CN116814620A - 用于抑制syn2a的多核苷酸、含有其的外泌体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种用于抑制syn2a的多核苷酸、含有其的外泌体及其用途。本申请中提供了一种syn2a siRNA序列,其可作为syn2a抑制剂用于预防/治疗/辅助治疗创伤后应激障碍(PTSD);本申请中还提供了一种装载有syn2a siRNA序列的外泌体,它能够高效、组织特异性的递送syn2a siRNA序列至靶基因,抑制靶基因或其编码蛋白的表达,对恐惧记忆难消退模型鼠治疗效果显著,可显著降低其平均僵直率。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,特别涉及用于抑制syn2a的多核苷酸、含有其的外泌体及其用途。
背景技术
创伤后应激障碍(PTSD)是一种精神类疾病,主要由于个体受到强烈的创伤而引发,并且症状可以持续数月或数十年。而且,PTSD往往与其他精神疾病,比如抑郁、自杀想法并存。因此,PTSD的治疗显得更加迫切。然而,目前临床上最常用的方法是在心理学家或精神科医生的指导下的暴露疗法,而这个过程是低效的,它可能需要长久的治疗过程来克服这段痛苦的记忆。当然,目前还有一些药物疗法,比如抗抑郁药,如SSRI药物氟西汀(百忧解)(fluoxetine(Prozac)和帕罗西汀(赛乐特)(paroxetine(Paxil),在治疗PTSD的一些症状中是有效的,但此类药物有潜在的心理依赖和成瘾性。因此,开发新的安全的治疗创伤后应激障碍的药物至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于抑制syn2a的多核苷酸。
本发明的另一目的在于提供一种外泌体。
本发明的另一目的在于提供一种药物组合物。
本发明的另一目的在于提供一种预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的方法。
为解决上述技术问题,本发明第一方面,提供了一种分离的多核苷酸,所述多核苷酸选自下述任一种:
(i)如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸;
(ii)与SEQ ID NO:1所示序列相比,同源性大于80%的的多核苷酸;和
(iii)由SEQ ID NO:1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的多核苷酸。
本发明的第二方面,提供了一种含有本发明第一方面所述多核苷酸的小核酸分子,所述小核酸分子为siRNA、siRNA前体、dsRNA、shRNA、miRNA或小干扰RNA。
本发明的第三方面,提供了一种含有本发明第一方面所述多核苷酸或含有本发明第二方面所述小核酸分子的外泌体。
本发明的第四方面,提供了一种药物组合物,包括:本发明第一方面所述的多核苷酸/本发明第二方面所述的小核酸分子/本发明第三方面所述的外泌体,和药学上可接受的载体。
本发明的第五方面,提供了一种预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的方法,所述方法包括步骤:向受试对象施加治疗有效量的本发明第一方面所述的多核苷酸,或者向受试对象施加治疗有效量的本发明第二方面所述的小核酸分子,或者向受试对象施加治疗有效量的本发明第三方面所述的外泌体,向受试对象施加治疗有效量的本发明第四方面所述的药物组合物。
在一些优选的方案中,所述施用的方式为静脉注射。
本发明的第六方面,提供了本发明第一方面所述的多核苷酸的用途,用于:
(i)预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍;
(ii)制备用于预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的药物;
(iii)体外非治疗性地降低syn2a基因或其编码蛋白的表达水平;和/或
(iv)用作syn2a抑制剂。
本发明的第七方面,提供了本发明第二方面所述的小核酸分子的用途,用于:
(i)预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍;
(ii)制备用于预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的药物;
(iii)体外非治疗性地降低syn2a基因或其编码蛋白的表达水平;和/或
