TW215109B - - Google Patents
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Description
五、發明説明(1 ) Λ 6 Π 6 經濟部屮央栉準·Acs:工消费合作社印製 本發明係有U —種附接一種寡核苷之元件*該元件之製 法及一種轸断用套姐興其用法。本發明特別有W核酸診甌 學之領域。 近年來已迅速發展核酸探針技術,因為研究者巳發現其 在偵测各種少置出現在人類或動物澜試樣本中之疾病*有 櫬«或遣傳特微上之價值。探針之用法係根據互補之観念 〇DNA具有二股,二股利用互補核苷酸(亦稱為核苷酸對 )之間之氲鍵结合在一起。 DH A複合物通常安定,但是各股可利用打破氫鐽之條件 分開(或變性)所釋出之單股則僅與另一股具有互補之核 脊酸序列再结合。此雜交«程可Μ兩股均呈溶液之形式進 行,或由其中一股附在一種固*基霣上逢行。 一種有機Μ或衄胞中之檷的运it序列可能僅佔轚DNA 分子之極小部份•因此很難利甩大部份附橛紀物之DHA探 针偵测其存在。已有許多研究探討僅偵》—種檷的核酸之 少數分子之方法。 此相闞技藝之一項顯蓍進展供!述於US-A-4,683,195, US-A-4,683.202與US-A-4,965,188。此等專利案銳明放大 與偵测方法•其中引子在一種核苷酸聚合作用劑(如: DHA聚合_)及去《核糖核苷三18酸酯之存在下,與一種 禰的核酸股(稱為棋板)進行《交。在特定條件下•當核 苷酸沿蓍搞板•由引子之3’一纗加入時,结果形成引子之 擴大產物。此等臺物再變性•並於另一《擴大反應中 作為更多相冊引子之横板使用。當此變性*雄交與引子孃 3 - •先 IU1 in 背 -而 之 >主 意 項 孙 寫 本 裝 π 線 本紙ft尺度遑用中钃_家《率(CNS)T4規格(210X297公 81. 4. 10,〇〇〇張(II) 215109 Λ 6 It 6 五、發明説明(2) 經府部屮央榀準而工消许合作杜印製 大作用 已知為 數最隨 一 Μ 所述· 過去 當偵涮 例如: 面形固 一種 Μ上乾 附接在 之聚合 定捕捉 ,但是 滌固定 探針被 一種固 低探針 若能 攞供高 至最少 上述 合之載 之循瓖進行許多次時(例如:25至30次 "聚合酶鍵反Κ”(或PCR)之«程使檷的 指數级增加,因此即容易偵测。 檷的核酸已充份地擴大後•即如所摘錄 可採用各種偵澜步驟進行偵澜。 已設計了各種裝置供雜交分析法用•藉 探針之前,使檷的核酸呈不溶解性。例 US-A-4,925,785,已採用硝基饑维索濾 體載fl供此目的用。 用來附著探針或其他試爾之技術為僅使 « ·即如例如:ΕΡ-Α-0 381 501所述者 聚合物粒子之探針融合入一《由另一種 物形成之固Η載Η中。雖-然利用乾燁或 -試黼.(如:捕捉探針)t方法巳改菩* 仍有艰制。試黼之固著性差。尤其當分 之捕捉探針中之試劑溶液時•有些探針 洗掉時,即失去了應有之訊號。此外, 體載Μ之融合需要离潘及危險之設備· 對標的核酸之捕捉能力。 避免有鼷固定捕捉探針之已知方式之問 敏感度分析法•使因捕捉探針流失而喪 •賻為所期盼者。 閜臞Β利用一種元件解決•«元件係包 黼•載Η上配置一種核酸試朗姐合物· 循環)•該 核酸之原來 之専利系上 Μ在使用壤 如:如述於 材及其他平 之於固Η載 。最近則使 可加热軟化 黻合作用固 去相闞技蕕 析法中,洗 會移位,當 捕捉探計輿 此點容易降 R ·同時能 失之訊號減 含一種可粘 姐合物中包 •先 閲 in 背 -而 之 it 意 項 fl· 蜞 % 本 裝 玎 線 本紙张尺度遑用中《«家《毕(CNS)T4規格(210X297公*) 10,000張(H) ί Λ· ^ fJ Π 6 五、發明説明(3) M濟部屮央標準而R工消«·合作杜印製 含下列物霣之混合物: a. —種核酸試爾,供包含: 由第一種聚合物姐成之粒子•該聚合物之玻璣戆化灑 度為至少約70t:,該粒子之平均直徑為約0.1至約3微 米•及 一種與粒子共價性附接之寡核苷酸•及 b. —種水不溶性粘著_,係包含第二種聚合物•該聚合 物之玻鶄鯉化«度比第一種聚合物之玻_戆化謳度 至少低約301D, 該聚合物帖著蘭在姐合物中之含量為約1至約20重量% 〇 此外·本發明亦徒供一裡包含上述元件之内含式«試装 置。 一 此外-·—種製備一種核酸测試-元件之方法包括: Α.使一種核酸試颼姐合物S置在一種可粘合之載«上, 該姐合物包含下列物霣之混合物: a_ —種梭ft試朗,你包含: 由第一種聚合物姐成之粒子•該聚合物之玻璃想化邋 度為至少約7〇·〇 ·該粒子之平均直徑為約至約3微 米,及 一裡興粒子共價性附接之募核*及 b.~種水不溶性粘著两,係包含第二種聚合物,«聚合 物之玻漓戆化瀛度»比第一種聚合物之玻*戆化®度 至少低約30t: * (請洗|«1頡背%之注意事項再项寫本頁) 裝_ -線, -5- 本紙张凡度遑用ta«家楳準(CNS)IM規格(210X297公it) 81. 4. W,0U0ft(H) 21510^ Λ β η 6 五、發明説明(乓) 該聚合物粘蓍两在姐合物中之含量為約1至約20重量% ,及 Β.使該己配置之核酸試繭姐合物於足使之粘附在《Η上 之溫度及時間下加熱*並乾燦之。 本發明亦搛供一種轸断用之测試套姐,係包括: ⑴上述元件•及 ⑵一種偵测試麵•供偵测核醮試朗寡核苷黻與檷的核酸 之雜交產物。 此外* 一《偵测欏的核酸之方法包括: Α.使一涸疑含有一種標的核酸之樣本輿上述元件接觸, 其中該S置之核酸試劑之寡核苷酸為該檷的核酸之互補型 檷的核酸與元件上之核酸試_形成一種蟾交產物•及 B .偵·测雑交產物之存在,作為_樣本中該檷的核酸存在性 之指禰。 此外,亦攞供一種放大並偵测一種禰的核酸之方法,换 包括: ih 气先 閲 讀 背 -而 之 /i 意 事 項 # 填 % 本 裝 η 線 經濟部屮央標準劝R工消t合作杜印製 之物性 S矗在 配交存 該雄酸 中種核 其.一 的 .型成 檷 ,觸補形 中 大接互劑 本 放件之試 樣 酸元酸酸 為 核述核核 作 的上的之 · 檷與檷上 在 之酸該件 存 中核為元 之 本的核與 物 樣禰苷酸 裹 試之核核 交 澜後寡的 摊 種大之禰 該 一放黼之 测。 使使試大 偵樣 Α.Β.酸放且C.相 核 · 之 本紙ft尺度逍用中《围家«率(CNS) T4規格(2丨0x297公;«:) 81. 4. 10.000張(Η) 挝濟部屮央標準而员工消t合作社印製 五、發明説明(5 ) 本發明提供一種遽用於績簡核酸之改ft元件。供此用蟾 之改良元件興方法之待色离鼠號與低背最干揠。該元件特 別磨用於偵癱樣本中含最極飫*例如:《至100籲分子之 核酸》本發明捤供一種轸断用之改a元件*其中使捕捉探 針配置在特定s域内•且不容裊被液黼或《械處理移位。 因此•所捕捉到檷的核酸之可能»號可宪全艦定且強度离 〇 此等特色係由一種具有一種牢画地附著在元件之固艚載 讎上之《當核酸試鑲之元件達成•並慧免了輿試麵»合及 乾嫌有鬭之缺點•且分析期閜亦不會洗掉試黼。 此元件因採用聚合物與粘蓍_之特殊姐合,使粒吠之核 酸試鬭附著在一種固艚之可粘合式載Η上·而鏽有逭些優 黏。粘蓍Μ之用最供試_含量ϋ ·使試Μ與檷的核酸容 易接觸·。該試鬵具有特別小粒子-,Μ提供离敏感度及對載 Μ之最佳粘附性。 該鼷示係下文寅例2所述之分析法比較结果之國解銳明 〇 本發明之元件包括一β可粘合式載鱷,該載黼上配置著 (如下文所述)一種或多種核酸姐合物•各姐合物則包含 一種核酸試两與一種水不溶性粘蓍麵之澴合钧。 可帖合式載鱷為櫥胞性物質(通常為合成聚合钧),該 物質可使用加热成趙音波加β粘合技術自行粘合(成融合 )或與S—片該物質粘合(成融合)。该載鱷最好可經熱 粘合β竈用之可粘合式載麵包括(但未限_): _片•钃_ -7- 本紙Λ尺度遑和中 β家榫率(CNS) Τ 4規格(210x297公¢) ? ki'tt 閲 讀 背 而 事 項 填 % 本 裝 訂 線 81. 4. 