3的實例。然 而,相同的原則相信在所有實例中都可行的。 所見到的是一涸加大的檢澜位址41B ·包含了如在EPA 381,051中所述的固定的珠子。在圔4A中所示的階段,放 大的目檷核酸物質*帶有一個生物素尾巴是Μ「-叫表 示。這種物質已接在珠子上。此外•何SA-HRP禰示的反應 室則排空到偵测位址。(SA-HRP Μ「A*J表示,表示為二 個檷示了的生物素蛋白)。一些SA-HRP已纆接在目棵核酸 的生物素*但是一些則未接上或「鬆鬆地J在珠子上及 40Β反應室的表面。 當下一個反應室,含訊息物質如leuco dye ( Μ「 L.D.」表示)脹滿時,leuco dye Μ「少量液體J 100的 形式前進,如圖4B。它的前導凸面102接近41B偵測位址 ,由於其移動,箭頭104 。當「少量液體」100通過偵測 位址41B時*如圓4C,在前導凸面的先前的試劑則被掃除 ,只留下已鍵结的檷示與少量液體100的尾镅反應,以在 41B偵測位址產生呈色。因~為是位於被偵讀的110區域* 任何在下游(在前導凸面102 )產生的額外呈色是無翮的 。這些額外呈色為避免向後移動到檢测位址,則利用上述 的 shear-thinni^ng膠脂加 阻播。 奮俐 下列詳盡的範例將有肋於說明本發明。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) -丨裝· 訂. -11 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4规格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 A6 B6 五、發明説明(丨0 ) (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 所有的實施及比較性範例都具備如下的試劑•除非額外 註明: A · 评βΗΠΤ/ΗΤν分枏物的進備作業: HUT/AAV/78细胞内含HIV Μ檷準的酚氛仿萃取過程處理 Μ分離DNA ,所得DNAK分光光度計來定量。回收的DNA (100,000副HIV)播聚合》鍵反應(PCR)來故大,反應混合 液中(concktail)內含Μ下需篇別的引子(priier) *級衝, 液(10nM氛化鎂· 50·Η三羥甲基氛基甲烷媛銜液(TRIS), 50βΜ 氛化鉀•及 0.1 ng/iil 的明膠),1.5·Μ 的 dATP, dCTP, dGTP及dTTP弄去氧核苷酸三磷酸,及40僩單位的 DHA 聚合海,來自於 Thermus aquat i cus 。 使用了兩姐的引子* 一姐互補於ENV區•一组互補於 HUT/HIV DHA的GAG區。在每一組中的引子都被生物素醢 化Μ加速檢測作用。根據US-A-4,914,210中所指示的,兩 組四乙二醇(tetraethylene glycol)成靥群*接在寡核脊 酸上。 PCR流程則取250 «1的上述反應混合液在PCR反懕囊泡 中進行,其分析级元素述於P.N. Schnipelsky等人。 1991 年 3月 21 日歸檑的 EPA 381,051及 USSN 673,053 (現已 通遇 >。更特別地是*使用了圔7的10C反應囊。與先前所 * 經濟部中央標準扇貝工f合作社印製 述的類似,具有相同的參考數字•因此增加了一儷「C」 。所M,如上所述的,使用了 26C, 3 0C, 32C, 36C,及 34C反應室;44C, 48C, 50C及52C通道;40C偵測位址 -12 - 82.3. 40,000 本紙張尺·度適用中a®家標準(CNS〉甲4现格(210 X 297公*〉 經濟部中央標準局貝工消费合作杜印製 A6 _ B6 _ 五、發明説明(11 ) 及42C ®料室。PCR放大作用在不同於10C試驗反應囊的 反應囊中進行,將放大的物質集合起來並注射到26 C反應 室中,Μ符合所有複製品的结果,如例1中的32。 使用歐洲專利申請案第402,994中所述的一種熱循環處 理器。 DNA目搮物預热到90= 10秒鐘*然後在96C變性30秒 及降溫至70 1C 60秒,以引子和產生引子延伸產物。後兩, 個步驟(在96 1C加熱,然後701C)重複了總共40個循壤。這 個PCR過程重複了 6 4次,然後這個含有新合成PCR產物的 液體則由64PCR反應囊泡轉移到同一個容器,來集合所有 PCR產物。將集合物M PCR媛銜液稀釋20倍則為樣本*用 作ΜΜ文中所述的試驗。 