CN105695602A - 一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法 - Google Patents

一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法 Download PDF

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CN105695602A
CN105695602A CN201610184491.9A CN201610184491A CN105695602A CN 105695602 A CN105695602 A CN 105695602A CN 201610184491 A CN201610184491 A CN 201610184491A CN 105695602 A CN105695602 A CN 105695602A
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刘仕平
夏庆友
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
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Abstract

本申请公开了一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，包括以下步骤：RNA的分离纯化；探针与Marker的放射性标记和标记产物纯化；制胶和电泳；转膜与RNA分子的交联固定；预杂交和杂交；洗杂交膜和低温放射自显影；杂交探针的剥脱与膜的再利用。该方法RNA质量高，材料成本低，电泳条带整齐，噪音信号低，适合于鉴定家蚕miRNA和其他小RNA，而且对其他物种的miRNA及其靶基因鉴定也有一定参考价值。

Description

一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法
技术领域
本申请属于生物遗传领域，具体地说，涉及一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法。
背景技术
印迹技术是将生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程，由Southern最先于1975年建立，用以研究DNA图谱，也称作Southern杂交。之后，许多研究者应用Southern杂交技术开展研究。1977年，Alwine等首次运用印迹技术检测RNA，这种与DNA印迹技术相对应的RNA印迹技术被称为Northern印迹杂交(Northernblot)。Northern杂交只需要利用一段单链cDNA分子探针便可以检测和测量不同长度的RNA分子，所以很快就得到了广泛运用。1993年，Lee等运用Northern杂交技术鉴定了第1条miRNA，即线虫(Caenorhabditiselegans)的lin-4；2000年，Reinhar等、Pasquinelli等利用Northern杂交技术在线虫和果蝇(Drosophilamelanogaster)中发现了第2条miRNA，即let-7。2001年，有3个实验室通过Northern杂交和克隆测序鉴定了线虫、果绳以及哺乳动物中的200多条miRNA，开启了miRNA研究的新时代。作者于2007年首先利用Northern杂交技术对家蚕miRNAlet-7进行了鉴定和表达研究，随后又利用该技术与miRNA芯片对预测的90多条家蚕miRNAs进行了鉴定和时空表达谱分析。Northern杂交曾被认为是miRNA鉴定的金标准。然而，由于Northern杂交的过程长，操作步骤繁多，加之miRNA自身存在分子短小和表达量低等特点，因此一些很重要的操作细节即可能直接影响到实验的成败，要得到miRNA的高质量Northern杂交图并不容易。
发明内容
有鉴于此，本申请针对现有技术中存在Northern杂交的过程长，操作步骤繁多的问题，提供了一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，适合于鉴定家蚕miRNA和其他小RNA，而且对其他物种的miRNA及其靶基因鉴定也有一定参考价值。
为了解决上述技术问题，本申请公开了一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，包括以下步骤：
1)RNA的分离纯化；
2)探针与Marker的放射性标记和标记产物纯化；
3)制胶和电泳；
4)转膜与RNA分子的交联固定；
5)预杂交和杂交；
6)洗杂交膜和低温放射自显影；
7)杂交探针的剥脱与膜的再利用。
进一步地，RNA的分离纯化具体按照以下步骤实施：
(1)180℃烘研钵2h，待冷却至室温后放于-20℃冰箱中预冷；
(2)分装Trizol至1.5mL离心管中，1mL/支；
(3)将100μg家蚕组织材料在冰上研磨至白色粉末，需要加3次液氮；
(4)将粉末转到Trizol中，用移液枪枪头吹吸数次至无明显块状，静置5min；
(5)加入300μL氯仿，用力振荡混匀20s，静置10min；
(6)4℃条件下12000r/min离心20min，转移上清液约600μL，加入100μLPEG6000-NaCl混合溶液，15％PEG6000，2mol/LNaCl，轻轻颠倒混匀，冰上静置10min；
(7)4℃条件下10000r/min离心15min，将上层液体转移到无RNA酶的1.5mL离心管中，计量液体的体积；
(8)离心管中依次加入1/10体积的pH5.2、3mol/LNaAc、4μLDNAmate，颠倒数次混匀，再加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒数次混匀，-20℃静置2h以上；
