CN103604680B

CN103604680B - 聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色方法

Info

Publication number: CN103604680B
Application number: CN201310634022.9A
Authority: CN
Inventors: 劳方业; 齐永文; 邓海华
Original assignee: Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute
Current assignee: Guangzhou Sugarcane Industry Research Institute
Priority date: 2013-11-28
Filing date: 2013-11-28
Publication date: 2016-08-17
Anticipated expiration: 2033-11-28
Also published as: CN103604680A

Abstract

本发明公开了一种聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色方法。本发明方法只选择需要检测的凝胶区域用边框框定进行局部的、薄层溶液的染色和显色，不用浸泡整块胶板，大大节省了试剂和纯净水，降低了成本，减少了废液的排放，还可避免脱胶问题，显色速度快，方便同时进行多个处理，提高实验效率。本发明是一种灵敏、快速、简便、经济、环保的PAGE胶染色方法。

Description

聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色方法

技术领域

本发明涉及一种聚丙烯酰胺凝胶染色的方法，具体涉及一种聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色的方法。

背景技术

聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)自1959年建立以来，已成为分析蛋白质和核酸样品的一种常用方法，在分子生物学及相关学科的基础和临床研究中被广泛应用。由于其具有较高的分辨率，尤其在AFLP、SSR、SNP 等分子标记研究和遗传图谱构建等方面应用更多。

电泳后对样品的显示有许多方法，目标产物的检测主要采取显色法，目前主要采用同位素放射自显影法、荧光染料标记法、溴化乙锭和银染法。放射自显影法具有灵敏度高、可靠性强等优点，但必须使用同位素标记，操作过程比较繁琐，且操作者易遭受同位素辐射的危险，需特别的设备和防护措施，而且成本昂贵，因而在应用中有一定的局限性。荧光染料标记法虽然没有了同位素对人的危害性，但检测灵敏度降低了，操作过程也同样繁琐，而且需要有荧光显微镜等设备，成本较高。溴化乙锭( EB) 染色法方便易行，但聚丙烯酰胺对EB的荧光有猝灭作用，大大降低了溴化乙锭染色灵敏度，特别是EB具有致癌性，使得对凝胶的操作和处理变得复杂。银染法可以有效地克服以上述多种常见凝胶染色法的缺点，检测灵敏度高，使用样品量少、无毒无害、不易扩散，易于观察。传统的银染方法主要包含下面几个步骤: (1)预处理与固定；(2)染色；(3)显色；(4)终止反应等。要用到蒸馏水或去离子水、乙醇、硝酸、硝酸银、碳酸钠、甲醛、硫代硫酸钠、乙酸等多种化学试剂，整个过程比较繁琐，所需时间近2小时。近年来，许多研究人员对PAGE胶中蛋白质和DNA的银染和显色的过程优化进行了探索，并已取得很大发展，实验程序大为简化、消耗也更少。

目前DNA分子标记、遗传图谱构建等大量使用PAGE胶。大胶（胶厚：0.4mm，面积：33×52cm²～38×52cm²）使用比较普遍，银染这样的大胶，每次染色液、显色液的量都在2.0～2.5L，试剂消耗较大，且胶板在碱性溶液中浸泡，胶很容易从玻璃板上脱落而全功尽弃。小胶（胶厚：1.0mm，面积：11×20cm²～18×25cm²）也经常用到，虽然没有脱胶问题，但每次染色液、显色液的量都在0.4～0.6L，试剂消耗也较大。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种试剂用量少，操作简便、灵敏，可有效防止脱胶的环保的聚丙烯酰胺凝胶染色方法。

本发明的目的在于提供一种聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色的方法。

本发明所采取的技术方案是：

一种聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）电泳结束将玻璃胶板取下平放，撬开玻璃板，拿去较短的玻璃板，将长玻璃板沾有凝胶的一面向上平放；

