KR102074139B1 - 미꾸리과 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법 - Google Patents

미꾸리과 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 미꾸리과 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법에 관한 것으로 더 상세하게는 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머; 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머; 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 미꾸리과 어종 판별용 종특이적 PCR 키트를 제공한다.

Description

미꾸리과 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법{Genetic markers and methods for identifying species belong to Cobitidae}
본 발명은 유전자 마커 및 판별방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 미꾸리과 어종 판별용 유전자 마커 및 판별방법에 관한 것이다.
경골어류강 잉어목에 속하는 미꾸리과(Family: Cobitidae) 어류는 우리나라에 5속 16종이 보고되어 있고, 그 중 국내 주요 양식대상 종은 미꾸리속(Genus: Misgurnus) 어류로서 미꾸라지(Misgurnus mizolepis)와 미꾸리(Misgurnus anguillicaudatus)가 속한다. 이들 종은 소형 저서성 어류로서, 우리나라 전 담수역과 중국, 일본 등에 분포하며, 주로 늪이나 논 또는 농수로 등의 물의 흐름이 약하거나 정체되고 진흙이 깔린 곳에서 조류나 유기물 등을 먹고 산다. 분류학적으로 미꾸라지가 미꾸리보다 입수염 길이, 미병부 높이 및 체폭이 더 길거나 큰 것으로 알려져 있으나, 외형이 매우 흡사하여 구분이 어렵다. 이들 종은 예로부터 식용으로 이용되어 왔고, 80년대 중반까지 늪이나 농수로 등 자연 생태계에 자원량이 풍부하여 식용, 낚시 미끼용 등으로 수출되기도 하였다. 그러나 90년대 들어 자원량이 감소하면서 부족한 수요를 충당하기 위해 중국산 미꾸라지 수입량이 점차 증가하였고 현재는 매년 8천톤 이상 수입되고 있다.
한편 Paramisgurnus dabryanus는 중국, 대만 및 유럽 등에서 서식하는 종으로 국내 서식하는 미꾸라지 M. mizolepis와 외형이 매우 유사하며 최대 20cm 까지 성장하는 대형종으로, 환경부 연구보고서(외래생물 등의 생태계위해성평가 및 위해우려종 발굴 연구보고서, 2014)에 따르면 상기 P. dabryanus은 국내 미꾸라지 M. mizolepis와 자연 상태에서 상호 교배가 가능하기 때문에 국내 생태계 교란 발생 우려가 있다고 보고된 바 있고, 환경부 지정 "위해 우려종 "으로 선정되어 있다. 그러나 P. dabryanus와 M. mizolepis 두 종간에 형태적 차이가 크지 않기 때문에 형태적 분류는 어려운 것으로 보고되고 있다. 이에 분자계통학적 방법론의 개발이 시급하나 이들 종의 유전적 차이에 대한 연구 또한 미비하여 종판별을 위한 분석법은 아직 연구된 바 없다. 이와 관련하여 대한민국 공개특허 제2014-0010617호는 미꾸라지의 원산지 식별용 프라이머 및 이를 이용한 식별방법에 대해 개시하고 있다.
그러나 상기 선행기술의 경우, 미꾸라지 M. mizolepis 동종의 국내산과 중국산 집단의 원산지 식별방법에 관한 것으로, 외형이 유사한 미꾸리과 3종의 종판별을 위한 유전자 마커에 관한 기술은 아직 존재하지 않는다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 외형이 매우 유사하여 형태적 방법으로는 종판별이 어려운 미꾸리과 어류 3종을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 종판별용 유전자 마커 및 판별방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머; 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머; 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 미꾸리과 어종 판별용 종특이적 PCR 키트가 제공된다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 미꾸리과 어류로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 상기 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 미꾸리과 어종 판별방법이 제공된다.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 본 발명은 분자생물학적인 기술을 이용한 미꾸리과 3종을 판별하기 위한 기술로써 기존의 형태적 형질을 이용한 분류법으로는 종판별이 어려운 미꾸리과 어류 3종을 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 종 판별효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따라 미꾸리과 3종의 미토콘드리아 DNA의 COI (Cytochrome c oxidase subunit I) 영역 염기서열을 바탕으로 Bioedit 플랫폼의 Clustal W 프로그램을 사용하여 상동성을 확인 및 미꾸리과 3종에 결합할 수 있는 프라이머 영역을 나타내는 그림이다.