(9)4℃条件下13000r/min离心10min，小心将液体倒在废液缸中，用500μL75％乙醇洗沉淀1次，4℃条件下10000r/min离心2min，倒掉液体，将残留液体吸出；
(10)在无菌操作台上将沉淀自然风干，时间为5min或在真空干燥箱中干燥至微透明，时间为2min；
(11)视沉淀量向离心管中加入50～100μL无RNA酶的甲酰胺溶液，用移液枪枪头将沉淀离散以助溶，于4℃条件下溶解沉淀30min；
(12)取1～2μLRNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，电泳缓冲液为l*TBE，100V；
(13)电泳期间吸取1.5μLRNA检测浓度，以1.5μL甲酰胺作对照；
(14)按照30μL/支将RNA进行分装后，进行PAGE凝胶电泳及后续操作，也可以加入500无水乙醇于-80℃保存备用。
进一步地，步骤2)中的探针与Marker的放射性标记和标记产物纯化具体按照以下步骤实施：
探针和Marker的5’末端标记DNA探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；根据合成量加适当体积的双蒸水配制成浓度为100μmol/L的储存液，取出2斗加至18μL双蒸水中，稀释成20μL浓度为10μmol/L的工作液；小RNAMarker为DecadeTMMarkersSystem，继续在冰上配制标记反应体系：20μL探针标记反应体系包括Nuclease-freewater2μL、10*KinaseBuffer2μL、10U/μLT4PNK1μL、[γ-32P]ATP5μL，混匀后分装，19.2μL/支，然后加入探针底物0.8μL；10μLMarker标记反应体系包括Nuclease-freewater2μL，10*KinaseBuffer1μL，10U/μLT4PNK1μL，[γ-32P]ATP5μL，Decademarker1μL；反应程序为38℃，1.5h；70℃，8min；
标记产物的纯化具体操作如下：
(1)待标记结束后，补加100μL无RNA酶的双蒸水，然后转入1.5mL洁净离心管中；
(2)依次加入pH5.2、3mol/LNaAc20μL、DNAmate4μL和无水乙醇250μL，室温静置10min；
(3)4℃条件下12000r/min离心15min，将液体部分倾倒在同位素废液专用防护瓶中；
(4)将沉淀用75％乙醇洗1次，4℃条件下10000r/min离心2min，将液体倒在专用的放射性同位素废液瓶中；
(5)4℃条件下10000r/min离心2min，吸出液体，在超净工作台上静置10min后，加入60～80μLTE缓冲液，冰上溶解10min；
(6)标记小RNAMarker时，加入6～8μL10*CleavageReagent，混匀后室温放置6min，吸取60～80μL6*GelLoadingBufferII加入到标记产物中，沸水浴2min；
(7)按10支或20μL/支分装探针标记产物，按5μL/支或10μL/支分装小RNAMarker的标记产物；
(8)将标记产物于-20℃或-80℃存放备用，放射性标记探针应在[γ-32P]的半衰期内使用。
进一步地，步骤3)中的制胶和电泳具体按照以下步骤实施：
3.1)低温配制变性PAGE凝胶
(1)首先进行制胶和电泳装置的无RNA酶处理，用70％乙醇或中性洗洁精溶液擦拭PAGE胶电泳槽、压片条、梳子及制胶用的玻璃板，用0.1mol/LNaOH或3％H2O2浸洗30min，然后依次用单蒸水、双蒸水和无RNA酶的双蒸水冲洗；
(2)将制胶装置如玻璃板、梳子和压片条放在真空干燥箱中干燥，也可以在无菌超净台上用无菌风吹干；
(3)准确量取35mL双蒸水于50mL小烧杯中，用记号笔准确标出烧杯的液面位置，以便于定量配制PAGE胶；
(4)制取12％变性PAGE胶35mL，含16.8g尿素、3.5mL10*TBE、10.5mL40％丙烯酰胺，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺质量比为19:1,加无核酸酶水至总体积为35mL；
(5)60℃水浴2min或在微波炉中加热1min，微波输出功率为1000W，用移液枪枪头轻轻搅动液体至溶质完全溶解，然后将小烧杯放于冰水或4℃冰箱中冷却；
(6)从冰水或4℃冰箱中取出PAGE胶溶液，迅速加入175μL10％过硫酸铵、35μL四甲基乙二胺，并轻轻搅拌混匀；
(7)用1mL移液枪枪头吸取PAGE胶溶液沿着压片条边缘缓缓加入到胶室中，于室温下待胶凝固。
3.2)样品的上样前处理
(1)从-80℃冰箱中取出分装保存于无水乙醇中的小RNA，加入DNAmate4μL和pH5.2、3mol/LNaAc5μL，4℃条件下13000r/min离心10min；
(2)倾倒管中的液体后，在超净工作台上放置10min；
(3)往离心管中加入30μL无RNA酶的甲酰胺溶液，室温放置10min；
(4)加入等体积无RNA酶的6*GelLoadingBufferII；
(5)65℃热水浴10min或80℃热水浴5min后，冰水浴10min，在冰浴期间如果PAGE胶已凝固并冷却，便取出梳子，用200μL移液枪枪头吸取电泳缓冲液0.5*TBE冲洗PAGE胶点样孔，最后吸掉点样孔里残留的0.5*TBE。
3.3)上样后的差速电泳
(1)将变性后的小RNA和Marker上样，吸取电泳缓冲液将点样孔填满，记下点样的顺序；
(2)首先于200V条件下电泳1h，根据溴酚蓝指示，待所有样品RNA进入胶中后，调至300V继续电泳2h，即溴酚蓝总的移动距离约为9cm即可；
(3)关掉电源，取下玻璃夹板，倒掉电泳缓冲液，用专用撬片从玻璃板一角撬开夹心层，先让PAGE胶附在玻璃上，根据样品的分布，切掉多余的胶，并特别切掉胶的一角以标记胶的方向和样品顺序；
(4)进行电泳质量检测，将取下的PAGE胶放在含荧光染料Goldview的电泳缓冲液浸染10min，用无荧光染料，的0.5*TBE漂洗5min后紫外成像观察；
