CN102174144B - 一种荧光乳胶颗粒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种荧光乳胶颗粒的制备方法：a)将烯酸酯类单体、荧光染料与超纯水按照重量比为1～15∶0.004～0.4∶100混合，搅拌、加热，并在引发剂的作用下发生无皂乳液聚合，得到第一反应产物；b)将步骤a)得到的反应产物过滤、离心后去除上清液，洗涤所述去除上清液后的剩余物，得到荧光乳胶颗粒。本发明提供的制备方法工艺条件温和，制备的荧光乳胶颗粒粒径均匀可控，单分散性好。

Description

一种荧光乳胶颗粒及其制备方法

技术领域

本发明涉及聚合物合成领域，更涉及一种荧光乳胶颗粒及其制备方法。

背景技术

随着医学诊断技术不断地发展，对目标分析物的检出限不断下降，因此需要不断发展抗原或者抗体标记技术。目前，标记技术主要采用放射线同位素、胶体金、荧光分子、酶、乳胶颗粒等。它们都有各自优点，但对于复杂的临床样本来说，不能实现高通量、微量化、自动化、灵敏化等检测技术的发展。而荧光染料分子与乳胶颗粒相者结合的一种高分子材料为实现这一检测技术提供了强有力的手段。因为它既有荧光分子的高灵敏性，又具有乳胶颗粒的高通量、自动化、微量化的特点。因此，这种高分子材料具有非常广阔的发展空间。

荧光乳胶颗粒是指粒径在纳米到微米范围内，负载有荧光物质，在外界光的激发下能够发射荧光的乳胶颗粒。其外形可以是任意形状，但一般是球形。根据载体及荧光物质的不同，荧光乳胶颗粒可以分为两种：一种是无机/有机乳胶颗粒(乳胶颗粒是高分子材料，荧光物质是无机物，如包裹量子点的乳胶颗粒)；另外一种是有机/有机乳胶颗粒(乳胶颗粒是高分子材料，荧光物质是有机物染料分子)。其中有机/有机乳胶颗粒可以在其表面方便地引入各种需要的功能基团(氨基、羧基、羟基、醛基等)，同时也可以选择不同的共聚单体和聚合工艺路线进行高分子乳胶颗粒设计，因此，有机/有机荧光乳胶颗粒一直都是人们研究的热点。

制备荧光乳胶颗粒的方法目前存在三种方法：第一种是通过荧光单体分子与乳液单体分子共聚合成荧光乳胶颗粒。美国专利US4326008公开了一种荧光乳胶颗粒及其制备方法，将丹磺酰氯与丙烯胺反应，合成荧光单体分子，然后与乳胶单体共聚合而制备荧光乳胶颗粒。美国专利US4194877公开了一种荧光乳胶颗粒及其制备方法通过丙烯酰胺将荧光染料分子连接到聚合单体上，再通过乳液聚合制备出荧光乳胶颗粒。中国专利200710031103.4公开了一种荧光乳胶颗粒及其制备方法采用金属配合物荧光单体与乳胶单体共聚而制备的荧光乳胶颗粒。通过这种方法制备的荧光乳胶颗粒荧光稳定、荧光染料分子分布均匀，染料分子不容易泄露等优点，但是这种方法需要荧光分子带有不饱和键，能够与乳胶颗粒单体发生共聚，而大多数荧光分子不具有不饱和键，即使能够合成出来工艺路线也非常复杂。

第二种是先通过聚合反应制备出乳胶颗粒并在乳胶颗粒表面修饰不同的活性基团(氨基、羟基、羧基、醛基等)，然后通过共价键的方式把荧光分子连接到乳胶颗粒表面上，从而制备得到荧光乳胶颗粒。美国专利US4609689公开了一种荧光乳胶颗粒及其制备方法通过1，3-丙二胺的桥梁作用把异硫氰酸荧光素(FITC)连接到颗粒表面而制备荧光乳胶颗粒。美国专利US6268222公开了一种荧光乳胶颗粒及其制备方法，将纳米级的荧光颗粒共价连接到微米级的颗粒上，从而制备得到荧光编码颗粒。美国专利US5194300公开了一种荧光乳胶颗粒及其制备方法，用荧光胺与表面带有羧基酯的颗粒反应而制备荧光乳胶颗粒。这种方法制备的荧光乳胶颗粒方法简单，颗粒大小容易控制，但是存在很多不足之处，如：由于乳胶颗粒表面修饰基团有限使得共价交联的荧光分子有限，即单个荧光乳胶颗粒荧光强度不强；荧光分子在颗粒表面容易受到外界的影响；乳胶颗粒交联荧光分子后表面剩余的活性功能基团大大减少，从而导致生物大分子与颗粒交联的机会大大减少。