도 2는 미꾸리과 3종에 결합할 수 있는 프라이머를 이용한 PCR 증폭산물을 관찰한 전기영동 사진이다.
도 3 내지 도 6은 각각 본 발명의 실시예에 따른 미꾸리과 3종의 미토콘드리아 DNA 중 COI 영역의 단일염기다형성 유전자 부위가 포함된 종별 단상형(haplotype) 분석결과이다.
도 7은 본 발명의 미꾸리과 3종 모두에 결합할 수 있는 프라이머 및 미꾸리과 3종에 종특이적인 프라이머 영역의 모식도이다.
도 8은 본 발명의 미꾸리과 3종 미토콘드리아 DNA의 CO1 영역 염기서열 비교 및 종특이 마커 개발을 위한 프라이머 영역을 나타내는 그림이다.
도 9는 본 발명의 미꾸리과 3종의 종특이적 프라이머를 이용한 다중(Multiplex) PCR 증폭산물을 관찰한 전기영동 사진이다.
용어의 정의:
본 명세서에서 사용되는 "미꾸리과 3종"은 경골어류강 잉어목에 속하는 미꾸리과 어류로 국내에 서식하고 있는 미꾸리속의 미꾸라지(M. mizolepis)와 미꾸리(M. anguillicaudatus), 그리고 Paramisgurnus 속으로 중국에 서식하며, 외형이 국내 미꾸라지와 매우 유사한 P. dabryanus를 포함하고 있다.
본 명세서에서 사용되는 COI (Cytochrome c oxidase subunit I) 유전자는 미토콘드리아 DNA의 특성상 모계유전을 하며, 유전적 재조합이 일어나지 않으므로 종간, 품종간 계통 분석에 많이 이용되고 있다. 특히, COI 유전자는 어류를 포함한 많은 종에서 종판별 마커를 위한 DNA barcode로써 널리 사용되고 있다.
본 명세서에서 사용되는 "프라이머"는 검출하고자 하는 종에 특이성을 가진 표적 염기 서열과 상보적인 염기 서열을 갖는 단일 가닥의 특이적인 올리고뉴클레오타이드를 가리킨다.
발명의 상세한 설명:
본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머; 서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머; 서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 및 서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, 미꾸리과 어종 판별용 종특이적 PCR 키트가 제공된다.
상기 PCR 키트에 있어서 상기 미꾸리과 어종은 M. mizolepis, M. anguillicaudatus 및 P. dabryanus로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 미꾸리과 어류로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계; 상기 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계; 상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, 미꾸리과 어종 판별방법이 제공된다.
상기 판별방법에 있어서, 상기 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계는 818 bp의 밴드가 확인되면 P. dabryanus, 669 bp가 확인되면 미꾸라지(M. mizolepis), 및 486 bp가 확인되면 미꾸리(M. anguillicaudatus)로 결정함으로써 수행될 수 있고 다중(Multiplex) PCR로 게놈 DNA를 증폭할 수 있다.