(5)用0.5*TBE再漂洗1min，以备转膜用。
进一步地，步骤4)中的转膜与RNA分子的交联固定具体按照以下步骤实施：
4.1)低温转膜
(1)用10mL0.5xTBE浸泡适当大小的1张尼龙膜和2张半干转印加厚滤纸，浸泡时间5min，
(2)在浸泡尼龙膜和转印滤纸的间隙，可用75％乙醇清洗半干转膜装置的内壁；
(3)在转膜仪的载物板上，从下往上按顺序放置转印滤纸、尼龙膜和PAGE胶；用针穿透胶的各点样孔刺下面的尼龙膜，以辅助标识将转移在尼龙膜上各样品的位置；随后在胶上放置一张转印滤纸，注意在各层之间不能有气泡产生；
(4)用移液枪枪头吸取0.5*TBE均匀地滴加在最上层的滤纸上，吸掉滤纸上及周围的残留液体；
(5)装好半干转膜装置的压板和上面的盖子，接通电源；
(6)根据滤纸的面积，按3.3mA/cm2设置转膜所需的电压和电流，将转膜装置移到4℃冰箱中转膜2h，也可在更温和的转膜条件下过夜转膜；
(7)关掉电源，打开电转仪，取下转印滤纸、胶和膜，将转印滤纸放在无RNA酶的双蒸水中漂洗30min，用保鲜膜包起，保鲜膜重新使用5次，每次使用之前用100mL0.5*TBE浸洗10min；
(8)剪掉尼龙膜右下角作标记，防止混淆样品顺序和膜的载样面。
4.2)小RNA分子的交联固定
(1)将尼龙膜平铺在一张转印滤纸上，在HL-2000型紫外交联仪中交联固定，1000μJ/cm2，约40S；
(2)取出膜，盖上一张洁净的转印滤纸，于80℃烘30min或60℃烘1h；
(3)在膜的左下角标注日期，继续下面的实验操作，或用保鲜膜包起，-20℃条件下暂时保存。
进一步地，步骤5)中预杂交和杂交具体按照以下步骤实施：
(1)交联后，用10mL0.l*SSC或0.5*TBE漂洗尼龙膜3min，然后将膜转到杂交管，膜的非载样面与管壁之间不能有气泡；
(2)根据所用杂交膜的大小，按0.15mL/cm2加入预杂交液，预杂交液为6*SSC，l〇xDenhardt’s溶液，2g/LSDS；
(3)取30μL质量浓度为10mg/mL的鲑鱼精DNA，煮沸变性2min，冰上放置5min，加入到预杂交液中，预杂交条件为37℃6h或65℃3h；
(4)将预杂交液倒在专用废液缸中，加入杂交液和10mg/mL变性鲑鱼精DNA，其中，杂交液为6*SSC，5*Denhardt’s溶液，2g/LSDS；
(5)取出miRNA探针于室温解冻后沸水浴3min，冰上放置5min，4℃条件下1000r/min离心2min，取15～20μL加入到杂交液中；
(6)37℃条件下杂交8～10h或过夜。
进一步地，步骤6)中的洗杂交膜和低温放射自显影具体按照以下步骤实施：
6.1)滚动式洗膜
(1)暂停杂交炉，取下杂交管，将杂交液倒在专用的同位素废液缸中；
(2)吸取10～15mL洗膜液沿无膜的管壁缓缓滴进杂交管，37℃滚动洗膜3min，换新的洗膜液，重复2次，洗膜液为6*SSC，2g/LSDS；
(3)用等体积洗膜液在42℃条件下滚动洗膜20min，重复1次；
(4)取出杂交膜，放入10mL0.5*TBE中漂洗3min。
6.2)低温放射自显影
(1)至少提前6h配好显影液、停影液和定影液，其中，显影液为米吐尔2g，无水亚硫酸钠100g，对苯二酚5g，硼砂29g，加双蒸水至1000mL；停影液为冰醋酸13.5mL，加双蒸水至1000mL；定影液为65℃温水600mL，硫代硫酸钠240g，无水亚硫酸钠15g，冰醋酸13.5mL，硼酸7.5g，钾钒15g，搅拌溶解后加双蒸水至1000mL；
(2)将洗好的杂交膜用保鲜膜包起来，先用便携式盖革计数器初测样品区域内的同位素信号强度，估计放显所需时间；
(3)将杂交膜放入放射自显影专用压片盒并调整好膜的位置；
(4)在暗室中取出X-光胶片，折叠右下角以便定位，将胶片按一定方位平放在杂交膜的上面，锁紧压片盒；
(5)将压片盒放入-70℃冰箱中，根据检测到的信号值放显一定时间，一般需要经过2d放显处理miRNA条带才会在胶片上显现；
(6)从-70℃冰箱取出压片箱，于暗室中室温放置30min；
(7)在暗室中打开压片盒，取出X-胶片，放进显影液中5min；
(8)将胶片从显影液中取出，放入停影液中2min；
(9)将胶片转入定影液中5min；
(10)将胶片转入清水中，2min后取出，再用自来水冲洗胶片，挂于通风处晾干；
(11)在胶片左下角贴标签，注明样品名称、miRNA名称、低温下放显时间及洗胶片日期。
进一步地，步骤7)中的杂交探针的剥脱与膜的再利用具体按照以下步骤实施：
(1)提前1d用无RNA酶的双蒸水配制剥脱液，剥脱液为0.1*SSC，5g/LSDS；
(2)将杂交膜平铺在洁净的盒子中，载样面向下；
(3)煮沸100mL剥脱液，倾倒在膜上，匀速摇动冷却至室温，重复2次；
(4)将杂交膜转到100mL0.5*TBE中，室温漂洗3min；
(5)从0.5*TBE中取出杂交膜，放入杂交管中进行下次预杂交和杂交。
与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
1)RNA质量高：将提取RNA的常用Trizol试剂与PEG-NaAc-DNAmate沉淀系统结合起来，可以有效地分离和纯化RNA。用甲酰胺而不用水溶解沉淀，能有效地防止RNA被核酸酶降解。所提取的RNA可用于miRNA及其靶基因检测，增加了miRNA与其靶基因检测结果的可比性和重复性。
2)材料成本低：按上面的标记和纯化步骤，可以增加标记产物的得率,完全可以满足用于小RNA检测和其他方面研究的需要。虽然用mirVanaTMProbe&MarkerKit(Ambicm公司产品)按操作说明进行标记和过柱纯化也可以得到理想的结果，但成本较高。本技术流程中的标记和纯化方法不但可以减少污染机会，还由于不需要价格昂贵的纯化柱，降低了实验材料的成本。另外，转膜后的转印滤纸用无RNA酶的清水漂洗后可以反复使用几次，也节约了成本。