Β .濬浼溶液的郸備: 清洗溶液製備成含IX癸基硫酸納鹽的磷酸緩衝生理溶液 ,含有10 mmolar鱗酸納鹽1 150 mnolar氯化納,及1 BBolar ethylenedianinetetraacetic acid, ρ Η 7.4° C .杭生蛋白_莆表/山棼磷氬化物(SA-HRP)结会體溶液 的_齓備: * —種抗生蛋白鍵菌素及山葵遇氧化海结合應得自於 Zy麗ed實驗室(洛杉磯)·Μ含Ο.Οίχ thinerosal防腐劑及 0.53;酶蛋.白的酸緩衝溶液(出7. 3)稀釋1:8000倍。 -13 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4规格(210 X 297公釐) ' 82.3. 40,000 --------------- -------裝------訂---- i (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 五、發明説明(12 ) D . 1 ρ υ ο 〇 dvp组成的制備 100毫升水中有25克聚乙烯吡咯烷釅的溶液與1毫升的 二甲基甲醯胺中有0.20克的4,5-bis(4-dimethylaminophenyl)-2'(4-hydroxy-3,5-diBethoxyphe nyl)脒唑,形成藍色的leuco dye混合並攪拌1小時。然 後加到由2.76克單璘酸納之一水化合物溶於1900毫升的水 ,0.2 毫升的0.1M之diethylenetriaminepentaacetic acid溶液,及 1.51 克.的 4’-hydroxyacetanilide所混合製_/ 備的50X氫氧化納溶液中,並調成pH6.82。然後加入2奄 升的30X «氧化氫並攪拌混合物使成顔色分敗。最後,取 24.75毫升的溶液與0.25毫升的25mM的dinedone水溶液及 0.125克的瓊脂糖混合,Μ產生含0.55K瓊脂糖的呈色组成 物。所有组成物在80 =下加熱且攫拌,直到瓊脂糖溶解, 然後冷卻到室溫。 Ε .裡針試_的餺備 一種 poly [ styrene-c〇-3-(p-vinylbenzylthio) ?1*〇9丨〇11丨〇3 3(;1(^](奠耳比率97.6:2.4,重量比率95:5, 1« m平均直徑)的水性聚合«水懸液(dispersion)已製備 *及下文中所述的一種寡核苷酸共價鍵结於聚合體的一部 份,而另一種寡'核苷酸則贫價鍵,结於聚合《的另一部份, 利用USSH 654,1 12中所述的步驟(由?〇1^丨〇611〇等人歸檔 於 2/12/91)及Sutton等人所述的EPA 462,644 。該寡 核苷酸經由兩個四乙二酵分曆體連结到聚合體上•四乙二 -14 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4規格(210 X 297公釐) 82,3. 40,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標率局霣工消费合作社印製 Α6 Β6 五、發明説明(13 ) 酵為一種1,2-丙二酵部份,及胸腺嘧啶《(基。播著 US 4,96 2,029中的步驟,將每條寡核苷酸加到聚合體上 ,經由3-胺基-1,2,-丙二酵部份的胺基。 聚合體/寡核脊酸探针與poly (methyl aery late-co-sod i un 2-acry laraido-2-nethylpropanesulfonate _co-2-acetoacetoxyethyl methacrylate)的應乳坫連物 混合。(重量比為90:4:6 )。M質粒對粘連聚合物的乾重 比率4/0.1 (2.5Χ粘寒>。該水懸液有4%的固《成份。 這些試劑配方用來製備一連串的分析裝置*含有試劑用 作HUT/HIV分析中的抓取探針。該控制試劑寡核苷酸序列 為一段來自HIV基因姐的序列,而且用作一段無意義的序 列。這段無意義的探針應該不會抓取任何HUT/HIV分析序 列,且最後沒有顔色形成。其他的探針試劑則互補於 HUT/HIV DNA的ENV區域的序列。 上述的試劑用來製備一連串的分析元素(反應囊)•每 一涸包含了反應室(其中之一是PCR反應囊泡,為分析樣本 最初加入的地方),檢測反懕室及顢料收集室。