10,_張(H) 經册部屮央標準劝员工消f合作杜印製 Λ 6 116 五、發明説明(6) 轚•與臢,該等載臞可依一種瀛當方式及於竈當位置自行 粘合•在粘合之_片•螌子成鼷之閬產生《道成空睬。亦 較隹者為利用一些方式使«_表面粗tt化·有肋於核酸姐 合物之粘附作用。 該等載牖可由例如:聚醮類{如:聚(鲟苯二酸次乙醮 ),聚[對苯二酸4,4-(六氫-4,7-次甲基亞铕滿-5-基) -二次笨基酸〕及聚(1, 1,3-三甲基-3-苯基-5,4·-和滿 羧酸4,4'-亞興丙基二次苯基酗)},聚磺酸酶類〔如:二 苯酚A聚破酸_ (例如:通用電子(General Electric)之 產品力參(LEXANTM) 〕 ·聚釀胺類[如:聚(對苯二_胺 對次苯基酯)〕,聚亞胺類[如:4,4’-二孩基二苯基H 興苯均四酸二酸酐之聚亞胺產物〕•及纖鰌素〔如:饑維 素乙酸酗,及纖维素乙酸酯丁 ΚΓ_〕等姐成。 一項-具W寘施例中,使聚乙嫌薄Η之周邊粘合•形成一 僩具有可容纳各種試» |包括本文所述之核酸試_之空隙 之容器。另一項具«實豳例中,聚乙烯興一種聚醮如:聚 (對苯二酸次乙_)之積雇板可利用加热粘合。積蹰板中 可具有許多鼷•包括:粘著麵或蒸汽阻隔暦及可粘合層。 其他具鱷實豳例係相闞技藝之專家們容易了解者。 本文所述之核酸試麵係沈稹在該可粘合式載Μ之表面上 •可均勻分佈•成分佈在一僩成多儺特定Β域中。》試_ 最好位於該載Μ表面之特定Β域中如:呈圔黏•印刷長條 或其他所需形吠。一項具Μ實譫例中•數種不阀核酸試« 沈積在載Η表面之分闋特定Β域*因此可使用》元件阎畤 -8 - 本紙Λ尺度遑用+ β·家《準(CNS)T4規格(210X297公釐) 81· 4. 10.000¾ (H) (請先w-ift背而之注意事項Λ-填寫本页) 裝< 線- 五、發明説明(7 ) Λ 6 Π 6 偵测多種檷的核酸。例如:該元件可含有一条列試麵圔點 或長條。 瑭用於本發明之核酸試_係由一種第一種聚合物(或聚 合物之集合物 > 姐成·該聚合«之玻瑠魍化蠹度(Τβ1>為 至少約70X^1··^最好約70至約175 t:,更佳者為約75至 約1401;之轉(内。玻_戆化灞度係抱聚合物由玻鶄籲改 變為一種似橡膠•可潦動或B粘之聚合物時之灞度。玻鶄 想化謳度之澜定法述於”聚合物評估技術興方法” •第1 卷·班約馬II戴克公司* 1966年(Techniques and Hftthods of Polymer Evaluation. V o1. 1, Marcel Dekker, Inc., New York, 1966)° 竈用於本文之粒子在水性液髓中亦為不渗«性且不會鼸 脹。此類性霣確侏K置在元件之_可粘合式載麵上之姐合物 具有完-¾之结構。不可臃脹性偽~指粒子在38 t:之一種水性 液Μ中浸泡約2.5分鐘後•採用菖林(Green)等人述於 .1 Phntn. Sr ? 20. 205 (1972)之朦脹测曇計 Uwelloieter·)藹量該水性液讎中粒子之_腺率很》(即 請 .先 閲 讀 背 Λ 之 注 意 事 項 # 填 寫 本 頁
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屮 央 準 A 合 作 社 印 製 • K脹率小於1 〇炻)。 粒子之形吠雞然不拘,只要粒子之最大尺寸之畏度未超 «下述球形粒子之最大窻徑即可•但仍w球形粒子較佳° 粘子之規格大致上—致者亦較佳。重點在於粒子之最大尺 寸(例如:亶往)為約0.1至約3微米•但赢授箱81為約 0.5至約2微米較隹° 該等粒子(至少其表面)像由可使寡梭脊酸共價達接(
«-£濟部屮央標準而β工消费合作杜印11 Λ 6 Π 6 五、發明説明(8) 見下文> 之天然或合成材料姐成。此類材料通常具有反應 性基圏,可與寡核苷酸或其一種衍生型反應形成一種共價 鍵0 通常·可輿胺基或駕Μ基反應之任何反性基均竈用於 本文。特別竈用之反應性基團包括(但未限—種反應 性_素,羧基,髀*活化之2-取代乙磺醮基,活化之2-取 代乙蒙基,乙烯磺薩基•乙鴆獷基,瑁氧基· β ·籯碡基 •胺基(活化後)*肼興活性酯類如:璩珀_亞胺氧鑛基。 較佳之粒子為如述於ΕΡ-Α-0 323 692之有檐聚合性小珠* 係由具有一《活性鹵索·活化之2-取代乙磺_基或乙烯磺 釀基之一種成多種乙孀糸未餹和之可聚合性單黼製成。最 佳之粘子具有反應性羧基且你由具有如下蠼式结構之睪驩 姐成 —
CHz=CR-L-OOOM 其中R為氫,鹵索或1至3俚磧原子之烷基,Μ為氬,一 種_金*離子或銨離子,且L為一 g鍵结鰱中含δ至50個 碳•氧·氮或疏原子之有機鍵接基團。 具有反應性基團之逋用之代表性乙烯糸未鉋和之可聚合 性單Μ包括(但未限制):丙烯酸、中基丙埔酸,間輿對 -(2-氛乙磺鼸基-甲基)苯乙烯· Μ與對-[2-(對甲笨磺 豔氧基)乙磺豔甲基]苯乙嫌•閜與對-乙淆磺_甲基-苯乙烯· N-[W_對-(2-氯乙碥_甲基> 笨基]丙烯酿胺* H-[2-(2-«乙磺_基> 乙基甲釀胺甲基]丙_釀胺·戊二酸 單-(閧與對乙烯苄醣·戊二酸單-對乙鑼苄_·戊二酸 -10- 本紙诋尺度遑《中ΒΒ家«準(CHS)T4規格(210父297公4) 81. 4. 10,000張(H) (請先TU1讀背而之注意事項爯蜞寫本頁) .裝. 線· 9 οb2 66 ΛΠ Μ濟部屮央標準;*'JA工消费合作社印51 五、發明説明(9 ) 單-2-甲基丙烯釀氧乙_,甲基丙»酸_2_(4—羧基丁醮 胺基)-乙醣,甲基丙烯酸2-(Η·-(5-羧戊基)脲基]乙醮, 戊二酸章-甲基-丙熥醢基五-(氧次乙基)醮,戊二黢單 -(4-丙烯釀氧丁基)醮,4-(4-羧基丁醮胺)笨乙烯,戊二 酸單-2-(對乙»苄鑛基)乙曲•戊二酸單-間與對乙烯 苄硫基)乙》,4-(4-羧基丁醯胺甲基)苯乙鑼•戊二_犟 -2-U-甲基-N-(4-乙烯苄基)胺基]乙ft , 3-(對乙鏵苄縝 基)丙酸,4-[2-(4-羧基丁釀肢基 > 乙醣甲基]苯乙孀, 4-[2-(羧甲氣乙釀胺基)乙磧甲基]苯乙嫌.4_(;2_(羧基甲 味基-乙》胺基)乙疏甲基]苯乙烯,璩珀酸單-2-(對乙烯 苄味基)乙醮,4-[2-(羧基甲氧乙_氧*)乙鴯甲基]苯乙 烯,*珀酸蓽-4-乙»苄_,2-(4-乙»苄鐮基)璩珀_ , 2-(4-乙«苄磓基)苯甲酸,丙二犟-2-[2_(4_乙埔苄磧 基)乙氣基]乙磧甲苯二酸軍甲基丙埔釀基五-(氧 次乙基)»,《珀酸單-2-{2-[2-(4-乙烯苄碴基)乙氧基 ]乙碴基}乙醮•苯二酸軍-2-{2-[2-(4-乙烯苄硫基)乙氧 基]乙硫基}乙齙· 3-[4-<4-乙烯苄氧基)苄磧基]丙酸與 4-(4-[4-(4-乙烯苄氣基)苄磺基]苄碲基} 丁酸。 前述犟驩可》合化形成均聚物,但是最好與一種或多種 其他乙烯系未«和之可聚合性單«共聚合化。 更特定言之,壤用於本發明之粒子(至少其表面 > 係由一 種包含下列钧*之聚合物姐成: <a>約0.1至約60觼量%衍生自具有一儸如上述之反應性 *围之一種成多檷乙烯糸未_和之可聚合性單黼之循壞單 閱 if} 背 -而 之 >主 意 事 項 -Pf 寫 本 頁 裝 η % -11- 本紙张尺度遑Λ1中《 B家《率(邙S)T4規格(210x297公*) Λ 6 Π 6 五、發明説明(1 0) 位. 4»的40至約99.9重量%衍生自一種或多種乙鳓系未餹和 之可聚合性單Μ之循瓖單位·該等犟體遒行均聚合化時· 產生一種水不溶性均聚物,及 (c>〇至約15重衍生自典於上述與砂成份定義之一 種或多種乙烯糸未饞和之可聚合性單臞之循瑁單位,包括 (但未限制)可為共聚物提供臞臞安定性之親水性摩钃。 竃用於上述成份(b)之犟《包括(但未限刺)•♦乙_基芳 香系(例如:苯乙烯與苯乙嫌衍生物如:4-乙鳓基甲苯, α -甲基苯乙烯,2,5-二甲基苯乙烯,4-三级丁 *苯乙烯 與2-氯苯乙烯),丙烯酸與甲基丙烯酸之_類興醮胺類( 例如:’丙烯酸甲醮•甲基丙鳓酸甲釀·丙嫣酸正丁醮,甲 基丙烯酸2-乙基己_·丙烯酸與Μ-笨基丙«釀Κ) · 丁二烯-*丙烯騎,乙酸乙烯_,_乙酸乙烯苄_,乙嫌基澳 *亞乙烯基氯興具有二儡或多儼可聚合性基圈之可交鐽單 «(如:乙姆基•例如:二乙烯苯•及二-與三丙嫌酸酯 )。