3)电泳条带整齐：用等体积的甲酰胺溶液溶解样品后再加入等体积的GelLoadingBufferII保证了所有样品等体积上样，有利于各样品等速电泳。上样液的体积过大，会使样品在电泳中形成较长的拖尾；而上样液体积过小，用移液枪上样时样品容易附着在上样孔的胶壁上。本技术流程中，上样液总体积设定为60fJiL可以避免上样液体积过大或过小的不利影响。用缓冲液清洗残留在上样孔里的过硫酸铵，可防止点样孔中残留的高浓度过硫酸铵影响样品电泳质量。如果加入缓冲液后再加样品，有些样品不容易沉淀到上样孔底部，电泳条带不整齐；相反，先加样品后再加入缓冲液，可以使各样品电泳条带整齐。采用差速电泳方法，即样品先在较低电压下平缓入胶，再在较高电压下快速电泳，也会使电泳条带更加整齐和美观。
4)噪音信号低
Northern杂交通常因为噪音信号较高干扰了目标条带的检测和分析。本操作流程针对miRNA检测的洗膜方法和洗膜条件能把背景噪音降到最低,而且对探针与靶分子的结合影响较小，使要检测的目标miRNA条带清晰，Northern杂交图片也更加清晰和美观。
当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1RNA的分离纯化
这一过程包括14项主要操作：
(1)180℃烘研钵2h，待冷却至室温后放于-20℃冰箱中预冷；
(2)分装Trizol至1.5mL离心管中(1mL/支)；
(3)将100μg家蚕组织材料在冰上研磨至白色粉末(需要加3次液氮)；
(4)将粉末转到Trizol中，用移液枪枪头吹吸数次至无明显块状，静置5min；
(5)加入300μL氯仿，用力振荡混匀20s，静置10min；
(6)4℃条件下12000r/min离心20min，转移上清液约600μL，加入100μLPEG6000-NaCl混合溶液(15％PEG6000，2mol/LNaCl)，轻轻颠倒混匀，冰上静置10min；
(7)4℃条件下10000r/min离心15min，将上层液体转移到无RNA酶的1.5mL离心管中，计量液体的体积；
(8)离心管中依次加入1/10体积的3mol/LNaAc(pH5.2)、4μLDNAmate(TaKaRa公司产品)，颠倒数次混匀，再加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒数次混匀，-20℃静置2h以上；
(9)4℃条件下13000r/min离心10min，小心将液体倒在废液缸中，用500μL75％乙醇洗沉淀1次，4℃条件下10000r/min离心2min，倒掉液体，将残留液体吸出；
(10)在无菌操作台上将沉淀自然风干(约5min)或在真空干燥箱中干燥至微透明(约2min)；
(11)视沉淀量向离心管中加入50～100μL无RNA酶的甲酰胺溶液(BBI公司产品)，用移液枪枪头将沉淀离散以助溶，于4℃条件下溶解沉淀30min；
(12)取1～2μLRNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量(电泳缓冲液为l*TBE，100V)；
(13)电泳期间吸取1.5μLRNA检测浓度，以1.5μL甲酰胺作对照；
(14)按照30μL/支将RNA进行分装后，进行PAGE凝胶电泳及后续操作，也可以加入500无水乙醇于-80℃保存备用。
实施例2探针与Marker的放射性标记和标记产物纯化
根据选用探针种类不同，有多种标记方法，此处仅介绍5’末端标记方法。探针为与miRNA或其他小RNA序列反向互补的DNA或RNA序列。
2.1探针和Marker的5’末端标记DNA探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。根据合成量加适当体积的双蒸水配制成浓度为100μmol/L的储存液，取出2斗加至18μL双蒸水中，稀释成20μL浓度为10μmol/L的工作液。小RNAMarker为DecadeTMMarkersSystem(Ambion公司产品)，也可以为自行合成的小RNA片段。继续在冰上配制标记反应体系：20μL探针标记反应体系包括Nuclease-freewater2μL、10*KinaseBuffer(TaKaRa公司产品)2μL、10U/μLT4PNK(TaKaRa公司产品)1μL、[γ-32P]ATP5μL，混匀后分装(19.2μL/支)，然后加入探针底物0.8μL；10μLMarker标记反应体系包括Nuclease-freewater2μL，10*KinaseBuffer1μL，10U/μLT4PNK1μL，[γ-32P]ATP5μL，Decademarker1μL。在PCR仪上按“38℃，1.5h；70℃，8min”的反应程序进行标记。
2.2标记产物的纯化具体操作如下：
(1)待标记结束后，补加100μL无RNA酶的双蒸水，然后转入1.5mL洁净离心管中；
(2)依次加入3mol/LNaAc(pH5.2)20μL、DNAmate4μL和无水乙醇250μL，室温静置10min；
(3)4℃条件下12000r/min离心15min，将液体部分倾倒在同位素废液专用防护瓶中；
(4)将沉淀用75％乙醇洗1次，4℃条件下10000r/min离心2min，将液体倒在专用的放射性同位素废液瓶中；
(5)4℃条件下10000r/min离心2min，吸出液体，在超净工作台上静置10min后，加入60～80μLTE缓冲液，冰上溶解10min；
(6)标记小RNAMarker时，加入6～8μL10*CleavageReagent(Ambion公司产品)，混匀后室温放置6min，吸取60～80μL6*GelLoadingBufferII(0.25％溴酚蓝，0.25％二甲苯青FF，15％Ficoll400)加入到标记产物中，沸水浴2min；
(7)按10支或20μL/支分装探针标记产物，按5μL/支或10μL/支分装小RNAMarker的标记产物；
(8)将标记产物于-20℃或-80℃存放备用，放射性标记探针应在[γ-32P]的半衰期(约2周)内使用。
实施例3：制胶和电泳
3.1低温配制变性PAGE凝胶