(iv)用作syn2a抑制剂。
本发明的第八方面,提供了本发明第三方面所述的外泌体的用途,用于:
(i)预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍;
(ii)制备用于预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的药物;
(iii)体外非治疗性地降低syn2a基因或其编码蛋白的表达水平;和/或
(iv)用作syn2a抑制剂。
本发明的第九方面,提供了一种含有本发明第一方面所述多核苷酸的外泌体的制备方法,所述方法包括步骤:
获取原始的外泌体,然后将本发明第一方面所述的多核苷酸导入所述原始的外泌体中,即得含有本发明第三方面所述多核苷酸的外泌体。
在一些优选的方案中,通过电转导法或者化学转导法将本发明第一方面所述的多核苷酸导入所述原始的外泌体中。
在一些优选的方案中,所述原始的外泌体通过使ECS试剂处理细胞获得。
本发明相对于现有技术而言,至少具有下述优点:
(1)本发明提供了一种syn2a siRNA序列,其可作为syn2a抑制剂用于预防/治疗/辅助治疗创伤后应激障碍(PTSD);
(2)本发明还提供了一种装载有syn2a siRNA序列的外泌体,它能够高效、组织特异性的递送syn2a siRNA序列至靶基因,抑制靶基因或其编码蛋白的表达,在小鼠动物模型中,尾静脉注射外泌体包裹的syn2a siRNA,能够显著降低普通C57小鼠以及恐惧记忆难消退模型鼠的平均僵直率,因此,该外泌体药物是治疗性的,能够有效地预防和/或治疗和/或辅助治疗PTSD。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明,这些示例性说明并不构成对实施例的限定。
图1是根据本发明实施例中小鼠尾静脉注射DiD染料标记外泌体(DiD-labeledExosome),观察0,2,8小时外泌体在体内的代谢情况;
图2是根据本发明实施例中小鼠尾静脉注射对照外泌体和si syn2a外泌体后,大脑皮层的syn2a/b蛋白Western blot验证对比结果,其中,Con为对照组,Si-syn2a为实验组,GAPDH是内参,采用t检验分析,数据为均数±标准误,**P<0.01;
图3是根据本发明实施例中普通C57BL/6J小鼠尾静脉注射对照RNA外泌体和si-syn2a外泌体后双因素方差分析对照组和si-syn2a外泌体组在恐惧记忆消退过程中的僵直率变化,数据为均数±标准误,*P<0.05;
图4是根据本发明实施例中普通C57BL/6J小鼠尾静脉注射对照RNA外泌体和si-syn2a外泌体后t检验分析对照组和si-syn2a外泌体组在恐惧记忆获取阶段,其僵直率无明显差异,而在恐惧记忆消退测试的僵直率出现明显改变(n=5),数据为均数±标准误,*P<0.05。
图5是根据本发明实施例中AtLAS-/-小鼠尾静脉注射对照RNA外泌体和si-syn2a外泌体后双因素方差分析对照组和si-syn2a外泌体组在恐惧记忆消退过程中的僵直率变化;
图6是根据本发明实施例中t检验分析对照组和si-syn2a外泌体组在恐惧记忆获取阶段,其僵直率无明显差异,而在恐惧记忆消退测试的僵直率出现明显改变(n=7),数据为均数±标准误,*P<0.05,**P<0.01。
具体实施方式
现有技术中尚无更安全的治疗PTSD的有效药物。RNA干扰(RNAinterfering,RNAi)作为一个新的基因治疗技术,其在抗病毒、抗肿瘤和抗炎症等医药领域应用前景广阔,得到了迅速发展,部分RNA药物已进入临床试验阶段,为疑难杂症尤其是多因素的疾病如癌症、病毒感染开辟了全新的治疗途径。然而,小干扰RNA必须在胞内才能发挥作,RNA分子带负电荷,并且对体内广泛存在的核酸酶敏感,不容易被递送至靶基因实现治疗作用。
本发明人经过广泛而深入的研究发现,设计了靶向syn2a基因并抑制其表达的核酸药物,此外,发明人还发现将其装载在外泌体中,在体内低免疫原性、低毒性、无诱导突变,应用于递送小干扰RNA治疗创伤后应激障碍效果极佳,因此包含本发明多核苷酸的外泌体成为一种治疗PTSD的药物是非常新颖且可行有效的方法。
多核苷酸