分析裝置 (或元素)是以加热一張 P〇ly (ethylene terephthalate) /polyethylene laminate (SC0TCHPAKTN 241,3M公司)在 —儷成形站(或模子),形成一列受壓的區域(反應囊泡 )在板子的一邊,靠近尾墙’為較,大的受壓匾域,在板子的 另一面。最後形成一個主要的通道,從第一個反應囊泡到 最後一僩,和從每涸反應囊泡來的支流。所Μ從薄板到表 面板,最後反應囊有來自受壓區到主要通道的反應囊的装 -15 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4规格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 --------------- --------裝------訂---- ^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 013588 A6 B6 經濟部中央標準局貞工消费合作社印製 五、發明説明(14 ) 置 如 USSN 673 ,053 中 Schn i p el sky 等人所 述 〇 每 個 受 壓 域 除了 主 要 通 道 末 端 是充滿 了 適當 的劑試 成 分 外 一 個 表 面 板則 做 成 薄 板 蓋 在 受壓區 及 通道 區,並 封 成 一 個 脹 滿 的 封 閉區 > 在 每 個 受 壓 區之間 ( 除了 最後一 個 外 ) 〇 然 而 1 首 先表 面 板 整 個 冠 狀處理 0 如上 所述的 探 針 試 爾 配 方 (I n v e n t i on & C on tr 〇1)然後 立 刻在 所處理 的 表 面 的 四 僩 不 同 的點 沈 m 每 個 點 有0 . 9到1 .1 u 1的配 方 〇 沈 澱 配 方 在 室 溫流 動 的 空 氣 中 乾 燁30秒 以約 95r的 烙 嫌 在 支 持 界** 面 的 另一 邊 加 熱 〇 is. 例 1 : 存 在 檷 示 反襄室 及 sR Μ Z 間 的 淸 洗 反 宰 為 證明 圖 2的 實 例 16個複 製 品已 製備。 其 中 每 個 反 應 囊 泡 加滿 了 試 驗 範 例 中 所用的 試 劑· 如下: K. 麻 釋消 ί 鬭 7 ) 試 劑 26C 用作注 射 分析 物(〜190 -210 U 1) 30C SA-iiRP 结 合體 (〜350 U 1) 32C 清洗溶 液 (〜235 y 1) 36C 清洗溶 液 (-350 u 1) 34C 1 euco dy e (〜 235 u 1 ) ( 因此 提 供 了 額 外 的 冲洙物 質 ,但 只對從 第 二 反 應 囊 泡 到 第 五反 應 囊 泡 的 分 離 有用* 而 對於 分II第 一 反 應 囊 泡 和 -16 - (請先閲讀背面之注意事項再塡寫本頁) 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4規格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 «濟部中央標準局霣工消费合作社印製 A6 B6 五、發明説明(lii ) 第二反應囊泡無用)。 一個類似於EPA 381,501所發表的(闞於立即閲讀的一 個明顯不重要的步驟及中止溶液反懕室已省略 >。比較性 的實例。另一姐相同於實例1具有16個反應囊已製備,除 了第一次冲洗及在第2及3反應囊泡之SA-HRP结合物的位 置及其甩量是相反的。也就是說使用350 u 1的冲洗溶液及 235 w 1 的 SA-HRP溶液。 表面板被製成多曆.板,而且被三個步驟所密閉。第一步/ 夾層被壓縮,而且在含有試劑的反應囊泡及廢料反應囊泡 周圍加热至1491C而加Μ密封。接受樣本的PCR反應囊之 形成包括封門破裂及通道•此部份装置被大約16310«當 形狀的加熱口所加熱。第三步是整個實驗裝置週邊密封的 形成*及所有反應囊泡週邊封門的再密封,是利用當下層 平板維持周圍的溫度時,將上層平板維持至199t:。在完 成的實驗裝置(或元素)中的通道及反應囊泡是被固定的 ,使得含有試爾的滾简通遇元素中的位置時,反應囊泡能 依序地破裂,使試劑從每一僩反懕囊泡顧著開口至主要通 道•並流向含有捕捉探針的·'匾域。最後的元素是例置的, 使得含有捕捉探针點(沈積物)的表面板是已完成元素的 底部,而探針沈積物被逋當地排列在主要通道中而形成偵 測站。四涸探針'點在主要通Γ道上.被固在四個不同的位置, 分別羼於不同的樣本。 位於主要通道末端的最後一個廢料反應室是比其他的堪 大*並具有吸力Μ收集廢液。 -17 - 本紙張尺度適用中國國家櫟準(CNS)甲4規格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —裝· 訂·