(1)首先进行:制胶和电泳装置的无RNA酶处理，用70％乙醇或中性洗洁精溶液擦拭PAGE胶电泳槽、压片条、梳子及制胶用的玻璃板，用0.1mol/LNaOH或3％H202浸洗30min，然后依次用单蒸水、双蒸水和无RNA酶的双蒸水冲洗；
(2)将制胶装置如玻璃板、梳子和压片条放在真空干燥箱中干燥，也可以在无菌超净台上用无菌风吹干；
(3)准确量取35mL双蒸水于50mL小烧杯中，用记号笔准确标出烧杯的液面位置，以便于定量配制PAGE胶(35mL)；
(4)制取12％变性PAGE胶35mL，含16.8g尿素、3.5mL10*TBE、10.5mL40％丙烯酰胺(丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺质量比为19:1),加无核酸酶水至总体积为35mL(至标记线)；
(5)60℃水浴2min或在微波炉中加热1min(微波输出功率为1000W),用移液枪枪头轻轻搅动液体至溶质完全溶解，然后将小烧杯放于冰水或4℃冰箱中冷却；
(6)从冰水或4℃冰箱中取出PAGE胶溶液，迅速加入175μL10％过硫酸铵、35μL四甲基乙二胺(TEMED，Sigma-Aldrich公司产品)，并轻轻搅拌混匀；
(7)用1mL移液枪枪头吸取PAGE胶溶液沿着压片条边缘缓缓加入到胶室中，于室温下待胶凝固。
3.2样品的上样前处理
(1)从-80℃冰箱中取出分装保存于无水乙醇中的小RNA，加入DNAmate4μL和3mol/LNaAc(pH5.2)5μL，4℃条件下13000r/min离心10min；
(2)倾倒管中的液体后，在超净工作台上放置10min；
(3)往离心管中加入30μL无RNA酶的甲酰胺溶液，室温放置10min；
(4)加入等体积无RNA酶的6*GelLoadingBufferII；
(5)65℃热水浴10min或80℃热水浴5min后，冰水浴10min，在冰浴期间如果PAGE胶已凝固并冷却，便取出梳子，用200μL移液枪枪头吸取电泳缓冲液0.5*TBE冲洗PAGE胶点样孔，最后吸掉点样孔里残留的0.5*TBE。
3.3上样后的差速电泳
(1)将变性后的小RNA和Marker上样，吸取电泳缓冲液将点样孔填满，记下点样的顺序；
(2)首先于200V条件下电泳1h，根据溴酚蓝指示，待所有样品RNA进入胶中后，调至300V继续电泳2h，即溴酚蓝总的移动距离约为9cm即可；
(3)关掉电源,取下玻璃夹板，倒掉电泳缓冲液，用专用撬片从玻璃板一角撬开夹心层，先让PAGE胶附在玻璃上，根据样品的分布，切掉多余的胶，并特别切掉胶的一角以标记胶的方向和样品顺序；
(4)进行电泳质量检测，将取下的PAGE胶放在含荧光染料Goldview(上海赛百盛公司产品)的电泳缓冲液浸染10min，用无荧光染料,的0.5*TBE漂洗5min后紫外成像观察，如果胶上所有样品小RNA的5SrRNA和tRNA条带清晰、亮度均匀，并且无明显的拖尾，说明样品上样量比较均匀，而且小RNA质量较好；
(5)用0.5*TBE再漂洗1min，以备转膜用。
实施例4转膜与RNA分子的交联固定
4.1低温转膜
(1)用10mL0.5xTBE浸泡适当大小的1张尼龙膜(Ambkm公司产品)和2张半干转印加厚滤纸(简称转印滤纸，BioRad公司产品)，浸泡时间5min，
(2)在浸泡尼龙膜和转印滤纸的间隙，可用75％乙醇清洗半干转膜装置(Bio-Rad公司产品)的内壁；
(3)在转膜仪的载物板上，从下往上按顺序放置转印滤纸、尼龙膜和PAGE胶；用针穿透胶的各点样孔刺下面的尼龙膜，以辅助标识将转移在尼龙膜上各样品的位置；随后在胶上放置一张转印滤纸，注意在各层之间不能有气泡产生；
(4)用移液枪枪头吸取0.5*TBE均匀地滴加在最上层的滤纸上，吸掉滤纸上及周围的残留液体；
(5)装好半干转膜装置的压板和上面的盖子，接通电源；
(6)根据滤纸的面积，按3.3mA/cm2设置转膜所需的电压(8～12V)和电流(500～700mA)，将转膜装置移到4℃冰箱中转膜2h，也可在更温和的转膜条件下过夜转膜；
(7)关掉电源，打开电转仪，取下转印滤纸、胶和膜，将转印滤纸放在无RNA酶的双蒸水中漂洗30min，用保鲜膜(可重新使用5次，每次使用之前用100mL0.5*TBE浸洗10min即可)包起；
(8)剪掉尼龙膜右下角作标记，防止混淆样品顺序和膜的载样面。
4.2小RNA分子的交联固定
(1)将尼龙膜平铺在一张转印滤纸上，在HL-2000型紫外交联仪(美国UVP公司)中交联固定(1000μJ/cm2，约40S)；
(2)取出膜，盖上一张洁净的转印滤纸，于80℃烘30min或60℃烘1h；
(3)在膜的左下角标注日期，继续下面的实验操作，或用保鲜膜包起，-20℃条件下暂时保存。
1.5预杂交和杂交
进行以下6项操作：
(1)交联后，用10mL0.l*SSC或0.5*TBE漂洗尼龙膜3min，然后将膜转到杂交管，膜的非载样面与管壁之间不能有气泡；
(2)根据所用杂交膜的大小，按0.15mL/cm2加入预杂交液(6xSSC，l〇xDenhardt’s溶液，2g/LSDS)；
(3)取30μL质量浓度为10mg/mL的鲑鱼精DNA(Ambion公司产品)，煮沸变性2min，冰上放置5min，加入到预杂交液中，预杂交条件为37℃6h或65℃3h；
(4)将预杂交液倒在专用废液缸中，加入杂交液(6*SSC，5*Denhardt’s溶液，2g/LSDS)和10mg/mL变性鲑鱼精DNA；
(5)取出miRNA探针于室温解冻后沸水浴3min，冰上放置5min，4℃条件下1000r/min离心2min，取15～20μL加入到杂交液中；
(6)37℃条件下杂交8～10h或过夜。
实施例6洗杂交膜和低温放射自显影
6.1滚动式洗膜
(1)暂停杂交炉，取下杂交管，将杂交液倒在专用的同位素废液缸中；
(2)吸取10～15mL洗膜液(6*SSC，2g/LSDS)沿无膜的管壁缓缓滴进杂交管，37℃滚动洗膜3min，换新的洗膜液，重复2次；
(3)用等体积洗膜液在42℃条件下滚动洗膜20min，重复1次；