本发明涉及一种用于抑制syn2a及其编码蛋白表达的分离的多核苷酸。作为核酸药物,其可以与靶基因syn2a结合从而抑制syn2a表达。如本发明中所用的,术语“多核苷酸”或“核酸”指的是由天然存在的碱基,糖和糖(中枢)结合而成的核苷酸或核苷酸单体序列。该术语还包括包含天然不存在的单体或其一部分的限定或替换序列。本发明的多核苷酸序列可以是脱氧核糖核酸序列(DNA)或核糖核酸序列(RNA),并且可以含有腺嘌呤,鸟嘌呤,胞嘧啶和尿嘧啶的天然碱。在本发明的一个实施方式中,多核苷酸为核糖核酸序列为如SEQID NO:1所示的多核苷酸。在本发明的一个实施方式中,多核苷酸为核糖核酸序列为与SEQID NO:1所示序列相比,同源性大于80%(优选地大于90%,进一步优选地大于95%,进一步优选地大于98%,更进一步优选地大于99%)的多核苷酸。在本发明的一个实施方式中,多核苷酸为核糖核酸序列为由SEQ ID NO:1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的多核苷酸。针对靶基因syn2a,发明人设计了多个多核苷酸分子,经过筛选和验证,得到上述多核苷酸序列,同等剂量下,syn2a表达抑制能力最强。前述的SEQ ID NO:1:CCCAGAAATGACCATGTGATA。
如本发明中所用的,术语“同源性”、“序列同一性”和“同一性的百分比”可互换使用,是指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即相同)核苷酸或氨基酸的百分比。可以通过以下方法测量两个或多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性。排列多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列,对排列的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行评分,并将其与排列的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量进行比较。多核苷酸可以在一个位置上不同,例如,根据包含不同的核苷酸(即,替换或变异)或核苷酸的缺失(即,在多核苷酸中插入或缺失一个或两个核苷酸)。多肽可以例如通过含有氨基酸(即,取代或变异)或氨基酸的缺失(即,插入一个或两个多肽中的氨基酸或氨基酸的缺失)在一个位置上不同。可以通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算序列同一性。举例来说,百分比同一性可通过将含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置的数量除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数,然后乘以100来计算。
小核酸分子
本发明还涉及含有上述多核苷酸的小核酸分子,小核酸分子可以是siRNA、siRNA前体、dsRNA、shRNA、miRNA或小干扰RNA中至少一种。
如本文所用,术语“RNAi”(RNA interference,RNA干扰)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(dsRNA)诱发的、高效特异性降解具有互补配对序列的RNA的现象。由于使用RNAi技术可以特异性关闭特定基因的表达,所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及肿瘤的基因治疗等领域。dsRNA介导的RNAi现象在真菌、果蝇、拟南芥、锥虫、水螅、涡虫、斑马鱼等多种真核生物中均有发现,而且在植物中的转录后基因沉默(posttranscriptional gene silencing,PTGS)、共抑制(cosuppression)及RNA介导的病毒抗性、真菌的抑制(quelling)现象也均属于RNAi在不同物种的表现形式。
如本文所用,术语“siRNA”(Small interfering RNA,siRNA)是指一种小RNA分子(约21-25个核苷酸),可由Dicer(RNA酶Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶)从其前体(比如dsRNA、shRNA等)加工而成,也可由化学方法合成或由其它蛋白加工产生。siRNA是siRISC的主要成员,激发与之序列互补的目标RNA被迅速切割降解,导致目标基因的沉默,因此成为RNAi中的关键功能分子。在给出特定的基因靶位序列的情况下,本领域技术人员可以通过常规的方法设计并获得针对该靶位序列的siRNA。
如本文所用,术语“siRNA前体”是指可以在哺乳动物细胞中被加工产生siRNA的RNA分子,具体地说,是由Dicer或其它类似蛋白选择性加工从而产生成熟的siRNA,进而实施RNAi。