其他可產生一種水不格性均聚物之單艚亦蟾用•且係 相«I技藝之専家們成了解者。較佳成份<b)為乙烯基芳番系 軍體。 適用於成份之擊體包括(但未限制):非離子性親水 性軍Μ如:丙烯醮較•中基丙烯黼胺· N-颺丙基丙烯纏胺 •丙烯酸2-羥乙_,甲基丙烯酸2-羥乙》· Ν-乙烯基-2-吡洛啶麵及其他相醐技藝之専家戒了解者。此外•尚可 使用具有活性次甲基之單«•如:甲基丙«黢2-乙釀乙_ -12- 本蛑張尺度ΑΛΙ + Β覼家«準CCNS)T4規格(2)0X297公址) 81. 4. ΙΟ,ϋυϋ張 (請先*WJ請背而.之注意事項再项寫本頁) 裝· 線· Λ 6 Π6 經濟部屮央梂準Λ;κχ工消1V合作杜印製 五、發明説明(1 1 ) 氧基乙釀,及»钂子性單髑•如:Ν,Η,Η-三甲基-K-乙» 苄銨基氯及3-羥乙基-卜乙烯牌哇《化物。 其他癦用於成份之單臞包括彼等具有聚氧次烷llff_ 者,如述於例如:US-A-4,086,143。代表性軍鱷包括(但 未限制):五乙二酵單甲基丙烯酸酯•十乙二醇單甲基丙 烯酸酯,廿乙二酵單甲基丙熥酸_,五乙二_單丙埔酸_ ,聚丙二酵軍甲基丙烯酸酯及聚丙二酵軍甲基丙烯黻釀。 較佳之成份<c>睪臞為甲基丙埔酸2 -乙醜乙_氧基乙酯》 各成份(a>、4>)與(〇之不同犟艚混合物可共聚合化,唯要 求該等單體可互相相容且所形成之粒子表面上應含有足夠 之反應性基團。 較佳之第一種加成聚合钧包运:聚[苯乙»-共-單-3-( 對乙烯苄磧基)丙酸]或聚-[笨乙馮-共-琥珀酸犟-2-(對乙 烯苄昧基)乙酯。 該等粒子最好由約2至約15重量%成份⑻·約85至約 98重量%成份<b>,及0至約10重量%成份<α之加成聚合作 用衍生形成之循環擊位姐成》更隹者•偽由約2至約10重 量%成份⑻•約90至約98重衋%成份(b),及〇至約1〇重置 %成份(〇衍生形成之循環單位姐成。 磨用於製造本文之粒子之共聚物偽揉用檷準之乳液成戀 浮液聚合技術製供。 該萼粒子亦可為含有如上述》合物作為外殼之核心/外 败粒子•因此表面上即具有反應性基圃。此頰粒子之核心 -13- 本紙张尺度遑《中a B家《率.(CNS) T4規格(210x297公釐) 81. 4. 10,0⑻張(II) (請先閲讀背而之注意事項再填寫本页) 裝< 訂· 線' Λ 6 1\ 6 經濟部屮央標準XJEX工消t合作社印91 五、發明説明(12) 可由任何可R予所必要之物理完整性輿玻鶄戆化瀣度之遘 當聚合物姐成*此等聚合物通常不同於外«聚合物。 寡核苷酸之分子共價鍵结在粒子上。"寡核苷酸"一篇係 指一種包含二儸或多儸(最好多於三儸)去氧核糖核苷酸或 核糖核脊酸之分子。其大小則依許多因素決定,此等因紫 包括輿之呈互補之檷的核酸•所附蓍之聚合粒子之大小· 及與粒子附接之方式•包括任何閜播基分子之畏度等。 寡核苷酸係利用任何應合技術與聚合粒子共價性附接。 該等寡梭苷酸係利用粒子表面上之反應性基圈與寡核苷酸 之相應氳味基•羧基或胺基反應•而直接附接。或者•核 苷酸可纆過生物素基化作用•或經修》而增加一種特定之 结合物質,該物質刖可與其可附接在粒子上之相應受鰌進 行特定结合。已知抗生物素-生_物索複合物可供此目的使 用•如-例如;ΕΡ-Α-0 139-489,-EP-A-O 192 168,及 ΕΡ-Α-0 370 694所述者。將生物素引入寡核苷_之繼程 可採用已知技術,包括述於ΕΡ-Α-0 097 373者達成。 然而*最好需使寡核苷酸進行化學修銻,使其中具有反 應性基團或具有”闋隔”基團或”鍵接”基_ ·延畏寡核苷酸 與粒子表面之間之距難。進行此邊程之技術係習知者,如 述於例如:US-A-4,914.210與 V0 89/11548。 使用一種聚合性粘署麵•使核酸坦合物之核駿《_囲定 在元件之可粘合式《鱷上。粘著_亦具有使試黼粒子互相 鍵结之作用。此粘蓍鼸包括一種第二種聚合物•其玻鶄戆 化灞度(T«2)比«粒子第一種聚合物之玻親艟化ffl度 -14- 本紙ft尺度遑用中β Β家«毕(CNS)甲4規格(210x297公*) 81. 4. 10,000¾ (H) (請先閲請背而之注意事項Λ-填寫本頁) 裝< 訂_ 線< 經漪部屮央標毕·而A工消费合作社印製 五、發明説明(13) (Tu)至少低約30*C » T«2最好比Td低約30至約120 υ °T«2亦低於約90tJ。更佳者* T«2為約-50至約+ 40t: 之範_内。 該粘著細不溶於診斷及分析方法上常見之水性液顦中。 雖然非必要,但該粘蕃_亦最好在該水性液黼中為不可K 脹性。 更特定言之,第二種聚合物包含下列物質: 砂約55至100重量%衍生自上述第一種聚合物之成份to 中所使用之一種或多種乙烯糸未tt和之可聚合性單《之循 環單位* ® 0至約45璽ft%衍生自一種或多種乙燏糸未鰌和單艚 之循環覃位•該等單鱷可形成一種水溶性均聚物·或可由 極性基團[如:一级•二级與三运胺類*羥基與聚(次烷基 氧)基.围]·-陰艨子性基甌[如:-羧酸根,磺酸根,碲酸根 •磷酸根與膦酸根]•及矚離子性基團[如:三烷銨與三烷 钃]或其他相U技藹之専家成了解之基圏提供親水性,及 (f>0至約15籯量%衍生自一種或多種乙烯系未鉋和軍Μ 之循瓖犟位*該等軍麵可在聚合物粘著劑中*生交鐽性。 錐然上述第一種聚合物之成份(b)之單Μ亦«用於成份fcb •但是成份(d)之較佳犟Μ為烷基丙烯酸酯輿烷基甲_丙烯 酸釀•其中咳烷基具有1至8髑磧顗小(如:甲基•乙基 •正丙基·正丁基*興丁基· 2 -乙基己基•己基興辛基) "15- 本紙51c尺度边《中《«家樣率(邙S)T4規格(210X297公:¾) si.4. 10,000^((() (請洗|«1讀背.1(&之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂_ Λ 6 Π 6 經濟部十央梂準"JA工消伢合作杜印製 五、發明説明(14) •且該读基中亦可穿插一 β或多儡硫,氣或含1至6 β碳 原子之亞胺烷基。更佳之單«包括(但未限树):丙烯酸 甲醮,甲基丙烯酸甲釀,丙烯酸正丁酯與甲基丙烯酸正丁 酗。以丙烯酸甲醮最佳β. 逋用於成份⑻之單«包括(但未限制):帚《價之單臞 (陽雕子性或陰離子性)如:酸類或其鼸類,包括(但未 限制):丙埔酸•甲基丙烯酸•衣康酸,2-丙鴆_1漦基 -2-甲基丙磺酸,3-甲基丙烯釀氧丙烷-1-磺酸與其鹽類· «-(2-丙烯_氣乙基-1<,»1,1<-三甲基銨甲磧酸鹽,3-羥乙基 -1-乙烯咪唑氯化物,甲基丙烯酸肢基乙醣鼸酸鼸, Ν-(2-胺丙基)甲基丙烯醮胺II酸鼸·丙烯酸2-羧基乙酯, 對苯乙烯磺鼸與其Η類,間輿對羧甲基苯乙烯及其鑒類· 及其他乙烯糸未鉋和之可聚合性駿鹽,羧酸鹽,碴酸鼸 •膦酸.,四级銨腹,吡啶臃,-牌唑鼸或靖嗯啉η。亦壤 用者為上述第一種聚合物之成份⑶之含羧基單體(及其» 頫)。 亦遍用於成份⑻之非繾子性犟包括:含胺之犟體,如 :丙烯酸二甲胺丙酯與甲k丙烯酸二乙胺乙醣,及含羥基 之單«•如:丙烯酸2-羥乙酯,甲基丙烯酸2-羥乙醮•丙 烯酸2,3-二羥丙_,及五乙二酵軍丙烯酸酯。 較佳之成份⑻單《包括:2-丙嫌釀胺基-2-甲基丙磺酸 及其Μ類,甲*丙埔酸2-胺基乙酯_酸Μ與H- (2-胺基丙 基)甲基丙埔醢胺醮酸_。 可徒供交鑣性之成份(f>之掣體可在聚合作用期間交鍵· -1 6 _ 本紙51尺度逍用中《國家楳毕(CNS) T4規格(210x297公;it) (請先間讀背而之注忿事項再項寫本頁) 81. 4. lO.OOOfk (Η) 經漪部屮央標準沁β工消fr合作杜印製 五、發明説明(15) 或在接鏑之自體化學反應後或輿其他交鍵繭進行化學反應 後交鍵。此類單體包括:多官能性之乙烯基單《如:二― 與三-丙烯酸酯與甲基烯酸醮(如:二丙烯酸次乙酸與二 甲基丙烯釀次乙酯)•二乙烯笨類,及含活性次甲基可使 用已知之化學反應進行交鍵之單β。