(4)取出杂交膜，放入10mL0.5*TBE中漂洗3min。
6.2低温放射自显影
(1)至少提前6h配好显影液(米吐尔2g，无水亚硫酸钠100g，对苯二酚5g，硼砂29g，加双蒸水至1000mL)、停影液(冰醋酸13.5mL，加双蒸水至1000mL)和定影液(65℃温水600mL，硫代硫酸钠240g，无水亚硫酸钠15g，冰醋酸13.5mL，硼酸7.5g，钾钒15g，搅拌溶解后加双蒸水至1000mL)；
(2)将洗好的杂交膜用保鲜膜包起来，先用便携式盖革计数器初测样品区域内的同位素信号强度(countperminute，CPM)，估计放显所需时间(如3*105CPM约需要10min，3*104CPM约5h，3*103CPM约10h，3*102CPM约2d)；
(3)将杂交膜放入放射自显影专用压片盒并调整好膜的位置；
(4)在暗室中取出X-光胶片，折叠右下角以便定位，将胶片按一定方位平放在杂交膜的上面，锁紧压片盒；
(5)将压片盒放入-70℃冰箱中，根据检测到的信号值放显一定时间，一般需要经过2d放显处理miRNA条带才会在胶片上显现；
(6)从-70℃冰箱取出压片箱，于暗室中室温放置30min；
(7)在暗室中打开压片盒，取出X-胶片，放进显影液中5min；
(8)将胶片从显影液中取出，放入停影液中2min；
(9)将胶片转入定影液中5min；
(10)将胶片转入清水中，2min后取出，再用自来水冲洗胶片，挂于通风处晾干；
(11)在胶片左下角贴标签，注明样品名称、miRNA名称、低温下放显时间及洗胶片日期。
实施例7杂交探针的剥脱与膜的再利用
操作如下：
(1)提前1d用无RNA酶的双蒸水配制剥脱液(0.1*SSC，5g/LSDS)；
(2)将杂交膜平铺在洁净的盒子中(载样面向下)；
(3)煮沸100mL剥脱液，倾倒在膜上，匀速摇动冷却至室温，重复2次；
(4)将杂交膜转到100mL0.5*TBE中，室温漂洗3min；
(5)从0.5*TBE中取出杂交膜，放入杂交管中进行下次预杂交和杂交。
在上述操作中，要注意以下问题：
1、低温下制胶
用微波炉加热溶解小烧杯中的尿素后，不宜马上加入TEMED和过硫酸铵，否则会很快凝聚，要等待溶液冷却至室温，再将小烧杯转移到41冰箱中继续冷却。在低温下加入TEMED和过硫酸铵，降低了过硫酸铵的催化作用，在灌完胶后，随着温度的上升，过硫酸铵的催化作用增强，液体胶才很快凝聚，可以保证小烧杯中的胶溶液在凝聚之前能完全加入到胶室中。低温下制胶还可以防止胶中产生气泡或结块，使制出的凝胶质地均匀。
2、转膜条件适当
只有把胶上的样品完全转到膜上，才能真实反映各样品中待检分子的质量，所以转膜效果直接影响到整个实验结果。当转膜电压和电流过低，要想充分转膜就需要延长转膜时间；而转膜电压和电流过高，在转膜时产生大量的热量将会使胶变形，导致胶上的样品转到膜上时发生错位。因而本技操作在4℃；3.3mA/cm2条件下转膜1～2h，既能实现样品完全转移，又能防止转膜过程中产生大量热量导致转膜错位。
3紫外交联和烘烤固定相结合
紫外交联和60℃或80℃烘烤都是将核酸分子固定在膜上的有效方法,在一定条件下结合这2种方法进行操作，不但能高效地将miRNA分子固定在膜上，也有利于之后的标注和稳定保存，可以有效提高膜的重复使用效果。
4降低非特异性杂交
经过反复比较后发现，先用0.5*TBE或0.1*SSC漂洗膜，不但可以防止膜放入杂交管时产生气泡，还可节约预杂交液。杂交液的体积会影响探针的浓度和杂交效果，根据膜面积确定杂交液用量既能够很好地提高杂交效果，又能充分利用标记好的探针，还可有效节约实验成本。在预杂交和杂交过程中连续2次使用300μg鲑鱼精DNA，也能有效地降低非特异性杂交。
5杂交膜的重复利用
由于研究材料来之不易，重复利用杂交膜，既节约了研究成本，又加快了研究进度。要重复利用杂交膜，须将前一次杂交上的探针完全洗脱下来，同时还要最大限度地保护膜上的样品分子，防止在剥脱探针的过程中将膜上的miRNA分子洗掉。
如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术入员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术入员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。
还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域入员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

Claims (8)

1.一种基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)RNA的分离纯化；
2)探针与Marker的放射性标记和标记产物纯化；
3)制胶和电泳；
4)转膜与RNA分子的交联固定；
5)预杂交和杂交；
6)洗杂交膜和低温放射自显影；
7)杂交探针的剥脱与膜的再利用。
2.根据权利要求1所述的基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，其特征在于，所述RNA的分离纯化具体按照以下步骤实施：
(1)180℃烘研钵2h，待冷却至室温后放于-20℃冰箱中预冷；
(2)分装Trizol至1.5mL离心管中，1mL/支；
(3)将100μg家蚕组织材料在冰上研磨至白色粉末，需要加3次液氮；
(4)将粉末转到Trizol中，用移液枪枪头吹吸数次至无明显块状，静置5min；
(5)加入300μL氯仿，用力振荡混匀20s，静置10min；
(6)4℃条件下12000r/min离心20min，转移上清液约600μL，加入100μLPEG6000-NaCl混合溶液，15％PEG6000，2mol/LNaCl，轻轻颠倒混匀，冰上静置10min；
(7)4℃条件下10000r/min离心15min，将上层液体转移到无RNA酶的1.5mL离心管中，计量液体的体积；