국내외에서 어류 종 분류 및 계통연구는 형태의 계측형질 및 계수형질 등을 이용한 형태학적 분류법이 많이 이용되고 있으나, 상기 방법론은 성어 이전 단계의 어류에서는 적용하기 어렵고, 형태적 특성이 단순하거나 종 내 변이성이 큰 어종 또는 형태분류학적 연구가 미진한 어종의 경우에 있어서는 형태적 형질에만 의존할 경우 분류학적 오류가 생길 수 있다. 이에 형태학적 분류법의 한계점들을 해결하기 위해 유전자 염기서열 분석을 통해 생물 계통을 추론하는 분자계통학적 기법의 개발이 시급하나 M. mizolepis과 P. dabryanus종의 유전적 차이에 대한 연구가 미비한 상황이다. 현재 미꾸리과 3종 중 P.dabryanus는 우리나라에서 위해우려종으로 지정되어 있어 국내 미꾸라지인 M. mizolepis와의 구분이 중요한 사항으로 상기 두 종의 유전자가 NCBI 상에 미토콘드리아 유전자 염기서열이 등재되어 있으나, 전적으로 매우 유사한 관계로 일부 연구자들이 P.dabryanus 와 M. mizolepis 종명을 동종 이명으로 보고 유전자 염기서열을 등재하는 경우가 많아 등재된 염기서열을 기반으로 유전자 종판별 마커의 개발이 어려운 실정이다. 이에 상기 문제를 해결하기 위하여 예의 노력한 결과 본 발명자들은 확보한 시료들에서 미토콘드리아 DNA 염기서열을 확보하기 위해서 NCBI 상에 등재된 미토콘드리아 유전자 염기서열을 바탕으로 3종 모두에 결합할 수 있는 프라이머를 제작하였고, 이를 이용하여 시료들의 미토콘드리아 DNA 염기서열을 분석함으로써 3종에 종 특이적으로 결합하는 프라이머를 제작하였으며, 이를 적용하여 육안으로 비교 시 외형이 매우 유사함으로 형태적 방법을 통한 종판별에는 어려움이 있는 미꾸리과 어류 3종을 동시에 신속하고 정확하게 판별할 수 있는 종판별 유전자 마커 및 판별방법을 개발하였다.
종판별 유전자 마커개발을 위해서 국내산 M. mizolepis, 중국산 M. mizolepis 및 P. dabryanus 그리고 국내산 M. anguillicaudatus 시료로부터 COI 영역 염기서열의 종별 단상형(haplotype)을 분석한 결과, M. mizolepis 집단은 20개의 단상형(도 3~6, MM_Hap 1~20), P. dabryanus 집단은 12개의 단상형(도 3~6, PD_Hap 1~12)이 확인되었으며, M. anguillicaudatus은 31개의 단상형(도 3~6, MA_Hap 1~31)이 확인되었다. 상기 미꾸리과 3종의 COI 영역 염기서열에 대한 단상형 분석을 통해 확인된 각 종의 특이적 단일염기다형성 유전자 부위(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)를 바탕으로 종판별 마커를 개발하였다.
본 발명에서 사용한 공지서열은 특정 개체에 대한 서열이므로 모든 종을 대표한다고 볼 수 없으므로 종내 유전자 변이(variation)가 존재한다. 특히 공지서열로 프라이머를 설계하다보면 종내 유전자 변이 부위로 인해 증폭이 안 되는 현상이 발생할 수도 있으나, 본 발명은 종내 유전자변이를 배제하기 위해서 종판별 유전자 마커에 IUB 중의성(ambiguity) 코드(codes)를 사용하여 단일염기다형성 유전자 부위를 바탕으로 최적의 프라이머 부위를 선택하였으므로 정확하고 효율적인 미꾸리과 3종의 종판별이 가능하다. 이에 프라이머 서열에서 A는 아데닌(adenine)을, G는 구아닌(guanine)을, C는 시토신(cytosine)을, T는 티민(thymine)을 나타내고, R은 G 또는 A, Y는 T 또는 C, M은 A 또는 C, K는 G 또는 T, S는 G 또는 C, W는 A 또는 T, B는 G 또는 C 또는 T, D는 A 또는 G 또는 T, H는 A 또는 C 또는 T, V는 A 또는 G 또는 C, N은 A 또는 G 또는 C 또는 T를 나타낸다. 이는 본 명세서의 모든 서열을 제시하는 데에 있어 동일하게 적용하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1: 재료 준비 및 DNA 추출
본 발명에 사용된 실험어는 국내산 미꾸라지 M. mizolepis 시료 81개체, 중국산 미꾸라지 M. mizolepis 시료 45개체, P. dabryanus 시료 35개체 및 국내산 미꾸리 M. anguillicaudatus 시료 156개체를 사용하였다. 본 발명에서 사용한 시료에 대한 구체적인 정보를 하기 표 1에 요약하였다.