後者實例包括:甲H 丙烯酸2-乙釀乙_氧乙酯,Η -(2-乙釀乙醢氣乙基)丙烯釀 Κ,Ν-(2-乙釀乙釀胺乙基)甲基丙烯醣胺* 6-(間輿對-乙烯笨基)-2*4-己二酮,丙烯醃乙酸乙_及相闞技藝上 已知之其他單級。 成份(f)之較佳簞«包括:甲基丙烯酸2-乙釀乙釀氧乙醣 ,N-(2-乙鶸乙釀氧乙基)丙»釀胺與N-(2-乙釀乙釀胺乙 基)甲基丙烯釀胺。 遘用於製供粘著_之共聚物最~每由衍生自約70至約98重 JK %成-份(d);約2至約30繾量成份间,與〇至約1〇重量 %成份(f>之循瓖單位姐成。更佳者·偽由衍生自約85至約 95重量%成份(d) ·約2至約15重量%成份(e> •與〇至約8重 量%成份Φ之循瑁犟位姐成》 粘蓍劑之一種較佳加成聚合物為聚[丙《酸甲曲-共-2-丙烯_胺基-2-甲基丙礒酸納讕-共-甲基丙烯酸-2-乙tt 乙tt氣乙醮]〇 本發明所使用含聚合性粘著劑與核酸試劑琨合物之核酸 合物中•粘蓍劑之乾物簠含置可离達約20%。粘蕃 ί«之含量最好約1至約20籯量炻•更佳者為約2至約10簠最%。 -17- 本紙尺度遑W中《國家«毕(CNS)〒4規格(210x297公龙) 81. 4.丨(),000張(㈦ (請先閲誚背.1¾之注意事項#填窍本頁) 裝· 線- Λ fi η 6 於”的_ 五、發明説明(1 6) 該姐合物可視需要包含其他少量添加物,如:媛衢繭· 界面活性劑或结合劑,即通常佔姐合物總重量約5 %以下 Ό 該核酸試麯姐合物可依任何逋當方式塗佈在該可粘合之 載《。例如:可採用檷準塗佈儀器與技術塗佈在載體上· Μ手塗佈,在載《上印刷,利用吸管尖頭·微注射針頭或 微分散泵形成斑點後,乾嫌之。然而,該姐合物最好僅利 用微針頭Κ —種水性懸浮液形式配置,並在該可粘合式載 β上乾爍。乾爍«程係使配置好之姐合物在低於上述第一 種聚合物之玻璃態化瀑度約10至約80*C之溫度範·内加熱 而完成。 核酸試劑姐合物在載艚上之覆董程度可依分析方式,分 析法元件之姐態及相Μ技藝之IT家咸了解之其他因索等, 出現相-當大變化。例如:該姐合-物可均匀塗佈在該可粘合 之載_上·或塗佈在該載《之指定®域上(如上述姐合 物最好塗佈在指定區域上。將不同試劑塗佈在不同S域之 技術係晋知者。有些情況下,該等試_可分配在指定Μ域 中*衋生容易目視偵测之型*。 ..............<........裝.....叮:..線:·{ (請先閲讀背而之注意事項典項窍本頁) **I 1 .1. I .1 經濟部屮央標準杓貝工消#合作社印製 載粘· •。另 式地霣酸II'。 合效性路分理 粘有械用敝處 可更機使面臞 之可或括表氣 性朗子包软性 水物霣理刻慯 親合,ft触: 高姐學學液如 提Ε化化«Μ 而試種:酸氣 理酸 一如毓之 «核為例之霣 前之可。Μ物 «中理合ift化 纆例處姐路活 巳槲舫之二含 種實該»用經 1 Μ 。 型使可 用具上理及亦 使類Μ處涉Μ 好此載间程載 最。在不«» Μ附或該 81. 4. 10,〇〇0張(H) 本IMIiKJt遑用中《«家樣準(CNS)T4規格(210 X 297公Λ) 經浒部屮央標準沁只工消费合作社印製 五、發明説明(1 *7) 一種巳知之製程為在高灌下使用一氧化二氮。 «子處理法包括:霣暈放霣法,火焰與霣植放電法》 另一種前處理涉及同時進行化學與電子«理,如:在一 種反應性氣《之存在下,利用一種無捸《頻率電磁場處理 0 較隹之前處理包括:霣暈放霣處理法,鉻酸處理法及在 一種反應性氣《存在下利用_嫌電頻率電磁場之處理法》 以霣暈放轚處理法最佳。 上述前處理之替代處理法或補充處理法係在載體上塗佈 一種親水性聚合物進行前處理,該親水性聚合物具有作為 親水性補充靨之作用,且可改善上述所配置姐合物之粘附 性。補充曆聚合物及其製法係相Η技蕕習知者。此類聚合 物通常由含有一届或多届除離子_性或親水性側基如:羧基 ,確_·基’亞明後基•膦基(ph»sphinyl),嫌基輿理基之 循環單位姐成。此類聚合物之其他一般特性包括(但未限 制):單體中含有一些鹵素如:乙烯基氯,二氯乙烯•及 相Μ技«之專家咸了解者。 特別逋用之補充曆物霣包括:聚(丙烯騎-共-亞乙烯基 氮-共-丙烯酸),聚(丙烯酸甲酯-共-亞乙烯基氯-共-衣 唐《>,聚(衣康酸軍甲齙-共-亞乙烯基氯),聚(衣康酸 犟乙酯-共-亞乙烯基«)及聚(衣康酸單丁 _-共-亞乙烯 基氣)。 製備本發明之元件時,可使核酸試_姐合物配置在如本 文定義之可帖合式載黼上,並使所e置之姐合物在足使姐 -19- 本紙张尺度逍用中《«家榣毕(CNS) T4規格(210X297公*) 81. 4. 1(),〇⑻張(||) (請先閲請背而之注意事項本頁) 裝- 訂 線- .*«.濟部屮央標準杓貝工消#合作社印3i 五、發明説明(18) 合物乾嫌之灌度與時閜下加热。雖然進行壤當粘附作用之 時間與灌度可里反比例變化•但是通常滬度範比所使用 第一種聚合物之玻鶄鐮化灞度低約1〇至約80C。加熱時間 通常約10至約40秒。 本發明之元件可依許多種方式用於更詳述於下文之分析 法中。例如:該元件可僅為一種籣易物品•供實驗室或β 生診療室Μ檷準吸管·》杯及此等分析法已知之其他設備 (包括:供進行分析之適當容器)使用。最簡路之容器為 試管,Α光管•燒瓶或燒杯•較複_之容器則具有促成自 動分析《程之结構。 或者,該元件可成為一種可棄式测試装置之一部份來使 用•該等测試装置之结構係相Μ技藹已知者》 纳入該元件之較佳容器為如Εί:Α-0 381 501所述之一種 内含式肩試装置。埴種澜試装置名為相U技藝上巳知為化 學剷試包裝,袋裝或透明試管裝。其结構可在依 US-A-4,902,62 4所述探作分析法時,提供某些瀟度特性。 此類测試装置具有許多個不同反應室(或常稱為”囊胞 "(blisters)),其中含有多種試謂,埋衝ΒΙ及其他應用於 分析法中不同步》之材枓。該测試装置可*當地且迅速地 進行加熱與冷卻循環•以促進各種PCR放大作用步《•偽 本發明之較佳方法。其他«用之容器可《遢魍當改造供自 動進行成單次使用本發明方法。 此類测《装置中•本«明之元件係配置在一《特殊之小 室(成”囊胞”)中•試劑與液«可通過陔反應室•促進一 -20 - 表紙ft尺度逍用中明家樣华(CHS)Τ4規格(210x297公*) 81. 4. 10,000張⑻ (請洗閲讀背f之注意事項典填寫本頁) 裝- 線· 經 濟 部 屮 央 櫺 準 jih 工 消 合 杜 印 31 Λ 6 Π 6 五、發明説明(19) 系列反應,K偵癱檷的核酸。此畤之試爾與液臞則視為M 潦纆”固定在元件上之核酸試繭。元件上之核酸試01係用 來”捕捉”待偵测之檷的核酸。該元件可利用粘著_固定 在测試装置上,使元件融合在测試裝置之聚合物猜鑾上· 或使用其他習知方式納入测試装置中。《 —項具艚貢豳例 中,該元件本身可成為测試裝置之牆壁或完整一部份。 該濂試裝置可為内含式,意即雖然該裝置容許外來壓力 進入供傅送液Η·但是待加入樣本後•其構道為完全封閉 ,因此不會發生外漏現象。 較佳具《實施例中,测試裝置包括二片由彌性聚合材料 製成之相當薄之薄Η (如:加壓或加热可粘合式聚乙烯-聚(對苯二酸次乙_)積暦板•例如:史高板 (SCOTCHPAKTIM热粘合式臢,第_229或241號,此二者均來 自3M公司),其外緣均巳利用熱-粘合法或超音波加壓粘合 法密封。亦可使用热活化粘著劑,如:述於 US-A-4,352,925之乙二酵•二乙二酵及對苯二酸之共聚醣 ,或如述於US-A-4,126,46 4之聚笨乙烯-聚興戊間二烯-聚苯乙烯嵌段共聚物與聚(次乙基-共-乙酸乙烯酯)之混 合物。 薄Η之閭之某些點粘合後則形成小宜或通道 > 因此試劑 與液Μ可保留在澜試裝置内•並利用加颳装置移動通過。 本發明之元件即置於此類小宽中。置有該元件之小室係考 窳其他小室與通路之U係而设計•以使分析法所採用之試 Μ與液Μ可涑鼴該元件並進入巳設計來收集痛試麵與液髑 21 本紙張尺度遑用中Β »家樣毕(CHS) ΤΜ規格(210x297公址) Τη .先 閲 ih 背 •而 之 >主 意 事 項 填 % 本 η 訂 k 81. 4. 10,0⑻張⑻