如本文所用,术语“miRNA”(microRNA)是一类由内源基因编码的长度约20-24个核苷酸的非编码单链RNA分子,在动植物中参与对大量基因的表达调控。到目前为止,在动植物以及病毒中已经发现四千多种miRNA分子。大多数miRNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇(cluster)的形式存在于基因组中。每种miRNA可以调控多个靶基因,而几种miRNA也可以共同参与调节同一基因,组成复杂的调节网络。据推测,miRNA调节着人类一半以上基因的表达。miRNA存在多种形式,最原始的是pri-miRNA;pri-miRNA经过Drosha加工后,成为pre-miRNA,即miRNA前体,长度大约为50-90个核苷酸;pre-miRNA再经过Dicer酶酶切后,成为长约20-24个核苷酸的成熟miRNA。miRNA主要通过抑制翻译和加速mRNA的脱腺苷酸化抑制靶基因表达,其机制有别于siRNA介导的mRNA降解。
在活体中产生“小干扰RNA”(siRNA)的一种办法是,将siRNA序列作为“短发夹”的一部分克隆进质粒载体中。当送入动物体内时,该发夹序列被表达出来,形成一个带有顶端环结构的“双链RNA”(shRNA),被细胞内的Dicer蛋白所识别和加工,产生有功能的siRNA。
如本文所用,术语“shRNA”、“shRNA”可互换使用,是以人miR-26b的前体作为骨架构建的一种特殊的shRNA。所述shRNA从5′端到3′端依次为:(a)5′端旁侧序列区;(b)5′端配对siRNA区域;(c)顶端环区域;(d)3′端配对siRNA区域,并且所述5′端配对siRNA区域与3′端配对siRNA区域形成双链区域;(e)3′端旁侧序列区;所述shRNA产生siRNA,且所述siRNA的核苷酸序列对应于所述3′端配对siRNA区域或5′端配对siRNA区域。
广义的shRNA是short hairpin RNA的缩写,即,“短发夹RNA”。shRNA包括两个短反向互补序列,中间由一顶端环(loop)序列分隔的,组成发夹结构,通常由细胞内源的RNA聚合酶III(RNApolymeraseIII)启动子控制转录,shRNA序列的末端连接5-6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。shRNA也可以由其它RNA聚合酶的启动子转录产生。
外泌体
本发明还涉及含有上述多核苷酸的外泌体。如本发明中所用的,术语“外泌体(exosome)”和“外排体”可互换使用,指的是细胞产生的直径在30~100nm的囊泡,具有脂质双层膜结构。外泌体由活细胞分泌,并且天然存在于体液中,包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁。由细胞胞吞系统中的晚期内吞体与细胞膜融合或者直接通过细胞膜从细胞中释放出胞外,在细胞间信号传递中起重要作用。本发明的一个实施方式中,外泌体含有如SEQ IDNO:1所示的多核苷酸。在本发明的一个实施方式中,外泌体含有与SEQ ID NO:1所示序列相比,同源性大于80%(优选地大于90%,进一步优选地大于95%,进一步优选地大于98%,更进一步优选地大于99%)的多核苷酸。在本发明的一个实施方式中,外泌体含有由SEQ IDNO:1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的多核苷酸。
在优选的实施方式中,外泌体还可经工程化改造,例如靶向改造、负载改造。本发明的一个实施方式中,对纯化后的外泌体进行负载改造,外源装载(post-modification)本发明的多核苷酸。
外泌体的制备方法
本发明还涉及含有多核苷酸的外泌体的制备方法,包括步骤:
(1)获取原始的外泌体;
(2)将上述多核苷酸导入原始的外泌体中,即得含有多核苷酸的外泌体。
本发明中,原始的外泌体指的是直接从细胞中获取的未经装载外源靶序列的外泌体。获取原始的外泌体的方式可通过本领域常规的方式进行,例如使用市售的外泌体提取试剂盒,并按照试剂盒说明书操作获得外泌体。在本发明的优选的实施方式中,使用ECS(Exosomoe Concentration Solution)试剂处理细胞获得原始的外泌体。