또한 상기 실험어로부터 꼬리지느러미 5 mm2를 절단한 후 MagExtractor genome DNA purification Kit (Toyobo, Japan) 및 MagExtractor MFX-6100 자동 DNA 추출 시스템(Toyobo, Japan)을 사용하여 DNA를 추출하였고, 상기 추출된 DNA를 NanoDrop ND-1000 분광 광도계(Thermo Fisher Scientific, Barrington, IL, USA)를 이용하여 정량하였으며, 분석에 사용하기 전까지 -20℃에서 보관하였다.
실험어 시료 정보
국명(학명) 채집지 채집일 개체수
미꾸라지
Misgurnus mizolepis 		경북 김천 2008.11 32
전남 영암 2009.08 29
충북 2018.04 10
전남 2018.04 10
중국 허난성 2018.07 45
Paramisgurnus dabryanus 중국 광둥성 2016.05 8
중국 허난성 2018.07 27
미꾸리
Misgurnus anguillicaudatus 		경북 김천 2008.11 48
전남 영암군 2009.08 29
경남 삼랑진 2009.06 30
경주 양남면 섭읍리 2008.11 49
실시예 2: 미꾸리과 3종 특이적 프라이머 제작
본 발명자들은 미꾸리과 3종 어류의 미토콘드리아 DNA 염기서열 분석을 위해서 미국 국립생물공학정보센터(National Center for biotechnology Information, NCBI, www.ncbi.nlm.nih)에 등록된 미꾸리과 어류들의 유전자 서열을 바탕으로 Bioedit 플랫폼의 Clustal W 프로그램을 사용하여 상동성을 확인하였고, 미꾸리과 3종 모두에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머를 제작하였다(도 1 및 표 2 참조). 상기 염기서열 분석을 위한 프라이머에 관한 정보를 하기 표 2에 요약하였다.
프라이머의 염기서열 정보
프라미어 염기서열 (5'-> 3') 단편크기 서열번호
MMA_COI_F GTY ACY GCA CAT GCC TTT GT 951 bp 1
MMA_COI_R AAC TAC ATA ATA TGT GTC RTG GAG 2
실시예 3: 염기서열 분석
본 발명자들은 상기 실시예 2에서 제작한 미꾸리과 특이적 프라이머를 이용하여 유전자 분석을 수행하였다. 구체적으로, PCR　증폭은 10 pM 미꾸리과 특이적 프라이머 MMA_COI_F(서열번호 1) 및 MMA_COI_R(서열번호 2) 각 1 ㎕, Solg 2x Taq PCR Smart mix 2 (Solgent, Korea) 10 ㎕, 증류수 7 ㎕ 및 실시예 1에서 추출된 각 개체별 DNA 1 ㎕로 구성된 PCR 혼합물 20 ㎕를 사용하였다. PCR 반응조건은 먼저 95℃에서 10분간 변성시키고, 95℃에서 1분, 58℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 총 35회 반복하였고, 마지막으로 72℃에서 7분간 신장시켜주는 과정을 거쳤다. 그 후 PCR 증폭 여부 확인을 위해 PCR 반응산물 2 ㎕를 1.5% 아가로즈겔(agarose gel)에서 전기영동하여 확인하였다(도 2). 이어서 상기 증폭된 PCR 산물은 염기서열 분석을 위해 Expin PCR SV (GeneAll Biotechnology, Korea)를 사용하여 정제하였고, 정제된 PCR 반응물 1 ㎕, 5x BigDye therminator v1.1 (Applied Biosystems, USA) sequencing buffer 1.5 ㎕, BigDye terminator reaction mix v1.1 0.8 ㎕, 10 pM 정방향(서열번호 1) 또는 역방향(서열번호 2) 프라이머 0.16 ㎕ 및 증류수 6.54 ㎕로 구성된 10 ㎕ 반응액을 96℃에서 2분간 변성시키고 96℃에서 15초, 50℃에서 5초, 60℃에서 2분씩 총 25회 반복하는 조건으로 Sequencing PCR을 수행하였다. 상기 Sequencing PCR 반응물에 125 mM EDTA (pH 8.0) 1 ㎕, 3 M sodium acetate (pH 5.2) 1 ㎕, 99.9% 에탄올 25 ㎕를 첨가하고, 4℃, 3,000 rpm의 조건으로 45분간 원심분리 하였다. 그 후 70% 에탄올로 세척하고, 상온에서 10분간 건조시킨 후 Hi-Di formamide (Applied Biosystems, USA) 10 ㎕로 DNA 펠릿(pellet)을 녹인 후, ABI 3730XL DNA analyzer (Applied Biosystems, USA)로 서열분석을 수행하였다.