It 6 五、發明説明异〇) 部 屮 央 標 準 工 消 t 合 作 杜 印 製 之«存室中。 本發明之元件可用於許多種偵籣檷的核酸之方法中。特 別龜用於放大與偵测K驗槺本中一種或多種樣的核酸所含 有之一種或多種特定之核酸序列。此等樣本可包括》»成 病籌材料·毛髮,Μ液或其他含有可偵测之道傅性DHA或 RHA之材料。 本發明尤其瑭用於生產一種感染性製鬵之至少一種特定 核酸序列,其產量相當於參與反應步Κ之數量之指數级倍 数。該產物將為一僩獨立之核酸雙願性姐合(duplex) ·其 末纗相當於所使用特定引子之末*。任何核酸來源•不綸 純化與否•均可作為起始物霣使用。若需要時•可使用核 酸混合物。待複製之序列可為轚《核齄之一儼蹶片。此外 *許多聲股核酸可為各特定核酸~使用相匾之引子與偵《方 式(包-括上述捕捉試麵),同畤-進行放大興偵_。相同核 酸中之多重序列亦可放大與偵拥。 待偵《之核酸可來自各種來源包括:任何來«中之質» •天然DNA或RNA。 可採用巳知製程,自各種姐織中萃取 ,包括:血液,周邊血液單核細胞(PBHC),姐織物霣或相 闢技蕤巳知之其他來《。本«明特別遍用於放大與偵《於 基因姐DNA,细8DNA,ffKDNA·病毒RNA·或感染綑β或 病毒之细_中所發現之DNA或RNA中所發瓚之核酸序列。 本文所述之方法可用來偵测或鑑定與感染性疾病•遣傅 性典常成衄MU椹如:痛症有Η之特定核酸序列。亦可用 於法學性調查工作與DNA鑑定。 22 朱紙Λ尺度遑用中國《家樣準(CNS) T4規格(210x297公Λ) 81. 4. ιο,ουο張(Η) (請洗W1讀背f之注意事項洱磺寫本頁) 裝< 線· Λ 6 η 6 五、發明説明(21) (請洗閲誚背f之注意事項#璘^本頁) 一項具麵貢豳例中,該元件係在一種已知為雑交分析法 中作為捕捉探針使用。竈用於本文之雄交分析法,製程與 試两係述於如:US-A-4,358,535,US-A-4,486,539輿 US-A-4,925,785等參考文默中。 本發明之元件亦壤用於繼聚合_鰱反應(或PCR)後,M 捕捉”放大之檷的核酸。PCI{之詳細遇程亦為習知者。壤 用於與欏的核酸直接或間接蠊交。”間接”之意係指可能存 在同時對檷的核酸及偵测探針里互補之中間寡核苷酸。加 附禰記物及製備探針之製程係相闞技習知者。*用之檷記 物包括:放射性同位素,®子密集之試劑,發色_,發螢 光鐳,燐光_部份«,嫌朊及其他磁性粒子•生物索輿其 他特興性结合部份Μ,化學發光物部份鱷及酵索。邊用之 酵索包括(但未限制):葡萄化酶,通氣化物_,尿 酸_ · -半乳糖苷酶,葡基》_與_(性磷酸酶•且可利用 已知製程附接在寡核苷酸上。此類酵素之基霣與形成色調 之姐合物係習知者。 經漪部屮央標準而:S:工消许合作社印敗 當該標記物為一種如:β氣化物_之酵素較《宜時,有 時候在分析期間可添加*氧化氩及a當之色調形成姐合物 。例如:逋用之逢生色調轼劑包括:四甲基_苯胺與其衍 生物,及白色染枓,如:三芳基咪唑白色染料或其他可在 *氧化物»及邊氧化氳之存在下反應產生一種色調之化合 物。特刖適用之產生色讕姐合物述於US-A-5,024,9 35。 另一種且較佳之具《實豳例中,PCR *程之引子係《過 生物索基化作用•巳放大之梭酸則利用附可偵测檷ε物之 -23- 81. 4. 10,(W0張(H) 本M·張尺度逍《 + «國家榫準(CHS) «Ρ 4規格(210x297公: 經浒部屮央梂準沁β工消伢合作社印3i 五、發明説明(22) 抗生物鬵或其衍生物偵Λ。例如:抗生物素可興一種酵索 形成共轆物》或具有一«放射性部份《或另一價如上述偵 测探針所述及之偵瀰部份體。放大產物上之生钧索輿抗生 物索形成ft合物,並使用應當偵测試_輿技術。引子之生 物素基化作用可採用已知製程進行。 本發明之元件可包括在診斷用套姐内,該窖姐中亦包含 一種或多種試爾·儀器成該元件之使用銳明書。該赛姐最 好包括一種供偵湾元件中核黢試繭寡核苷酸與檷的核酸之 轅交產物及檷的核酸之偵测試朗(可纆遢或未經遢PCR〉》 ”偵測試爾”係指可單獨或集腰產生一種可偵测之訊號之 一種或多種届別反應物霣。最佳之偵测試劑為一種用於 PC R且與禰的核酸呈互補型之生物基化之引子。或者,該 偵测試_為一種*用於雑交分析'法之水溶性*附檷記物之 寡核苷-酸。- - 該套姐可包含其他試劑與液《,如(但未限制):洙籌 液,萃取姐合物,稀釋劑,級®鬭,引子,探针,DN A聚 合«及PC R試劑姐合物。套姐之姐件通常依竈於在缠當條 件下通送興存放之方式分開包装。 下列貢例係說明本發明之搮作法•但未Μ任何方式加Μ 限制。除非另外銳明*否則所有百分比均以重鼉計。 窗俐夕材料明方法: 寅例1與2所使用之核酸«蘭之«法如下: 使用已知之乳液聚合技術· «I _ 之聚合粒子( (請先閲讀背f之注意亊項洱填寫本頁) 裝< 訂· 線· 本紙張尺度边用中β «家《毕(CNS) Ή規格(210x297公货) 81. 4. Ιϋ,οοϋ張(Η) Λ 6 Π 6 五、發明説明(23) 平均直徑1.2微米)。此等粒子上則附接蓍寡核苷酸分子 。SEQ ID H0:1 (序列雄別鏞號1): 5'-X-GAGACCATCA ATGAGGAAGC TGCAGAAT-3 * 其中X為一籣含有二儸四乙二酵聞播基之R二醉鏞结基圈 ,係根據US-A-4,962,029之技術製備及附接在寡核苷酸上 〇 寡核苷酸分子如下述附接在粒子上,形成一種核酸K 劑: M2-(N-嗝啉基)乙磺_緩街痕(0.1M, pH 6>洗满粒子二 次。使粒子樣本(30微克)懸浮在《衝液(1奄升)中後,興 1-(3-二甲胺丙基)-3-乙基碳化二亞胺«[酸Μ (0.15«升 *100«克/毫升«衝液)及寡核苷酸(0.0288毫升· 57.3 0D/亳升純水· 1.65 00單_位或55微克)潘合。混合 物於室.溫下(20 - 25t:)上下_供^旋轉15小時後雛心。以水 洗縧粒子三次•再次懸浮在純水中,固《含量為0.9%。 核》試劑興聚m甲酯-共-2-丙烯麵胺基- 2·=^基 ——一 〜— ---------------------------------------------------------- ELiULillJi--共二里JSL0烯酸2 -乙酿乙«LiL5醮)(重量比 合。所得姐合物中含約18¾ (乾物重 )粘蕃劑。此混合物圼水性》浮液形式塗佈在一種热粘合 式載Μ上•形成如下述實例1之元件。 Μ濟部屮央栉準局β工消合作社印31 .先 閲 ία 背 ,而 之 注 意 事 項 填 寫 本 μ 用於貫例2之PCR過程之引子如下: SEQ ID N0.2 : 5 1 -X-AGTGGGGGGA CATCAAGCAG CCATGCAAA-3 * SEQ ID NO. 3: 25 81. 4.丨0,〇〇〇張(H) 本紙張尺度遑用中國《家榫毕(CHS)肀4規格(210x297公;It) 215109 Λ 6 η 6 經濟部屮央標準/«;迈工消许合作杜印51 五、發明説明(2Μ 5f-TTCCTGCTAT GTCACTTCCC CTTGGTTC-3' 其中X代表一届生物素四次乙基間隔基,係依 US-A-4,914,210所指示製備並附接在寡核苷酸上。 實例3之核酸試繭係依類似方式·採用不同規格之鼴〔 苯乙烯··共-3-(對乙烯苄硫基)丙酸〕(莫耳比例 ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------—-一――'' ------------ -----------------*—.-训—— 97.6:^.4)粒子製傅,並依類似方式,使下列寡核苷酸附 接在粒子上。SEQ ID HO. 4: 5 *-ATTATCTTTT ATATTCTAAC CAGGATT-X-3' 其中X包含二儺四乙二酵聞限基及3’-末纗之一钃3-胺基 -1,2-丙二酵鏈结基。 