第三种方法是通过包埋吸附的方式进行制备。即在聚合反应中加入荧光分子，使得荧光分子随着单体的聚合作用而被包埋在乳胶颗粒的内部或表层，或者是合成出乳胶颗粒然后再通过溶胀作用包埋荧光分子。美国专利US5723218公开了一种荧光乳胶颗粒及其制备方法，利用溶剂溶胀方法将氟化硼络合二吡啶甲川类化合物(BODIPY)包埋到乳胶颗粒中而制备荧光乳胶颗粒。美国专利US5073498公开了一种荧光乳胶颗粒及其制备方法，也是通过溶胀方法制备荧光乳胶颗粒。美国专利US4717655公开了一种荧光乳胶颗粒及其制备方法，采用两种染料按照一定比例配置成溶液，制备出五种不同的荧光乳胶颗粒。中国专利200710058397.X公开了一种荧光乳胶的制备方法，采用染色的方法制备出不同的荧光乳胶颗粒。这种方法制备荧光乳胶颗粒方法简单，但荧光分子在颗粒中的分布不均一，结合不牢固，容易泄露出来，特别是在一些非极性溶液中使用时，有机染料非常容易被浸出。

荧光乳胶颗粒的聚合方法一般采用常规乳液聚合或者分散乳液聚合，而这些制备方法的配方、工艺比较复杂，同时制备的颗粒粒径不均一、单分散性差、颗粒表面不干净，粒径很难控制，不利于在生物检测当中的应用。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于提供一种荧光乳胶颗粒的制备方法，工艺条件温和，制备的荧光乳胶颗粒粒径均匀可控，单分散性好。

为了解决技术问题，本发明提供了一种荧光乳胶颗粒的制备方法，包括：

a)将烯酸酯类单体、荧光染料与超纯水按照重量比为1～15∶0.004～0.4∶100混合，搅拌、加热，并在引发剂的作用下发生无皂乳液聚合，得到第一反应产物；

b)将步骤a)得到的反应产物过滤、离心后去除上清液，洗涤所述去除上清液后的剩余物，得到荧光乳胶颗粒。

优选的，所述荧光染料选自罗丹明系列染料、香豆素染料、氟硼类染料、方酸类染料、花菁类染料中的一种或多种。

优选的，步骤a)中加入与超纯水的重量比为0.003～0.5∶100的离子共聚单体；所述离子共聚单体选自：2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)，苯乙烯磺酸钠(NaSS)、甲基丙烯酸-2-磺酰乙酯钠盐(NaSEM)、二甲基乙烯基吡啶硫酸甲酯盐(DVPM)、甲基丙烯酸磺丙酯钾盐(SPM)、2-甲基烯丙基磺酸钠(NaMS)中的一种或者多种。

优选的，所述引发剂为过硫酸盐。

优选的，所述加热的温度为60℃～90℃。

优选的，所述烯酸酯类单体为甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸乙酯。

优选的，在步骤a)中加入丙烯酸类化合物、烯胺类化合物、烯醛类化合物、烯硫醇类化合物，醇类化合物、环氧类化合物中的一种或多种。

优选的，步骤a)具体为：

a1)将甲基丙烯酸甲酯、荧光染料、离子共聚单体与超纯水按重量比为1～15∶0.004～0.4∶0.003～0.5∶100混合，得到第一反应溶液；

a2)将所述第一反应溶液以300r/min的速度搅拌，以60℃～90℃的加热，以过硫酸钾作为引发剂，在氮气保护下进行无皂乳液聚合反应，反应1～4h后得到预聚物；

a3)向所述预聚物中加入甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸混合物，然后再反应2h，得到第二反应产物。

优选的，步骤a)具体为：

a1)将甲基丙烯酸甲酯、荧光染料、离子共聚单体与超纯水按重量比为1～15∶0.004～0.4∶0.003～0.5∶100混合，并向所述混合物中加入甲基丙烯酸，得到第二反应溶液；

a2)将所述第二反应溶液以300r/min的速度搅拌，以60℃～90℃的加热，以过硫酸钾作为引发剂，在氮气保护下进行无皂乳液聚合反应，反应2～24h得到第三反应产物。