經濟部中央標準局Λ工消費合作社印S A6 B6 五、發明説明(16 ) 實例1及比較性霣例之完全反應囊用來評估試劑配方1 如下: 在每一個實驗装置中的反應囊泡装入(190-210^1) 20 倍如上所述的稀釋的PCR產物,而其遇程如下: 節例 1 分析物被预熱95^ 120秒,其反應囊泡滾動並打開封門使溶 液到達偵測站(探針.沈積物)°分析物和探針試劑在偵测, 站中於421C 5分鐘進行雑交。這時在第二個反應囊泡中的 S A-HRP结合物於65 C預熱。结合物反應囊泡滾動並打闋封 門,使得溶液流向偵測區域,以取代分析物。經過5分鐘 ,含有第一次冲洗溶液之第三個反應囊泡於551C中預热。 這時打開並冲洗偵測站,維持5分鐘。這時第二次冲洗溶 液被預热至55T,然後含有第二次冲洗溶液的反應囊泡, 打開並冲洗偵测站。最後含有形成訊號之染劑姐成物不經 預熱滾動並打開封門,而姐成物流向偵測站。經遇5分鐘 的作用,可利用Μ下所述之色圖來分析呈色等级,Table I記錄呈色等级,而其圖Pi表現在ffl5A。 hh筘忡断俐 每個元素含有'分析物的反Λ應囊,泡被預热95t 120秒•然 後滾動並打開封門*使溶液到達含有4個固定探针試劑的 沈積物•也就是兩個控制探針及兩儷HUT/HIV探針黏附的 沈積物。分析物和探針試劑在偵澜站於42Ϊ: 5分鐘進行雜 -18 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4规格(210 X 297公釐) 82:3. 40,000 --------------- -------裝------訂---- ♦ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) A6 B6 五、發明説明(17 ) 交。此時含冲洗溶硖的反懕囊泡被預熱至55它·然後冲洗 溶液反應囊泡滾動並打開封門•使冲洗液進入偵測區域, 並清潔主要通道,並除去未结合的分析物。之後,不經預 熱的抗生蛋白鍵菌素/山葵過氧化物反應囊泡滾動並打開 •使溶液流向偵測區,结合在固定的生物素醢化分析物至 少5分鐘。在此期間,第二次冲洗液被預熱至55=,反應 泡滾動並打開封門,冲洗偵測站,並除去未结合物霣。最 後形成訊號染色姐成之反應泡滾動並打開•流向反應站並; 取代第二次冲洗物。探針洗積物經5分鏟形成染色。每個 探計沈積物的顔色與染色密度比較,其色圓以〇為沒有密 度,而10為最高密度。呈色等级記錄於Table 1[而其画形 在圖5B ( Table I及I代表字元"LTR”及"ENV”,控制無意 義探針沈積物;與分析物中HIV基因姐之ENV區域互補。 在偵測反應室中的4®珠子位置由左至右分別代表’ "LTR",,,ENV”,"LTR”及” ENV"。 (請先閲it背面之注意事項#塡寫本頁) _裝· 訂· 娌濟部中央標準局貝工$合作社印製
9 1X 本纸張尺度適用t國國家標準(CNS)甲4现格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 五、發明説明(18
表 I 啻例 1 - Η T V A6 B6 複製物 1 2 3 4 5 6 LTR 0.5 0 0.5 1 1 ENV 7
LTR
ENV 6 . 6 . 7 0 . 5 5 8 0 . 5 6 . 9 1 5 10 0.5 5 11 0.5 7 12 0.5 6 13 0.5 7 14 0.5 6 15 0 . 5 2 16 0.5 L 平均值 - 6 . 6 . ! 6 5 . ! 6 4 5 -----------------------装------.玎----m (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 0 0 . ! 7 2 .R .69 經濟部中央標準局貝工消费合作社印製 20 本紙張尺度適用中國囷家標準(CNS)甲4规格(210 X 297公釐) 82,3. 40,000 313538 A6 B6 五、發明説明(19 ) 表
比較性範例-HIV 複製物 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 平均值