(8)离心管中依次加入1/10体积的pH5.2、3mol/LNaAc、4μLDNAmate，颠倒数次混匀，再加入2.5倍体积的无水乙醇，轻轻颠倒数次混匀，-20℃静置2h以上；
(9)4℃条件下13000r/min离心10min，小心将液体倒在废液缸中，用500μL75％乙醇洗沉淀1次，4℃条件下10000r/min离心2min，倒掉液体，将残留液体吸出；
(10)在无菌操作台上将沉淀自然风干，时间为5min或在真空干燥箱中干燥至微透明，时间为2min；
(11)视沉淀量向离心管中加入50～100μL无RNA酶的甲酰胺溶液，用移液枪枪头将沉淀离散以助溶，于4℃条件下溶解沉淀30min；
(12)取1～2μLRNA用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，电泳缓冲液为l*TBE，100V；
(13)电泳期间吸取1.5μLRNA检测浓度，以1.5μL甲酰胺作对照；
(14)按照30μL/支将RNA进行分装后，进行PAGE凝胶电泳及后续操作，也可以加入500无水乙醇于-80℃保存备用。
3.根据权利要求1所述的基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，其特征在于，所述步骤2)中的探针与Marker的放射性标记和标记产物纯化具体按照以下步骤实施：
探针和Marker的5’末端标记DNA探针序列由上海生工生物工程技术服务有限公司合成；根据合成量加适当体积的双蒸水配制成浓度为100μmol/L的储存液，取出2斗加至18μL双蒸水中，稀释成20μL浓度为10μmol/L的工作液；小RNAMarker为DecadeTMMarkersSystem，继续在冰上配制标记反应体系：20μL探针标记反应体系包括Nuclease-freewater2μL、10*KinaseBuffer2μL、10U/μLT4PNK1μL、[γ-32P]ATP5μL，混匀后分装，19.2μL/支，然后加入探针底物0.8μL；10μLMarker标记反应体系包括Nuclease-freewater2μL，10*KinaseBuffer1μL，10U/μLT4PNK1μL，[γ-32P]ATP5μL，Decademarker1μL；反应程序为38℃，1.5h；70℃，8min；
标记产物的纯化具体操作如下：
(1)待标记结束后，补加100μL无RNA酶的双蒸水，然后转入1.5mL洁净离心管中；
(2)依次加入pH5.2、3mol/LNaAc20μL、DNAmate4μL和无水乙醇250μL，室温静置10min；
(3)4℃条件下12000r/min离心15min，将液体部分倾倒在同位素废液专用防护瓶中；
(4)将沉淀用75％乙醇洗1次，4℃条件下10000r/min离心2min，将液体倒在专用的放射性同位素废液瓶中；
(5)4℃条件下10000r/min离心2min，吸出液体，在超净工作台上静置10min后，加入60～80μLTE缓冲液，冰上溶解10min；
(6)标记小RNAMarker时，加入6～8μL10*CleavageReagent，混匀后室温放置6min，吸取60～80μL6*GelLoadingBufferII加入到标记产物中，沸水浴2min；
(7)按10支或20μL/支分装探针标记产物，按5μL/支或10μL/支分装小RNAMarker的标记产物；
(8)将标记产物于-20℃或-80℃存放备用，放射性标记探针应在[γ-32P]的半衰期内使用。
4.根据权利要求1所述的基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，其特征在于，所述步骤3)中的制胶和电泳具体按照以下步骤实施：
3.1)低温配制变性PAGE凝胶
(1)首先进行制胶和电泳装置的无RNA酶处理，用70％乙醇或中性洗洁精溶液擦拭PAGE胶电泳槽、压片条、梳子及制胶用的玻璃板，用0.1mol/LNaOH或3％H2O2浸洗30min，然后依次用单蒸水、双蒸水和无RNA酶的双蒸水冲洗；
(2)将制胶装置如玻璃板、梳子和压片条放在真空干燥箱中干燥，也可以在无菌超净台上用无菌风吹干；
(3)准确量取35mL双蒸水于50mL小烧杯中，用记号笔准确标出烧杯的液面位置，以便于定量配制PAGE胶；
(4)制取12％变性PAGE胶35mL，含16.8g尿素、3.5mL10*TBE、10.5mL40％丙烯酰胺，丙烯酰胺与甲叉双丙烯酰胺质量比为19:1,加无核酸酶水至总体积为35mL；
(5)60℃水浴2min或在微波炉中加热1min，微波输出功率为1000W，用移液枪枪头轻轻搅动液体至溶质完全溶解，然后将小烧杯放于冰水或4℃冰箱中冷却；
(6)从冰水或4℃冰箱中取出PAGE胶溶液，迅速加入175μL10％过硫酸铵、35μL四甲基乙二胺，并轻轻搅拌混匀；
(7)用1mL移液枪枪头吸取PAGE胶溶液沿着压片条边缘缓缓加入到胶室中，于室温下待胶凝固。
3.2)样品的上样前处理
(1)从-80℃冰箱中取出分装保存于无水乙醇中的小RNA，加入DNAmate4μL和pH5.2、3mol/LNaAc5μL，4℃条件下13000r/min离心10min；
(2)倾倒管中的液体后，在超净工作台上放置10min；
(3)往离心管中加入30μL无RNA酶的甲酰胺溶液，室温放置10min；
(4)加入等体积无RNA酶的6*GelLoadingBufferII；
(5)65℃热水浴10min或80℃热水浴5min后，冰水浴10min，在冰浴期间如果PAGE胶已凝固并冷却，便取出梳子，用200μL移液枪枪头吸取电泳缓冲液0.5*TBE冲洗PAGE胶点样孔，最后吸掉点样孔里残留的0.5*TBE。
3.3)上样后的差速电泳
(1)将变性后的小RNA和Marker上样，吸取电泳缓冲液将点样孔填满，记下点样的顺序；
(2)首先于200V条件下电泳1h，根据溴酚蓝指示，待所有样品RNA进入胶中后，调至300V继续电泳2h，即溴酚蓝总的移动距离约为9cm即可；