실시예 4: 염기서열 분석 및 종특이적 프라이머 제작
본 발명의 실시예 3에 따라 얻어진 미꾸리과 어류에 대한 양방향 서열은 SeqMan Program 소프트웨어(DNASTAR, USA)를 사용하여 하나의 서열로 조합하였다. 상기 확보된 염기서열은 DNA Sequence Polymorphism (DnaSP, ver. 5.10.01) 프로그램을 사용하여 종별 단상형을 분석하였다. 상기 분석을 통해 종간에 차이를 나타내는 단일염기다형성 유전자 부위를 확인하였고(도 3 내지 도 6), 단일염기다형성 유전자 부위를 바탕으로 종간 약 150 bp 이상의 서열 차이를 두고 최적의 프라이머 부위를 선택하여 미꾸리과 어류 3종에 대한 종특이적 정방향 프라이머를 디자인하였다(도 7 내지 도 8 및 표 3 참조).
종 특이적 프라이머의 염기서열 정보
프라미어 염기서열 (5'-> 3') 단편크기 서열번호
PD-COI-F CTG CCA CCC TCA TTT CTA CTA 818 bp 3
MM-COI-F CTC GCA GGT RTT TCT TCA ATT 669 bp 4
MA-COI-F CGR AAY CTA AAC ACC ACC TTT 486 bp 5
MMA_COI_R AAC TAC ATA ATA TGT GTC RTG GAG - 2
실시예 5: 단일 PCR 분석
본 발명자들은 상기 실시예 4에서 제작한 종특이적 프라이머의 종 특이적 증폭을 확인하기 위하여 미꾸리과 3종의 DNA를 주형으로 하여 PCR을 시행하였다. 구체적으로, 상기 제작한 종 특이적 프라이머의 교차 반응 여부 및 최적 온도를 확인하기 위해서 단일 PCR을 진행하였다. 먼저 증폭을 위한 PCR 혼합물 10 ㎕는 상기 표 3의 10 pM 미꾸리과 특이적 프라이머 MMA_COI_R (서열번호 2) 0.5 ㎕, 표 3의 10 pM 미꾸리과 종 특이적 프라이머(서열번호 3 내지 5) 0.5 ㎕, 10x Takara buffer 1 ㎕, dNTP 0.8 ㎕, Takara Ex Taq 0.05 ㎕, 증류수 6.15 ㎕ 및 실시예 1에서 추출된 각 개체별 DNA 1 ㎕로 구성되었다. PCR 반응조건은 먼저 95℃에서 10분간 변성시키고, 95℃에서 1분, 56~64℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 총 35회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 7분간 신장시켜주는 과정을 거쳤다. 상기 증폭된 PCR 산물은 1.5% 아가로즈 겔(agarose gel)에서 전기영동을 하여 증폭 여부를 확인하였다.
그 결과, 62~64℃의 결합 온도에서 P. dabryanus는 PD-COI-F (서열번호 3)/MMA_COI_R (서열번호 2), M. mizolepis는 MM-COI-F (서열번호 4)/MMA_COI_R (서열번호 2) 및 M. anguillicaudatus는 MA-COI-F (서열번호 5)/MMA_COI_R (서열번호 2) 프라이머 조합에서 종 특이적인 증폭반응이 나타남을 확인하였다.