實例3中亦使用聚[間與對乙烯基甲笨(64:36)-J1-JL基 __丨丨___--,.~'...—.' — * - «>- - "· 丙烯酸](重最味98,: ?)UL^_。此等粒子係依冒知之》浮 液聚合技術或依述於US-A-3,61 ί, 9 72之有限聚结製程 (1 i i t-ed co-a lescence procedures)製儀 ° 寅例2之標的核酸為HIV-1之g^E域之140-核苷酸節段 〇 洗滌液(250微升)包含磷酸納嫒衢液(10·Μ, pH 7.4), 氯化納(150 ·Μ),乙二胺四乙酸(1 ·Μ)疏酸癸ffi(l %)。 洗滌液使用前先加热至55它。 PCR所採用之DN Α聚合酶係單離自水生樓热《 (T h e r η u s aquattru<s) 〇 鐽抗生物索(streptavidiiO與山與《氧化物酶之共軀物 偽得自驀金山金德貢驗宽(Zyaed Labs, San Francisco) •且埋K9f白<0.5 9έ)之含定與防IRAMthUerosal 26- 本紙诋尺度遑和中β國家«準(CNS)TM規怙(210x297公*) 請 •先 閱 ifi 背 *而 之 注 意 事 項 存 寫 本 頁 81. 4. 10.〇〇〇張(||) A 6η β 經浒部屮央榀準;员工消赀合作社印敗 五、發明説明(25) preservative) (Ο.ΟΙΧ):^ 磷酸鼸緩衡液(cH 7.3)稀釋 1:8000° 一種白色染色姐合物之製法如下:使2-(4-羥基-3,5-二 甲氧苯基)-4,5-雙(4-甲氧笨基)咪唑(製成0.1%溶液)溶 於含聚(乙烯綦吡咯啶嗣)(20%)之磷酸筘埋衝液(5·Μ)溶 液中。然後添加此溶液至含邊氧化氫(1〇βΜ) · 4·-羥基乙 鼸替苯胺竃子轉移繭(5 ·Μ)及二次乙基三胺五乙酸螯合繭 (10/ζΜ)之磷酸納緩衝液中*形成终壤度為1 %聚(乙烯 基吡咯啶醑)輿0.005%白色染料。 實例2之PCR反應液包括:參(羥甲基)胺基甲烷緩街液 (10·Μ,出δ),霣化钾(50·Μ),氯化鎂(1〇·Μ)及明膠( 10微克)之溶液。此溶液中添加引子(各100微微奠耳), dN + P(各1.5 ·Μ)及DNA聚合酶(7]5犟位)。 實例-3中*製備下列瘠液,產生PCR試劑: DNA聚合酶之齡存緩銜液係由參(羥甲基)胺基甲烷緩衡 液(8毫升,1 Η·出8) •氱化鉀(13.32毫升,3Μ).二 确異赤蘚酵(dithiothreitol)(0.4 «升· 1Μ),乙二胺四 乙酸(0.16毫升,0.25 M)甘油(250毫升,8 0%),一種含 30¾南待(N0KIDETTM) P-40非離子性界面活性蘭(希格馬 化學公司(Sig^a Chemical))與 30% 吐溫(TWEENTM) 20 非 離子性界面活性繭(1C典國公司(ICI Ane「iCas. Inc)之界 面活性酬溶液(6.67毫升)及一種明《溶液(4毫升· 2%) 製供·因此其终濺度為級銜Μ(20·»〇 >氯化鉀(100 «Μ) •二班赤蘚酵(1 ·Μ),乙二胺四乙酸(0·1·Μ)· 甘油(50 -27- 本紙張尺度逍用中B*家«率(CNS)T 4規格(210X297公货) 81-4. 10,000¾ (H) (請·北閲讀背f之注意事項再蜞筠本頁) 裝· 線-
215109 iU 經浙部屮央榀準工消费合作社印製 五、發明説明(¾) %),界面活性劑(各0.5 %),明膠(20 0微克/ «升), 並加水至形成400亳升溶液。 亦製備第二種級衢液,使之含參(羥甲基)胺基甲烷 (IOibM, cH 8.3)·氯化钾(50·Μ),氛化鎂(10·Μ),明膠 (10微克)及甘油(7.5% )。 製備第三種緩衡液•使之含參(羥甲基)胺基甲烷 (10·Μ)與吐瀑(TWEEITM>20非離子性界面活性黼(0.5% ) 〇 然後由上述三種鑀銜液製衡PCR試劑溶液·你添加12微 升儲存級街液混合液至2 88微升第二種拔銜液中》取此混 合物220微升中•添加80微升第三種級衝液*最後添加經 «生物素基化之欏的核酸*形成40pM之禳度》 *例1元件之製法 此貢例說明本發明一種元件之-製法•並W此元件與本發 明範_以外之元件,即核酸試蘭Μ另一種方式粘附在載艚 上所形成之元件進行比較。 製餚本發明之元件時•係採用241型史高板 (SC0TCHPAKTM)積層板(3Μ/公司)之樣本作為固W載W ,該橫曆板係聚乙烯與聚對苯二酸次乙酿之積騰板° 板之聚乙烯臁利用來自皮拉技術(Pillar Technologies, Ha「tland Wiscansin)或艾康工業(Enercon Industries, Meno no nee Wisconsin)之一般處理設備進行18章*8理至 56 - 59達因/平方公分。 聚乙烯-» (對苯二酸次乙_)積曆板之聚乙嫌庸你經热 -28- 本Λ»·尺度Ϊ4用中國家你準(CNS)T4規怙(210x29/公址) 81. 4. 10,000¾ (H) (請先間讀背而之注意事項再填窩本頁) 裝_ 訂_ 線- 215109 Λ 6 Η 6 經濟郝中央栉準灼员工消奸合作社印製 五、發明説明(27) 粘合在元件載《上•形成一僩周醒密封之偵测通道。此通 道中含有一®入口尖頭,供注射液《進入通道内,並具有 —個出口装置,使液體流出通道。 上述粘著爾與核酸試爾之姐合物以一種水性懸浮液(2激 升*試爾固《量0.9炻,0.2%粘著劑)形式塗佈在經霣暈 處理之載體上。該懸浮液係塗佈在偵测通道中之指定載體 區域上,並使用热熨斗(95 C,30秒)輿載«底部接觸加以 乾埭。積曆板薄片則纆熱粘合在元件上•形成一儷《圃密 封之偵澜通道。 積層板薄片熱粘合在元件上之前,先進行一項物理試驗 ,以決定核酸試劑姐合物固定在載《上之程度。此試驗包 括磨擦乾《之姐合物沈積物,並使載《依180度折叠。本 發明元件中之試覿未脫鐮載《 ·_反而緊緊地固定其上。在 此等物理試驗期間,僅極少量姐哈物自載《上脫落。 依類似方式製備對照姐元件,係採用相同載钃與核酸試 劑,但省略不用粘著劑。將含核酸試劑(0.9¾固«之懸浮 液)之1微升甘胺酸緩衝液(0.1M, pH 8.5)塗佈在烴《晕 «理之載《上指定S中,乾嫌•並依上述使一片積«板薄 片热粘合在沈稹物上。進行热粘合之前,Μ物理方式磨镲 乾嫌之試劑,使載Μ彎曲180度,観察試劑是否仍粘附在 載«上。此類物理試驗期間,許多試_自載«上脫落。 *例2元件於PCR方法中^闲法 此寅例銳明並tb較貢例1所述元件於HIV-I DHA序列之 放大與偵《法中之用法。 -29- (請先W讀背而之注意事項Λ·填寫本頁) 裝< 訂 線· 本紙张尺度遴用中》«家樣竿(CKS)IM規格(2丨0X297公A) 8】.4. 10,000張⑻ 五、發明説明(28) Λ 6 It 6 經濟部屮央楳準而只工消"合作社印製 添加不同量之上述標的HIV-I DNA衡片(Ο, 100, 10s 與104個樣棋(copies)或分子)至上述PCR試繭溶液中。 所得溶液之總體稹各為100微升。 將各溶液分別置入250微升微最試管中’並使用PCR烴 遇如下程序之40次循環進行政大作用: 變性:加熱至96 t: *並保持30秒,及 起始/纊大:冷卻至68T0並保持1分鐘。 PCR所採用之設備為希特斯/伯金艾偁公司 (Cetus/Perkin E丨ner)生產之伯金艾倮热循環櫬 (Perkin-Elmer Theriaocycler)產品。 最後一次循環後,加热溶液至95 υ,並保持5分鐘,使 所形成之雙股衋物變性。該热溶液分別注射至元件之偵测 通道中(《例1輿對照姐),並確'~使溶液輿固定在其中之核 酸試劑均勻接觸。注射溶液後元件在42 t:下培養5分 鐘•使互補之檁的核酸與元件中試劑之寡核苷酸雄交。W 餘液體則利用壓埔空氣擠出或利用針简抽出。 上述洗滌液則注入各元件中二次·Μ排除未雜交之物質 。一旦最後一次洗出液排出時,即令含鍵抗生物素與過氧 化物梅之共輛物之溶液(2 00微升)注入各元件中.並於 42C下培養2分鏞。一旦溶液排出時,亦依類似方式注入 白色染色溶液(200撤升),並再培《5分鍮。 排出剌餘液《•元件中所出現之色綢訊《經目視依0至 1〇(最髙密度)分级。其结果示於釀示中。此二種元件之背 最干擾(樣棋數0 )均相當低。然而,分析放大之檷的核酸 -30- 本紙Λ尺度遑用中《國家楳毕(CNS) 規格(210X297公龙)