可使用本领域常规引入核酸递送方式将本发明的多核苷酸导入外泌体中,即将目标多核苷酸序列工程化装载在外泌体中。根据负载的操作发生在外泌体纯化步骤前或外泌体纯化步骤后,将装载分为外源装载或内源装载。外源装载为首先将获取的外泌体纯化,然后在通过电转法,电穿孔法等电转导方式或化学转导方式将目标多核苷酸导入纯化的外泌体中。内源装载为首先对来源细胞进行改造,例如通过直接转染或共孵育等方式将目标多核苷酸导入来源细胞,然后使来源细胞产生外泌体,得到含有目标多核苷酸的外泌体。本发明的一个优选的实施方式中,使用外源装载的方式将目标多核苷酸导入外泌体,获得含有目标多核苷酸的外泌体。
纯化外泌体的方法参考本领域常规的方式进行,示例性地如将外泌体颗粒粗品使用Exosomoe Purafication Filter(EPF柱)进行纯化,于4℃以3000g离心10min,离心后收集EPF柱管底的液体,得到纯化后的外泌体颗粒。
药物组合物
本发明还涉及药物组合物,包括本发明多核苷酸或本发明外泌体,以及药学可接受的载体。
如本发明中所使用的,术语“药学可接受的载体”可包括药学上可接受的赋形剂、缓冲剂、稳定剂或本领域技术人员已知的其他物质中的一种或多种。药学上可接受的载体的示例包括但不限于水、盐水、缓冲剂、等渗剂诸如糖、多元醇、辅助物质诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂以及它们的组合中的一种或多种。此类材料应该无毒,并且在所采用的剂量和浓度下应该不干扰活性剂成分的功效。载体或其他物质的确切性质可取决于施用途径,例如肌肉内、皮下、口服、静脉内、皮肤、粘膜内(例如,肠)、鼻内或腹膜内途径。在本发明的一些实施方式中,药物组合物包括本发明的多核苷酸和作为药学上可接受的载体的核酸递送载体,这些核酸递送载体的示例包括脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肽、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、金属颗粒以及细菌、病毒(诸如,杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、粘粒、质粒、真菌载体和通常用于本领域中且被描述为在各种真核宿主中表达的其他重组载体。
治疗方法
本发明还涉及预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的方法,包括步骤:向受试对象施加治疗有效量的上述多核苷酸,或者向受试对象施加治疗有效量的外泌体,或者向受试对象施加治疗有效量的药物组合物。
如本发明中所使用的,术语“治疗”指根除或改善疾病或病症,或者与该疾病或病症相关的一种或多种症状。在一个实施方式中,本领域技术人员已知该种症状与待治疗的疾病或病症相关。在特定的实施方式中,该术语指通过向患有该疾病或病症的对象施用一种或多种预防性或治疗性药剂而使疾病或病症的扩散或恶化最小化。在部分实施方式中,该术语指在特定疾病的症状发作后,联合或不联合其它附加活性剂施用本发明的化合物。
如本发明中所使用的,术语“预防”指预防疾病或病症,或与该疾病或病症相关的一种或多种症状的发作、复发或扩散。在一个实施方式中,本领域技术人员已知该种症状与待预防的疾病或病症相关。在特定的实施方式中,该术语指针对具有罹患此处所述的疾病或障碍的风险的患者,在症状发作前联合或不联合其它附加活性剂施用本发明中的多核苷酸或外泌体。该术语包括了特定疾病的症状的抑制和减少。在特定的实施方式中,具有一种疾病的家族史的患者被特别作为候选者。此外,具有复发症状史的患者也是潜在的预防候选者。就此而言,术语“预防”可与术语“预防性处理”互换使用。
本发明中多核苷酸或外泌体的“治疗有效量”指在疾病或紊乱的治疗或控制中足以提供治疗性效果、或者足以延缓或最小化与该疾病或紊乱相关的一种或多种症状的药物的数量。化合物的治疗有效量指单用或联合其它疗法使用时可在疾病或紊乱的治疗或控制中提供治疗性效果的治疗性药剂的数量。术语“治疗有效量”可包括改善总体疗法、减少或避免疾病或紊乱的症状或起因、或者增强另一治疗性药剂的治疗效力的数量。
如本发明中所使用的,术语“对象”在此定义为包括动物,如哺乳动物,包括但不限于,灵长动物(例如,人)、牛、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠、小鼠等。在特定的实施方式中,该对象为人。
作为本发明中多核苷酸、外泌体或药物组合物的施用方式,可选用经口、肠胃外、吸入喷雾、局部、直肠、鼻腔、口腔、阴道或经由植入的储库施用。如本文所用的术语“肠胃外”包括皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内和颅内注射或输注技术。优选地,组合物经口、腹膜内或静脉内施用。在本发明的一个更优选的实施方式中,施用的方式为静脉注射。