优选的，所述甲基丙烯酸与超纯水按重量比为0.022～3∶100。

本发明提供了一种荧光乳胶颗粒的制备方法，使用烯酸酯类单体与荧光染料在超纯水中发生无皂乳液聚合，由于无皂乳液聚合不需要使用乳化剂，成核均匀，乳胶颗粒粒径可以根据添加原料的量进行调控，制备成乳胶颗粒后，荧光染料与烯酸酯类单体结合紧密，不容易渗出，荧光染料分布均匀，粒径更均匀、单分散性好。本发明提供的制备方法工艺条件温和，操作简单，制备的乳胶颗粒粒径具有单分散性，表面整洁干净。

附图说明

图1本发明提供的制备方法制备的300nm大小的荧光乳胶颗粒电镜扫描图；

图2本发明制备的荧光乳胶颗粒的激光共聚焦扫描荧光成像图；

图3本发明制备的荧光乳胶颗粒的激光共聚焦扫描白光成像图；

图4本发明制备的荧光乳胶颗粒的激光共聚焦扫描荧光、白光成像图叠加效果图。

具体实施方式

为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点而不是对本发明专利要求的限制。

本发明提供了一种荧光乳胶颗粒的制备方法，包括a)将烯酸酯类单体、荧光染料与超纯水按照重量比为1～15∶0.004～0.4∶100混合，搅拌、加热，并在引发剂的作用下发生无皂乳液聚合，得到第一反应产物；

b)将步骤a)得到的反应产物过滤、离心后去除上清液，洗涤所述去除上清液后的剩余物，得到荧光乳胶颗粒。

本发明使用的是无皂乳液聚合，所谓无皂乳液聚合是指在反应过程中完全不加乳化剂或仅加入微量乳化剂(其浓度小于临界胶束浓度CMC)的乳液聚合过程，又称为无乳化剂乳液聚合，本发明不加入任何乳化剂，制备荧光乳胶颗粒时，优选使用共聚单体稳定乳胶颗粒，因为在乳液成核期，荧光染料分子会导致乳胶颗粒成核阶段不稳定，所以需要加入这种物质。所以共聚单体可以是离子的共聚单体也可以是非离子的共聚单体，共聚单体主要特征在它能够溶解在水中，能够在加热条件下发生聚合。本发明优选使用离子共聚单体，水溶性更好，使反应更加稳定，得到的乳胶颗粒的粒径更加均匀。

按照本发明，所述烯酸酯类单体优选为甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸乙酯，更优选为甲基丙烯酸甲酯，随着烯酸酯类单体分子量的增长，其性能越差，聚合度和聚合后得到的乳胶颗粒的粒径过大或不可控。

按照本发明所述引发剂优选使用过硫酸盐，更有选为过硫酸钾或过硫酸铵，最优选为过硫酸钾。

按照本发明，优选将烯胺类化合物、烯醛类化合物、烯硫醇类化合物，醇类化合物、环氧类化合物中的一种或多种加入到反应体系中，可以为荧光乳胶颗粒引入功能化基团，按照本发明更优选向反应体系中加入甲基丙烯酸或甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯的混合物。加入具有功能化基团的化合物的荧光乳胶颗粒制备方法有两种：

第一种方法为先将甲基丙烯酸甲酯(MMA)、荧光染料、离子共聚单体加入到超纯水的反应釜中，一起搅拌，搅拌速度为300r/min，温度加热到60～90℃，以过硫酸钾(过硫酸钾)作为引发剂，在氮气保护下进行聚合反应。

当反应进行1～4h后，在反应体系中加入甲基丙烯酸甲酯(MMA)与甲基丙烯酸(MAA)混合物，所述混合物中MMA与MAA的按重量比优选为1∶1～10，然后再反应2h得到第二反应产物。

将所述第二反应产物过滤，离心，去上清，用超纯水洗涤2～3遍，得到功能化荧光乳胶颗粒。

第二种方法为：将甲基丙烯酸甲酯(MMA)、荧光染料分子、离子共聚单体、甲基丙烯酸(MAA)、加入到超纯水的反应釜中搅拌，搅拌速度为300r/min，加热温度在60～90℃之间，以过硫酸钾(过硫酸钾)作为引发剂，在氮气保护下进行无皂乳液聚合反应，得到第三反应产物。