8】.4. 10,000張(H (請先閲讀背而之注意事項再填寫本頁) Λ 6 Π 6 經濟部屮央標半沁R工消1Ϊ,合作杜印^ 五、發明説明(29) 時·本發明之元件在各檷的核酸濃度下出現較高舐號*此 黏顯示核酸試劑烴過偵测邊程之重覆洗嫌及與數種不同液 «接觸後,存留在元件中之情形較佳。如實例1所示,對 照姐元件樣本中之許多量試劑容易被磨擦脫鐮載β,因此 咸信分析法所使用之液體亦多在分析期間排出。相當霣要 之點為本發明之元件證明對低壤度(100偁樣播數)檷的核 酸具高敏感度。 實例3亦採用辉度捆租去》雄捆夕戧«夕試黼中俥用不固 十小粒平之港合物之對睡奮例 此實例銳明製備一種含核酸試劑姐合物之元件之本發明 搮作法,並比較其用法輿本發明範_κ外之元件之用法。 亦比較經β理之載體與未》處理之載體之用法。 製衡不同粒子大小之聚[苯乙^ -共-3-(對乙烯苄疏基> -丙酸](輿耳比例97.6 : 2.4,重量比95 : 5)水性聚合物 小珠分敗液,粒子上則具有如下述之寡核苷酸與之共價鍵 结。如上述SEQ ID N0. 4序列之寡核苷酸利用二鍤四乙二 酵間隔基* —倨3-胺基-1· 2-丙二酵部份體*及一俚胸胨 唯啶Μ基《接在粒子上。寡核苷酸诹利用3 -胺基-1· 2 -丙 二酵部份《之胺基附接在聚合物粒子上形成試劑。 製備平均粒子大小不同之試劑: «用於本發明播作法之轼劑包括平均大小約1.3微米之 粒子•且係由上述聚合物帖著劑(0.1 %固騙)於2-胺基-2-羥甲基-1> 3-丙二醉/乙二胺四乙酸«衝液中配成 2.0Χ 固 Μ。 -31- 本紙张尺度逍用中國《家楳毕(CNS)T4規格(210x297公放) 81. 4. 10,000張(H) (請先閲讀背而之注意事項#堝寫本頁) 215109 Λ 6 U6 五、發明説明(3〇) 本發明範圄K外之核酸試劑(對照姐A )包括平均大小約 8微米之粒子•且係Μ聚合物粘著劑(0.1 %固髓)於2-胺 基-2-羥甲基-1· 3-丙二酵/乙二胺四乙酸緩衡液中配成 4.0 %固《。對照姐Β與C包含不同大小之粒子混合物:對 照姐Β為1.3黴米粒子(20%)與8.0微米粒子(80%)之混 合物·對照姐C則為此二種大小粒子之50- 50 (重量比)混 合物。 採用該等試蘭®方製供下列元件,元件中則具有試爾作 為分析法之捕捉探針: 頂曰 1 2 3 4 _量逋理? I 本發明 對照姐a 對照姐B 對照姐C 無 2 本發明 對照姐A 對照姐B Is照姐c 有:8秒 (請先閲讀背而之注意事項#填寫本頁) 裝- 經濟部屮央榀準而β工消1V合作杜印3i
製備元件時,使聚(對苯二酸4乙_/聚乙烯積層板溥 Η)(史高板(SC0TCHPAKTM)241, 3Μ公司)於—種成型台( 或搞型)下加熱,形成一排均向薄Η同一脚下壓之E域’ 因此當稍後與另一片播加薄積時,所形成之小袋具有 狭窄通道•由該下壓之Ε域通往主通道,各下稍後均 充滿一種壤當之試劑姐合物。在下壓及通道®上另加上一 薄片暦積形成覆藎片,並拈合*因此各下與通往主通 道之通道之間形成一届鉋滿之坫合域。然而•第一•接近 主通道末纗之一俚區段接受霣暈放《處理’係由安康公司 (Enercon)之DYNE-A-MITETM霣翬放霣單元在0.95公分間 «下放《至嫌弗簏(TEFL0NT“)介霣板8秒鐮。上述試驗B -32- 本紙Λ尺度遑和中BB家《罕(CNS)T 4規格(210X297公;it) 81. 4. 10,000¾ (Η) 215109 A 6 Η 6 經潦部屮央櫺準· 而卩工消设合作杜印製 五、發明説明(31) 方(本發明及對照姐A - C)則»後立即沈積在經處理表面上 之四個點,形成一排®點上各含有0.9至1.1微升上述配方 之元件。巳Ε置之Κ方於室a下之空氣流下乾嫌約2〇秒· 同時利用約95t:之熨斗加熱載«之相反側。另一姐元件朗 依頰似方法製備•但未進行霣暈放霣處理。 該装置中所形成之小囊胞(或小室)刖填入所需之試劑。 各元件之第一届囊胞係製成可接收待涮》之樣本•並加加 热期間保留該樣本。第二俚囊胞中則充滿如上述之鍵抗生 物素-山葵IS氣化物_共輾物姐合物。第三儸囊跑中含有 1 %硪酸癸齙納洗滌液(係含10·Μ磷酸納,150 氣化納 與1 ΒΜ乙二胺四乙酸之礪酸Κ鑀衡食薑溶液•出7.4), 且第四偭囊胞則包含上述白色染色姐合物。位於主通道末 纗之最後一β囊胞比其他囊_大_•且含有一種吸收朗,成 為《液之鵪存-室。 - 然後加上覆Μ片跚積,並依三《步《粘合。首先壓箱該 三層夾心板,並僅使含該三種試黼溶液之囊胞周圃及《液 囊胞周圔在約149 t:下加热粘合。接收樣本之PCR囊胞( 包括鉋滿之粘合處)與通道之形成係經由澜試包在粗成型 加热绀之間,於約163 C下加热來達成。第三步驟為在测 試包《豳形成周瑾粘合《•並使所有囊胞阚遒拈合鏠利用 上》板溫度199 t進《5念旺抿居沮底板則仍保留在周溫下 。所完成測試包(或元件)中所形成之通道位置可使一隻滾 W横《元件含*18之部份時•接蓍瀰破漘胞之粘合雄,並 迫使各囊胞中之試劑沿蓍出口暹道進人主通道•流至含捕 -33- 本紙张尺度遑用+襲8家«準(CHS)T4規格(210χ2ίΠ公*:) (請先間請背而之注悉事項#蜞寫本頁) 裝. 訂· 線· 81. 4. 10,000ft(H) 經浒部屮央榀準:工消费合作社印製 五、發明説明(3幻 捉探針之區域。 所完成之轚俚测試元件偽依下文所迷用來評估試_配方 在测試裝置之囊胞中填入約205 - 210緻升作為檷的核酸 生物索基化之寡核苷酸試«溶液*其核》酸序列與共價结 合在聚合物粒子(即核酸試ΒΠ上之寡梭苷酸呈互襦•然後 加以粘合。該生物索基化之欏的核醵序列如下:SEQ ID NO. 5:5,-X-AATCCTGGTT AGAATATAAA AGATAAT-3,其中X為一個犟一之四乙二酵鐽结基圏•供附接在生物素 上》PCR反應溶液中之檷的核酸濃度成信為40pM。 含此試劑之囊胞於95 - 98 υ下預热120秒•然後以滾_ 打破帖合處•使溶液流至含核酸^劑之Β域。寡核《酸試 劑與捕捉試»則在42 下培養5分鐘期間·於偵测囊胞中 進行雜交,而含抗生物素-山葵過氣化物臃共醣物之囊胞 則加熱至35它。共親物囊胞之粘合處破裂•溶液流至偵测 區·在該處與可遇到之生物索基化試劑進行免疫反應。洗 滌液囊胞之粘合處(預热至55t 300秒 > 破裂·洗縧液則流 至偵澜S,清洗主通道,並去除偵测區中未结合之共艉物 。含形成色钃姐合物之囊胞之粘合處則»後破裂*姐合物 亦流至偵籣6。培養5分tt ·使色綢形成後•方鑲取顔色 密度值。如下表I所示之顔色密度值係分二«特點評估:”染色 點品質”與”染色《顏色”。 -34- 表紙張尺度逍用中家樣旱(CHS)甲4規格(2丨0 X 297公; 81. 4. 10,000張(H_ (請先M1ft背而之注意事項#填寫本頁) δι 2 η 6 五、發明説明(33) ”染色黏品質”係依1至5分評判•各分數之評估值如下 (分數愈低愈好): 1- 一染色點品質良好•目視未發現《I落或暇庇· 2- 出頊凹痦或極輕微Μ» (佔25% Μ下之圏黏)。 3- 軽微剝瑢(約25%钃點) 4- 顧著Μ瑶(25 - 75%圔點) 5- ΗΙ點完全剝瑶。 ”染色黏顔色”係根據目視,Μ灘色綢密度與色·比較· 其中0為嫵密度· 10為密度最离。此時分數象离愈好。” 品質”輿"顔色”分數之綜合即顧示該試劑S方是否改菩了 粘附性Γ品質”)·是否損傷所豪生之訊號(”顔色")·或兩 者。m_Ιι_ .,染 色 品 質 項 目 1 (本發明) 2 (對照姐Α) 3 (對照姐Β) 4 (對照姐C) 1 (乾) 1.17 2.08 1.25 1.83 1 (瀰) 4.08 4.75 4.66 4.25 2(乾) 1.00 1.00 1.00 1 . 08 2 (瀰) 1.08 1 . 83 1.58 1.83 染色黏頭 色 經濟部+央標準妁β工消许合作杜印製 1 2 3 4 項 目 (本發明) (對照姐Α) (對照姐Β) (對照姐)C 1 6.0 5.33 6 . 0 6.80