用途
本发明还涉及上述多核苷酸、外泌体或药物组合物的用途,用于
(i)预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍;
(ii)制备用于预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的药物;
(iii)体外非治疗性地降低syn2a基因或其编码蛋白的表达水平;和/或
(iv)用作syn2a抑制剂。
如本发明中使用的,术语“和/或”应被视为两个指定特征或组件中的每一个的具体公开,有或没有另一个。因此,本文中诸如“A和/或B”之类的短语中使用的术语“和/或”旨在包括“A和B”、“A或B”、“A”(单独)和“B”“(独自的)。同样在术语“A、B和/或C”中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下各个方面:A、B和C;A、B或C;A或C;A或B;B或C;A和C;甲和乙;B和C;A(单独);B(单独);和C(单独)。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
除非另有指明,本文所用的技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义,需要注意的是,本文所用的术语仅为了描述具体实施方式,而非意图限制本申请的示例性实施方式。
实施例1
本实施例中,提取了外泌体并纯化。具体步骤如下:
小鼠细胞常规培养,首先进行上清液预处理,在去除杂质的离心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution(ECS试剂),加入ECS试剂后将离心管盖紧,通过涡旋振荡器混匀1min,再放置于4℃静置2h;取出装有混合液的离心管于4℃以10000g离心60min,弃上清,沉淀中富含外泌体颗粒;取100μL 1×PBS均匀吹打离心沉淀物,待其均匀悬浮在PBS中后,将重悬液转移至新的1.5mL离心管中;将含有重悬液的1.5mL离心管于4℃以12000g离心2min,保留上清液,该上清液中富含外泌体颗粒。
将收获的外泌体颗粒粗品转入Exosomoe Purafication Filter(EPF柱)上室中,于4℃以3000g离心10min,离心后收集EPF柱管底的液体,此液体即为纯化后的外泌体颗粒。
实施例2
本实施例中,为了更好地确定我们的外泌体定位,将实施例1中得到的纯化的外泌体进行荧光染料标记。具体步骤如下:
染料工作液制备:用Diluent C稀释储存液,配制浓度为100μM的染料工作液(避光操作);
外泌体染色:在外泌体中加入染料工作液,加入染料工作液后将离心管盖紧,通过涡旋振荡器混匀1min,再静置孵育10min,向孵育后的外泌体-染料复合物中加入1mL的1XPBS混匀,按照外泌体提取方法再次提取外泌体以去除多余染料,取100μL1×PBS重悬沉淀物,沉淀即为标记后的外泌体。
实施例3
本实施例中,将siRNA电转至经荧光染料标记的外泌体。具体步骤如下:
取实施例2中得到的经荧光染料标记的外泌体,采用电转程序,将100微克si-syn2a电转至外泌体中。
取实施例2中得到的经荧光染料标记的外泌体,采用电转程序,将100微克含有发明人设计的其他siRNA序列依次电转至外泌体中,得到对照组。例如将siRNANC序列电转至外泌体中,得到对照组。
syn2a siRNA(SEQ ID NO:1):CCCAGAAATGACCATGTGATA;
siRNANC序列(SEQ ID NO:2):TTCTCCGAACGTGTCACGT。
实施例4
本实施例中,将外泌体注入实验动物脑内,进行线索性条件恐惧记忆消退行为学实验。
通过尾静脉注射的方式,把实施例3得到的外泌体注入小鼠,通过小动物活体成像技术观察0小时,2小时及8小时外泌体在体内的分布情况(图1),发明人发现外泌体在2小时已入脑,并且维持时间可长达8小时。