2）把边框置于凝胶上，框住需要染色的区域，将边框软质面与凝胶紧贴，防止液体的渗漏；在边框内倒入染色液，让染色液迅速均匀铺满整个需要染色的区域，进行染色；

3）把边框内的染色液倒出，洗去残留染色液；

4）再在边框内倒入显影液，让显影液均匀铺满整个需要染色的区域，进行显色至可看见清晰的条带；

5）把边框内的显影液倒出，洗去残留显影液，即可。

进一步的，步聚2）中所述的边框为2层材料构成的密闭边框，与凝胶接触的为平滑的软质材料层，另一层为硬质材料层。

进一步的，所述的软质材料选自PVC软质塑料、软质橡胶。

进一步的，所述的硬质材料选自千思板、环氧树脂板、不锈钢、铝合金、有机玻璃、PVC硬质塑料。

进一步的，所述边框的软质材料层和硬质材料层的厚度独立为0.3～0.5cm。

进一步的，当所配制的凝胶厚度小于0.5mm或凝胶面积大于18×25cm²时，步聚1）中所述的长玻璃板在配胶前，将与胶接触的面涂布亲和硅烷，促进凝胶与贴合。

进一步的，步聚2）中所述染色的时间为5～10min。

进一步的，所述染色液包含0.1～0.2%(w/v)AgNO₃和0.05～0.10%(v/v) Tween20。

进一步的，所述显影液包含1.0～2.0%(w/v)NaOH、0.04～0.05% (w/v)Na₂B₄O₇和0.05～0.08M甲醛。

本发明的有益效果是：

在本发明中，用特制的边框紧密地框定需要染色的凝胶区域，进行局部的、薄层的染色和显色，本发明方法主要有以下3方面优点：

一方面，可避免整块凝胶板的浸泡，染色液和显影液只需薄层地浸泡框定的凝胶，大大节省了染色液和显影液等试剂的用量，其用量仅为常规用量的0.8%左右，降低了成本，也显著减少了废液的排放；

另一方面，可避免染色过程中的脱胶问题，当凝胶厚度小于0.5mm，若发生脱胶，凝胶上的DNA条带容易被冲掉而无法看到实验结果，当凝胶面积较大时，若发生脱胶，胶体很难移动，且凝胶很容易被破碎而前功尽弃。本发明的检测方法用边框稳住凝胶，也不用浸泡整块凝胶板，凝胶边缘也不会与显影液中的碱接触，非常有效地避免了脱胶现象；

最后，本发明的染色方法操作简便，显色速度快，10～15min就可以得到检测结果，也有利于避免凝胶因浸泡过久与玻璃析脱离，省时省力，更方便同时进行多个处理，有利于提高实验效率。

综上，本发明是一种灵敏、快速、简便、经济、环保的聚丙烯酰胺凝胶染色方法。

附图说明

图1聚丙烯酰胺凝胶（大面积Ⅰ型凝胶）的框定区域快速染色图，A为软质材料边框（半透明）与硬质材料边框（黑色）图，B在聚丙烯酰胺凝胶上放置软质材料边框，C在软质材料边框上再放置硬质材料边框，D用夹子把边框与玻璃板固定在一起；

图2聚丙烯酰胺凝胶（小面积Ⅱ型凝胶）的框定区域快速染色图，A为染色前，软质边框在下，硬质边框在上，用夹子把边框与玻璃板固定在一起，B为染色后示意图；

图3聚丙烯酰胺凝胶的传统染色图，A为大面积Ⅰ型凝胶的传统染色图，B为小面积Ⅱ型凝胶的传统染色图。

具体实施方式

3）把边框内的染色液倒出，洗去残留染色液；

5）把边框内的显影液倒出，洗去残留显影液，即可。

优选的，步聚2）中所述的边框为密闭边框，与凝胶的接触面为平滑的软质材料，另一面为硬质材料。

所述的软质材料优选为PVC软质塑料、软质橡胶。

所述的硬质材料优选为千思板、环氧树脂板、不锈钢、铝合金、有机玻璃、PVC硬质塑料。

所述边框的软质材料层和硬质材料层的厚度独立优选为0.3～0.5cm，二者四条边的宽度均优选为1.0～2.0cm。

优选的，当所配制的凝胶厚度小于0.5mm或凝胶面积大于18×25cm²时，步聚1）中所述的长玻璃板在配胶前，将其与凝胶的接触面涂布亲和硅烷，促进凝胶与其贴合。

优选的，步聚2）中所述染色的时间为5～10min。

以下结合具体实施例对本发明作进一步的说明。

实施例 1:

1）聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后将33×52cm的玻璃胶板取下平放，其中凝胶的厚度为0.4mm，小心撬开玻璃板，拿去较短的玻璃板，将长玻璃板（配制凝胶时经亲和硅烷处理过）沾有凝胶的一面向上平放；

2）把29×45×0.6cm的边框放置于凝胶上框住需要染色的区域（如图1所示），其中边框的软质材料层为PVC软质塑料（如图1 A中的半透明边框），硬质材料层为环氧树脂板（如图1 A中的黑色边框），先将软质材料层框住需要染色的区域（如图1 B所示），在软质材料层上面放上硬质材料层（如图1 C所示），再在边框上对称地夹上夹子（如图1 D所示），使边框软质面紧贴凝胶（也可以利用重物压等其他方法使边框和凝胶紧贴），防止液体的渗漏，再在边框内倒入染色液20mL，迅速让染色液均匀铺满整个需要染色的区域，并轻轻晃动8min；

3）把边框内的染色液倒出、沥干，加入50mL纯净水轻轻漂洗3s，倒出、沥干，重复1次；

4）把边框内的水沥干后，再倒入显影液20mL，迅速让显影液均匀铺满整个需要染色的区域，并轻轻晃动2min，可看见清晰的条带；

5）把边框内的显影液倒出、沥干，加入50mL纯净水轻轻漂洗约30s，倒出、沥干，重复2次，即可。

实施例 2:

1）聚丙烯酰胺凝胶电泳结束后将15×22cm的玻璃胶板取下平放，其中凝胶的厚度为1mm，小心撬开玻璃板，拿去较短的玻璃板，将长玻璃板沾有凝胶的一面向上平放；

2）把13×19×0.6cm的边框放置于凝胶上框住需要染色的区域（如图2 A所示），其中边框的软质材料层为PVC软质塑料，硬质材料层为环氧树脂板，在边框上对称地夹上夹子，让边框软质面紧贴凝胶，防止液体的渗漏，再在边框内倒入染色液5mL，迅速让染色液均匀铺满整个需要染色的区域，并轻轻晃动8min；

3）把边框内的染色液倒出、沥干，加入20mL纯净水轻轻漂洗3s，倒出、沥干，重复1次；

4）把边框内的水沥干后，再倒入显影液5mL，迅速让显影液均匀铺满整个需要染色的区域，并轻轻晃动2min，可看见清晰的条带；

5）把边框内的显影液倒出、沥干，加入50mL纯净水轻轻漂洗约30s，倒出、沥干，重复2次，即可，染色后的图片如图2 B所示。

实施例 3 ：

2）把13×19×1cm的边框放置于凝胶上框住需要染色的区域，其中边框的软质材料层为软质橡胶，硬质材料层为千思板，在边框上对称地夹上夹子，让边框软质面紧贴凝胶，防止液体的渗漏，再在边框内倒入染色液5mL，迅速让染色液均匀铺满整个需要染色的区域，并轻轻晃动8min；

实施例 4 ：

2）把29×45×1cm的边框放置于凝胶上框住需要染色的区域，其中边框的软质材料层为PVC软质塑料，硬质材料层为PVC硬质塑料，在边框上对称地夹上夹子，让边框软质面紧贴凝胶，防止液体的渗漏，再在边框内倒入染色液20mL，迅速让染色液均匀铺满整个需要染色的区域，并轻轻晃动8min；

下面对实施例中凝胶框定区域快速染色方法的试剂用量、纯水用量及试剂费用等方面与传统染色法的进行比较。

分别统计传统染色法（如图3所示）和本发明的框定区域快速染色法（如图1和图2所示）中的试剂用量、纯水用量及试剂费用，统计数据如下表1所示。其中，传统染色法即将凝胶置于相关溶液中浸泡进行染色和显色，当凝胶面积大于18×25cm²或厚度小于0.5mm时，需粘附在玻璃板上进行染色操作，如图3A所示的面积大且薄的Ⅰ型凝胶（长×宽×厚:52cm×33cm×0.4mm）的传统染色方法，必须将Ⅰ型凝胶粘附在玻璃板上置于液体中进行浸泡，且操作须须细致，时间掌控要得当，否则凝胶容易脱落破碎；而图3B所示的面积小且厚的Ⅱ型凝胶（长×宽×厚: 15cm×22cm×1mm）的传统染色方法，可以去玻璃板，单独浸泡进行染色。

表1 聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色法与传统染色法的试剂用量等比较

注：传统染色1为如图3A所示的大面积Ⅰ型凝胶染色，传统染色2为如图3B所示的小面积Ⅱ型凝胶染色。

根据表1中的数据可获知：Ⅰ型凝胶染色过程中，本发明的染色方法中染色液和显色液用量均仅为传统染色方法的0.8%，节省率达99.2%，所需要的费用也仅为传统染色方法用量的0.8%。在Ⅱ型凝胶染色过程中，本发明的染色方法中染色液和显色液用量均为传统染色方法的1%，节省率达99%，所需要的费用也为传统染色方法用量的1%。此外，纯水的用量也大为减少，更为重要的是废液的排放显著减少。

Claims

1.一种聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色的方法，其特征在于：包括如下步骤：

3）把边框内的染色液倒出，洗去残留染色液；

5）把边框内的显影液倒出，洗去残留显影液，即可；

步聚2）中所述的边框为两层材料构成的密闭边框，与凝胶接触的为平滑的软质材料层，另一层为硬质材料层；

所述的软质材料选自PVC软质塑料、软质橡胶；

所述的软质材料层和硬质材料层的厚度独立为0.3～0.5cm，二者四条边的宽度为1.0～2.0cm。

2.根据权利要求1所述的一种聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色的方法，其特征在于：所述的硬质材料选自千思板、环氧树脂板、不锈钢、铝合金、有机玻璃、PVC硬质塑料。

3.根据权利要求1所述的一种聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色的方法，其特征在于：当所配制的凝胶厚度小于0.5mm或凝胶面积大于18×25cm²时，步聚1）中所述的长玻璃板在配胶前，将其与凝胶的接触面涂布亲和硅烷，促进凝胶与其贴合。

4.根据权利要求1所述的一种聚丙烯酰胺凝胶框定区域快速染色的方法，其特征在于：步聚2）中所述染色的时间为5～10min。