(3)关掉电源，取下玻璃夹板，倒掉电泳缓冲液，用专用撬片从玻璃板一角撬开夹心层，先让PAGE胶附在玻璃上，根据样品的分布，切掉多余的胶，并特别切掉胶的一角以标记胶的方向和样品顺序；
(4)进行电泳质量检测，将取下的PAGE胶放在含荧光染料Goldview的电泳缓冲液浸染10min，用无荧光染料，的0.5*TBE漂洗5min后紫外成像观察；
(5)用0.5*TBE再漂洗1min，以备转膜用。
5.根据权利要求1所述的基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，其特征在于，所述步骤4)中的转膜与RNA分子的交联固定具体按照以下步骤实施：
4.1)低温转膜
(1)用10mL0.5xTBE浸泡适当大小的1张尼龙膜和2张半干转印加厚滤纸，浸泡时间5min，
(2)在浸泡尼龙膜和转印滤纸的间隙，可用75％乙醇清洗半干转膜装置的内壁；
(3)在转膜仪的载物板上，从下往上按顺序放置转印滤纸、尼龙膜和PAGE胶；用针穿透胶的各点样孔刺下面的尼龙膜，以辅助标识将转移在尼龙膜上各样品的位置；随后在胶上放置一张转印滤纸，注意在各层之间不能有气泡产生；
(4)用移液枪枪头吸取0.5*TBE均匀地滴加在最上层的滤纸上，吸掉滤纸上及周围的残留液体；
(5)装好半干转膜装置的压板和上面的盖子，接通电源；
(6)根据滤纸的面积，按3.3mA/cm2设置转膜所需的电压和电流，将转膜装置移到4℃冰箱中转膜2h，也可在更温和的转膜条件下过夜转膜；
(7)关掉电源，打开电转仪，取下转印滤纸、胶和膜，将转印滤纸放在无RNA酶的双蒸水中漂洗30min，用保鲜膜包起，保鲜膜重新使用5次，每次使用之前用100mL0.5*TBE浸洗10min；
(8)剪掉尼龙膜右下角作标记，防止混淆样品顺序和膜的载样面。
4.2)小RNA分子的交联固定
(1)将尼龙膜平铺在一张转印滤纸上，在HL-2000型紫外交联仪中交联固定，1000μJ/cm2，约40S；
(2)取出膜，盖上一张洁净的转印滤纸，于80℃烘30min或60℃烘1h；
(3)在膜的左下角标注日期，继续下面的实验操作，或用保鲜膜包起，-20℃条件下暂时保存。
6.根据权利要求1所述的基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，其特征在于，所述步骤5)中预杂交和杂交具体按照以下步骤实施：
(1)交联后，用10mL0.l*SSC或0.5*TBE漂洗尼龙膜3min，然后将膜转到杂交管，膜的非载样面与管壁之间不能有气泡；
(2)根据所用杂交膜的大小，按0.15mL/cm2加入预杂交液，预杂交液为6*SSC，l〇xDenhardt’s溶液，2g/LSDS；
(3)取30μL质量浓度为10mg/mL的鲑鱼精DNA，煮沸变性2min，冰上放置5min，加入到预杂交液中，预杂交条件为37℃6h或65℃3h；
(4)将预杂交液倒在专用废液缸中，加入杂交液和10mg/mL变性鲑鱼精DNA，其中，杂交液为6*SSC，5*Denhardt’s溶液，2g/LSDS；
(5)取出miRNA探针于室温解冻后沸水浴3min，冰上放置5min，4℃条件下1000r/min离心2min，取15～20μL加入到杂交液中；
(6)37℃条件下杂交8～10h或过夜。
7.根据权利要求1所述的基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，其特征在于，所述步骤6)中的洗杂交膜和低温放射自显影具体按照以下步骤实施：
6.1)滚动式洗膜
(1)暂停杂交炉，取下杂交管，将杂交液倒在专用的同位素废液缸中；
(2)吸取10～15mL洗膜液沿无膜的管壁缓缓滴进杂交管，37℃滚动洗膜3min，换新的洗膜液，重复2次，洗膜液为6*SSC，2g/LSDS；
(3)用等体积洗膜液在42℃条件下滚动洗膜20min，重复1次；
(4)取出杂交膜，放入10mL0.5*TBE中漂洗3min。
6.2)低温放射自显影
(1)至少提前6h配好显影液、停影液和定影液，其中，显影液为米吐尔2g，无水亚硫酸钠100g，对苯二酚5g，硼砂29g，加双蒸水至1000mL；停影液为冰醋酸13.5mL，加双蒸水至1000mL；定影液为65℃温水600mL，硫代硫酸钠240g，无水亚硫酸钠15g，冰醋酸13.5mL，硼酸7.5g，钾钒15g，搅拌溶解后加双蒸水至1000mL；
(2)将洗好的杂交膜用保鲜膜包起来，先用便携式盖革计数器初测样品区域内的同位素信号强度，估计放显所需时间；
(3)将杂交膜放入放射自显影专用压片盒并调整好膜的位置；
(4)在暗室中取出X-光胶片，折叠右下角以便定位，将胶片按一定方位平放在杂交膜的上面，锁紧压片盒；
(5)将压片盒放入-70℃冰箱中，根据检测到的信号值放显一定时间，一般需要经过2d放显处理miRNA条带才会在胶片上显现；
(6)从-70℃冰箱取出压片箱，于暗室中室温放置30min；
(7)在暗室中打开压片盒，取出X-胶片，放进显影液中5min；
(8)将胶片从显影液中取出，放入停影液中2min；
(9)将胶片转入定影液中5min；
(10)将胶片转入清水中，2min后取出，再用自来水冲洗胶片，挂于通风处晾干；
(11)在胶片左下角贴标签，注明样品名称、miRNA名称、低温下放显时间及洗胶片日期。
8.根据权利要求1所述的基于Northern杂交检测家蚕microRNA的方法，其特征在于，所述步骤7)中的杂交探针的剥脱与膜的再利用具体按照以下步骤实施：
(1)提前1d用无RNA酶的双蒸水配制剥脱液，剥脱液为0.1*SSC，5g/LSDS；
(2)将杂交膜平铺在洁净的盒子中，载样面向下；
(3)煮沸100mL剥脱液，倾倒在膜上，匀速摇动冷却至室温，重复2次；
(4)将杂交膜转到100mL0.5*TBE中，室温漂洗3min；
(5)从0.5*TBE中取出杂交膜，放入杂交管中进行下次预杂交和杂交。
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