将所述第三反应产物过滤，离心，去上清，采用超纯水洗涤2遍，得到表面羧基荧光乳胶颗粒。

按照本发明，甲基丙烯酸甲酯、荧光染料、离子共聚单体与水按重量为1～15∶0.004～0.4∶0.003～0.5∶100，甲基丙烯酸与超纯水按重量比为0.022～3∶100；所述甲基丙烯酸与所述甲基丙烯酸甲酯的混合物中，甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯按重量比优选为1～10∶1。所述的甲基丙烯酸甲酯最好用按照质量百分比计浓度为10％的氢氧化钠溶液，按等体积洗涤2次，然后采用超纯水洗涤3～4次，再用旋转蒸发仪进行馏分，以除去甲基丙烯酸甲酯中的阻聚剂；过硫酸钾最好用水进行重结晶。

按照本发明，离子共聚单体优选为选用2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸(AMPSA)，苯乙烯磺酸钠(NaSS)、甲基丙烯酸-2-磺酰乙酯钠盐(NaSEM)、二甲基乙烯基吡啶硫酸甲酯盐(DVPM)、甲基丙烯酸磺丙酯钾盐(SPM)、2-甲基烯丙基磺酸钠(NaMS)等离子共聚单体中的一种或者多种。

按照本发明，所述的有机荧光分子可以选用荧光素、罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明101、香豆素染料、氟硼类染料、方酸类染料、花菁类染料等疏水性染料荧光物质的一种；也可以选用多种有机荧光物质。引发剂可以选用过硫酸钾或者过硫酸胺等过硫酸类物质，本发明优选使用过硫酸钾。更优选为

按照本发明，搅拌速度最好在100～600r/min，在氮气保护下反应温度最好为60～90℃，反应时间最好为2～24h。

本发明制备的功能化荧光乳胶颗粒是采用无皂乳液聚合的方法制备的。其粒径在0.1～1nm之间，通过对甲基丙烯酸甲酯、荧光染料分子、离子共聚单体、引发剂以及搅拌速度、反应温度、功能化单体加入的量与加入时间的控制，可以制备得到粒径可控，单分散性好，表面洁净，并且颗粒表面具有功能化基团，而且数目和分布在一定程度上可以控制的荧光乳胶颗粒。这种颗粒可以通过EDC、NHS等化学物质活化颗粒表面带有的活性基团，而将生物分子固定在乳胶颗粒表面。在合适的激发光照射下，荧光乳胶颗粒能够发射荧光。同时也可以通过控制加入荧光分子的种类和数量，以及其他条件可以制备得到具有不同发射波长和荧光强度的乳胶颗粒，从而解决了同时对多个目标检测进行检测的技术难题。

实施例1：250nm左右大小的羧基荧光乳胶颗粒

在反应釜中加入570ml超纯水，10mlMMA，罗丹明B 0.02g，苯乙烯磺酸钠18mg，一起混合搅拌加热，搅拌速度为150rpm，通氮气30min～60min，使反应体系中溶解的氧气尽量排尽，当温度升高到70℃时，加入20ml过硫酸钾开始计时，反应进行了90min后加入MAA和MMA，他们之间的比例是1∶1，反应在继续进行2h时后停止。冷却后，将颗粒进行过滤，然后采用50ml的离心管对颗粒进行离心，洗涤3次，得荧光乳胶颗粒。

实施例2：300nm左右大小的羧基荧光乳胶颗粒

在反应釜中加入565ml超纯水，15mlMMA，罗丹明6G 0.02g，苯乙烯磺酸钠18mg，一起混合搅拌加热，搅拌速度为180rpm，通氮气30min～60min，使反应体系中溶解的氧气尽量排尽。当温度升高到70℃时，加入20ml过硫酸钾开始计时，反应进行了120min后加入MAA和MMA，他们之间的比例是1∶1，反应在继续进行2h时后停止。冷却后，将颗粒进行过滤，然后采用50ml的离心管对颗粒进行离心，洗涤3次，得荧光乳胶颗粒。

实施例3：400nm左右大小的羧基荧光乳胶颗粒

在反应釜中加入550ml超纯水，30mlMMA，罗丹明1010.03g，苯乙烯磺酸钠18mg，一起混合搅拌加热，搅拌速度为200rpm，通氮气30min～60min，使反应体系中溶解的氧气尽量排走，当温度升高到70℃时，加入20ml过硫酸钾开始计时，反应进行了120min后加入MAA和MMA，他们之间的比例是1∶1，反应在继续进行2h时后停止，冷却后，将颗粒进行过滤，然后采用50ml的离心管对颗粒进行离心，洗涤3次，得荧光乳胶颗粒。