发明人通过经典的线索性条件恐惧记忆消退行为学,检测si-syn2a外泌体药物的效果。首先选取雄性8-10周野生型小鼠10只,实验开始前,提前6小时尾静脉注射外泌体(5只实验组,5只对照组)。实验第一天,将小鼠放入电击箱中,此时电击箱场景为A,气味为低浓度乙醇,3mim后进行第一次足底电击(0.8mA,1s)和声音(80db,4000hz,30s)配对,即声音出现29s后进行1s电击,声音和电击同时结束。经历5次这样的配对练习,间隔20s,最后一次训练后60s把小鼠取出放回鼠笼,记录每只小鼠的僵直率。第二天小鼠进行恐惧记忆条件化。实验第三天,先提前6小时进行尾静脉注射外泌体,再进行恐惧记忆消退训练,将小鼠放入实验箱,更改试验箱场景,设为场景B,气味为低浓度乙酸,适应3min后呈现14次循环声音(80dB,4000Hz,20s)刺激,无电击呈现,相邻两次声音之间间隔20s,最后一次训练后60s将小鼠从实验箱取出放回鼠笼,记录僵直率。实验第四天,同第三天操作,最后统计其僵直率。实验取得了预期的效果,通过对僵直率的统计,发现注射si-syn2a外泌体组的僵直率明显降低(图3-4)。同时,对小鼠进行杀鼠取脑组织,通过蛋白免疫印迹实验,证明注射si-syn2a外泌体组较对照组确实降低了脑内syn2a的蛋白水平(图2)。
同时,参考现有技术中的方法,制备了一种恐惧记忆难消退鼠AtLAS-/-小鼠模型它是一种很好的PTSD模型鼠。再次用同样的行为学实验再次验证。通过统计发现,在AtLAS-/-小鼠上注射si-syn2a外泌体组的僵直率明显低于AtLAS-/-小鼠注射对照外泌体组(图5-6)。
本领域的普通技术人员可以理解,上述各实施方式是实现本发明的具体实施例,而在实际应用中,可以在形式上和细节上对其作各种改变,而不偏离本发明的精神和范围。
Claims (10)
1.一种分离的多核苷酸,其特征在于,所述多核苷酸用作syn2a抑制剂,所述多核苷酸选自下述任一种:
(i)如SEQ ID NO:1所示的多核苷酸;
(ii)与SEQ ID NO:1所示序列相比,同源性大于80%的的多核苷酸;和
(iii)由SEQ ID NO:1所示序列经过一个或几个核苷酸的取代、缺失或添加而形成的多核苷酸。
2.一种含有权利要求1所述的多核苷酸的小核酸分子,所述小核酸分子为siRNA、siRNA前体、dsRNA、shRNA、miRNA或小干扰RNA。
3.一种含有权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述小核酸分子的外泌体。
4.一种药物组合物,其特征在于,所述药物组合物包括:权利要求1所述的多核苷酸或权利要求2所述的小核酸分子,和药学上可接受的载体。
5.一种预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的方法,其特征在于,所述方法包括步骤:向受试对象施加治疗有效量的如权利要求1所述的多核苷酸;或者
向受试对象施加治疗有效量的如权利要求2所述的小核酸分子;或者
向受试对象施加治疗有效量的如权利要求3所述的外泌体;或者
向受试对象施加治疗有效量的如权利要求4所述的药物组合物。
6.如权利要求1所述的多核苷酸的用途,用于:
(i)预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍;
(ii)制备用于预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的药物;
(iii)体外非治疗性地降低syn2a基因或其编码蛋白的表达水平;和/或
(iv)用作syn2a抑制剂。
7.如权利要求2所述的小核酸分子的用途,用于:
(i)预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍;
(ii)制备用于预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的药物;
(iii)体外非治疗性地降低syn2a基因或其编码蛋白的表达水平;和/或
(iv)用作syn2a抑制剂。
8.如权利要求3所述的外泌体的用途,用于:
(i)预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍;
(ii)制备用于预防、治疗和/或辅助治疗创伤后应激障碍的药物;
(iii)体外非治疗性地降低syn2a基因或其编码蛋白的表达水平;和/或
(iv)用作syn2a抑制剂。
9.如权利要求3所述的外泌体的制备方法,其特征在于,所述方法包括步骤:
获取原始的外泌体,然后将如权利要求1所述的多核苷酸导入所述原始的外泌体中,即得。
10.根据权利要求8所述的方法,其特征在于,所述原始的外泌体通过使ECS试剂处理细胞获得。
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