LTR ΕΝ V 5 2
LTR
ENV 1 1 1 1 1 0 . 5 1 1 0.5 2 7 7 7 3 7 1 7 7 L 丨.44 1 1 1 1 1 0 . ! 0 .: 1 1 1 1 6 2 6 5 6 7 6 4 6 6.5 4 6 B . 5 5.44 --------------- -------裝------ΤΓ---- i (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局貝工—合作社印製 21 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4规格(210 X 2耵公«) 82.3. 40,000 «濟部中央標準局貝工消费合作社印製 Α6 Β6 五、發明説明(20 ) 很明顯地,特別是從画5 A和5B的比較中得知*在放大的 核酸物質與檢測位址雜交之後,在加入標示試劑之前的清 洗步驟的減少並無害於结果。實際上,卻得到更好的结果 。在定是時,可將範例1中第2及第4個珠子"ENV”加以 平均,並與比較範例比較。對範例來說,平均值為6.0和 5.69·而對比較範例而言,兩者都是5.44。 上述的结果不限於一項特定的分析一例如,對CM V (cytomegalovirus)的分析。為了造僩理由*寡核脊酸序 列一直未被定出*因為相信這分析是不重要的,對於顯示 能夠減少一個或兩個清洗步驟。 與範例1發生的结果比較•顯示若省略第二清洗室•產 生如圖1所示的反應囊。也就是說*在這種反應囊只有一 個清洗反應室及步驟介於檷示反應室及步驟(使用 SA-HRP )及訊息物質反應室及步驟(使用leuco dye和 H2O2 )之間。 相同地•已顯示這種4反應室的反應囊僅有一個位於放 大核酸物質反應室及檷示反應室之間的清洗反應室。產生 的结果相當於傳铳的在每/個反應室(雜交步嫌)及標示 反應室(摞示步驟)之後有一個清洗反應室。 断俐 ?:節例 T的反藤聶脚*不里清浼溶液反庸囊的hh » 兩姐PCR分析反懕囊依範例1的過程製備的,有如下的 例外: L第三儷探針組成是依範例1的過程製備*含有互補於 -22 - (請先閲讀背面之注意?:項再壜寫本頁) 裝· 訂. 本紙張尺度適用中國a家標準(CNS)甲4规格(210 X 297公货) 82·3. 40,000 經濟部中央標準局員工$合作社印製 313588 A6 _B6_ 五、發明説明(21 ) 來自HUT/HIV DNA的GAG區域的序列。 2 3個探針的每一個只有一個點(沈積物)加入每個元 素中•依序為⑴如上述的來自GAG區域的新探針,⑵範例 1的控制探針•及⑶範例1的反懕試爾探針。 a —姐5反應囊泡的反懕囊如範例1的反覆清洗形式( SA-HRP结合物於第二反應囊泡及清洗液於第三反應囊泡) 依範例1中所述的進行。 4.第二组反應囊泡只使用了三種試劑反應室•並無清洗, 反應室,如圈3所示。他們含有相同的姐成,包括來自集 合池的分析姐成*與在範例1中第一姐元素相同的姐成( 具有傳统的清洗横式),及Μ下列順序的反應囊泡: 反藤鼉泡(圖 7 ) 肉容物 26C PCR分析物
30C SA-HRP 32C 呈色偵測姐成 其餘反應囊泡或反應室被排空。 第二組的反應囊如下進行: PCR反應囊泡,分析物預热至95C 120秒,然後滾動並 打開封門,並在偵测站引導分析物至3個探針沈積物。在 42Τ的雜交作用進行5分鐘,而第二反應囊泡的SA-HRP溶 液則預熱至65¾。然後第二反應囊泡滾動並打開封門,溶 -23 - (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) —裝. 訂 " 本紙張尺度適用中國國家櫟準(CNS)甲4规格(210 X 297公* ) 82.3. 40,000 A6 B6 五、發明説明(22 ) 液纆由通道至偵測站。结合物在偵拥站應5分鐘*然後含 圼色偵测水懸液的反應囊泡滾動•並打開封門*而不需預 熱,而將水懸液導流至偵澜站以取代SA-HRP。在檢測站中 染劑水懸液作用了五分a之後*則可利用範例1中的色譜 讀出呈色等级。兩组元素的圼色等级記錄在TABLE IIA及 IIB並分別Μ圈6A及6B的圈形表示。 資料顯示了反應囊泡之反應*之结構,相對於5反應囊 泡提供了正訊息,然而在無意義(控制姐)珠子上的訊息, 強度有點昇高。這點可利用大量的圼色檢測水懸液來減少 或消除。