Tk 先 閲 背 而 之 注 意 事 項 再 塡 寫 π 裝 線 本紙張尺度遑用中家《毕(CNS>T4規格(210X297公釐) 81. 4. 10,000張(H) 15109 λ 6 ______Β_6 五、發明説明(54) (12個黏中 (12俚點中 (12僩點中 (12俪點中 洗掉9儸) 洗掉9髑) 洗掉10钃) 洗掉7個) 7.42 6.67 6.92 7.75 由表I所示數據達成如下结論: 1) 具有未經電晕處理載Η之元件出現可接受之色調密度 (即敏感度)·但是亦洗掉許多試爾(即粘附性不足)。 2) 含較大粒子之試麵配方通常較混漘•且所得之染色點 品質與顔色較低。 3) 使用小粒子試_配方(包括灞式與乾式)可得到最佳之 ”染色點品質"分數。 4) 小珠(二種大小)混合物通常無法豪生所需之姐合試鋼 粘附性與色調密度。 (請先閲讀背而之注意事項洱填寫本頁) 裝. 訂- -線· 經濟部中央標準而β工消1V合作杜印31 本紙Λ尺Λ遑用中 Β家榣率(CNS)T4規格(210x297公;¢) 8】.4. 10.000張(Η)
Claims (1)
- t t 縱麻午 AT B7 C7 D7 六、申請專利範園一種與該粒子 b . —種水不溶 物之玻璃態 至少低約3 0 *0 該聚合物粘著 ,該第一種聚 (a) 約 應 化 活 胺 約 性 0.1至 性基围 該反應 之2-取 性酯· 基與氫 60至約 之乙烯 超音波音 酸試劑姐 劑*係包 物姐成之 ,該粒子 共價性附 性粘著爾 化溫度比 » 劑在姐合 合物包含 約60簠1 之乙烯未 性基團係 代乙磺酿 乙烯醢基 确基, 99.9簠量 系未飽和 壓可粘合式載體之元件,該載Μ 合物,該姐合物則包含下列物質 含: 粒子•該聚合物之玻璃態化溫度 之平均直徑為約0.1至約3微米, 接之寡核苷酸,及 •係包含第二種聚合物,該聚合 第一種聚合物之玻璃態化溫度 物中之含量為約1至約20重量% ♦ ♦ %衍生自一種或多種具有一涸反 飽和之可聚合性單«之循環單位 選自:活性鹵素,羧基,脒,活 基,活化之2-取代乙羰基,一種 •乙烯羰基,醛,.肼,瓖氣基._, •Λ %衍生自一種或多種可提供疏水 之可聚合性單«之循瑁單位,及 (請先«.讀览面之注意事項再填葙本頁) .装· •打· •線. 絰濟邡中央標準局印裝 (〇 〇至約15重悬%衍生自一種或多種異於上述⑻與Ob) 所定義之乙烯糸未飽和之可聚合性單18之循環單位 T4(210X 297-a 215109 A7 B7 C7 D7 經濟部中央搮準局印^ /、、申請專利範面,-且 該第二種聚合物包含: <cb 約55至約100重悬%衍生自一種或多種可提供疏水 性之乙烯糸未飽和之可聚合性單«之循瑁單位, 0至約45重董%衍生自一種或多種可形成一種水溶 性均聚物或可提供親水性之乙烯糸飽和之可聚合性 單體之循環單位,及> ❿ 0至約15重量%衍生自一種或多種可在該第二種聚 合物中產生交鏈之乙烯糸未飽和之可聚合性單«之 循環單位。 2. 根據申請專利範園第1項之元件,其中該載體業由霣翬 放電處理,輅酸處理,在一種反應性氣體存在下利用一 種無限電頻率電磁場處理·或在配置該組合物之表面上 具有親水性補充靥。 3. 根據申請専利範圍第1項之元件,其中該聚合粒子之平 均直徑為約0.5至約2微米。 4. 根據申謫専利範匾第1項之元件,其中該第一種聚合物 之玻璃態化溫度為約70至約175TC,該第二種?R合物之 玻璃態化溫度則比該第一種聚合物玻璃態化溫度低約 30至約 1201C。 * 5. 根據申謫專利範園第1項之元件,其中該粘著_在該姐 合物中之含;!為約2至約10重ft%。 6. —種内含式測試装置,其含有根據申請専利範画第1項 之元件。 f 4(210X297 公尨) (請先聞讀背面之注意事項再嗔窝本页) •裝· •訂. 線. 215109 A B c D 六 、申請專利範圊 -種製備一種核酸测試元件之方法,係包括: A.使一種核酸試劑姐合物沈積在一個可粘合式載雅上, 該姐合物係包含下列物質之混合物: a. —棰核酸試劑,係包含: 由第一種聚合物姐成之粒子•該聚合物之玻璃態化通度 為至少約70¾,該粒子之平均直徑為約〇.1至約3微米, 友 一種與該粒子共價性附接之寡核苷酸,及 b. —種水不溶性聚合物粘著劑,係包含第二種聚合物, 該聚合物之玻璃態化溫度比第一種聚合物之玻璃態化溫 度至少低約30*0, 該聚合物粘著劑在姐合物中之含量為約1至約20重量% ,該聚合物粘著劑在姐合物中之含最為約1至約20重量 %,該第一種\聚合物包含: <a> 約0.1至約60重量%衍生自一種或多種具有一儸反 應性基围之乙烯未飽和之可聚合性軍髑之循瑁單位 •該反應性基圈係埋自:活性_素,羧基,胖,活 化之2 -取代乙磺醢基,活化之2 -取代.乙羰基,.—福 活性酷,乙烯醮基,乙烯羰基,酸',肼,環氧基, 胺基與氫硫基, ' 水及 疏, 供位 搮單 可環 種循 多之 或體 種單 -性 自合 生聚 衍可 %之 ft和 重飽 .9未 99系 約烯 至乙 60之 約性 (請先閑讀背面之注意事項再填寫本頁) •裝· •打· 經濟部中央搮準局印裝 (b) 與 (a) 述 上 於 興 種 多 或 種 一 自 生 衍 ¾ 最 3 5 1 約 至 ο 甲 4(210X 297公省) 215109 AT B7 C7 D7 六、申請專利範園 (請先閑讀背面之注意事項再填商本百) 所定義之乙烯糸未飽和之可聚合性單體之循環單位 ,且 該第二種聚合物包含: (d) 約55至約100重量%衍生自一種或多種可提供疏水 性之乙烯系未飽和之可聚合性單Μ之循環單位. (e) 〇至約45重麗%衍生自一種或多種可形成一種水溶 性均聚物或可提供親水性之乙烯糸飽和之可聚合性 單體之循瑁單位•及 〇军約15重董%衍生自一種或多種可在該第二種聚 合物中產生交鏈之乙烯系未飽和之可聚合性單體之 循瑁單位,且 B.使該沈積之核酸試劑組合物在足使該姐合物粘附在該 載》上之溫度與時間下加热。 8. 一種診斷用測試套姐•係包含: ⑴一個根據申請専利範園第1項之元件,及 ⑵一種偵测試劑,供偵测該元件中之該核酸試劑寡核 苷酸與該摞的核酸之雜交龕物。 9. 根據申請專利範圃第8項之套姐,其中該偵澜試劑為二 種與該檷的核酸呈互補之經生物素基化之引子^ 10. —種偵测一種欏的核酸之方法,該方法包括: 經濟部中央橾準局印製 A. 使疑含有一種欏的核酸之樣本與一個根據申請専利範 圃第1項之元件接觸使該檷的核酸即與元件上之故核 酸試劑形成雜交產物,及 B. 偵测該雜交產物之存在,作為該樣本中該欏的核酸存 -4-f 4(210X297 公廣) AT B79A 5109_D? 六、申請專利範® 第核 存 園該 酸 範之 核 : 利上 的 栝 専件 標 包 請元 該 0申輿 中 ,,據酸 本 法大根核 樣 方放種的 該 之酸一禰 為 酸核含之及作 核的包大,, 的欄輿放物在 播種酸該產存 種一核使交之 一 之的 雜物 測中檷觸/種產 。偵本之接一交。 檷及樣大件成雜標 指大試放元形該指 之放測該之劑測之 性種使使項試偵性 在 1Α.Β.1 酸C.在 ...................................Λ ...............¾..............................ίτ (請先閱讀背面之注意事項再填荈本頁) 經濟部中央揉準局印製 f 4(210X297公廣)
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