실시예 6: 다중 PCR 반응 조건 확립
본 발명자들은 본 발명의 종 특이적 프라이머를 이용한 다중 PCR 조건 확립을 위해서 10 pM 정방향 프라이머(P. dabryanus 검출용 PD-COI-2F, 서열번호 3/ M. mizolepis 검출용 MM-COI-2F, 서열번호 4/ M. anguillicaudatus 검출용 MA-COI-5F, 서열번호 5) 각각 0.5 ㎕, 10 pM 역방향 프라이머(MMA_COI_R, 서열번호 2) 0.5 ㎕, 10x Takara buffer 1 ㎕, dNTP 0.8 ㎕, Takara Ex Taq 0.05 ㎕, 증류수 5.15 ㎕ 및 실시예 1에서 추출된 각 개체별 DNA 1 ㎕로 구성된 PCR 혼합물 10 ㎕을 사용하였다. 결합 최적 온도 확인을 위해서 gradient PCR 반응을 진행하였으며, PCR 반응은 먼저 95℃에서 10분간 변성시키고, 95℃에서 1분, 56~64℃에서 1분, 72℃에서 1분씩 총 30회 반복하였고 마지막으로 72℃에서 7분간 신장시켜주는 과정을 거쳤다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 다중 PCR 분석을 통해 나타난 미꾸리과 어류 3종의 서로 다른 크기의 PCR 증폭 산물을 관찰하였고, 58℃가 다중 PCR을 위한 적정 온도로 확인되었으며, 비특이적인 증폭은 관찰되지 않았다.
결론적으로, 본 발명의 미꾸리과 어류 3종 판별용 유전자 마커를 이용하면 개별 프라이머쌍을 별도의 반응 용기에서 반응시켜서 종을 판별할 수 있을 뿐만 아니라, 공통의 리버스 프라이머를 사용하고 포워드 프라이머의 결합 위치가 밴드의 크기를 통해 종을 판별할 수 있을 정도로 조정되어 있고, 단일 반응용기에서 동시에 3개의 종특이적 프라이머를 모두 포함시킨 다중 PCR을 수행하더라도 미꾸리과 3종 중 어떤 종에 속하는지 신속하게 판별할 수 있기 때문에, 효율적인 종판별에 활용 가능하다.
본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.
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Claims (5)

  1. 서열번호 3으로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제1포워드 프라이머;
    서열번호 4로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제2포워드 프라이머;
    서열번호 5로 기재되는 핵산서열로 구성되는 제3포워드 프라이머; 및
    서열번호 2로 기재되는 핵산서열로 구성되는 범용 리버스 프라이머를 포함하는, M. mizolepis, M. anguillicaudatus 및 P. dabryanus로 구성되는 군으로부터 선택되는 미꾸리과 어종 판별용 종특이적 PCR 키트.
  2. 삭제
  3. 미꾸리과 어류로부터 게놈 DNA를 추출하는 게놈 DNA 추출단계;
    제1항의 PCR 키트로 추출된 게놈 DNA를 증폭하는 DNA 증폭 단계;
    상기 증폭된 DNA 산물에 대하여 전기영동을 수행하는 전기영동 단계; 및 전기영동 된 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계를 포함하는, M. mizolepis, M. anguillicaudatus 및 P. dabryanus로 구성되는 군으로부터 선택되는 미꾸리과 어종 판별방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 DNA의 밴드 패턴을 분석하는 단계는 818 bp의 밴드가 확인되면 P. dabryanus, 669 bp가 확인되면 국내에 서식하고 있는 미꾸라지(M. mizolepis), 및 486 bp가 확인되면 미꾸리(M. anguillicaudatus)로 결정함으로써 수행되는, 방법.
  5. 제3항에 있어서,
    다중 PCR로 게놈 DNA를 증폭하는, 방법.
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CN115261483A (zh) * 2022-02-21 2022-11-01 自然资源部第三海洋研究所 一种鉴别澳大利亚小裸胸鳝隐存种与小裸胸鳝的分子遗传学方法

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