实施例4：500nm左右大小的羧基荧光乳胶颗粒

在反应釜中加入540ml超纯水，40mlMMA，罗丹明B 0.04g，苯乙烯磺酸钠18mg，一起混合搅拌加热。搅拌速度为220rpm，通氮气30min～60min，使反应体系中溶解的氧气尽量排尽，当温度升高到70℃时，加入20ml过硫酸钾开始计时，反应进行了180min后加入MAA和MMA，他们之间的比例是1∶1，反应在继续进行2h时后停止。冷却后，将颗粒进行过滤，然后采用50ml的离心管对颗粒进行离心，洗涤3次，得荧光乳胶颗粒。

表1实施例1～4制备的荧光乳胶颗粒的性能

实施例	平均粒径大小(nm)	分散指数(PDI)	数量峰值大小
				实施例1	252.2	0.002	30.5％
实施例2	290.2	0.009	28.1％
				实施例3	407.2	0.004	30.9％
实施例4	507.4	0.002	25.1％

通过表1可以看出发明提供的制备方法，粒径可控，粒径均匀，采用激光纳米粒度仪对颗粒进行测定，颗粒的分散指数、数量峰值参数都说明颗粒单分散性好。

图1也可以说明本发明实施例1制备的颗粒大小均一、单分散性好。

图2～图4为一组图片，是采用激光共聚焦显微镜所拍摄的照片，表明每个颗粒是有荧光的，图2是荧光成像图，图3是白光成像图，图4是图2和图3两张图片的叠加图。

以上对本发明提供的一种荧光乳胶颗粒及其制备方法进行了详细的介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (9)

1.一种荧光乳胶颗粒的制备方法，其特征在于，包括：

a）将烯酸酯类单体、荧光染料、离子共聚单体与超纯水按照重量比为1～15:0.004～0.4:0.003～0.5:100混合，搅拌、加热，并在引发剂的作用下发生无皂乳液聚合，得到第一反应产物；

b）将步骤a）得到的反应产物过滤、离心后去除上清液，洗涤所述去除上清液后的剩余物，得到荧光乳胶颗粒；

所述离子共聚单体选自：2-丙烯酰氨基-2-甲基丙烷磺酸，苯乙烯磺酸钠、甲基丙烯酸-2-磺酰乙酯钠盐、二甲基乙烯基吡啶硫酸甲酯盐、甲基丙烯酸磺丙酯钾盐、2-甲基烯丙基磺酸钠中的一种或者多种。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述荧光染料选自罗丹明系列染料、香豆素染料、氟硼类染料、方酸类染料、花菁类染料中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述引发剂为过硫酸盐。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述加热的温度为60℃～90℃。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述烯酸酯类单体为甲基丙烯酸甲酯或甲基丙烯酸乙酯。

6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤a）中加入丙烯酸类化合物、烯胺类化合物、烯醛类化合物、烯硫醇类化合物，醇类化合物、环氧类化合物中的一种或多种。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤a）具体为：

a1）将甲基丙烯酸甲酯、荧光染料、离子共聚单体与超纯水按重量比为1～15:0.004～0.4:0.003～0.5:100混合，得到第一反应溶液；

a2）将所述第一反应溶液以300r/min的速度搅拌,以60℃～90℃的加热，以过硫酸钾作为引发剂，在氮气保护下进行无皂乳液聚合反应，反应1～4h后得到预聚物；

a3）向所述预聚物中加入甲基丙烯酸甲酯与甲基丙烯酸混合物，然后再反应2h，得到第二反应产物。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤a）具体为：

a1）将甲基丙烯酸甲酯、荧光染料、离子共聚单体与超纯水按重量比为1～15:0.004～0.4:0.003～0.5:100混合，并向所述混合物中加入甲基丙烯酸，得到第二反应溶液；

a2）将所述第二反应溶液以300r/min的速度搅拌,以60℃～90℃的加热，以过硫酸钾作为引发剂，在氮气保护下进行无皂乳液聚合反应，反应2～24h得到第三反应产物。

9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述甲基丙烯酸与超纯水按重量比为0.022～3：100。

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