3反應囊泡结構允許使用較少的試劑•較低的單 位操作成本*較小的反應囊儲存空間,較短的操作時間, 及較小,較不複雑的處理器。 TABLE IIA m m y s反腱爨泡 «濟部中央標準局R工$合作社印製 複製物 GAG ENV LTR 1 7 * 7 0.5 2 7 7 1 3 7.5 7 1 4 - 7.5 " 7 1 0.5 5 7 7 1 -24 - 本紙張尺度適用中國國家揉準(CNS)甲4规格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000 --------------- I------裝------訂---- V (請先閲讀背面之注意事項再堉寫本頁} 313538 A6 B6 五、發明説明(23 ) TABLE I IB 3反鼸囊 泡窨料 禝製物 GAG EHV LTR 1 7 7 2 2 7.5 7 2 3 7 7 2.5 4 7.5 7 2.5 本發明於本文所揭示的可實際應用於不在本文中所掲示 的任何元素。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局典工濟费合作社印製 -25 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)甲4规格(210 X 297公釐) 82.3. 40,000
Claims (1)
- 第S2107038號専利申謫案 中玄由讅專莉節圃钹TF太(抓告本經濟部中央橾準局負工消费合作社印製 7T、申請專利範圍 1 一種偵测放大核酸物質之方法,其係雜交此種物質至具 有至少一個固定探針的偵测位置上,標示此已雜交且剛 固定的核酸物質,並予該位置一種能活_化訊息物質以產 生訊息的標示物,之後將該訊息物質加入該位置以產生 可偵測的訊息, 其特徵在於標示步驟可直接用在雜交步驟後,其間不需 淸洗步驟,或是添加步驟直接用在標示步驟後,其間不 需清洗步驟,Μ及特激在於該標示物不為一種放射性標 示物。 2- 根據申請專利範圍第1項之方法,另包括一《步驟*其 僅於雜交核酸物質及與標示物的檷示步驟間,Κ經加熱 清洗液清洗位置。 i 3- 根據申請專利範圍第1項之方法,另包括一涸步驟,其 僅於使用標示物的標示步驟及添加訊息物質的步驟間, 以经加熱清洗液清洗位置。 4 根據申請專利範圍第1項之方法,其中標示步驟在雜交 步驟之後直接進行,其間不需淸洗步驟,及搮示步驟之 後直接用添加步驟,其間不需分隔之清洗步驟。 根據申請專利範圍第1, 2, 3或4項之方法,其中標 示物是一種酵素。 6- 根據申請專利範圍第1項之方法,另包括一步驟*其於 雜交步驟之前,先轉移放大物質。 7- 一種故大及偵測核酸物質之密封裝置,其使用至少一股 目標股當作模板,該裝置含一個用來放大核酸物質樣本 本紙張尺度適用中國國家揉準(CNS ) A4規格(210X297公釐) .1: . {諳先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂-- -線 8r8 8 ABCD 六、申請專利範圍 的反應室(26),一涸偵測放大的核酸物質的偵測位置 (41),及含有檁示物及能有效結合產生可偵測訊息的訊 息物質之儲存反應室(30)與(34),及連接反應室(3 2)與 位置(41)間液體流通的通道(5 6), 其特徵在於該装置無任何清洗反應室,内含之漬洗溶液 實質上沒有用於儲存或反應室所用之捕捉、標示物、及 形成訊息的試劑, 故在包括排空及移動反懕室内容物至偵測位置的連纘步 驟中無清洗步驟。 a 根據申請專利範圍第7項之裝置,其中該裝置不具任何 清洗反應室*內含之清洗液體實質上沒有用在儲存或反 應室中的捕捉,標示物和形成訊號軾劑。 a 根據申請專利範圍第7項之裝置,其中所有之反應室’ 偵测位置及通道均是密封的* Μ免裝置外部的漏失造成 滯留污染。 ία 根據申請專利範圍第7, δ或9項之裝置,其中棵示物 為一種酵素。 4 - --Ι —,ίί —I U— (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 ^nn nf— I = _ A 經濟部中央標率局負工消t合作社印製 ψ mu Bn— nn 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS) Α4規格(210Χ297公釐)
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